Summary
El objetivo de este protocolo es la producción de fibras de la matriz extracelular todo destinados a la reparación de la herida que son adecuados para la evaluación preclínica como parte de un implante de andamio regenerativa. Estas fibras se producen por la cultura de los fibroblastos en las membranas de fibra hueca y extraídas por disolución de las membranas.
Abstract
Andamios de ingeniería derivados de matriz extracelular (ECM) tienen conducido gran interés en medicina por su potencial de acelerar el cierre y cicatrización de la herida. Extracción de la matriz extracelular de fibrogénicos celular cultivos en vitro tiene potencial para generación de ECM de líneas celulares humanas - y potencialmente específico para cada paciente, minimizando la presencia de epitopos xenogeneicos que ha dificultado la clínica éxito de algunos productos de ECM existentes. Un reto importante en la producción en vitro de ECM adecuado para la implantación es que producción de ECM por cultivo celular suele ser de relativamente bajo rendimiento. En este trabajo, se describen los protocolos para la producción de ECM por células cultivadas en andamios de membrana de fibra hueca sacrificial. Membranas de fibra hueca son cultivadas con líneas celulares de fibroblastos en un medio celular convencional y disuelto después de cultivo celular para producir filamentos continuos de ECM. Las fibras del ECM resultantes producidas por este método pueden ser decellularized y liofilizadas, haciéndola conveniente para el almacenaje y la implantación.
Introduction
Andamios quirúrgicos implantables son un accesorio de la reparación de la herida, con mallas de polímeros sintéticos más 1 millón implantado en todo el mundo cada año para reparación de pared abdominal solo1. Sin embargo, tras la implantación de los polímeros sintéticos materiales tradicionalmente utilizados en la fabricación de estos andamios tiende a provocar una respuesta de cuerpo extraño, resultando en inflamación deletérea para la función del implante y cicatrización del tejido2 . Además, como los materiales predominantes de malla sintética (es decir, polipropileno) apreciable no son remodelados por el cuerpo, son generalmente aplicables a los tejidos donde se pueda tolerar una cicatriz, limitando su utilidad clínica hacia el tratamiento de tejidos con función de orden superior tales como músculo. Si bien hay muchos productos de malla quirúrgica que han sido aplicados con éxito clínico, fabricante reciente recuerda de sintético quirúrgico mallas y complicaciones de los implantes de tejido entre las especies destacan la importancia de maximizar el implante biocompatibilidad, incitando a la FDA para apretar regulaciones sobre quirúrgica malla fabricantes3,4. Implantación de andamios derivados de tejidos de pacientes reduce esta respuesta inmunitaria, pero resulta en el sitio donante importante morbilidad5. Matriz extracelular (ECM) andamios producidos en vitro son una posible alternativa, como andamios de ECM decellularized exhiben excelente biocompatibilidad, particularmente en el caso de ECM autólogo implantes6.
Debido a la limitada disponibilidad de tejido de la paciente de cosecha para implante autólogo y el riesgo de obstaculizar la función en el sitio donante, la capacidad de producir ECM andamios en vitro de la cultura de líneas celulares humanas o, si es posible, un paciente células propias es una alternativa atractiva. Los retos principales en la fabricación de cantidades sustanciales de ECM en vitro es el secuestro de estas moléculas de difícil captura. En trabajos previos, hemos demostrado que el ECM puede ser producido por cultivo de fibroblastos secretoras de ECM en sacrificio espumas poliméricas que se disuelven después del período de la cultura a ECM de rendimiento que puede ser decellularized de implantación7, 8,9,10. Como ECM producido en espumas tienden a adoptar la arquitectura interna de las espumas, las membranas fibra hueca (HFMs) fueron exploradas como andamio sacrificial para la producción de hilos de ECM. Descritos métodos encargados de laboratorio de la escala de la fabricación de membranas de fibra hueca de calidad de cultura de celulares y la extracción de fibras de la matriz extracelular de bulto de la misma tras un período de cultivo de fibroblastos. Este enfoque de cultura estática es fácilmente adoptable por los laboratorios que contienen equipos de cultura de célula mamífera estándar. ECM producida por este método podría aplicarse a una variedad de aplicaciones clínicas.
