Summary
ここでは、マウス変形性関節症の確立された外科モデルを利用して、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内の細胞外染色アッセイと細胞内染色アッセイの両方を使用して、単球/マクロファージおよびT細胞サブセットを同定するための詳細で再現可能なフローサイトメトリープロトコルについて述べた。
Abstract
変形性関節症(OA)は、痛みや身体的な制限に苦しむ患者に影響を与える最も一般的な筋骨格疾患の一つです。最近の証拠は、T細胞と単球/マクロファージの両方がOAの病因に関連する可能性のある疾患の潜在的な炎症成分を示している。さらなる研究は、Th1、Th2、Th17、およびT-調節性リンパ球、およびM1、M2、および滑膜組織居住マクロファージなどの炎症性細胞系のサブセットに重要な役割を果たした。しかしながら、局所滑液および全身性炎症細胞反応と関節の構造変化との相互作用は不明である。T細胞と単球/マクロファージがOAにどのように寄与するかを完全に理解するには、滑膜組織、二次リンパ器官および全身(脾臓および骨髄)においてこれらの細胞とそのサブセットを同時に定量的に同定できることが重要である。今日では、異なる炎症細胞サブセットは、これらの細胞プロセスを調査する際に多色流サイトメトリーを強力な技術にする細胞表面マーカーの組み合わせによって同定することができる。このプロトコルでは、滑液組織および二次リンパ器官の収穫に関する詳細なステップと、単一細胞懸濁液の生成について説明する。さらに、単球/マクロファージとそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイと、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内のT細胞およびそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイを提示する。このプロトコルの各ステップは最適化され、テストされ、他の外科および非外科的OAマウスモデルに利用することができる非常に再現性の高いアッセイをもたらした。
Introduction
変形性関節症(OA)は、関節1に関連するすべての組織の様々な病理を含む衰弱および痛みを伴う疾患である。世界人口の約3.8%に影響を及ぼす2,OAは最も一般的な筋骨格系疾患の1つであり、2020年までに世界の第4位の障害原因となる。外傷後OAは関節損傷後に発生し、膝4、5などの影響を受けやすい関節において、OAの少なくとも12%、OAの最大25%を占める。,5さらに、関節損傷はOAの生涯リスクを5倍以上6倍に増加させる。明らかに同様の不安定性を持つすべての傷害がOAの開発に進むわけではないので、長期的なOAリスクを引き起す要因を定義することは依然として困難です。OAに素因がある傷害特異的な病理、原因、およびメカニズムを調査し、より良く定義するために、心的外傷後OAを予防および/または治療するための効果的な治療法を開発することが1重要である。
OAとその定義軟骨破壊は、以前は完全に機械的ストレスに起因し、したがって、OAは非炎症性疾患2と考えられていた。しかし、最近の研究では、滑膜の炎症性浸潤と、OA患者の滑膜組織における炎症性細胞の増加が、健康なコントロール2と比較して、OAの潜在的な原動力として炎症成分に光を当てることが示されている。さらなる研究は、CD4+およびCD8+T細胞プロファイルの両方の異常ならびに自然免疫系の単球/マクロファージがOA2、7,7の病因に寄与する可能性があることを示した。これらの異常に関する詳細な調査は、様々なT細胞サブセット2、例えばTh1 8、Th299、Th178 8およびT規制(Treg)集団10、11,11のような関連する役割を明らかにした。この説得力のある証拠にもかかわらず、T細胞応答の変化とOAの発達と進行との因果関係はまだ不明である2.
OAに役割を持つ特定のT細胞に加えて、最近の研究では、分偏光/活性化マクロファージがOA12の病因と関連している可能性が示唆されている。特に、血液単球に由来するマクロファージは、滑膜に蓄積し、OAの開発中に古典的に活性化されたマクロファージ(M1)または代替活性化マクロファージ(M2)のいずれかに蓄積し、単球由来マクロファージとOA13との間の相関関係を暗示する。対照的に、マクロファージの特定のサブセットは、発達中の初期に臓器を移入し、単球独立物質14においてその数を自立する。近年、これらの滑膜組織居住マクロファージ(STRM)14について、密接的な接合バリアによって媒介された関節保護機能が14示された。これらの知見は、特にマクロファージサブセットの異常がOAの開発中に重要な役割を果たす可能性があることを示している。しかし、この炎症細胞反応と外傷後の関節の構造変化との相互作用は不明である。
歴史的に、滑液組織における免疫細胞の解析は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)が15,16,16に近づくことで免疫組織化学(IHC)またはmRNA発現に限定された。しかし、IHCとRT-PCRの両方が、複数の異なる細胞タイプとそのサブセットを同時に識別する能力を欠いているため、これらの方法の適用性が制限されます。さらに、IHCは組織の小さなサンプルの分析に限定され、焦点炎症性細胞蓄積を見逃す可能性がある。ここ数年、さまざまな細胞タイプの無数の表面マーカーが開発され、免疫細胞のサブセットは、これらのマーカーの明確な組み合わせによって確実に同定できるようになりました。着実な技術進歩により、フローサイトメーターは、多数の異なるフルオロクロムを同時に同定することができ、大型の多色抗体パネルの分析が可能になりました。
