Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

Gecombineerde ozon- en bacteriële endotoxine blootgestelde muizen vertonen wijdverspreide celdood, waaronder die van neutrofielen. We zagen cellulaire aanpassingen zoals verstoring van cytoskelet lamellipodie, verhoogde cellulaire expressie van complexe V ATP synthase subeenheid β en angiostatine in broncho-alveolaire lavage, onderdrukking van de immuunrespons van de longen en vertraagde neutrofiele rekrutering.

Abstract

Longen worden voortdurend geconfronteerd met directe en indirecte beledigingen in de vorm van steriele (deeltjes of reactieve toxines) en infectieuze (bacteriële, virale of schimmel) ontstekingsaandoeningen. Een overweldigende gastheerreactie kan leiden tot gecompromitteerde ademhaling en acuut longletsel, dat wordt gekenmerkt door long neutrofiele rekrutering als gevolg van de patho-logische gastheer immuun,coagulatieve en weefsel remodellering respons. Gevoelige microscopische methoden om muriene long cellulaire aanpassingen te visualiseren en te kwantificeren, als reactie op lage dosis (0,05 ppm) ozon, een krachtige milieuverontreinigende stof in combinatie met bacteriële lipopolysaccharide, een TLR4-agonist, zijn cruciaal om de ontstekings- en reparatiemechanismen van de gastheer te begrijpen. We beschrijven een uitgebreide fluorescerende microscopische analyse van verschillende long- en systemische lichaamscompartimenten, namelijk de broncho-alveolaire lavagevloeistof, long vasculair perfusaat, linkerlong cryosecties en sternaal beenmergperfusaat. We tonen schade van alveolaire macrofagen, neutrofielen, longparenchymweefsel, evenals beenmergcellen in correlatie met een vertraagde (tot 36-72 uur) immuunrespons die wordt gekenmerkt door discrete chemokinegradiënten in de geanalyseerde compartimenten. Daarnaast presenteren we long extracellulaire matrix en cellulaire cytoskelet interacties (actine, tubuline), mitochondriale en reactieve zuurstofsoorten, anti-coagulatie plasminogen, zijn anti-angiogene peptide fragment angiostatine, de mitochondriale ATP synthase complex V subunits, α en β. Deze surrogaatmarkers, aangevuld met adequate in vitro celgebaseerde assays en in vivo dierbeeldvormingstechnieken zoals intravitale microscopie, kunnen essentiële informatie verschaffen om de longrespons op nieuwe immunomodulerende middelen te begrijpen.

Introduction

Acuut longletsel (ALI) is een cruciale pathologische reactie van de longen op infectieuze of andere schadelijke stimuli die wordt gekenmerkt door gelijktijdige activering van coagulatieve, fibrinolytische en aangeborenimmuunsysteemen 1. Neutrofielen voelen onmiddellijk microbiële en intracellulaire schadepatronen door de Toll-achtige receptor (TLR) familie2,3,4. Neutrofielen geven voorgevormde cytokinen en cytotoxische korrelinhoud vrij, die vervolgens bijkomende weefselschade kunnen veroorzaken. De daaropvolgende alveolaire schade wordt ontsierd met secundaire celdood die leidt tot het vrijkomen van moleculen zoals adenosinetrifosfaat (ATP)5, waardoor een vicieuze cirkel van immuundysregulatie ontstaat.

Een onopgelost probleem in het begrip van ALI heeft betrekking op de vraag hoe de verwonding wordt geïnitieerd binnen het alveolaire membraan. Het elektronentransportcomplex V, F1F0 ATP synthase, is een mitochondriaal eiwit waarvan bekend is dat het alomtegenwoordig wordt uitgedrukt op het plasmamembraan van cellen (inclusief endotheel, leukocyten, epitheel) tijdens ontsteking. Het celcytoskelet dat bestaat uit actine en tubuline, herbergt veel celvorm en functiemodulerende en mitochondriale eiwitten, respectievelijk. We hebben onlangs aangetoond dat blokkade van de ATP-synthase door een endogene molecule, angiostatine, neutrofiele rekrutering, activering en lipopolysaccharide (LPS) veroorzaakte longontstekingdempt 6. Zo kunnen zowel biochemische (ATP synthase) als immuun (TLR4) mechanismen de alveolaire barrière reguleren tijdens longontsteking.

Blootstelling aan ozon (O3), een milieuverontreinigende stof, tast de longfunctie aan, verhoogt de gevoeligheid voor longinfecties en korte lage niveaus van O 3-blootstellingen verhogen het risico opsterfte bij mensen met onderliggende cardiorespiratoire aandoeningen7,8,9,10,11,12,13,14. Blootstelling aan fysiologisch relevante concentraties van O3 biedt dus een zinvol model van ALI om fundamentele ontstekingsmechanismen te bestuderen7,8. Ons lab heeft onlangs een murien model van lage dosis O3 geïnduceerde ALI15. Na het uitvoeren van een dosis en tijdrespons op lage O3-concentraties, merkten we op dat blootstelling aan 0,05 ppm O3 gedurende 2 uur acute longschade veroorzaakt die wordt gekenmerkt door long-ATP-synthasecomplex V-subeenheid β (ATPβ) en angiostatineexpressie, vergelijkbaar met het LPS-model. Intravitale longbeeldvorming onthulde desorganisatie van alveolaire actinemicrofilamenten die wijzen op longschade, en ablatie van alveolaire septale reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus (wat wijst op abrogatie van baseline celsignalering) en mitochondriaal membraanpotentieel (wat wijst op acute celdood) na 2 uur blootstelling aan 0,05ppm O315 die correleerde met een heterogene long18FDG-retentie 16 , neutrofiele werving. De boodschap van onze recente studies is dat O3 exponentieel hoge toxiciteit produceert bij blootstelling aan concentraties onder de toegestane limieten van 0,063 ppm gedurende 8 uur (per dag) voor blootstelling bij de mens. Belangrijk is dat er geen duidelijk begrip bestaat over de vraag of deze subklinische O3-blootstellingen TLR4-gemedieerde mechanismen kunnen moduleren, zoals door bacterieel endotoxine17. Zo bestudeerden we een dual-hit O3- en LPS-blootstellingsmodel en observeerden we de immuun- en niet-immuun cellulaire aanpassingen.

We beschrijven een uitgebreide fluorescerende microscopische analyse van verschillende long- en systemische lichaamscompartimenten, namelijk de broncho-alveolaire lavagevloeistof (d.w.z. BAL) die de alveolaire ruimten, het long vasculaire perfusaat (d.w.z. LVP) bemonstert dat de long vasculatuur en het alveolaire septale interstitium bemonstert in het geval van een aangetaste endotheelbarrière, linker long cryosecties, om te kijken naar ingezeten parenchymale , perifeer bloed dat de circulerende leukocyten en het sternale en dijbeenmerg perfuseert dat de proximale en distale plaatsen van hematopoëtische celmobilisatie tijdens ontsteking bemonstert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het onderzoeksontwerp werd goedgekeurd door de Animal Research Ethics Board van de Universiteit van Saskatchewan en voldeed aan de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care voor humaan diergebruik. Zes-acht weken oude mannelijke C57BL/6J muizen werden aangeschaft. OPMERKING: Euthanaseer dieren die vóór het geplande eindpunt ernstige lethargie, ademhalingsproblemen of andere tekenen van ernstige nood ontwikkelen.

OPMERKING: Bereid het volgende voor: 27-18 G naald-stomp (hangt af van de diameter van de muis luchtpijp), de juiste grootte PE-buizen voor de stompe naald (maak een PE canule voor elke muis), canule, 2 scherpe scharen, 2 stompe tangen (klein), 1 scherpe tang (klein), 3 1 ml spuiten, gelabelde microfuge buizen (voor BAL, bloed, vasculaire en beenmerg perfusate collectie) en gelabelde Alle chemicaliën die voor de experimenten worden gebruikt, zijn aangegeven in de tabel met materialen.