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Protocol
1. producción de matriz extracelular con membranas de fibra hueca sacrificio
PRECAUCIÓN: N-metil-2-pirrolidona es un solvente irritante y tóxicos reproductivos. Exposición a NMP puede causar irritación a la piel, ojos, nariz y garganta. Resistentes al solvente equipo de protección personal debe usarse cuando manejo NMP. Uso de NMP se debe realizar dentro de una campana de humos.
- Preparación de solución de polímero de polisulfona membranas de fibra hueca
- Peso 70 g de pellets de polisulfona (peso molecular de 35 kD) en un bote de peso utilizando una balanza analítica.
- Transferencia de 314 mL (323,3 g) de N-metil-2-pirrolidona (NMP) a un matraz de borosilicato limpio.
- Coloque una barra de agitación en el matraz con NMP y lugar matraz sobre el agitador. Fijar el agitador a una moderada tasa de rotación.
- Utilice un embudo seco para Introduzca lentamente el preparado 70 g de polisulfona en el matraz con el NMP.
- Deje que la solución de polímero "marear contra" agitar durante tres días a temperatura ambiente o hasta que el homogeneizado.
- Configuración de concentricidad y limpieza de la hilera de membrana de fibra hueca
Nota: Toberas de hilar están comercialmente disponibles; dimensiones de hilera correcta son fundamentales para la fabricación exitosa de la membrana y se enumeran en la Tabla de materiales. Manejar la hilera muy suavemente, como la aguja de la hilera es particularmente frágil.- Utilice un destornillador o taladro con una broca de destornillador adecuado para desmontar cuidadosamente la hilera.
- Flujo suavemente de acetona a través de la entrada y salida de la hilera, recogiendo cualquier polímero acetona y residual en un vaso de vidrio para eliminación.
- Asegure la parte superior del cuerpo de la hilera con la aguja hacia arriba en un tornillo de mesa.
- Coloque el cuerpo de salida (parte inferior) de la hilera en la parte superior del cuerpo.
- Moverse lateralmente el cuerpo de salida de la hilera mientras sujeta la parte superior del cuerpo fijada en el tornillo hasta que la aguja de la hilera es directamente en el centro del cuerpo de toma de corriente.
- Lenta y cuidadosamente vuelva a colocar los tornillos de los dos cuerpos de la hilera asegurándose que la aguja visible en la salida de la hilera quede centrada.
- Fabricación de membranas de polisulfona de fibra hueca
- Prepara una "ánima" que contiene 45 mL de N-metil-2-pirrolidona y 255 mL de agua desionizada, formando una mezcla de 15% de NMP con agua desionizada.
- Monte una hilera de membrana de fibra hueca concéntrica 8 cm sobre la superficie de un baño de agua temperatura ambiente.
- Conecte la entrada del polímero de la hilera y la entrada del agujero de la hilera a dos recipientes a presión de acero separada teniendo un volumen interno de al menos 350 mL. Ambos barcos deben tener válvulas de retención en sus puntos de venta.
- Conecte cada uno de los recipientes a presión a los reguladores de cilindros de gas de2 N separados
- Utilice un embudo para introducir la droga preparada solución ~ 315 mL en el recipiente de presión conectado a la entrada del polímero de la hilera. Asegúrese de que la parte superior de la nave está cerrada.
- Usar un embudo para introducir el preparado del alesaje (300 mL) de solución en el recipiente de presión conectado a la entrada del agujero de la hilera. Asegúrese de que la parte superior de la nave está cerrada.
- Abrir la válvula de retención para el buque taladro primero, entonces el polímero vaso segundo. Si la hilera es suficientemente limpia, la solución de agujero comenzará a corriente de la salida de la hilera.
- Presionar ambos buques a 1 PSI. Confirmar visualmente que soluciones de polímero y diámetro son salir de la hilera, con un filamento blanco continuo precipitación como las corrientes combinadas en contacto con el baño de agua.
- Utilice pinzas largas para dirigir la naciente fibra debajo de los rodillos en el centro de la bañera y entonces la fibra nació alrededor de un disco giratorio conectado a un motor de viento.