フローサイトメトリーは、多数の免疫細胞とそのサブセットを単一細胞レベルで同時に同定し、定量化できる強力な技術を研究者に提供します。私たちは、単球/マクロファージとそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイと、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内のT細胞およびそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイの両方を開発し、最適化しました。このプロトコルの各ステップは最適化され、テストされ、他の外科および非外科的OAマウスモデル17に利用することができる非常に再現性の高いアッセイを生じる。
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Protocol
北シドニー地方保健地区動物倫理委員会は、この議定書に記載されているすべての手続きを承認しました。マウスは、実験動物のケアと使用ガイド(オーストラリア国立健康医学研究評議会改訂2010)に従って収容され、世話されています。10〜12週齢のすべての実験に対して、雄C57BL/6マウスを利用した。
注: 心的外傷後OAを誘導するために、右の凝縮関節における内側半月板(DMM)の外科的不安定化が行われた。この動物モデルに関する詳細情報は、Glassonらの18社から出版された。要するに、一般的な麻酔はイオブルランを用いた誘導室で誘発され、その後、鼻コーンを用いて維持される。手術用脚はカミソリの刃で剃られ、外科部位は洗浄され、汚染を最小限に抑えるためにエタノールで振り回される。その後、動物は手術顕微鏡に移動し、滅菌タオルの上に置かれ、脚は滅菌紙のドレープで覆われ、外科現場を隔離し、汚染を最小限に抑えます。顕微鏡を用いて、0.5cmの内側パラ膝蓋関節切除術を行い、膝蓋骨を横方向に割り出し、腸内膝蓋骨脂肪パッドを上昇させ、解剖鉗子で経えて経皮性の内側半月骨脛骨靭帯を露出させる。関節は、任意の血液を除去するために無菌生理食糸で洗い流され、創傷は3つの層で閉じている - 関節カプセル、皮下組織(縫合材料を使用)および皮膚(外科組織の接着剤を使用)。ただし、このプロトコルで説明されているメソッドは、OA を誘導する他のモデルやメソッドに適用できます。OAは、動物の両側で誘導することができ、組織を収穫する場合、イプシララル(ドレイン)リンパ節を収穫することが重要である。
1. 脾臓の分離, 対側骨髄, スティフレーションと滑膜組織を排出するイプシ側リンパ節
- 頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。マウスを解剖顕微鏡下の上の上の位置に置き、70%エタノールで胸、腹部および脚を拭きます。腹腔をそのままにしてまっすぐはさみを使用して、腹部の長さのために慎重に正中線の皮膚を開きます。
- 皮膚に付着した皮下脂肪組織を残して、下層の筋肉から動物の右側の皮膚をそっと引っ張ります。通常、穏やかな牽引だけでは、皮膚と下層の脂肪組織を筋肉から分離します。散発的な付着は、組織を最小限に分離するために必要な緊張を維持し、リンパ節に害を与える可能性を減らすために、細かいはさみで切断する必要があります。2つの湾曲した細かい鉗子を使用して、大腿部に位置する脂肪組織を優しくからかうことによって、3つの血管の交差を識別する。イングイナルリンパ節は交差に位置し、その球体形状とわずかに暗い色で識別することができます。
- 細かい解剖鉗子を使用して、リンパ節を取り除きます。カプセルを破裂しないように注意してください。鉗子でリンパ節の表面に残った脂肪を取り除きます。
- 腹腔を開き、脾臓を特定します。細かいはさみで脾臓を切り取ります。汚染のリスクを最小限に抑えるために、大腸とその分岐を露出させるために、腸を静かに引き離します。腸骨リンパ節は、腹部大動脈の末端部および共通腸骨動脈の起源に位置する。右腸骨リンパ節を取り除き、1.3に記載されているように進みます。
- 両後肢の皮膚をそっと取り除きます。刃と細かいはさみを使って筋肉組織からきれいにして左大腿骨を解剖する。骨全体をそのままにして、スティフと股関節の両方を慎重に取り外し、大腿骨を取り除きます。
- 右の凝縮関節の膝蓋腱を特定し、膝蓋骨に近位の約5mmの四頭筋腱が露出するまで、これに近い隣接する筋肉組織を細かいはさみを使用して除去する。その後、膝蓋骨に約3〜4mm近位の四頭筋腱を切断してハンドルを形成し、細かい鉗子を使用して関節からそっと引き離す。これにより、関節カプセルの取り付けの端が大腿骨に見えるようにし、収穫される滑膜の量を最大化するために脛骨に向かう大腿骨から始まる両側の関節カプセルの端に沿って慎重に切断されたメスブレードを使用します。切断は四頭筋腱の穏やかな牽引を維持し、滑液組織ブロックが脛刺にのみ付着しているときに一時停止することが重要です。この段階では、関節内脂肪パッドは、膝蓋骨に遠位にはっきりと見え、ブレードを使用してメニシの関節および前側面から穏やかに剥離することができる。その後、関節カプセルの残りの部分(脛部)に沿って切断し、滑液組織ブロックを除去する。