1. Ozon- en LPS-blootstellingen voor inductie van murien longletsel

  1. Blootstelling aan ozon
    1. Bereid een aangepaste O3 inductiebox voor. Voeg muizenvoer, waterfles, verrijkingsspeelgoed en schoon beddengoed toe om de woonomgeving van de muizen na te bootsen.
      OPMERKING: Deze stappen zorgen ervoor dat de muizen vrije toegang hebben tot voedsel en water wanneer ze in de aangepaste inductiebox worden ondergebracht en helpen onnodige stress te verlichten.
    2. Schakel de O 3-kalibrator/generator "ON" (in de richting van de inlaatpoort) om de UV-lamp voor de hand te stabiliseren (ongeveer 15 minuten voor blootstelling) en sluit aan op de in-line O3-monitor.
      OPMERKING: De O3-monitor moet gemiddeld 0,05 ppm aflezen, zoals bemonsterd uit de uitlaat bij constante kamertemperatuur (72 ±3 °F) en relatieve vochtigheid (50±15%).
    3. Plaats voor O3-belichtingen voorzichtig muizen in de aangepaste inductiebox en stel de muizen continu bloot aan 0,05 ppm O3 gedurende 2 uur.
  2. Anesthesie en intranasale LPS-toediening
    1. Bereid 10 mg/ml voorraden voor ketamine en xylazine afzonderlijk.
    2. Bereid een cocktail door 20 delen ketamine en 1 deel xylazine te mengen. Als de muis X g weegt, injecteert u (X/200) ml ketamine/xylazinecocktail in de buikholte. Bereid voor één muis 1 ml cocktail bestaande uit 1000 μL van de ketaminevoorraad van 10 mg/ml en 50 μL van de xylazinevoorraad. Meng goed door op en neer te pipetten in een microfuge buis.
      OPMERKING: De ketamine- en xylazinevoorraden kunnen een week van tevoren worden bereid.
    3. Verdoof de muizen onder lichte intraperitoneale (IP) ketamine (50 mg/kg)/xylazine (1 mg/kg) mix (bijv. voor een muis van 25 g, injecteer 0,125 ml van de cocktail).
    4. Bereid een 1 mg/ml oplossing lps, in zoutoplossing, en vul 50 μL van de oplossing in een pipet.
    5. Houd de muis rechtop met zijn rug/rugzijde op de handpalm en houd de oren met dezelfde hand vast. Plaats nu 50 μL van de LPS-oplossing18 voorzichtig buiten de neusgaten (d.w.z. 25 μL op elk neusgat of 50 μL in één neusgat; maakt niet uit zolang de procedure snel is) en laat de muizen de LPS-oplossing inademen.
    6. Instill controlemuizen met 50 μL steriele zoutoplossing.
      Let op: Niet meer dan 100 μL overschrijden voor instillatie, wat fataal kan zijn. Te weinig volume (d.w.z. <50 μL) en er bestaat een risico op alleen nasale depositie.
    7. Leg na de toediening van LPS de muizen voorzichtig neer, hetzij op hun buik, hetzij op hun rug op de hoop beddengoed met hun hoofd iets naar beneden gericht.
      OPMERKING: Deze oriëntatie verlengt het vasthouden van de oplossing in de neusholte19.
    8. Verdoof de muizen na de blootstelling met een volledige dosis ketamine (200 mg/kg)/xylazine (4 mg/kg) (d.w.z. X/50 ml van de cocktail, waarbij X het muisgewicht in gram of 0,50 ml is voor een muis van 25 g).
    9. Observeer de muis totdat deze het bewustzijn en de juiste reflex verliest (d.w.z. niet terugdraait wanneer hij in liggende positie wordt gelegd). Controleer nu de muis op diepte van anesthesie, door de ademhaling (ritmische borstexcursies) en hartslag te controleren, die merkbaar zouden moeten vallen, na 1-2 minuten.
    10. Controleer vervolgens op pedaalreflexen, d.w.z. knijp in een van de cijfers van de achterpoten en observeer of het ledemaat is ingetrokken, als een reflex. Als de muis reageert, vul dan indien nodig bij met extra injecties van 0,1 ml of meer.
      OPMERKING: Om diepe anesthesie te bereiken, moet u er rekening mee houden dat bepaalde stammen of zwaarlijvige muizen meestal een groter distributievolume hebben en dus gemakkelijk kunnen worden overgedoseerd, als voldoende tijd niet is toegestaan voor volledige anesthesie (wat ongeveer 10 minuten of meer kan zijn). Dienovereenkomstig kunnen sommige stammen bestand zijn tegen anesthesie en dus meer aanvullingen vereisen. Deze kennis wordt opgedaan na vele praktische observaties en ervaring met muizen van verschillende stammen en leeftijd. Aangezien er ook een paar proefexperimenten werden uitgevoerd direct na blootstellingen met O3 en LPS (d.w.z. op het tijdstip van 2 uur), hebben we ook enkele zeer vroege BAL-celanalyses uit die experimenten opgenomen om de onmiddellijke effecten van de gecombineerde blootstelling aan O3en LPS te benadrukken.

2. Monsterverzameling

  1. Plaats de muis op een operatielade. Smeer nu voorzichtig de oogzalf op beide ogen om vochtverlies te voorkomen en reinig de muis met 70% ethanolspray.
    1. Maak kleine sneetjes door de bovenste en onderste huidmembranen met een schaar, om de luchtpijp en thorax bloot te leggen.
    2. Maak een snee net onder het borstbeen en stel het hart bloot.
  2. Hartpunctie
    1. Plaats een 25G-naald bevestigd aan een geïpariniseerde spuit in de rechterventrikel en neem bloed af door een hartpunctie.
      OPMERKING: Bloed trekt meestal met minimale zuigertrek, als de tijd van het blootstellen van het hart aan een hartpunctie minder dan een minuut is. Na het verzamelen van ongeveer 0,4-0,5 ml, moet men mogelijk een paar seconden pauzeren voordat het resterende bloed wordt verzameld. Dit wordt gedaan om het hart het resterende volume in de rechter ventriculaire kamer te laten pompen. Tegen het einde van de bloedafname stopt het hart om te pompen.
    2. Verzamel het bloed en bewaar het in microfuge buizen voor verdere verwerking.
  3. Tracheostomie
    1. Gebruik voorzichtig een pincet/stompe tang om het luchtpijpgebied vrij te maken van overtolkelijk weefsel. Gebruik gehandschoende handen meer dan de chirurgische instrumenten om bloedingen te voorkomen. Als er veel bloed sijpelt, bestaat het risico dat de BAL-monsters besmet raken. Gebruik indien nodig wattenstaafjes, hoewel dit niet de voorkeur heeft. Kimwipes zijn betere alternatieven.
    2. Snij door de ribbenkast om de longen bloot te leggen. Nogmaals, wees voorzichtig om het borstbeen en de intercostale slagaders of de oplopende aorta niet te snijden; kleinere sneden maken terwijl u door de ribbenkast gaat)
    3. Geef een katoenen ligatuur door onder de luchtpijpsnip en laat deze voorlopig als zodanig staan.
    4. Knip de luchtpijp op een geschikte plaats in het distale 1/3rd gedeelte, wijzend naar de longen, om toegang te krijgen tot een 28 G luchtpijp canule.
    5. Steek een 28 G PE canule (een minimale lengte van 3-5 mm en distaal uiteinde bijgesneden voor het inbrengen) in de luchtpijp. Kijk uit voor het einde van de luchtpijp voor bifurcatie en trek vervolgens ongeveer een mm naar achteren om te voorkomen dat alleen een enkele kwab wordt bemonsterd.
    6. Bind de katoenen ligatuur stevig vast om de canule op zijn plaats te houden. Laat de canule niet instorten.
  4. Broncho-alveolaire lavage (BAL)
    1. Vul 0,5 ml PBS in een spuit van 1 ml.
    2. Injecteer nu geleidelijk 0,5 ml PBS in de canule met behulp van een spuit van 1 ml.
    3. Na het injecteren van PBS, aspireer de spuit zolang deze niet bestand is tegen de zuigkracht.
      OPMERKING: Als er weerstand is tijdens het aspireren van de BAL-vloeistof, duidt dat op instorting van het alveolaire of bronchiale weefsel. Trek in dat geval de canule terug met een minuscuul om de canule los te maken van de wanden van het weefsel.
    4. Verzamel de aangezogen vloeistof in een gelabelde microfugebuis en plaats deze op ijs.
    5. Voer nog twee lavages op vergelijkbare wijze uit en verzamel ze in dezelfde flacon (d.w.z. in totaal 0,5 X 3 = 1,5 ml lavage).
    6. Meet het volume van de verzamelde BAL-vloeistof. Lavage recovery moet bijna 90% zijn.
  5. Long vasculair perfusaat (LVP)
    1. Snijd de dalende thoracale aorta op een plaats tussen de borst- en buikhelften, om een back-up van perfusaat in de longen te voorkomen terwijl u door de rechterventrikel perfusing.
    2. Vlek de holte in de buurt van het gesneden aorta-uiteinde, vrij van bloed.
    3. Doordrenk vervolgens de longen met 0,5 ml gemanoïneerde zoutoplossing in de kamertemperatuur die door de rechterventrikel wordt geïnjecteerd.
    4. Verzamel het vasculaire perfusaat uit de holte aan het snijeinde van de dalende thoracale aorta, in een microfugebuis, geplaatst op ijs en meet het volume.
    5. Ligateer de rechter bronchus proximaal aan zijn vertakking van luchtpijp (met katoendraad).
  6. In situ linker longfixatie
    1. Sluit een spuit van 1 ml aan op de luchtpijp canule, die lang genoeg is om door de vorige luchtpijpincisie te steken.
    2. Trek lucht terug in de spuit tot 0,6 ml markering.
    3. Vul vervolgens de resterende spuit (tot het einde) met 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de zuiger klaar is om eruit te springen zonder lucht uit de canule terug te zuigen.
    4. Bevestig de spuit nu met een plakband op een rechtopstaande container, gemeten tot 20 cm hoogte.
    5. Trek voorzichtig de zuiger eruit om de fixatieve naar de luchtpijp te laten stromen. Als er een paar luchtbellen in de canule zitten, plaats de zuiger dan voorzichtig op de spuit en de vloeistof begint na een paar seconden te stromen.
    6. Laat de linkerlong ter plaatse tot zijn totale capaciteitopblazen, gedurende 5 minuten, vanaf een hoogte van 20 cm en vorm een waterkolom van 20 cm.
    7. Zorg er tijdens deze procedure voor dat de juiste longlobben worden beschermd tegen contact met paraformaldehyde, omdat dit de downstream-assays zal beïnvloeden.
    8. Plaats gevouwen laboratoriumweefsels om paraformaldehyde te absorberen dat in contact kan komen met de juiste longlobben.
      LET OP: Paraformaldehyde is zeer giftig. Adem daarom niet in of plaats geen contact met blootgestelde delen van het lichaam. Wees uiterst voorzichtig tijdens het hanteren.
    9. Reinig tijdens de tijd van paraformaldehyde-instillatie de buik.
    10. Snijd de juiste longlobben van de luchtpijp en verwijder alle draad en plaats de lobben onmiddellijk in een gelabeld cryoviaal en laat deze vallen in vloeibare stikstof voor downstream moleculaire /biochemische cytokine-analyse / RT-PCR / western vlekanalyse van longhomogenaat.
    11. Trim de linkerlong voorzichtig voor bindweefsel of pleurale membranen en dompel deze gedurende 24 uur bij 4 °C in 2% paraformaldehyde.
    12. Sluit de vaste long in paraffine in volgens het standaard inbeddingsprotocol.
      Let op: Verwarm de longmonsters niet te veel.
    13. Snijd het buikgedeelte af en onthuid het van het bekken (heup)bot.
    14. Scheid de linker- en rechter dijbeenderen van het bekkengedeelte, in een met zoutoplossing gevulde petrischaal die op ijs wordt bewaard.
  7. Sternale en femur beenmerg aspirate collectie
    1. Reinig het weefsel en de spieren van de botten met behulp van laboratoriumweefsels.
    2. Verzamel het ventrale ribbenkast en borstbeen in een met zoutoplossing gevulde Petrischaal die op ijs wordt bewaard.
    3. Snijd de distale en proximale uiteinden van de sternale en dijbeenderen.
    4. Doordrenk de botten 4 keer met 0,5 ml zoutoplossing, gebruik goed aangebrachte naalden (24 tot 28 G) op spuiten van 1 ml en verzamel de fracties van elk bot in gelabelde buizen die zijn uitgerust met filters en op ijs zijn geplaatst.
      OPMERKING: De naaldmaat varieert per diergrootte. Na het spoelen moet het dijbeen transparant verschijnen.
    5. Zodra de monsters zijn verzameld, stopt u de muis in een plastic zak en plaatst u deze in een vriezer voor dierkarkassen voor een goede verwijdering, volgens de richtlijnen van de institutionele dierenfaciliteit.

