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Biochemistry

免疫反応向上技術を用いた超高速ウェスタンブロット

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61657
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

Summary

超高速ウェスタンブロッティング技術は、免疫反応促進剤と組み合わせて、環状ドレインおよび補充(CDR)技術を介して抗原抗体結合の運動を改善することによって開発される。

Abstract

ウェスタンブロット(免疫ブロットとも呼ばれる)は、生物医学研究のための正規の方法です。これは、特定のタンパク質の相対的なサイズと存在量だけでなく、翻訳後のタンパク質修飾を決定するために一般的に使用されます。この技術は豊かな歴史を持ち、そのシンプルさのために広く使用されています。しかし、ウェスタンブロッティング手順は、スループットを制限する長いインキュベーション時間であるという重大なボトルネックで、完了までに数時間、さらには数日かかることで有名です。これらのインキュベーションステップは、バルク溶液から膜上の固定化された抗原への抗体の拡散が遅いために必要とされる:膜付近の抗体濃度はバルク濃度よりもはるかに低い。ここでは、抗体溶液の循環ドレインおよび補充(CDR)による抗原結合を改善することにより、これらのインキュベーション間隔を劇的に短縮するイノベーションを提示する。また、免疫反応増強技術を用いて、アッセイの感度を維持しました。市販の免疫反応増強剤とのCDR法の組合せは、出力シグナルを高め、抗体インキュベーション時間を実質的に短縮した。得られた超高速のウェスタンブロットは感受性の損失なしで20分で達成することができる。この方法は、化学発光と蛍光検出の両方を使用してウェスタンブロットに適用することができます。この簡単なプロトコルにより、研究者は多くのサンプルでタンパク質発現の分析をよりよく探求することができます。

Introduction

ウェスタンブロット(イムノブロットとも呼ばれる)は、幅広い科学的および臨床的分野にわたる強力で基本的な技術です。この技術は、タンパク質1の存在、相対的存在量、相対分子質量、および翻訳後修飾を調べるために使用される。デジタル画像解析と組み合わせることで、この方法はタンパク質およびタンパク質修飾の豊富さを確実に分析することができます2.ウェスタンブロットは日常的に行われますが、時間と労力を要する方法です。膜を有する抗体の長いインキュベーションが必要です。ここでは、感度を犠牲にすることなくこの制限を克服するインキュベーション法の改変について述べる。

膜のインキュベーション中、抗体は溶液中に浮遊し、抗原は膜上に固定化される。その高い親和性のために、抗体が抗原に結合する速度は、バルク溶液から膜への抗体の拡散よりも速い。これにより、低濃度の「枯渇層」が作成されます(図1)。この技術では、より遠い抗体が受動的拡散によって膜に到達するまでに数時間かかることがあります。この効果は、大量輸送制限(MTL)3と呼ばれます。抗体含有溶液の繰り返しの排水と補充は、枯渇層を破壊し、MTL4を克服する可能性が提案されている。ここでは、従来のウェスタンブロッティングプロトコルにおけるMTLの効果を減少させ、必要な潜伏期間を顕著に短縮するために、この循環ドレインおよび補充(CDR)概念を実装する独自の技術を考案しました。

短時間で検出感度を維持するために、抗原抗体反応を加速する免疫反応増強技術を用いて、シグナル対ノイズ比5を向上させた。市販の免疫反応増強剤(IRE)の多くは2成分から構成されている(溶液1および2、表の材料表参照)。IREの独自の組成または作用機序は明らかにされていないが、固相結合アッセイにおいてIREが抗原と抗体との間の解離定数を低下させることを以前に発見したが、少なくとも部分的には、IRE6の増強効果を担う親和性の増加を示す。CDRとIREの組み合わせは、感度を犠牲にすることなく、手順全体の時間を短縮する超高速ウェスタンブロッティングプロトコルを生み出します。