注: この手順は、信頼性の高い結果を得るために非常に正確に行う必要があります。解剖を完了した後、「滑膜組織ブロック」は、膝蓋骨、膝蓋腱、腸蓋骨蓋脂肪パッド、上頭および膝蓋部の凹部の滑膜内層および副靭帯の前部に関連する関節カプセルで構成されるべきである。解剖中、全ての組織を湿潤に保ち、0.9%の生理液溶液を使用してください。
注:各滑液組織ブロックサンプルは、1.5 mlのRPMI 1640培地を含むラベル付き24ウェルプレートの別々のウェルに入れます。腸骨と鼠糖リンパ節の両方を1つの井戸に組み合わせ、2匹のマウスから組織をプールします。
2. 各組織からの単一細胞懸濁液の生成
注: 2匹のマウスからの滑液組織の流動解析に十分な細胞数を確保するためには、プールする必要があります。現在のプロトコルでは、同じ2匹のマウスからすべての組織をプールして、たとえを維持します。さらに、各動物に対して腸骨リンパ節とりえりリンパ節を組み合わせ、各サンプルに対して合計4個のリンパ節を生じた。一般に、1匹の動物の脾臓、骨髄およびリンパ節の細胞数は流動解析を行うのに十分であり、プロトコルを適用することができる。しかし、1つの動物のライジング時間から組織を使用する場合は、調整する必要があります。
- 脾臓
- 2つのプールされた脾臓を、15 mLチューブの上に70 μmのセルストレーナーの上に置きます。滅菌3 mLシリンジプランジャーを使用して、メッシュフィルターを通して脾臓を穏やかに浸します。10% FBSを補充する RPMI 1640培地の合計6 mLでストレーナーを頻繁に洗い流します。
- 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、5 mLの赤血球(RBC)リシスバッファーでペレットを再懸濁します。RTで5分間インキュベートし、10mLのPBSで溶精緩衝液を希釈して反応を停止する。細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、このステップを一度またはそれ以上の RBC がペレットに入らなくなるまで繰り返します。
注:30 μmの細胞ストレーナーを使用して、2ラウンドのライジングの間に新しい15 mLチューブに懸濁液を再フィルタして、凝固細胞を除去します。 - 溶出が完了したら、細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、上清を捨て、PBSの1 mLでペレットを再懸濁します。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。
- リンパ節
- 4つのプールされたリンパ節を、15 mLチューブの上に70μmの細胞ストレーナーの上に置きます。無菌3 mLシリンジプランジャーを押して、リンパ節を単一の細胞懸濁液にそっといじめます。10%FBSでRPMIの合計6 mLでストレーナーを頻繁に洗い流します。
- 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、上清を捨て、PBSの500 μLでペレットを再懸濁します。30 μmの細胞ストレーナーを使用して、凝固した細胞を除去するために新しい15 mLチューブに懸濁液を再フィルタします。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。
- 骨髄
- 損傷を与えずに、組織の親指鉗子を使用して、無傷の大腿骨を慎重につかみます。骨の洗い流しを容易にするために、近位大腿骨の端を鋭利なはさみで切り落とします。大腿骨を回し、大腿骨の間音のノッチの真ん中に23G針を置きます。穏やかな圧力を適用しながら、親指と人差し指の間で針を回転させて、骨腔に入るためにコンディルノッチに穴を開けます。
注:場合によっては、骨の粒子は、フラッシュする前に、針の変更をフラッシュ中に不必要な高圧を避けるために、穴を掘削した後に針を妨害することができます。 - 10%FBS(またはフラッシュが白くなるまで)で6 mLのRPMIで骨を洗い流し、23G針を持つ10 mLの注射器を15 mLチューブに置いた70 μmの細胞ストレーナーに入れます。3 mLシリンジのプランジャーで細胞ストレーナーを通して骨髄を静かに押し込み、さらに3 mLのRPMIでストレーナーをすすます。
注: すべての骨髄が完全に洗い流されると、ボーンは白く表示されます。 - 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、RBCのリシスバッファーの5 mLにペレットを再懸濁させます。RTで5分間インキュベートし、10mLのPBSで溶精緩衝液を希釈して反応を停止する。
- 細胞を回転させ(500 x g、5分、RT)、上清を捨て、PBSの1 mLでペレットを再懸濁します。30 μmの細胞ストレーナーを使用して、凝固した細胞を除去するために新しい15 mLチューブに懸濁液を再フィルタします。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。
- 損傷を与えずに、組織の親指鉗子を使用して、無傷の大腿骨を慎重につかみます。骨の洗い流しを容易にするために、近位大腿骨の端を鋭利なはさみで切り落とします。大腿骨を回し、大腿骨の間音のノッチの真ん中に23G針を置きます。穏やかな圧力を適用しながら、親指と人差し指の間で針を回転させて、骨腔に入るためにコンディルノッチに穴を開けます。
- 滑液組織