- Ajuste la rueda de compensación y el motor gire a una velocidad de aproximadamente dos metros por minuto.
- Realizar pequeños ajustes en los reguladores o velocidad de la rueda de recogida según sea necesario hasta logra un flujo de estado estacionario. La fibra naciente debe formar un ángulo de 90° con la superficie de la bañera de agua.
- Cierre los N2 cilindros reguladores y recipiente de presión válvulas de retención y desengrane el motor de la rueda de compensación después de que toda solución de polímero y agujero ha sido sacada de los vasos.
- Quite las membranas de fibra hueca preparada y colocarlos en un baño de agua desionizada durante tres días, el intercambio de agua desionizada una vez al día para eliminar el disolvente residual.
- Esterilizar las membranas de fibra hueca en autoclave a 121 ° C durante 30 minutos o por inmersión por un día en etanol al 70%.
- Siembra de células de las membranas de fibra hueca
Nota: Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse dentro de un gabinete de bioseguridad.- Tratamiento de las membranas de fibra hueca con una solución de 20 μg/mL de fibronectina de plasma bovino en PBS (pH = 7.4) para promover la fijación de la célula.
- Pesar 1 mg de fibronectina de plasma bovino en polvo en un barco de pesar y disolver en 1 mL de PBS estéril (pH = 7,4) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.
- Incubar la solución de fibronectina de plasma bovina de 1 mg/mL en la incubadora durante 30 minutos. Añadir la solución a 49 mL de PBS estéril en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL estéril.
- Incubar las fibras en el preparado 50 mL de fibronectina de plasma bovino en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 durante 1 hora. Recordar la solución de fibronectina para uso posterior y el almacén en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL estéril a 4 º C.
- Utilice microscissors estéril para cortar las fibras a la longitud deseada (< 6 cm).
- Células de fibroblasto de semilla directamente en el lumina de las membranas de fibra hueca con una densidad de siembra de 100.000 células por fibra con jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 21.
Nota: Una meta posible para la preparación de la suspensión de células de carga en la jeringa es una densidad de 100.000 células por cada 30 microlitros de medio de suspensión. - Coloque seis semillas fibras en un diámetro de 6 cm plato de Petri. Permitir que las fibras de semillas a incubar a 37 ° C con 5% CO2 durante cinco minutos.
- Quitar las fibras de semillas de incubación y cultivo hasta 3 semanas en DMEM/F-12 que contiene concentraciones finales de 50 μg/mL de ácido L-ascórbico y 150 μg/mL de L-ascórbico 2-fosfato ácido (recién preparados y estériles filtradas), 5 ng/mL TGF-β1 (de estéril filtrado de alícuotas almacenadas-20 ° C) y 1% de penicilina-estreptomicina en un 6 cm plato de Petri dentro de una 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Medio de intercambio celular cada dos días.
- Tratamiento de las membranas de fibra hueca con una solución de 20 μg/mL de fibronectina de plasma bovino en PBS (pH = 7.4) para promover la fijación de la célula.
- Extracción de la matriz extracelular de las membranas de fibra hueca cultivadas
- Lugar cultiva fibras en frasco centelleo individual con unas pinzas.
- Colocar hasta 5 mL de NMP en cada frasco utilizando una pipeta de vidrio.
- Sumerja las fibras huecas de NMP, realizando un total de tres bolsas de NMP. Aspirar lentamente el viejo NMP utilizando una pipeta de 1 mL para evitar desgarro del ECM extraído.
Nota: Al agregar el NMP fresco, es útil inclinar el frasco y permiten el NMP por los lados, de lo contrario el andamio ECM restantes es sometido a cortante que puede causar lagrimeo. - Quitar NMP y aclarado el hilo resultante de la ECM 3 veces en agua desionizada.
- Corte una hoja gruesa de 1/32 de pulgada de caucho de silicona para una longitud de 3 pulgadas, ancho de 1 pulgada y corte una de 8 mm por el molde rectangular de 4 mm en el centro de la longitud de la goma.