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Protocol

1. SDS-ページとPVDF膜への転送

  1. 相対サイズに基づいてタンパク質を分離するためにSDS-PAGEを行います。
    注:商用または自家製のゲルシステムは問題ありません。製造元のプロトコルに従ってください。
  2. 分離したタンパク質をゲルからPVDF膜に移す。
    注:一般的な転送方法(半乾式または湿式転送)が適しています。製造元のプロトコルに従ってください。

2. PVDF膜の遮断

  1. 膜を室温で撹拌して1時間適切なブロッキングバッファーにインキュベートします。
    注:一次抗体および検出システムに応じて、適切なブロッキングバッファを選択する必要があります。例えば、最も典型的なブロッカーはBSA、非脂肪乾燥乳、カゼイン、および市販の合成ポリマーである。Tween20 が 0.1% の PBS および TBS は、最も一般的に使用されるバッファーです。このブロッキング工程は、4°Cで一晩行なわれてもよい。

3. 一次抗体によるインキュベーション

  1. 蒸留水で10%免疫反応増強剤-1溶液(IRE-1)を調製する。渦はよく。
  2. 10%IRE-1で希釈された一次抗体を調製します。やさしく、十分に混ぜます。
  3. より大きな膜(4 cm x 8 cm - 8 cm x 8 cm)を使用する場合は、抗体溶液の8 mLを50 mL円錐形遠心分離管に加えます。より小さい膜(2 cm x 8 cm - 4 cm x 8 cm)を使用する場合、抗体溶液の3 mLを14 mLの丸底ポリプロピレンチューブ(材料表)に加える。
  4. ピンセットでPVDF膜を拾い、ブロッキング溶液を簡単に排出します。PVDF膜を手袋をした指でこのチューブに挿入し、膜全体がチューブの壁に付着していることを確認します。PVDF膜をチューブに挿入すると、もともとゲルに接触していた膜の「タンパク質側」に向かって、内側に向かいます。キャップをしっかりと閉じます。
  5. 50 mLチューブをガラス瓶に入れます。
    注:このインキュベーションに14 mLチューブを使用する場合は、50 mLチューブの中央にインナーチューブを保持するためにプラスチックリングホルダーのペアを使用して、50 mLチューブに14 mLチューブを挿入します。
  6. ハイブリダイゼーションオーブンをオンにします。
  7. 少なくとも5分間、6rpm回転で膜をインキュベートする。
    注:膜が常に壁に付着していること、および(内側の)チューブが抗体溶液で膜を均等に覆うために水平であることを確認してください。実際の実験の前に抗体の希釈とインキュベーション時間を較正します。

4. 膜洗浄

  1. 回転を停止します。
  2. ピンセットでチューブからPVDF膜を慎重に取り出し、50 mLのPBS-Tの容器に入れます。
  3. 膜をPBS-Tで短時間すすいでください。
  4. 気泡が出なくなるまで、蒸留水で容器内の膜をすすいでください。これは抗体の大部分を除去する。
  5. PVDF膜を容器から250 mLのPBS-Tを含むサラダスピナーに移します。
  6. ストレーナーバスケットをスピナーに入れます。蓋がしっかりと付けられていたことを確認します。
  7. スピナーをアクティブにし、約20〜30 sでそれを実行します。
  8. 溶液を捨て、蒸留水でスピナーの内側を簡単にすすきます。
  9. 250 mL の PBS-T を再度スピナーに加えます。
  10. 手順 4.6 と 4.7 を繰り返します。

5. 二次抗体を用いてインキュベーション

  1. 蒸留水で10%免疫反応増強剤-2溶液(IRE-2)を調製する。渦はよく。
  2. 10%IRE-2で希釈された二次抗体を調製します。やさしく、十分に混ぜます。
  3. ステップ3.3に記載されている抗体溶液およびチューブの体積を選択します。
  4. ピンセットでPVDF膜を拾い、溶液を簡単に排出します。手順 3.4 に記載されているように、PVDF 膜をチューブに挿入します。
  5. 50 mLチューブをガラス瓶に入れます。
  6. ハイブリダイゼーションオーブンをオンにします。
  7. 少なくとも5分間、6rpm回転で膜をインキュベートする。膜が常に壁に付着していること、および(内側の)チューブが抗体溶液で膜を均等に覆うために水平であることを確認してください。
    注: 実際の実験の前にインキュベーション時間を調整します。二次抗体が蛍光結合されると、暗所でインキュベーションを行う。