- 細かい外科用ハサミで小片に2つの滑液組織ブロックをサイコロ。培地でサンプルを15 mLチューブに移します。残りの細胞および滑液組織を得るためにRPMIの追加の0.5 mLで古い井戸をすすい、ハヤブサの管(最終容積2 mL)に移す。
ヒント: このステップで直径が広がるチップの転写ピペットとカットを使用します。 - メーカーの指示に従って酵素およびアリコートを再構成する(例えば、リベラーゼ)。1単位/mL(サンプルあたり合計2単位)の最終濃度をもたらすのに十分な酵素を加えます。MACS回転器を使用して37°Cで2時間消化します。
- 新しい15 mLチューブに70 μmの細胞ストレーナーを通して10%FBSとフィルター細胞懸濁液でRPMIの8 mLを加えることによって消化を停止します。古い15 mLチューブを、同じ細胞ストレーナー(15 mL最終容積)に同じ細胞ストレーナーを介して10%のFCS培地およびフィルターセル懸濁液を用いて、RPMIの別の5 mLでリンスします。
- 細胞を回転させ(500 gx g、10分、RT)、上清を捨て、PBSの500 μLでペレットを再懸濁します。トリパンブルー除外を使用して、ヘモサイトメーター上の生細胞の数を数えます。
- 細かい外科用ハサミで小片に2つの滑液組織ブロックをサイコロ。培地でサンプルを15 mLチューブに移します。残りの細胞および滑液組織を得るためにRPMIの追加の0.5 mLで古い井戸をすすい、ハヤブサの管(最終容積2 mL)に移す。
3. セルの割り当て
- 2つの96ウェルプレート(Uボトム形状)に、組織の種類、動物ID、および指定抗体パネルをラベル付けします。このプロトコルでは、モノサイトサブセットパネル(細胞外染色)およびT細胞サブセットパネル(細胞外染色)とT細胞サブセットパネルの2つの抗体パネルが使用されています。
- 各単一細胞懸濁液を使用して、ウェルあたり5 x 105 細胞を提供する。
注:実験を設定する際には、グループおよび組織タイプごとに予想される細胞の絶対数を評価します(処理された動物は対照動物よりも組織の細胞数が多くなります)。単一細胞懸濁液を生成する最後のステップで細胞ペレットを再懸濁する場合、200 μLあたり5 x 105 の濃度で終わるには、適切な量のPBSを選択してください。ここで使用される96ウェルプレートは最大300 μLを保持でき、通常、200 μLは、流出によるクロスコンタミネーションのリスクを最小限に抑えるのに理想的です。 - 各パネルおよび組織タイプについて、明確にマークされたウェルに未染色コントロールとして少なくとも5 x 105 細胞を分配する。
4. 単球サブセットパネル
- 生き生き性染色を行う:プレートスピナーを使用してスピンセル(500 x g、5分、4°C)を使用し、200 μLの1x PBSで細胞を1回洗浄します。1x PBSで1:50希釈した細胞非透過アミン反応性色素(生存性染色)のストック溶液を調製する。その後、このストック溶液の100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、ウェル当たり2μLの生存性染色の絶対体積を得ます。光から保護された4°Cで15分間インキュベートします。
注: 必要な生存性染色の最適な量は、用量滴定曲線を実行することによって決定する必要があります。さらに、希釈された生き生き性の汚れストック溶液は、1日で使用する必要があり、保存しないでください。製造能力染色の再構成、希釈、保管の方法については、製造元のマニュアルを参照してください。 - インキュベーション中に、適切な量のFACSバッファー(Ca2+およびMg+フリーPBS(0.1%BSAおよび0.02%アジ化ナトリウムを含む)で抗体のカクテルを調製します。200 μL の FACS バッファー、遠心分離機 (500 x g、 5 分、4 °C) で細胞を 2 回洗浄し、各ペレットを抗体混合物または適切な対照混合物の 100 μL で再懸濁させます。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
注意:アジドナトリウムは細胞に有毒であることに注意してください。現在のプロトコルでは、フローバッファ内のアジドナトリウムの濃度は非常に低い(0.02%)サンプルは、このように染色した直後に実行され、問題を引き起こしません。並べ替えられた細胞の下流機能アッセイが計画されている場合、実験の毎日新鮮なFACSバッファーを構成し、アジ化ナトリウムを使用しないことが有益である可能性があります。多数の抗体を使用する場合、適切な量の「ブリリアントステインバッファー」を抗体のカクテルに添加して結果を高めることをお勧めします。 - 200 μL の FACS バッファーで細胞を 2 回洗浄し、FACS + EDTA バッファー (1 mM EDTA を含む FACS バッファー) の 250 μL で細胞を再中断します。サンプルをラベル付き FACS チューブに転送します。サンプルを4°Cに保ち、取得するまで光から保護してください。
注意:免疫細胞は粘着性を持つ傾向があります。閉塞のリスクとダブレット数の両方を最小限に抑えるために、最終フローバッファに1 mM EDTAを追加することをお勧めします。
5. T セルサブセットパネル
- 生き生き性染色を行う:プレートスピナーを使用してスピンセル(500 x g、5分、4°C)を使用し、200 μLの1x PBSで細胞を1回洗浄します。1x PBSで1:50希釈した細胞非透過アミン反応性色素(生存性染色)のストック溶液を調製する。その後、このストック溶液の100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、ウェル当たり2μLの生存性染色の絶対体積を得ます。光から保護された4°Cで15分間インキュベートします。