3. Monsterverwerking

  1. Totaal (TLC) en differentieel (DLC) leukocytentellingen
    1. Centrifugeer perifere bloed-, BAL-, long vasculaire perfusaat- en beenmergmonsters (sternaal en dijbeen) gedurende 10 minuten bij 500 g.
    2. Verzamel de supernatanten, flash freeze ze en bewaar ze bij -80 °C tot verdere analyse.
    3. Reconstitueren van de cellen in minimaal 200 μL PBS.
    4. Voer TLC uit door BAL, bloed, long vasculair perfusaat en beenmergcellen te tellen op een hemocytometer.
    5. Beits nog eens 9 μL aliquot BAL met een 1 μL mix van calceïnegroen en rood ethidium homodimeer-1 om levende (groene) cellen te kwantificeren als gevolg van intracellulaire esteraseactiviteit en beschadigde BAL-cellen (in rood) als gevolg van verlies van plasmamembraanintegriteit.
    6. Voeg 2% azijnzuur toe aan lyse RBCs, in een 1:10 verhouding voor bloed TLC en 1:2 verhouding voor long vasculairperfusaat TLC.
      LET OP: Pas de celconcentraties aan door te verdunnen in PBS als de concentratie meer dan 1x106 cellen per ml bedraagt (zeer belangrijk voor de beenmergmonsters).
    7. Centrifugeer de cellen om cytospinen op dia's en vlekken te bereiden, zoals hieronder uitgelegd voor DLC's. Tel minimaal 100 cellen voor differentiële leukocytenceltellingen (DLC's).
      OPMERKING: Meestal kan men twee cytospins op één dia bereiden. En na 10-15 minuten luchtdrogen, ga verder met het kleuren van de stap.
    8. Splits de verzamelde BAL van drie pilotmuizen per groep in twee cytospinen elk en vlek voor actine/tubuline en mitochondriën met actieve oxidatieve fosforylering (verminderde mitotracker). Gebruik de BAL van nog drie muizen om elk in twee cytospinnen te splitsen, voor NK1.1/Gr1/CX3CR1 en ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatine bevlekte dia's. Splits de BAL van nog drie muizen in twee cytospinen om te beitsen voor ATPα/Ly6G en CX3CR1/Siglec-F.
  2. Bronchoalveolaire lavage (BAL) en long vasculair perfusaat (LVP) totale eiwitkwantificering
    1. Om O3- en LPS-geïnduceerde verstoringen van de vasculaire barrière of de relatieve oncotische druk in de twee longcompartimenten (d.w.z. het alveolaire septum (interstitiële) en long vasculaire perfusaat (vasculaire) compartimenten te kwantificeren, meet u het totale eiwitgehalte in de verzamelde vloeistoffen.
    2. Analyseer de ontdooide supernatantfracties voor hun totale eiwitconcentratie met behulp van een standaard wasmiddelbestendige colorimetrische test.
    3. Bronchoalveolaire lavage (BAL) en long vasculair perfusaat (LVP) chemokine analyse
      1. Analyseer vervolgens de chemokinen in BAL en long vasculair perfusaat (LVP) supernatanten met behulp van een 33-plex magnetische kraalgebaseerde immunoassay. Dit zal informatie geven over de directionaliteit van luchtweg/interstitium versus vasculaire chemokinegradiënten die zijn vastgesteld na gecombineerde blootstellingen.
      2. Analyseer het volgende panel van chemokinen : CXCL13 (B-lymfocyt chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epitheel-afgeleide neutrofiel-activerende peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-2 (CCL-2), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-2), CCL-2 (CCL-2) IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukine-10), IL-16 (interleukine-16), IL-1β (interleukine-1 bèta), IL-2 (interleukine-2), IL-4 (interleukine-4), IL-6 (interleukine-6), CXCL-10 (interferon gamma-geïnduceerd eiwit 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-induceerbaar eiwit 9 (IP-9)), KC (keratinocyt chemoattractant), MCP-1 (monocyt chemoattractant eiwit-1), MCP-3 (monocyt chemoattractant eiwit-3), MCP-5 (monocyt chemoattractant eiwit-5), MDC (macrofaag-afgeleide chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrofaag inflammatoire eiwit-1 alfa), MIP-1β (macrofaag inflammatoire eiwit-1 bèta), MIP-2 (macrofaag inflammatoire eiwit-2), MIP-3α (macrofaag inflammatoire eiwit-3 alfa), MIP-3β (macrofaag inflammatoire eiwit-3 bèta), RANTES (gereguleerd op activering, normale T-cel uitgedrukt en afgescheiden (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromale cel-afgeleide factor 1), TARC (thymus en activering gereguleerde chemokine (TARC)), TECK (Thymus-Expressed Chemokine (CCL25)) en TNFα (tumor necrosis factor alpha).