6. 膜洗浄

  1. 手順 4.1 ~ 4.10 に従います。

7. 画像の取得

  1. 化学発光検出
    1. 半移植柔軟フィルム(10 cm x 15 cm)を平らな表面に置きます。
    2. 5 mL チューブに化学発光基材の 2 つの成分を混合します。
    3. 混合基材の1.5mLを半移植柔軟なフィルムに直ちに移し、PVDF膜をその上に置きます。次いで、残りの基質溶液を膜上に移す。
    4. 半透明のフレキシブルフィルム上に混合基材を用いてPVDF膜を1分間インキュベートします。
    5. ピンセットでPVDF膜をピックアップし、基質溶液を簡単に排出します。
    6. 透明フィルムのペアの間に膜を挟みます。
    7. 化学発光モードで画像を取得します。
  2. 蛍光検出
    1. ピンセットでPVDF膜を拾い、溶液を簡単に排出します。
    2. 透明フィルムのペアの間に膜を挟みます。
    3. 蛍光モードで画像を取得します。
      メモ:ステップ7.1と7.2は、最大感度を確保するために、イメージングマシンに近接して実行する必要があります。
    4. バックグラウンドシグナルが高い場合、PBS-Tの80〜100 mLの容器内で洗浄工程を行い、10分リンスを一次抗体に対して3回、2次抗体に対して5分リンスを6回行う。
      注:10%のIRE溶液で希釈された一次抗体と二次抗体の両方を、感度6を失うことなく最大8〜10回使用できます。溶液は、最大1ヶ月間4°Cに保つ必要があります。

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Representative Results

この例は、ウェスタンブロット上の免疫増強技術と共にCDR法の有効性を示す。スタティックインキュベーションは、PVDF膜を抗体溶液と共にインキュベートした半透明のフレキシブルフィルムに対して行ったのに対し、CDRインキュベーションは膜および抗体溶液を含む回転チューブによるハイブリダイゼーションオーブン中であった(Movie)。 図2 は、ウェスタンブロット上の化学発光検出に必要な抗原量および抗体をそれぞれ示した。静的およびCDRインキュベーションの両方で、IRE溶液の使用は感度を高めました:IREは、静的条件下でß-アクチンを検出するために必要な細胞溶解物(抗原)の最小量を2.2μgから1.1μgに減少させ、CDRを使用して1.1 μgから0.275 μgにさらに減少しました(図2A)。同様に、抗6x Hisタグ抗体の最小濃度は、静的条件下では100 ng/mLから50ng/mLに、CDR条件下では100 ng/mLから12.5ng/mLに低下した(図2B)。5分または10分のCDRインキュベーションは、静的インキュベーション(一次抗体で60分、二次抗体で30分)と比較して検出限界を劇的に下げた。最後に、CDRとIREの組み合わせは、この非常に短いインキュベーション期間内であっても、ウェスタンブロット(ß-アクチン検出用の0.275 μgの細胞ライセートおよび抗6x Hisタグ抗体の12.5 ng/mL)に対する優れた感受性を明らかにした。

2番目の例は、この方法を蛍光検出を伴うウェスタンブロットへの応用に成功したことを示しています(図3)。蛍光検出は、化学発光検出とは対照的に、抗体を除去/再探査することなく、同じブロット上の複数の標的を同時に検出する独自の能力を有する。(彼)細胞ライセート中の6つのタグ付きAPとß-actinは、2色のフルオロフォアを用いて同時に検出された。IREによるCDRインキュベーションは、検出を加速するだけでなく、感度を増加させ、(His)6タグ付きAPのマスク解除を行った(図3A)。