- サンプルをインキュベートしながら、細胞外染色抗体カクテルを適切な量の1x FACSバッファで調製します。1x FACSバッファーの200 μLで細胞を2回洗浄し、それらをスピンダウン(500 x g、5分、4 °C)、各ペレットを抗体混合物または適切な対照混合物の100 μLで再懸濁させます。光から保護された4°Cで30分間インキュベートします。
- メーカーの指示に従って、固定および透過性キットで細胞内染色を行います。200 μLの 1x FACS バッファで細胞を 2 回洗浄し、200 μL の固定バッファーで再中断します。光から保護された4°Cで40分間インキュベートします。
- インキュベーション中に、抗体のカクテル(細胞内染色)を適切な体積の1倍の透過性および洗浄緩衝液で調製します。紡糸(750 x g、5分、4°C)で細胞を回収し、200 μLの1xパーミ/洗浄バッファーで細胞を2回洗浄します。
注:固定および透過性は、適切にペレットに少し困難になりがちな細胞で結果を生じます。後続の洗浄工程で細胞損失を最小限に抑えるために、遠心力を750 x gに増 やします。あるいは、より長い回転サイクルを適用することもできます。しかし、これは細胞を準備するために必要なかなり長い時間をもたらすであろう。 - スピンセル(750 x g、5分、4°C)を、各ペレットを抗体混合物または適切な対照混合物の100 μLで再懸濁します。光から保護された4°Cで40分間インキュベートします。
- 200 μLの1パーマ/洗浄バッファーで細胞を2回洗浄し、FACS + EDTA バッファーの 250 μL で細胞を再懸濁します。サンプルをラベル付き FACS チューブに転送します。サンプルを4°Cに保ち、取得するまで光から保護してください。
注:各抗体について、最適濃度は、用量滴定曲線を実行することによって決定される必要があります。抗体間の濃度は大きく異なる可能性があります:CD3とCD80は希釈係数1:1で使用され、CD11bとCD4は希釈因子1:6400で使用されました。抗体濃度を測定する場合は、実験中に使用される細胞と同じ数の細胞を使用します。
6. 補償、適切な管理およびガット
- 実験の設定
- 最適な抗体濃度が決定されると、スペクトルのオーバーラップを調整するための補償のための染色されていない、単一の染色されたコントロールを実行します。
注: セルと補正ビードの両方を使用して、すべての補正コントロールを実行します。報酬のために最も明るい結果(ポジティブイベントの最高MFI)を生成するものは何でも使用してください。MFIは平均蛍光強度を表し、生成されたシグナルの平均強度、したがって抗体発現のレベルを記述し、定義するためにしばしば使用される。 - 新しい多色実験を開始する際に、蛍光マイナス 1 (FMO) コントロールおよびアイソタイプ コントロールを実行します。FMOに関する詳細は、以前に公開されています19.
- 各組織タイプの未染色制御で白血球集団を検出するために最適なフォワードスキャッタ領域(FSC-A)電圧およびサイドスキャッタエリア(SSC-A)電圧を決定します。
注: 固定および透過プロセスは、セルの寸法を変更します。したがって、単球サブセットパネルとTセルサブセットパネルのFSC-AおよびSSC-A電圧は大きく異なります。Tセルサブセットパネルの最適な電圧を求めるには、CD3で単一染色されたセルと白血球集団に向かってバックゲートを使用し、FSC-A値とSSC-A値を調整します。
- 最適な抗体濃度が決定されると、スペクトルのオーバーラップを調整するための補償のための染色されていない、単一の染色されたコントロールを実行します。
- ギャッティング戦略
- 最適なFSC-AおよびSSC-A電圧が決定されたら、白血球集団にプライマリゲートを設置します。
注:各実験の前に、製造業者の指示に従ってキャリブレーションビーズを使用してサイトメーターを較正し、染色されていないビーズを実行します。異なる時点の白血球集団は、FSCおよびSSC特性に匹敵する(組織タイプ間のわずかな違いが予想され、正常である)を有するべきである。FSCとSSCが大きな問題を抱えている場合は、サイトメーターとサンプル生成を撮影します。 - ダブルを除外: プロット FSC-A (y 軸) と FSC-H (x 軸) をプロットします。シングルは、このプロットの対角線として表示されます。シングルのゲート。
- 死細胞を除外: プロット FVS510 (生存性染色) (x 軸) および FSC-A (y 軸).死んだ細胞はポジティブなイベントとして現れ、したがって生きた細胞にゲートします。
注: 真の負のセルは、未染色のコントロールに表示されます。したがって、染色されていないコントロールを実行する際に、サンプルの各セットに対してこのゲートを調整します。さらなる格紙は、調査される抗体パネルおよび細胞タイプに依存する。このプロトコルで使用される各パネルのギャティング戦略は、それぞれ 図1 と 図4にあります。
- 最適なFSC-AおよびSSC-A電圧が決定されたら、白血球集団にプライマリゲートを設置します。
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Representative Results