- Coloque la pieza de preparados de goma sobre un estándar 3 pulgadas por 1 pulgada microscopia diapositiva y autoclave a 121 ° C durante 30 minutos.
- Coloque cada fibra del ECM al lado de 8 mm por el molde de silicona de 4 mm hasta que no haya ningún espacio abierto visible.
- Coloque el molde en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y congelar a-80 ° C hasta completamente congelado.
- Liofilizar malla ECM congelado durante la noche o hasta que seque completamente. Tienda la malla a 4° C hasta que esté listo para descelularización.
2. descelularización de matriz extracelular
- Preparar una solución de 1% (w/w%) sodio dodecil sulfato (SDS) en agua desionizada.
- Incubar extrajo matriz extracelular en el molde en 1% de SDS durante 24 horas a temperatura ambiente en un eje de balancín con agitación suave.
- Enjuague extrajo matriz extracelular tres veces en tampón fosfato salina (PBS) con agitación suave, usando 3 mL de PBS por enjuague.
Nota: Los enjuagues deben realizarse suavemente para minimizar la rotura de andamios preparados. - Preparar 1 L de tampón de digestión de DNasa/Rnasa.
Nota: Tampón de digestión de DNasa/Rnasa se puede almacenar por varios meses a 4° C.- Pesar de 1,54 g de Tris HCl, 308 mg de MgCl2y 56 mg de CaCl2 en barcos de pesaje independiente.
- Tris HCl, MgCl2y CaCl2 se combinan con 1 L de agua desionizada en un matraz grande con una barra de agitación y revuelva hasta que se disuelvan todos los componentes.
- Filtro estéril el buffer de digestión con un filtro de 0,22 μm en un botella de borosilicato estéril 1 L y almacenar a 4° C.
- Preparar 5 mL de solución de digestión de DNasa/Rnasa.
Nota: La solución de digestión debe utilizarse dentro de las 24 horas de preparación.- Pesar de 0,125 mg (50 kU) de DNasa I en un pesaje del barco y añadir a 5 mL de tampón de digestión.
- Añadir 75 μl de solución stock de Rnasa A para el buffer de digestión.
- Llene cada molde con solución de digestión e incube a 4 ° C durante 6 horas.
- Aspirar la solución de digestión y enjuague tres veces en PBS estéril.
- Aspirar el PBS e incubar los andamios durante la noche en 10% penicilina-estreptomicina en PBS a 4° C.
- Aspire la penicilina-estreptomicina y enjuague andamios tres veces en PBS estéril.
- Coloque el molde en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y congelar a-80 ° C.
- Liofilizar la malla decellularized de ECM durante la noche o hasta que seque completamente.
- Transferir los andamios liofilizados dentro de una campana de bioseguridad a un contenedor estéril a 4 º C pendientes de uso.
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Representative Results
Éxito de la producción de matriz extracelular de andamios sacrificio depende de fabricación de andamio apropiado, cultivo celular y los procedimientos de enjuague solvente. Fabricación de las membranas de fibra hueca se realiza utilizando un chorro de seco mojado-spinning sistema montado de componentes comercialmente disponibles (figura 1) extrusión de la solución de polímero a través del anillo de acero disponible en el mercado hilera (diámetro interno = 0,8 mm, diámetro externo = 1,6 mm) para generar un tubo de solución de polímero que se precipita en una membrana de fibra hueca al entrar en contacto con un baño de agua de naciente.
Un proceso de ejemplo para la extracción de ECM de HFMs se ilustra en la figura 2. Figura 3A muestra que una sección transversal de polisulfona HFMs fabricados bajo este protocolo, exponiendo las capas externas e internas de dedo-como los poros de una membrana asimétrica. En el presente Protocolo, las células son sembradas específicamente en la luz interna de la membrana y cultivadas en platos de Petri de 6 cm de diámetro (figura 3B), con las células tienden a proliferar en todas las superficies de la membrana. Cultivadas de las membranas pueden someterse luego a lote NMP y enjuague agua desionizada en viales de centelleo de vidrio estándar (figura 3), produciendo hilos translúcidos de ECM (figura 3D). ECM-produciendo las células permanecen viables dentro HFMs durante todo el período de 3 semanas de la cultura (figura 4).