Figure 1
図1:循環排水補充(CDR)法の概略図。
(A)プローブが抗原に対する親和性が高いが溶液を拡散する能力が限られているとき、膜の近くの枯渇層は、静的条件下で急速に形成される。これにより、プローブを膜に移動することは、速度制限ステップとなり、長いインキュベーション時間は、物質移動制限を補う。(B)膜が壁に付着している間にチューブを回転させることによりCDR法は、枯渇層を排除し、同じプローブ溶液を補充して、膜付近のプローブ濃度を一定に保つ。この図は東ら 6 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:(A)異なる量の293細胞ライセート(8.8μg/laneからの1:2連続希釈)をSDS-PAGEによって分離し、続いてPVDF膜に移し、PBS-Tで5%スキムミルクでブロッキングした。ブロットをマウス抗ß-アクチン抗体(1:3,000希釈)でプローブした。(B)pAPTAG5(GenHunter)を含むpAPTAG5(GenHunter)を含む293細胞の感染に由来するコンディションされた培地を分離した後、タンパク質をPVDF膜に転写した。各膜は、異なる濃度の抗6x Hisタグ抗体(400 ng/mLから1:2連続希釈)を有するウェスタンブロットを施した。膜は単一の画像として画像化され、点線は個々の膜の境界を示す。この図は東ら 6 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:IREと組み合わせた蛍光検出とCDRを用いたウェスタンブロット上の複数の標的の同時検出。
pAPTAG5をトランスフェクトした293個の細胞からの異なる量のライセート(10μg/laneからの1:2の連続希釈液)を分離し、PVDF膜に移した。蛍光検出用ブロッキングバッファー(BFD)を1時間ブロックした後、ブロットを抗6X Hisタグおよび抗ßアクチン抗体でプローブし、IRDye 800CWヤギ抗ウサギIgGおよびIRDye 680RDヤギ抗マウスIgGを続けた。A:CDR条件下で10%IRE溶液で希釈した抗体、B:0.1%Tween20を含むBFDで希釈された抗体は、静的条件下で。CDR と IRE の組み合わせで感度が高いため、(His)6タグ付き AP の劣化が見られました。この図は東ら 6 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:従来の静的方法と比較して、強化された超高速CDRウェスタンブロットの模式図。
この図は東ら 6 から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ウェスタンブロットは、約40年前に開発された特定のタンパク質を検出するために広く使用されている分析技術です7,8.それ以来、技術は進化し続けており、その後の技術革新により、技術2、9、10、11、12、13の感度、速度、定量性が向上しています。ここで紹介する強化された超高速ウェスタンブロッティングプロトコルは、既存の技術にいくつかの大幅な強化を行います。IREによる検出閾値を下げることにより、感度を犠牲にすることなくインキュベーション時間を短縮します。特別なまたは高価な機器は必要ありません:ハイブリダイゼーションオーブンでチューブを回転させることは、MTLを克服するのに十分です。重要な技術革新は、CDRが効果的にアッセイの枯渇層を排除することです。一般的に、ローラー培養装置は溶液量を減らすために採用されているが、MTLを克服し、インキュベーション時間を短縮するこの方法の可能性は示されていない。全体の手順のための全体の時間の大幅な減少のために(図4)、ブロックされた膜が手に入っている場合、1日あたりのウェスタンブロットデータの量がはるかに多く得ることができ、従来のウェスタンブロッティングプロトコルではそうすることはほとんど不可能です。ロッキングプラットフォームシェーカー上の膜のインキュベーションは、静的インキュベーション4,6と同等であることを留意すべきである。大量の洗浄液を用いた家庭用の市販サラダスピナーでPVDF膜を洗浄すると、手順の持続時間も短くなる(図4)。