単球サブセットパネルとT細胞サブセットパネルの両方からの代表的な結果を以下に説明する。
図1 は、DMM処理動物の骨髄から集められた免疫細胞上の単球サブセットパネルの階層格紙戦略を示す。同じ戦略が使用され、他のすべての組織タイプで検証されました.実験を設定する際、各組織タイプに対してフォワード散乱面積(FSC-A)と側散乱面積(SSC-A)電圧を決定し、単球/マクロファージを同定し、T細胞およびデブリを除外した。各実験の間に、各組織タイプの非染色制御を分析し、必要に応じてFSC-AおよびSSC-A電圧を調整した。電圧は、パラメータが急激に変化すると、サイトメーターの閉塞が発生する可能性が高い場合、時間の経過とともに同様のままになります。さらに、染色されていないコントロールを使用して死んだ/生きている汚れの真の陰性を決定し、ゲートは実験が行われるたびに調整された(図2A)。実験を設計する際には、蛍光色素を慎重に選択し、通常は発現が低い表面マーカーを明るい蛍光色素と組み合わせる必要があります(例えば、ここでは、CD206にAlexa Fluor 647を使用しました)。異なる波長で検出できる様々な死んだ/生きている汚れが存在する。ここで、FVS510 が使用されました。
図3 は、滑液組織から単離され、動物がDMMまたはシャムコントロール手術を受けてから6週間後に細胞外表面マーカーで染色された免疫細胞からのサンプルデータを示す。すべてのサブセットは、研究および制御動物の両方でプロトコルを使用して容易に識別することができる。特に、マクロファージサブセット(DMM群におけるLy-6C+/MHC-II-マクロファージ(G7)の割合が高い)およびM1およびM2マクロファージの発現(DMM群におけるM2マクロファージの割合が高い)について、群の違いが見られる。
図4 は、DMM処理動物の脾臓から単離された免疫細胞上の細胞外および細胞内T細胞パネルの階層的な格子構造を可視化した。原則は、単球パネルに使用されるものと同じです。しかし、固定および透過プロセスは、細胞のサイズと密度を変更します。したがって、一般的なFSCおよびSSCパラメータは、細胞タイプごとに実験を最初に設定する際にCD3+セルからのバックガッティングプロセスを使用して決定する必要があります。一部のフッ素色は、時間の経過とともに凝集する傾向があります(例えば、ここでFoxP3で使用されたPE)。スペクトルのオーバーラップと補正に影響を与える高輝度により、集計結果を修正できる可能性があります。したがって、すべての抗体は、凝集体を減少させるために、使用前に毎回渦を紡ぎ、スピンダウンした。さらに、凝集体(G2)の影響をさらに低減するために、ゲート方式を使用しました。実験を設定しながら、蛍光マイナス1コントロール(FMO)を各抗体について行った。サンプル データは図 2B,2Cに示します。
図5 および 図6 は、リンパ節(図5)および滑液組織(図6)から単離され、動物がDMMまたはシャムコントロール手術を受けた4週間後にT細胞パネルプロトコルを使用して染色された免疫細胞を示す。データは、両方の組織におけるDMM動物(G9)におけるTh1細胞のより高い割合を示す。さらに、T制御細胞(G11)およびTh17細胞(G12)の細胞内染色は、プロトコルを用いて成功し、グループ間の差異を検出することができる。
図1:細胞外染色を用いたフローサイトメトリー階層格言戦略で単球/マクロファージとそのサブセットを同定する。骨髄細胞は主に、前方/側散乱(FSC-AおよびSSC-A)ドットプロット(G1)を使用して同定されます。その後、FSC-AおよびFSC-H(G2)を用いてシングルを検出し、その後生細胞が選択される(G3)。G3の細胞はさらにLy-6Gを使用して分類され、単球/マクロファージ(G5a)の好中球(G4)およびCD11bを同定する。MHC-IIはCD11b陽性細胞の中で樹状細胞(G5b)を同定するために使用され、F4/80はマクロファージ(G6)と単球(G12)の間で選択するために使用される。マクロファージは、Ly-6C および MHC-II (Ly-6C+/MHC-II- マクロファージ (G7) を使用して、さらにそのサブセットに分類されます。Ly-6C-/MHC-II-組織常駐マクロファージ(G8);Ly-6C-/MHC-II+ 血液はマクロファージ(G9)を起源としている。より多くのサブセットは、CD206とCD80(M1:CD80+/CD206- (G10)を使用して、マクロファージの全体とそのそれぞれのサブセットから選択することができます。M2: CD80-/CD206+ (G11))。単球は、MHC-IIおよびCD11c(MHC-II-/CD11c-単球(G13)を用いてさらに分類される。MHC-II+/CD11c- 単球 (G14).次に、活性化レベルはLy-6Cの式を用いて分類され、低(G15)、中型(G16)及び高(G17)に分けられる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単球とT細胞パネルの両方で適切なコントロールを示すサンプルデータ。(A)滑液組織は、DMM手術(DMM)またはシャムコントロール手術(sham)のいずれかを行った後6週間で採取し、細胞外表面マーカーを用いて単一細胞懸濁液を染色した。各実験の間に染色されていない細胞は死んでいる/生きている汚れのための真の陰性を決定し、ゲートを設定するために使用された(制御)。