4. Cytospinkleuring en long histologie

  1. Cytospin biochemische kleuring
    1. Omring de cytospins met een hydrofobe pen om de chemicaliën te bevatten voor incubatie tijdens de procedure.
    2. Rehydrateer de cytospinen gedurende 5 minuten in PBS.
    3. Bevestig de cytospinmonsters in 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten, was drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    4. Permeabiliseer met ijskoud 70% aceton gedurende 7 minuten en was opnieuw drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    5. Vlek voor actine en tubuline of gereduceerde Mitotracker (incubeer met een mix van 2 μg/50 μL Alexa 488 geconjugeerde falloïdine in groen, en 2 μg/μL Alexa 555 geconjugeerde muis anti-α tubuline of gereduceerde Mitotracker weergegeven in rood, respectievelijk) gedurende 15 minuten.
      OPMERKING: Gebruik het IgG1-isotypecontroleantilichaam van de muis in een afzonderlijke cytospin om het tubulinekleuringsprotocol te valideren. Voer dezelfde stappen uit als uitgelegd van 4.1.1 tot 4.1.8, maar voor isotyperegelaars.
    6. Verwijder de vlekken door het mengsel voorzichtig van de glijbaan te kantelen. Incubeer de dia's met DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) gedurende 5-10 minuten om kernen te bevlekken.
    7. Was de cytospins 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten, dek af met anti-fade montagemedia en bewaar 's nachts in het donker bij kamertemperatuur voordat u het beeldvorming.
    8. Verkrijg beelden onder een rechtopstaande microscoop met breed veld uitgerust met een wetenschappelijke camera. Zorg voor consistente belichtingstijden van de camera die zijn ingesteld voor de verschillende fluorescerende kanalen bij het weergeven van dia's.
  2. Cytospin immuun-fluorescerende kleuring:
    1. Omring de cytospins met een hydrofobe pen om de chemicaliën te bevatten voor incubatie tijdens de procedure. Rehydrateer de cytospinen gedurende 5 minuten in PBS.
    2. Fixeer de cytospinmonsters door 10 minuten in 2% paraformaldehyde te broeden, was drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    3. Permeabiliseer met 0,1% koude triton X-100 gedurende 2 minuten, was drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    4. Blokkeer vervolgens gedurende 15 minuten door de cytospin te incuberen met 1:50 verdunning van de Fc-blokantilichaamvoorraad (om ervoor te zorgen dat het primaire muisantilichaam niet niet specifiek reageert met de fc-antilichamen van de muis).
    5. Tip de dia's om het Fc-blok te verwijderen en verander in 1% BSA voor en incubeer de cytospin met een mix van 3 primaire antilichamen van belang (zie tabel 1 voor de verschillende combinaties) gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u isotypecontroleantistoffen uitvoert (incubeer met een mixmuis IgG1 en rat IgG2b kappa primaire antilichamen door stap 4.2.1 tot 4.2.9 uit te voeren en de antilichamen te vervangen door isotypecontroles) parallel met overeenkomstige secundaire antilichamen zoals besproken in onze recente studie20.
    6. Was 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten. Incubeer de cytospinen met een mix van naar behoren ontworpen secundaire antilichamen (zie tabel 1 voor de details).
    7. Verwijder de vlekken door de mix voorzichtig van de glijbaan te kantelen, incubeer met DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) gedurende 5-10 minuten om kernen te bevlekken. Was 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    8. Coverslip met anti-fade montagemedia en 's nachts bewaren in het donker bij kamertemperatuur voor beeldvorming.
    9. Verkrijg beelden onder een rechtopstaande microscoop met breed veld uitgerust met een wetenschappelijke camera. Zorg voor consistente belichtingstijden van de camera die zijn ingesteld voor alle fluorofoorkanalen bij het weergeven van dia's.
  3. Hematoxyline en eosine (H&E) histologie
    1. Voer aangepaste H&E-kleuring3 uit op long cryo-secties voor alle groepen.
  4. Beeldanalyse
    1. Verwerk en analyseer afbeeldingsgegevensbestanden (.tiff) in Fiji ImageJ open software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Controleer de vereiste parameters (Gebied, Omtrek, Geïntegreerde dichtheid, Vormdescriptoren, Feret's diameter, Circulariteit, Display label) die moeten worden geregistreerd onder het tabblad Analyseren en Metingen instellen.
    3. Met behulp van de ROI-manager, handmatig overzicht rond 50-200 cellen in het samengevoegde afbeeldingspaneel met behulp van de "vrije hand selecties" tool. Sla de regio's van belang (ROI) op met de opdracht Ctrl+T en kopieer de opgeslagen ROIs voor elke cel naar alle fluorofoorkanalen.
    4. Druk vervolgens op Ctrl+M om de vooraf ingestelde parameters voor alle fluorescerende kanalen te meten (bijv. 405 nm (DAPI of ATPβ in blauw), 488 nm (actine of NK1.1 of Ki-67 in groen), 568 nm (tubuline of Gr1 of CD61 in rood) en 633 nm (CX3CR1 of angiostatine in magenta)).
    5. Sla de resultaten op als .csv bestand onder een toepasselijke naam die uw analyse vertegenwoordigt. Kopieer de resultaten van het .csv bestand naar een spreadsheet en deel de fluorescentie-intensiteit (FI) (de kolom Raw Integrated Density uit het bestand Results) van het gebeitst molecuul door dat van DAPI of CD61 FI, volgens het kleuringsontwerp. Deze ratio's worden "DAPI of CD61 genormaliseerde FI ratio's" genoemd.
    6. Plot vervolgens deze genormaliseerde verhoudingen, circulariteit, celomtrek en Feret-diameter, om elke verandering in celgrootte na de gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS te evalueren.
    7. Gebruik geschikte statistische software om de normaliteit van de verzamelde gegevens te controleren en de nulhypothese te testen (zie de sectie statistische analyse hieronder).
  5. statistische analyse
    1. Express resultaten als gemiddelde ± SEM. Per groep werden minimaal drie muizen gebruikt.
    2. Pas voor chemokine-gegevensanalyse eenrichtings ANOVA-p-waarden aan voor valse detectiesnelheid volgens de Benjamini- en Hoshberg-correctie.
    3. Analyseer beeldparameters, cellulariteit, Feret diameter, perimeter, DAPI of CD61 genormaliseerde fluorescentie intensiteitsverhoudingen door Mann-Whitney U test (voor het vergelijken van twee groepen) of Kruskal Wallis test (voor het vergelijken van meerdere groepen) omdat deze gegevens normaal gesproken niet werden gedistribueerd.
    4. Voor de rest van de beeldvormingsexperimenten analyseert u de resultaten met behulp van een eenrichtingsanalyse van variantie, gevolgd door sidaks meervoudige vergelijkingen. p-waarden <0,05 werden als significant beschouwd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS leidt tot systemische ontsteking en beenmergmobilisatie na 72 uur: Celtellingen in verschillende compartimenten onthulden significante veranderingen in perifeer bloed en het totale aantal totale cellen van het dijbeenmerg bij gecombineerde blootstellingen aan O3 en LPS. Hoewel gecombineerde blootstellingen aan O3 en LPS geen veranderingen teweegbrengen in het totale aantal CELLEN VAN BAL (Figuur 1A) of LVP (Figuur 1B), worden polymorfonucleaire cellen na blootstelling gepresenteerd als het overheersende celtype op 24 (Figuur 1F, Aanvullende figuur 1), 36 en 72 uur na blootstelling. Let op de afwezigheid van Siglec-f en CX3CR1 kleuring in polymorfonucleaire cellen bij 24 uur BAL cytospin afbeelding (Figuur 1F). Drievoudige DAPI/CD11b/Gr1-kleuring van BAL-cytospinen vertoonde de aanwezigheid van grote CD11b- en Gr1-positieve mononucleaire cellen die macrofagen zijn bij 0 uur, die veranderen in kleinere polymorfonucleaire cellen met punctaat Gr1staining maar verstoken van CD11b-kleuring bij 4 uur (zoals weergegeven in de inzet in Supplemental 1F). De meeste BAL-cellen zijn polymorfonucleair en positief voor zowel CD11b als Gr1, bij 24 uur na blootstelling(aanvullende figuur 1).

De muizen vertoonden systemische leukocytose met 24 uur (3,3-voudig vs 0 h, p<0,05, figuur 1C) gevolgd door leukopenie bij 72 uur, wat werd gekenmerkt door 13-voudige lagere tellingen in perifeer bloed in vergelijking met 24 uur (p<0,01) en een 8,6-voudige lager in vergelijking met4 uur (p<0,05) na gecombineerde blootstelling ( De sternale beenmergcellen waren ook onveranderd in vergelijking met 0 uur of na gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS (figuur 1D). De beenmergtellingen van het dijbeen vertoonden een late 28,8-voudige piek bij 72 uur in vergelijking met 0 uur (p<0,01, figuur 1E) en andere tijdspunten (p<0,01, figuur 1E). Visualisatie van de LVP, en sternale en femur beenmergcellen toonden ook veranderingen in de celtypen aan overwegend polymorfonucleaire cellen (Aanvullende figuur 1). De sternale beenmergcellen vertoonden tekenen van schade, zoals blijkt uit extracellulair nucleair materiaal. Het dijbeenmerg vertoonde hogere aantallen CD11b- en Gr1-positieve cellen (aanvullende figuur 1), die samenvallen met de celtellingen.