HFMs cultivadas durante tres semanas con músculo esquelético de rata primaria fibroblastos (RSMF) fueron disueltos a través de tres bolsas de N-metil-2-pyrrolidone, después de lo cual ellos fueron aclarados tres veces en agua desionizada. La matriz extraída, siendo normalmente translúcido en apariencia cuando hidratada (figura 5A), tenderá a la nube sobre la hidratación si no sometidos a lavado solvente apropiado debido a la presencia de polímero residual. Cabe señalar que el ECM restante después de la disolución de la membrana es algo frágil, que requiere cuidado en la manipulación con pinzas finas. Las fibras del ECM montado en mallas y luego liofilizados presentan un color grisáceo y aspecto fibroso con una alineación longitudinal bruto (figura 5B).
Figura 1: flujo del proceso ilustrado para bastidor de membranas de fibra hueca. Membranas de fibra hueca se fabrican utilizando el método de separación de ubicua no-solvente fase inducido (NIPS) utilizando un sistema de componentes comercialmente disponibles figuran en la tabla de materiales específicos. Polisulfona en NMP (17,8 w/w%) y soluciones de agujero NMP (15 w/w% NMP en agua) se sacan de la vasos acero inoxidable separado por a presión N2 en una hilera, generando una membrana de fibra hueca naciente en la salida de la hilera que precipita totalmente al entrar en contacto con el baño de precipitación de agua del grifo. Fibra hueca naciente manualmente es guiada por debajo y sobre guías y permitió recoger sobre una rueda giratoria de compensación motorizado a una velocidad de 2,3 metros por minuto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ilustra la producción de ECM de membranas de fibra hueca culta. Membranas de fibra hueca se siembran con fibroblastos y cultivadas durante tres semanas, seguido por el intercambio de NMP x 3 y el intercambio de agua desionizada 3 x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: extracción de ECM y cultura. Membranas de fibra hueca mesoporosos asimétrico (A) fueron cultivadas durante tres semanas con las células RSMF en DMEM/F-12 con ácido ascórbico suplementado y TGF-β (B). Cultivadas fibras huecas (topC, D ) fueron disueltos a través de 3 intercambios en n-metil-2-pirrolidona luego enjuagadas tres veces en agua desionizada, dando lugar a filamentos continuos de ECM (D, abajo). Alta magnificación micrografía de microscopia electrónica de la superficie de la fibra del ECM (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: viabilidad en las membranas de fibra hueca celular. Membranas de fibra hueca representativas cultivadas con células RSMF para tres semanas fueron seccionados longitudinalmente utilizando una maquinilla de afeitar fina para revelar la superficie luminal de los HFMs y sometidos a muerto viva coloración con calceína AM y EthD-1. Tinción de viabilidad reveló una capa confluente de células viables con fluorescencia EthD-1 insignificante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: montaje de implante ECM. Hilos de rosca individuales de matriz extracelular (n = 30) derivado de la cultura de la RSMF células fueron colocadas longitudinalmente en un molde de silicona (A) y decellularized por SDS 1% seguida por el tratamiento con DNasa I, RNasa A y penicilina-estreptomicina. Fue liofilizado decellularized ECM, produciendo una malla color hueso con un aspecto fibroso y arquitectura longitudinal (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los procesos descritos permiten la producción de granel ECM biomateriales en vitro con membranas de fibra hueca de un sistema de hilado húmedo seco-jet que permite para la producción a granel barato de membranas así como el equipo de cultura de célula estándar. Mientras que las membranas fabricadas en este protocolo están diseñadas para uso en cultivo celular, el sistema descrito también puede ser adaptado para la producción de membranas para fines de separación, con poro tamaño distribución y hueco fibra dimensiones regulables variando dimensiones de la hilera, polímero utilizado, droga y llevaba caudal, velocidad de recogida y condiciones ambientales. 13 aunque el protocolo detallado emplea membranas de fibra hueca, en principio cualquier cultivo celular soluble del andamio con propiedades de transporte adecuado como célula abierta espumas podrían utilizarse, como se muestra en el anterior trabajo7, 8,9. Este planteamiento general aparece útil para la producción de andamios ECM por andamios sacrificio que pueden imitar más fielmente la arquitectura interna de los tejidos. Implantes producidos por este protocolo en particular presentan una alineación bruta (figura 5B), que puede ser de particular beneficio hacia la reconstrucción de los tejidos altamente alineados como tendones, ligamentos y músculo esquelético.