未染色細胞を用いたゲートの設定は、パネルA(B+C)脾臓細胞を未処理の対照動物から採取し、細胞外および細胞内マーカーの両方を用いて単一細胞懸濁液を生成し染色した。蛍光マイナス1(FMO)コントロールは、抗体パネル全体で細胞を染色することによって生成された抗体が1つだけ欠落している。両方の細胞内抗体に対するサンプルデータが示されている。(B) FMO -RORgt および (C) FMO -フォックス-P3.FMOは両方のパネルに対して行われ、各ゲートを設定するために使用されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスの滑膜から単球/マクロファージの細胞外染色。サンプル組織は、マウスがDMM手術(DMM)またはシャムコントロール手術(sham)のいずれかを受けた6週間後に採取した。使用されたゲートに関する詳細は 、図 1を参照してください。サンプル データは、すべてのサブセットを確実に識別でき、グループ間で違いを確認できることを示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞外染色と細胞内染色の両方を使用したフローサイトメトリー階層格子戦略で、T細胞とそのサブセットを同定する。T細胞は主に、前方/側散乱(FSC-AおよびSSC-A)ドットプロット(G1)を使用して同定されます。利用された抗体凝集体の性質上、CD3およびCD4(G2)を使用して除外すべきである。その後、FSC-AおよびFSC-H(G3)を用いてシングルを検出し、その後生細胞が選択される(G4)。G4の細胞はさらにNK1.1を用いて分類され、T細胞(G6)を同定するために、ナチュラルキラー細胞(G5)およびCD3を同定する。活性化のレベルはCD69(G6b)を用いて決定される。その後、CD4およびCD8を使用してTキラー細胞(CD4/CD8+(G7))およびTヘルパー細胞(CD4+/CD8-(G8))を同定する。Tヘルパー細胞は、C-X-CR3(CD183)およびCCR4(CD194)を使用してTh-1(C-X-CR3+/CCR4-)およびTh-2細胞(C-X-CR3-/CCR4+)に分類される。また、Th-17細胞(CD25+/RORgt+(G11))およびT-調節細胞(CD25+/Fox-P3+(G12))は、細胞内マーカーを使用して同定されます。さらに、CD44 および CD62L (CD44-/CD62L+ ナイーブ T メモリ セル (G13) を使用して、T ヘルパー セルからメモリ セルサブセットを識別します。CD44+/CD62L+ 中央Tメモリセル (G14);CD44+/CD62L- エフェクター Tメモリセル (G15))。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウスのリンパ節の排出から単離されたT細胞の細胞外および細胞内染色。サンプル組織は、マウスがDMM手術(DMM)またはシャムコントロール手術(sham)のいずれかを受けた4週間後に採取した。使用されたゲートに関する詳細は 、図4を参照してください。サンプル データは、すべてのサブセットを確実に識別でき、グループ間で違いを確認できることを示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マウスの滑液組織から単離されたT細胞の細胞外および細胞内染色。サンプル組織は、マウスがDMM手術(DMM)またはシャムコントロール手術(sham)のいずれかを受けた4週間後に採取した。使用されたゲートに関する詳細は 、図4を参照してください。サンプル データは、すべてのサブセットを確実に識別でき、グループ間で違いを確認できることを示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルに記載されている方法は、変形性関節症(OA)のマウスモデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節、滑膜組織の中の単球/マクロファージおよびT細胞の両方から様々なサブセットを確実に同定するように設計され、テストされた。現在のプロトコルは、抗体を交換することによって異なる組織タイプ、または他の細胞タイプを調査するために容易に変更することができ、OAの代替マウスモデルに使用することができる。他の組織タイプを試験する場合、免疫細胞の表面マーカーの発現が各組織20に変化するとして、各抗体の特異性を試験することが重要である。また、抗体を交換する場合には、抗体の最適濃度を確立するとともに、スペクトル重複の変化に対処するための補償プロセスを繰り返す用量滴定曲線を行う必要がある。
現在のプロトコルでは、OAはDMMマウスモデル18を用いて誘導された。この種は、心的外傷後OA17の病態生理を調査する際に多重の利点を提供するので、最も一般的に使用され、確立された動物モデルは、マウスにあります。特にマウスにおいて、外科および非外科的OAモデルは17:最も一般的なのは、内側半月板(DMM)の不安定化、前十字靭帯(ACLT)および非外科的ACL破裂(ACLR)の外科的切除術、それぞれ21である。これらの動物モデルはすべて、心的外傷後OAの病理における細胞炎症の役割の調査に適しており、現在のプロトコルは、実験室で前述のすべての動物モデルについて試験に成功した。上記の動物モデルはすべて確立されており、文献に記載されていますが、それぞれが他の17 の他の場所で詳細に議論されている独自の長所と限界を持っているので、以下に簡単に説明します。