Het totale eiwitgehalte van BAL was het hoogst na 36 uur na gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS: Kwantificering van de totale eiwitten in de LVP- en BAL-compartimenten werd uitgevoerd om ozongeïnduceerd longoedeem te correleren, d.w.z. plasma-eiwituitademing als gevolg van resulterende vasculaire en epitheliale barrièrestoornis als gevolg van de gecombineerde blootstelling. Bal totaal eiwit was 4,5 keer hoger bij 36 h (p<0,05) in vergelijking met 4 uur (figuur 2A). LVP-eiwit bleef echter onveranderd na blootstelling (Figuur 2B).

Gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS veroorzaakt sterke chemokinegradiënten in het long vasculaire compartiment en niet BAL: Chemokine multiplextesten werden uitgevoerd op zowel BAL- als LVP-supernatanten. Houd er rekening mee dat de relatieve verschillen tussen deze twee compartimenten een voorkeursretentie in een bepaald compartiment vertegenwoordigen. Het eosinofiele chemoattractant eotaxin-2 was 4,3 keer hoger bij 4 uur in het LVP-compartiment in vergelijking met 0 uur (p<0,05, figuur 3A). In het BAL-compartiment was eotaxin-2 3,2 keer lager bij 4 uur in vergelijking met 0 h (p<0,01, figuur 3B). De BAL eotaxin-2-niveaus bleven consistent dalen tot 72 uur met een 12,6-voudige reductie in vergelijking met 0 uur (p<0,01, figuur 3B). Het lymfocyt chemoattractant IL-2 was 10,1 keer hoger bij 4 uur in het LVP-compartiment in vergelijking met 0 h (p<0,05, figuur 3C). In het BAL-compartiment was IL-2 5,0 keer lager bij 36 h in vergelijking met 0 h (p<0,05, figuur 3D). De BAL eotaxin-2-niveaus bleven consistent 5,9-voudige reductie afnemen bij 72 uur in vergelijking met 0 uur (p<0,05, figuur 3D).

Interessant is dat veel chemokinen om 4 uur werden gewijzigd, in de LVP en niet in de BAL. De meeste van deze chemokinen vertoonden een bescheiden, maar significante toename van de LVP-niveaus met 4 uur in vergelijking met latere tijdstippen. Hoewel de eotaxin-1-spiegels na de blootstellingen niet hoog waren in vergelijking met 0 uur, waren de niveaus significant hoog bij 4 uur in vergelijking met 24 (2,7-voudig, p<0,05) en 72 uur (5,0-voudig, p<0,01, figuur 4A) na gecombineerde blootstelling. De niveaus van LVP TNFα waren 3,4 keer hoger bij 4 uur in vergelijking met 36 uur (p<0,05, figuur 4B). Evenzo was LVP IFNγ 2,9 keer hoger bij 4 uur in vergelijking met 72 h (p<0,05, figuur 4C). CX3CL1-niveaus waren ook hoog bij 4 uur in vergelijking met 24 (1,7-voudig, p<0,05), 36 (1,6-voudig, p<0,05) en 72 uur (2,2-voudig, p<0,01) na gecombineerde blootstellingen (figuur 4D). CCL27-spiegels vertoonden ook hogere niveaus bij 4 uur in vergelijking met 24 (2,7-voudig, p<0,05), 36 (3,9-voudig, p<0,01) en 72 uur (2,9-voudig, p<0,05) na gecombineerde blootstellingen (figuur 4E).

Sommige chemokinen hadden een sterke aanwezigheid in de LVP na 4 uur na gecombineerde blootstellingen, en niet veranderd in de BAL voor en na blootstelling, wat wijst op een sterke chemokinerespons van de longcapillairen. Bij 4 uur waren de IL-16 LVP-spiegels 3,4-voudig in vergelijking met 0 h (p<0,01), 3,2-voudig in vergelijking met 24 h (p<0,01), 4,5-voudig in vergelijking met 36 h (p<0,01) en 4,6-voudig in vergelijking met 72 h (p<0,01). Bij 4 uur waren de neutrofiele chemokine, CXCL5 LVP-spiegels 2,0-voudig vergeleken met 0 h (p<0,01), 4,7-voudig in vergelijking met 24 h (p<0,01), 2,2-voudig in vergelijking met 36 uur (p<0,01) en 2,7-voudig in vergelijking met72h (p<01). Bij 4 uur waren de LVP-spiegels van CXCL10 2,3-voudig in vergelijking met 0 h (p<0,01), 2,1-voudig in vergelijking met 24 h (p<0,05), 2,5-voudig in vergelijking met 36 h (p<0,01) en2,7-voudig in vergelijking met 72 h (p<00). Bij 36 uur waren de neutrofiele chemokine, SDF1α LVP-spiegels 4,2-voudig vergeleken met 0 h (p<0,01), 2,9-voudig in vergelijking met 24 uur (p<0,05), 6,8-voudig in vergelijking met 72 uur (p<0,01) na gecombineerde blootstellingen (figuur 4I). Bij 4 uur waren de MIP3β LVP-spiegels 2,3-voudig in vergelijking met 0 h (p<0,05) en 2,3-voudig in vergelijking met 72 h (p<0,05) na gecombineerde blootstellingen (figuur 4J).

Gecombineerde blootstelling aan O3 en LPS veroorzaakt necrose, verstoort cellulair cytoskelet, plasmamembraan en mitochondriale integriteit: Omdat het aantal compartimenten leukocyten en eiwitgehalte niet correleerden met de LVP chemokine gradiënten, werd het belangrijker om de cellen die uit deze compartimenten werden verkregen te visualiseren. Ex vivo actine/tubulinekleuring van baseline (0 h) BAL-cellen vertoonden de aanwezigheid van corticale actine, stressvezels en lamellipodia (weergegeven in groen, figuur 5 linker bovenpaneel) en microtubulinetwerk (weergegeven in rood, figuur 5 linker bovenpaneel) die samenvielen met verminderde mitotrackerkleuring die de aanwezigheid van actieve mitochondriën aangaf (weergegeven in rood, figuur 5 linkeronderpaneel). Meer dan 95% van de BAL-cellen was mononucleair bij aanvang. Om 4 uur vertoonden BAL-cellen extracellulair nucleair materiaal, punctaat cytoplasmatische actinekleuring zonder lamellipodie en verminderde corticale actinekleuring (weergegeven in groen, figuur 5 rechter bovenpaneel), gewaaid microtubulinetwerk (weergegeven in rood, figuur 5 rechter bovenpaneel) dat niet overeenkwam met de verminderde mitotrackerkleuring (weergegeven in rood, figuur 5 linker rechterpaneel). DAPI genormaliseerde actine fluorescerende intensiteitsanalyse toonde een 3,7-voudige afname van de verhouding die wijst op een vermindering van de actinekleuring na 4 uur na blootstelling (p<0,01, figuur 6A). Evenzo verminderde de genormaliseerde tubuline-fluorescerende intensiteit van DAPI ook met 1,5 keer na blootstelling (p<0,01, figuur 6B), wat wijst op een vermindering van tubulinekleuring. Het verlies van lamellipodie was duidelijk met een toename van de circulariteit van BAL cellulair cytoskelet onmiddellijk, d.w.z. bij 2 uur (p<0,01, figuur 6C) en 4 uur (p<0,05, figuur 6C) na blootstelling in vergelijking met 0 uur en een afname van de cytoskelet circulariteit bij 24 (p<<0,05) en 36 h (p<05) en 36 h (p<05) en 36 h (p<05) en 36 h (p<05) en36h (p<05 uur).

Tot 24 uur waren de BAL-cellen van de gecombineerde blootstelling dubbel positief voor calceïne (in groen, figuur 7) wat wijst op de aanwezigheid van actieve esteraseactiviteit, en ethidium homodimeer (in rood, figuur 7), wat aangeeft dat hoewel sommige cellen dood waren (rood), de meerderheid gedeeltelijk aangetaste cellen waren. Na 36 uur waren de BAL-cellen grotendeels levensvatbaar (groen), wat duidt op vervanging van de aangetaste cellen door leukocyten die uit andere systemische compartimenten werden gerekruteerd (figuur 7).