このプロトコルの使用は、IRE溶液とインキュベーション時間を用いて抗体希釈の最適化に依存しています。IREとの組み合わせでCDRが感度を大幅に増加させるため、アッセイの冒頭で幅広い範囲の抗体滴定が推奨される(図2)。インキュベーション時間は、考慮されるべきもう一つの要因です。静的条件下で一次抗体を用いた1hインキュベーションで良好なウェスタンブロット結果がある場合、一般的にCDR条件下でインキュベーション時間を5〜10分に短縮することができます。例えば一次抗体で夜間インキュベーションが必要な場合、少し長いCDRインキュベーション時間(30分~6時間)を評価する必要があります。二次抗体による希釈およびインキュベーション時間もまた重要です。CDR条件下で30分を超えるインキュベーションは、通常、より高い背景を与える。したがって、CDRインキュベーションの最大30分で二次抗体の慎重な滴定が必要です。抗体の注意深い滴定後にバックグラウンドシグナルが高い場合、広範な洗浄工程(10分リンス10回、洗浄液の80〜100mLの容器内の二次抗体の場合は5分6回)を行う必要があります。

ウェスタンブロットデータの品質は、多くの場合、使用される抗体に依存します。ウェスタンブロットに使用するのが難しい抗体を持っていたとき、タンパク質マーカーは、慎重な抗体滴定と広範な洗浄の後でさえも実質的なシグナルを示すことがありました。IREを用いたCDR法は非特異的結合を増加させる傾向にあることに気づいたので、抗体希釈剤にブロッキング試薬(スキムミルクなど)を添加すると、シグナル対ノイズ比14が向上する可能性がある。それは時間のかかるスクリーニングステップですが、試してみる価値があります。

ウェスタンブロットは、定量的なアプリケーション2のために重要になっています。半定量は、化学発光検出で行うことができます。ここで示す手順は、このエンド6へのストリッピングと再調査に適用されます。より広いダイナミックレンジのため、蛍光検出が最良の選択肢です。このプロトコルを用いて、蛍光検出は定量分析用の線形ダイナミックレンジを提供する6.蛍光検出によるCDRインキュベーション時間は、化学発光検出よりも長いように見えることを言及する価値があります。

ウエスタンブロットは幅広い用途を持ち、タンパク質の豊富さ、タンパク質とタンパク質の相互作用、翻訳後の修飾を研究するための普遍的な方法です。例えば、このプロトコル14で、抗炭水化物抗体をウェスタンブロットに簡単に使用できます。ウイルス、細菌、およびfugusの外表面に発現する様々な炭水化物部分は病原体特異的であるため、病原体の認識と感染症の診断のための貴重な標的です。したがって、この単純なプロトコルの適用は、実験だけでなく、ウェスタンブロッティング技術に依存する臨床免疫診断だけでなく、待ち時間の多くの分野に影響を与える可能性があります。

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Disclosures

著者らは、この記事の内容に直接関係する競合する利益を宣言していません。

Acknowledgments

この研究は、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の壁内研究部門によって支援されました。S.H.は日本の官民パートナーシップ学生留学プログラムの支援を受け、H.N.とK.Y.は武勇とVドラッグ海外研修奨学金を受けた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap Falcon 352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers N/A N/A Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600 Azure Biosystems Azure 600 Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution TOYOBO NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk Carnation N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep GE Healthcare NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey GE Healthcare NA9340V
HYBAID Micro-4 N/A N/A Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size Millipore Sigma IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LICOR 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LICOR 926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate seracare 5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody Millipore Sigma A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS) LICOR 927-40100 Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner OXO 32480V2B Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film Bemis Parafilm M PM996 semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes Falcon 352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube N/A N/A Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody Abcam ab9108
Tween20 Millipore Sigma P2287

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References

  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
  3. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
  4. Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
  5. Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
  6. Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  8. Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
  9. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

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生化学、問題163、ウェスタンブロット、イムノブロット、ケムイルミネッセンス、蛍光、免疫反応増強剤、質量輸送制限
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