すべての外科モデルは外科的アプローチ、創傷治癒プロセスおよび関連する炎症反応の対象である。心的外傷後OAの発達に対する炎症細胞の寄与を評価する場合、この炎症性創傷治癒応答は、特に介入後の初期の時点において、コンファウンダーとして役立つ可能性がある。さらに、DMMおよびACLTの手順は、動物間の変動を最小限に抑えるために、非常に標準化された方法で行う必要があります。ACLT手術はDMM手術よりも学ぶのがはるかに困難であり、ACLへの傷害のみを明確に識別して確実にし、他の関節組織18への吸気原性損傷を回避するためにDMMよりも大きな外科的暴露を必要とする。非外科的ACL破裂は、心的外傷後OAを誘導する標準化された非常に効率的な方法です。しかし、屈曲した膝の脛刺に制御された単一の圧縮負荷を適用する特殊な装置が必要である。このデバイスは、比較可能で信頼性の高い結果を得るために較正され、テストする必要があります。さらに、ACLRモデルは、ヒトを含む他の種のACL傷害では見られない後部内側脛骨高原22 の顕著な浸食を有するマウスにおいて非常に重度かつ進行性の関節損傷を誘発する。
OAの開発中に炎症過程とその細胞成分を総合的に特徴付けるためには、滑膜組織だけでなく、脾臓や骨髄などの副リンパ器官だけでなく、局所的なリンパ節も調べることができる。膝関節のリンパドレナージパターンは、膝関節から様々な分散23,24,24で腸骨および鼠砂リンパ節の両方を通るマウスおよびリンパ液で特徴付けられている。動物間の比較を容易にするために、我々は、このプロトコルで、インジュナルおよび腸骨リンパ節をプールすることを決定した。対照的に、膝に近い間、膝の後足を排出し、膝の炎症過程で役割を果たさない。
マウスは関節内関節滑液組織25 の少量を有し、ここでの免疫細胞の単離は依然として困難である。現在のプロトコルでは、滑液組織の収穫技術は、免疫細胞の最大数の単離を可能にするために適応された。したがって、収穫技術は、上頭蓋及び破砕部の凹部ならびに、その多数の免疫細胞26に起因する、破ばばんぼを含む。酵素の消化プロセスと選択は、腱を残しながら、滑膜および脂肪組織を完全に消化するように最適化され、膝蓋骨とその軟骨は障害を起こさずに行われた。このように、現在のプロトコルは、滑液組織から免疫細胞を収穫する再現可能な方法を導入する。
フローサイトメトリー分析は、OAの開発中に細胞の免疫プロセスを調査する際に複数の利点を有する;それにもかかわらず、この手法には制限があります。滑液組織内の免疫細胞の数が少ないため、少なくとも2匹の動物から組織サンプルをプールして1つのサンプルを得る必要がある。このプロトコルで使用されるフッ素クロムと色の数が多いため、各組織タイプのスペクトル重複の可能性を細心の注意を払う必要があり、この技術の使用を通じて一貫して再評価する必要があります。利用可能なマーカーの数が多く、特定の集団を同定するための研究間のかなりの変動のために、別の可能な制限は、細胞19を識別するために使用されるマーカーの選択である。フローサイトメトリーは、必ずしも全細胞に合算しない「事象」の定量化を可能にする。真の定量分析を得るためには、フロー解析を実行するときにカウントビーズを同時に取得するか、単一細胞懸濁液のセルを数えて絶対数を取得する必要があります(ここで行う)。一般に、このプロトコルの原理(フローパネルの設計と設定方法、または単一細胞懸濁液の調製に使用される技術)は、ヒトのサンプルに適合する可能性があります。しかしながら、ヒト免疫細胞の表面マーカーはマウス細胞とは異なるため、適切な抗体を選択して試験する必要がある。また、RBCの起液の持続時間および適切なバッファ量は、それが最も異なる可能性が最も高いように決定する必要があります。このプロトコルから他の種または組織にメソッドを適応させる前に、各ステップの綿密なテストは、メソッドが意図したとおりに動作していることを確認する必要があります。
その制限にもかかわらず、免疫細胞のフローサイトメトリー分析は、単一細胞レベルで単球細胞とT細胞サブセットの両方を同定することを可能にする強力な技術のままである。特に、現在のプロトコルは、滑液組織および二次リンパ器官におけるOAの発達中に細胞免疫応答を同定し、定量することができる信頼性の高い、再生可能な技術を導入する。将来的には、この技術は、様々な変形性関節症誘導動物モデルにおける免疫応答を特徴付け、以降、この衰弱性疾患に対する免疫調節薬の有効性を評価するのに役立つ可能性がある。
結論として、このフローサイトメトリープロトコルは、確立された外科的変形性関節症マウスモデルを利用したマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内の細胞外染色アッセイを使用して、単球/マクロファージおよびT細胞サブセットを同定するための詳細で再現可能な方法を記述する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
アンドリュー・リム博士とジャイルズ・ベスト博士のフローサイトメーターの設定に協力してくださったことに感謝します。このプロジェクトは、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG)(DFG-HA 8481/1-1)がPHに授与した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
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