Specifieke ATPα- en Ly6G-kleuring van de BAL-cellen onthulde discrete intracellulaire lokalisatie (Films 1 en 2) van zowel de eiwitten in alveolaire macrofagen als neutrofielen na blootstelling (Figuur 7). De gecombineerde blootstelling leidde tot een verlaging van de genormaliseerde fluorescerende intensiteitsverhouding van de DAPI van ATPα (figuur 7, 8A ) en een toename van het intracellulaire Ly6G-eiwitgehalte (figuur 7, figuur 8B, films 1 en 2). Vermindering van ATPα-kleuring, na 24 uur na blootstelling, gecorreleerd met lagere tubuline en tot op zekere hoogte verminderde mitotrackerkleuring. We hebben ook anucleaire ATPα positieve cellichamen waargenomen na blootstelling, wat bloedplaatjes kunnen zijn. We hebben onze bevindingen echter niet bevestigd. Om 2 uur zagen we kleinere mononucleaire BAL-cellen (p<0,01 Figuur 8C, p<0,01 Figuur 8D) in vergelijking met 0 uur, maar bij 4 uur waren de mononucleaire cellen groter (p<0,01 Figuur 8C, p<0,01 Figuur 8D) in vergelijking met 0 h. Bij 24 (p<0,01 figuur 8C, p<0,01 figuur 8D) en 36 uur (p<0,01 figuur 8C, p<0,01 figuur 8D) werden de BAL-cellen geleidelijk kleiner als gevolg van een verschuiving naar polymorfonucleaire cellen, in vergelijking met 0 uur.

Immunofenotypering van BAL-cellen onthulde voorbijgaande expressies van NK1.1, ATP β en Ki-67 en aanhoudende expressies van Gr1-, CX3CR1- en angiostatinepositieve BAL-cellen na gecombineerde blootstellingen aan O3 en LPS: Immunofluorescente kleuring van de eerste set BAL-cytospinen werd genormaliseerd tot DAPI-kleuring. Er was een toename van de cellulaire NK1.1 positieve cellen bij 24 uur (p<0,05 vs 0 h, figuur 9, 10A). Bij 36 uur hadden de BAL-cellen een lagere cellulaire NK1.1 fluorescerende intensiteit (p<0,01 vs 0 en 24 uur, figuur 9, 10A). De cellulaire Gr1 fluorescerende intensiteit was hoger bij 24 h (p<0,01 vs 0 h, figuur 9, 10B) en 36 h (p<0,01 vs 0 h, figuur 9, 10B). Evenzo was de cellulaire CX3CR1 fluorescerende intensiteit hoger bij 24 uur (p<0,01 vs 0 h, figuur 9,10C) en 36 uur (p<0,01 vs 0 uur, figuur 9, 10C).

Bij normaliteit naar cellulaire CD61, die ook alomtegenwoordig is in expressie, bleek een toename van de cellulaire ATPβ-fluorescerende intensiteit bij 24 uur (p<0.01 vs 0 h, figuur 9,10D) en een afname van de cellulaire ATPβ-fluorescerende intensiteit bij 36 uur (p<0,01 vs 0 en 24 uur, figuur 9, 10D). Atpβ vertoonde met name een voornamelijk nucleaire lokalisatie van 24 uur in vergelijking met perifere lokalisatie bij 36 uur (figuur 9). De cellulaire fluorescerende intensiteit van BAL Ki-67, een indicator van cellulaire proliferatie, was hoger bij 24 uur (p<0,01 vs 36 uur, figuur 9, 10E) in vergelijking met 0 en 36 uur. De niveaus lagen onder de uitgangswaarden bij 36 h (p<0,01, figuur 9, 10E), waarschijnlijk als gevolg van een hogere polymorfo-nucleaire CD61 versus Ki-67 expressie bij 36 uur (figuur 9). Ten slotte was de cellulaire fluorescerende intensiteit van BAL-angiostatine consistent hoog bij zowel 24 als 36 uur (p<0,01 vs 0 h, figuur 9, 10F), wat wijst op een specifieke toename van dit gespleten plasminogenfragment met metalloproteinase tijdens de longontstekingsreactie.

Gecombineerde blootstellingen veroorzaken wijdverspreide longschade: Long histologie toonde aan dat de gecombineerde blootstellingen langdurige schade aan de longen veroorzaken, zoals te zien is in H&E bevlekte cryosecties (Figuur 11). Hoewel bronchiolaire en alveolaire septale schade werd verwacht, was het surprizing om endotheelschade van grotere vaten te observeren, om 36 uur na blootstelling (Figuur 11). Er waren aanhechtings intravasculaire leukocyten, flarden van leukocytenaggregaten (inclusief neutrofielen) in de beschadigde alveolaire septale en peri-bronchiolaire gebieden (Figuur 11).