Intercambio regular del medio y, en particular, la suplementación del medio con ácido ascórbico y TGF-β es crucial para la producción de ECM, como el ácido ascórbico es una enzima esencial en la biosíntesis de colágeno, y TGF-β induce la síntesis de varias proteínas de la ECM10 . Además, debe realizarse un enjuague de ECM con NMP, de lo contrario polímero residual permanecerá en el ECM extraído, que aparece como una película blanca durante los enjuagues con agua. Debe tener cuidado para no excesivamente agitar ECM durante la disolución de la membrana, ya que es relativamente frágil. Andamios de ECM recogidos para la implantación deben someterse a un paso de descelularización como se describe para quitar xenogeneicos epitopos para minimizar una respuesta de cuerpo extraño huésped potencial.
La importancia de esta técnica radica en su producción de un andamio biocomplex de matriz extracelular todo que puede ser remodelado por los procesos de cicatrización propia del cuerpo. Al utilizar este enfoque para producir ECM de células específicas a una especie de destino, es posible minimizar la respuesta de cuerpo extraño que dificulta la efectividad clínica de esta clase de biomateriales; mediante el uso de las células específicas de un individuo, la respuesta de cuerpo extraño puede reducirse aún más. Este enfoque también permite la producción de ECM orientado hacia los tejidos particular, con los informes recientes que sugieren que ECM específicas de tejido puede ser particularmente eficaz en ciertas aplicaciones12. Como este protocolo permite la producción de ECM a través de varias líneas celulares, implantes ECM la combinación de varios tipos celulares (por ejemplo, musculares, nerviosas, endoteliales) podrían ser utilizado para adaptar implantes para aproximar más fielmente la estructura y la química complejidad de los tejidos diana. Mientras que las mallas de ECM presentadas aquí fueron pensadas originalmente como andamios para la reparación de la herida, también pueden tener uso como plataformas para investigaciones sobre las interacciones célula-ECM, durotaxis y biosensores. En particular, este enfoque presta el investigador la capacidad para producir ECM de tipos específicos de la célula de interés que puedan tener nuevas ideas sobre la significación biológica de tejidos específicos ECM estructura, composición y función.
Posibles mejoras en las técnicas de producción ECM presentadas aquí podrían incluir escala a través de la utilización de biorreactores dinámicos y previamente acondicionados, así como exploración de andamio sacrificio alternativos materiales y arquitecturas. En particular, la transición a un proceso de eliminación de andamio sin disolventes mejoraría la seguridad del proceso de extracción; sacrificio andamios compuestos de materiales que son degradables por las enzimas, tales como celulosa regenerada, pueden permitir sin disolventes de extracción ECM14. Mientras que la resistencia de estos materiales es por debajo de los de materiales sintéticos, existen varias vías para la mejora de estos andamios, incluyendo exploración de diversas condiciones de cultivo, formulaciones de medios de comunicación y geometrías de andamio sacrificial. Los recientes avances de la ingeniería genética podrían aprovecharse para producir líneas de células pro-fibróticos, que en combinación con plataformas para captura de ECM podrían permitir la producción de andamios satisfaciendo demandas clínicas. Además, existen sistemas de cultura dinámica como membrana de fibra hueca de lazo de flujo continuo Biorreactores facilitan las altas tasas de intercambio de nutrientes conducente a una mayor y más rápida producción de ECM y pueden ser de particular interés en aprovechar este usar la técnica para la producción de grandes cantidades de ECM para la investigación biológica y clínica.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de artritis y lesiones músculo-esqueléticas y enfermedades de la piel de los institutos nacionales de salud bajo el número de concesión R15AR064481, la National Science Foundation (CMMI-1404716), así como Instituto de biociencias de Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
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