Figure 1
Figuur 1: Compartimentale leukocytentellingen: A) Broncho-alveolaire lavage (BAL) totale leukocytentellingen bij 0 (d.w.z. baseline), 4, 24, 36 en 72 uur na gecombineerde 0,05 ppb ozon (O3) en 50 μg intranasale LPS blootstelling aan muizen. B) Totale concentratie van longculair perfusaat (LVP) bij 0 (d.w.z. baseline), 4, 24, 36 en 72 uur na gecombineerde 0,05 ppb ozon (O3) en 50 μg intranasale LPS blootstelling aan muizen. C) Totale leukocytenconcentratie in perifeer bloed (PB) bij 0 (d.w.z. baseline), 4, 24, 36 en 72 uur na gecombineerde ozonconcentratie van 0,05 ppb (O3)en 50 μg intranasale LPS-blootstelling aan muizen. D) Sternale beenmergconcentratie (BM) bij 0 (d.w.z. baseline), 4, 24, 36 en 72 uur na gecombineerde blootstelling van 0,05 ppb ozon (O3)en 50 μg intranasale LPS aan muizen. E) Totale concentratie van het femurbeenmerg (BM) bij 0 (d.w.z. baseline), 4, 24, 36 en 72 uur na gecombineerde blootstelling van 0,05 ppb ozon (O3)en 50 μg intranasale LPS aan muizen. Voor de grafieken A-E wordt 0 uur weergegeven in blauw, 4 uur in rood, 24 uur in groen, 36 uur in paars en 72 uur in oranje gegevenspunten; * p<0,05 en ** p<0,01. F) Representatieve BAL cytospin slide vanaf 24 uur blootstelling, met mononucleaire en polymorfonucleaire cellen wanneer gekleurd voor kernen met DAPI (in blauw), CX3CR1 (in groen) en Siglec-F (in rood). Merk op dat de samenvoeging van CX3CR1 en Siglec-F oranjegeel wordt weergegeven. De meerderheid van de mononucleaire cellen zijn positief voor Siglec-F, wat een kenmerk is van alveolaire macrofagen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Totale eiwitkwantificering: A) Bronchoalveolaire lavage (BAL) totaal eiwitgehalte en B) Long vasculair perfusaat (LVP) totale eiwitconcentratie werd geschat doorPierce 660 nm eiwittest (Thermoscientific, IL, VS). Voor de grafieken A-B wordt 0 uur weergegeven in blauw, 4 uur in rood, 24 uur in groen, 36 uur in paars en 72 uur in oranje gegevenspunten; * blz<0,05. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Long Eotaxin-2 en IL-2 chemokine gradiënten: Van de 33 chemokinen, twee chemokinen die significant werden gewijzigd in de long vasculaire perfusaat (LVP) en bronchoalveolaire lavage (BAL) en vloeistof na gecombineerde 0,05 ppb ozon (O3) en 50 μg intranasale LPS blootstelling aan muizen A) LVP eotaxin-2 Gegevens werden geanalyseerd door eenrichtingsanova en de p-waarde voor valse detectiesnelheid van meerdere variabelen werd aangepast volgens Benjamini- en Hoshbergcorrectie. Voor de grafieken A-D wordt 0 uur weergegeven in blauw, 4 uur in rood, 24 uur in groen, 36 uur in paars en 72 uur in oranje gegevenspunten. Paar-wijze vergelijkingen werden geanalyseerd na bonferroni's correctie. * vertegenwoordigt p<0.05, ** vertegenwoordigt p<0.01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Long vasculaire perfusaat chemokine concentraties: Concentraties van nog eens tien chemokinen werden gewijzigd, maar alleen in het long vasculaire perfusaat (LVP) compartiment. A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α en J) MIP3β. Voor de grafieken A-J wordt 0 uur weergegeven in blauw, 4 uur in rood, 24 uur in groen, 36 uur in paars en 72 uur in oranje gegevenspunten. Paar-wijze vergelijkingen werden geanalyseerd na bonferroni's correctie. * vertegenwoordigt p<0.05, ** vertegenwoordigt p<0.01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Bronchoalveolaire lavage (BAL) cytospin actine/tubuline en verminderde mitotrackerkleuring: Representatieve beelden van metactine/tubuline bevlekte BAL-cytospinen van A) 0 h en B) 4 uur na gecombineerde 0,05 ppb ozon (O3) en 50 μg intranasale LPS-blootstelling aan muizen. Merk op dat DAPI wordt weergegeven in blauw, actine in groen en tubuline in rood. Representatieve beelden van geïnduceerde mitotracker bevlekte BAL-cytospinen van A) 0 h en B) 4 uur na gecombineerde 0,05 ppb ozon (O3) en 50 μg intranasale LPS blootstelling aan muizen. Merk op dat DAPI wordt weergegeven in blauw en gereduceerde mitotracker in rood. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Bronchoalveolaire lavage (BAL) cytoskelet- en circulariteitsanalyse: BAL-cytospinen gekleurd voor actine en tubuline werden geanalyseerd op genormaliseerde DAPI-parameters, d.w.z., A) Actine-naar-DAPI-fluorescerende intensiteit (FI) -verhouding bij 0 en 4 uur, B) Tubuline-DAPI-fluorescerende intensiteit (FI) bij 0 en 4 uur en C) BAL-celcellaliteit bij 0 (n=75 cellen), 2 (n=105 cellen), 4 (n=66 cellen), 24 (n=31 cellen), 36 (n=154 cellen) h. Aangezien er ook een paar proefexperimenten werden uitgevoerd onmiddellijk na blootstellingen met O3 en LPS, d.w.z. om 2 uur tijdspunt, hebben we ook een zeer vroege BAL-cellulariteitsanalyse van het 2 uur-tijdpunt opgenomen om de onmiddellijke effecten van O3te benadrukken . Voor de grafieken A-C wordt 0 uur weergegeven in blauw, 2 uur in rood, 4 uur in groen, 24 uur in paars en 36 uur in oranje gegevenspunten. * vertegenwoordigt p<0.05, ** vertegenwoordigt p<0.01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Bronchoalveolaire lavage (BAL) intracellulaire en plasmamembraanstatus: BAL-cellen werden gekleurd op vitale vlekken, calceïne (in groen) en ethidium homodimeren/EthHD (in rood) zoals weergegeven in representatieve bovenste beeldpanelen bij A) 0, B) 24 en C) 36 uur na blootstelling aan O3 en LPS. Schaalbalk = 200 μm. BAL-cytospinen werden immunostained voor DAPI (in blauw), ATPα (in groen) en Ly6G (in rood). Representatieve beelden worden weergegeven in de onderste beeldpanelen bij A) 0 en B) 24 uur na O3- en LPS-belichtingen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Bronchoalveolaire lavage (BAL) mitochondriaal eiwit ATPα, lysosomale eiwit Ly6G en celgrootteanalyse: Immunostained BAL-cellen werden genormaliseerd voor DAPI om A) ATPα naar DAPI fluorescentie intensiteit (FI) ratio en B) Ly6G naar DAPI FI ratio te berekenen, na 0 en 24 uur na O3 en LPS blootstellingen. Immunostained BAL-cellen werden ook geanalyseerd op hun A) langste d.w.z. fretdiameter en B) omtrek, bij 0, 2, 4, 24 en 36 uur na O3- en LPS-blootstellingen. Voor de grafieken A-D wordt 0 h (n=119 cellen) weergegeven in blauw, 2 h (n=105 cellen) in rood, 4 uur (n=66 cellen) in groen, 24 uur (n=309 cellen) in paars en 36 uur (n=154 cellen) in oranje gegevenspunten. * vertegenwoordigt p<0.05, ** vertegenwoordigt p<0.01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Bronchoalveolaire lavage (BAL) intracellulaire fenotypering: BAL-cellen werden immunostained voor DAPI (in blauw), NK1.1 (in groen), Gr1 (in rood) en CX3CR1 (in magenta) zoals weergegeven in representatieve bovenste beeldpanelen bij A) 0, B) 24 en C) 36 uur na blootstelling aan O3 en LPS. Schaalbalk = 50 μm. BAL-cytospinen werden immunostained voor ATPβ (in blauw), Ki-67 (in groen), CD61 (in rood) en angiostatine (in magenta). Representatieve beelden worden weergegeven in de onderste beeldpanelen op A) 0, B) 24 en C) 36 uur na O3- en LPS-belichtingen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Bronchoalveolaire lavage (BAL) mitochondriaal eiwit ATPβ, lysosomale eiwit Gr1, intracellulaire CX3CR1 en angiostatine analyse: Immunostained BAL cellen werden genormaliseerd voor DAPI om A te berekenen) NK1.1 tot DAPI fluorescente intensiteit (FI) ratio, B) Gr1 tot DAPI FI ratio en C) CX3CR1 tot DAPI FI ratio, bij0, 2 Immunostained BAL-cellen werden genormaliseerd voor CD61 om A) ATPβ tot DAPI fluorescente intensiteit (FI) ratio B) Ki-67 tot DAPI FI ratio en B) Angiostatine (ANG) tot DAPI FI ratio te berekenen, bij 0, 24 en 36 uur na O3 en LPS blootstellingen. Voor de grafieken A-F wordt 0 h (n=21 cellen) weergegeven in blauw, 24 h (n=796 cellen) in rood en 36 h (n=2692 cellen) in groene gegevenspunten. * vertegenwoordigt p<0.05, ** vertegenwoordigt p<0.01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 11
Figuur 11: Long hematoxyline en eosine (H&E) histologie. Ozon (O3) en LPS geïnduceerde long cryosection H&E histologie bij 0, 24 en 36 uur na gecombineerde O3 en LPS blootstellingen. Gebieden met alveolaire epitheelschade worden gekenmerkt door effen zwarte pijlen en endotheelschade door zwarte pijlkoppen. Gele sterretjes (*) vertegenwoordigen vlekken van leukocyten in de alveolaire septale gebieden. A = alveolaire ruimte, B = bronchus, V = vasculatuur, schaalbalk = 100 μm voor linkerbeeldpanelen en 50 μm voor beeldpanelen aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

S.No. Primair antilichaam Invitrogen secundair antilichaam
1 Muis anti-NK1.1 IgG2a kappa (kloon PK136), Invitrogen Catalogus nr. 16-5941-82 Alexa 488 geconjugeerde geit anti-muis IgG (H + L), Catalogusnr. A11002
2 Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (kloon RB6-8C5), Invitrogen Catalogus Nr. 53-5931-82 Alexa 568 geconjugeerde geitenanti-rat IgG (H +L), catalogusnr. A11077
3 Konijn anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Invitrogen Catalogus Nr. 14-6093-81 Alexa 633 geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H + L), Catalogusnr. A21070
4 Muis anti-ATP5A1 IgG2b (kloon 7H10BD4F9), Invitrogen Catalogusnr. 459240 Alexa 488 geconjugeerde geit anti-muis IgG (H + L), Catalogusnr. A11002
5 Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (kloon 1A8), Invitrogen Catalogus Nr. 16-9668-82 Alexa 568 geconjugeerde geitenanti-rat IgG (H +L), catalogusnr. A11077
6 Muis anti-ATP5β IgG2b (kloon 3D5AB1), Thermofisher Catalogusnr. A-21351 Alexa 350 geconjugeerde geit anti-muis IgG (H +L), Catalogusnr. A11045
7 Rat anti-Ki-67 (kloon SolA15) IgG2a kappa, Invitrogen Catalogus Nr. 14-5698-82 Alexa 568 geconjugeerde geitenanti-rat IgG (H +L), catalogusnr. A11077
8 Armeense hamster anti-CD61 (kloon 2C9. G2) IgG1 kappa, BD Catalogus nr. 553343 Alexa 568 geconjugeerde geitenantihamster IgG (H+L), Catalogusnr. A21112
9 Konijn anti-angiostatine (muis aa 98-116) IgG, Abcam Catalogus nr. Ab2904 Alexa 633 geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H + L), Catalogusnr. A21070

Tabel 1: Primaire en secundaire antilichaamcombinaties die worden gebruikt om cytospinen te bevlekken die uit de monsters zijn bereid.

Uitlezen BAL LVP PB SBM FBM
Tlc * * + om 24 uur; - om 36, 72 uur + om 72 uur
Neutrofielen + om 24, 36, 72 uur + om 24 uur * + om 4, 24, 36, 72 uur + om 4, 24, 36, 72 uur
eiwit + om 36 uur * n.d. n.d. n.d.
Chemokine profiel - Voor eotaxin-2, IL-2 om 4, 24, 36, 72 uur + voor Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β bij 4 uur; + voor SDF1α bij 36 uur n.d. n.d. n.d.
Celgrootte + om 4 uur; - om 24, 36 uur n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPα - om 24 uur n.d. n.d. n.d. n.d.
NK1.1/Ki-67 + om 24 uur n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG + om 24, 36 uur n.d. n.d. n.d. n.d.

Tabel 2: Een uitgebreide samenvatting van de belangrijkste bevindingen van het onderzoek in verschillende compartimenten. * duidt geen verandering aan, + duidt op een toename en - duidt op een afname van de gemeten parameters. BAL duidt broncho-alveolaire lavagevloeistof aan, LVP duidt long vasculair perfusaat aan, PB geeft perifeer bloed aan, SBM staat voor borstbeenbeenmerg en FBM voor dijbeenbeenmergcompartiment.

Aanvullende figuur 1: Gr1 en CD11b immunostaining: Representatieve beelden van DAPI (in blauw), Gr1 (in groen) en CD11b (in rood) fluorescerende immunostained cytospin dia's van long vasculair perfusaat (LVP), sternaal beenmerg (BM) en femur beenmerg (BM) compartimenten bij 0, 4 en 24 uur na gecombineerde O3 en LPS blootstellingen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om dit Bestand te downloaden.

Aanvullende film 1 Driedimensionaal gerenderd volume BAL-macrofagen vanaf 0 uur tijdspunt (d.w.z. baseline), met nucleus (weergegeven in blauw) en immunostained voor ATPα (weergegeven in groen) en Ly6G (rood weergegeven). Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullende film 2: Driedimensionaal gerenderd volume BAL-macrofagen vanaf 24 uur tijdspunt na gecombineerde O3- en LPS-blootstellingen, met nucleus (weergegeven in blauw) en immunostained voor ATPα (weergegeven in groen) en Ly6G (rood weergegeven). Let op de aanwezigheid van anucleaire ATPα-positieve lichamen en een gefragmenteerde cel. Klik hier om deze film te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methoden die in de huidige studie worden gepresenteerd, benadrukken het nut van analyse van meerdere compartimenten om meerdere cellulaire gebeurtenissen tijdens longontsteking te bestuderen. We hebben de bevindingen samengevat in tabel 2. Wij en vele laboratoria hebben uitgebreid de muriene respons op intranasale LPS-instillatie bestudeerd, die wordt gekenmerkt door snelle rekrutering van longneutrofielen, die piekt tussen 6-24 uur waarna de resolutie begint. En onlangs hebben we aangetoond dat subklinische O3 (bij 0,05 ppm gedurende 2 uur) alleen al aanzienlijke longschade kan veroorzaken in de C57BL/6NJ-substam15, die wordt gekenmerkt door de verdeling van neutrofielen in het long vasculaire compartiment, terwijl beschadigde macrofagen en puin werden waargenomen in de BAL, wat wijst op het ontstekingspotentieel van O3. In dat model zagen we een afwezigheid van neutrofielen in het alveolaire compartiment als gevolg van O3 geïnduceerde alveolaire epitheelschade en resulterende fagocytose door de alveolaire macrofagen. Niet alleen hebben we extracellulair DNA en puin waargenomen in het O3-model, de BAL-macrofagen waren dysmorf, wat correleert met hoge IL-16-niveaus, een alarmine dat meestal wordt vrijgegeven door stervende neutrofielen. Daarom is het belangrijk om te begrijpen of deze subklinische O3-niveaus de immuunrespons kunnen beïnvloeden in anders robuuste C57BL/6J-substam, zoals opgemerkt bij suprafysiologische O3-niveaus 21. We merkten op dat gecombineerde O3- en intranasale bacteriële endotoxine neutrofielen rekrutering in de long- en systemische compartimenten veroorzaakten, gekenmerkt door de aanwezigheid van beschadigde neutrofielen in BAL, long vasculair perfusaat, sternale en femur beenmergcompartimenten vanaf 4 uur die hoog bleven bij 24, 36 en 72 uur. De cellulaire schade werd voorgesteld als verlies van corticale actine en lamellipodie en toename van de celgrootte in BAL leukocyten; neutrofielen, geanalyseerd in het BAL-compartiment, vertoonden significant verminderde positieve reactiviteit tot microtubuli, ATP-synthasecomplex V-subeenheid α (ATPα) en actieve mitochondriale vlek. Longen passen zich aan deze gecombineerde blootstelling aan door de expressie van cellulair ATP-synthasecomplex V-subeenheid β (ATPβ) en die van de ATPβ ligand, angiostatine (Tabel 2) te upreguleren.

Een belangrijk aspect van het bestuderen van ontsteking is het begrijpen van cellulaire necrose samen met chemokine gradiënten. Het was interessant om op te merken dat de totale leukocytentellingen niet anders waren, behalve in perifeer bloed en het dijbeenmergcompartiment. Deze observaties brachten ons ertoe om de cellulaire cytoskeletpatronen, grootte en immunofenotypering te onderzoeken. We zagen een verlies van lamellipodie en actieve mitochondriën in BAL-cellen die wijzen op cellulaire schade. Corticale actine organisatie is een essentieel kenmerk van intercellulaire signalering en de resulterende barrière eigenschappen. Cytoskelet desorganisatie is dus een goede marker van celschade wanneer necrose niet zo duidelijk te beoordelen is. Zelfs bij 36 uur hadden de BAL-cellen het plasmamembraan aangetast, zoals aangegeven door ethidium homodimeerkleuring. Onmiddellijk na de gecombineerde blootstellingen vertoonden neutrofielen in BAL Gr1-positiviteit, maar een in wezen negatieve kleuring voor CD11b, die zich lokaliseert naar de voorsprong en helpt bij alveolaire septale kruip22. De gecombineerde blootstellingen leiden dus tot accumulatie van atypische neutrofielen zonder cd11b-eiwit. LPS veroorzaakt geen downregulatie van CD11b. Deze functie is dus waarschijnlijk het gevolg van O 3-geïnduceerde schade aan de neutrofielen.

De BAL-cellen hadden een unieke eiwitsignatuur met hogere NK1.1-, Ki-67- en ATPβ-kleuring bij 24 uur in vergelijking met 0 uur (tabel 2). De BAL-cellen hadden een hogere expressie van Gr1, CX3CR1 en angiostatine, bij 24 en 36 uur in vergelijking met 0 uur (tabel 2). Deze bevindingen werden bevestigd door de aanwezigheid van geleidelijk meer Gr1-positieve neutrofielen in BAL, na 24 en 36 uur, na blootstelling (Tabel 2). De aanwezigheid van NK1.1- CX3CR1- en Gr1-positieve cellen, om 24 uur, duidt op de rekrutering van zowel mononucleaire als polymorfonucleaire cellen in de BAL. Onder de mononucleaire cellen domineerden de CX3CR1-positieve cellen met 36 uur, wat wijst op de aanwezigheid van interstitiële macrofagen, bloedplaatjes of monocyt afgeleide macrofagen. De opname van zowel Ki-67 als angiostatine als markers informeerde ons over de proliferatieve versus anti-angiogene omgeving, respectievelijk in de BAL. De gecombineerde blootstellingen aan O3 en LPS leiden dus tot proliferatie van waarschijnlijk macrofagen, gevolgd door een anti-angiogene omgeving als gevolg van neutrofiele infiltratie. De voorbijgaande toename van ATPβ-kleuring kan wijzen op een belangrijke aanpassing aan een verhoogde overleving van de BAL-leukocyten na 24 uur. Opgemerkt moet worden dat ATPβ zich kan binden aan angiostatine en langdurige overleving6,23kan remmen , wat in feite wordt weerspiegeld in de lagere Ki-67-index bij 36 uur na blootstelling.

Hoewel BAL-eiwit het hoogst was na 36 uur en niet op andere tijdstippen, vertoonde het vasculaire perfusaat in de longen geen veranderingen in de eiwitconcentratie voor of na blootstelling. Het is mogelijk dat het vasculaire compartiment niet is aangetast, maar dit is hoogstwaarschijnlijk verward als gevolg van oxidatie van elektronenrijke aminozuren zoals methionine, histidine en cysteïne door O3 geïnduceerde vrije radicalen en resulterende oppervlakteactieve eiwitten (SP-A, SP-B) afbraak evenals vasculair lek24,25,26. Kwantificering van BAL IgM, BAL oppervlakteactieve eiwitten, BAL albumine of kleurstof extravasatie (met behulp van Evans blauw of fluoresceïne iso-thiocyanaat (FITC) dextran) zijn alternatieve methoden om epitheliale en endotheel integriteit te beoordelen.

Interessant is dat de long vasculaire perfusaatspiegels van eotaxin-2 en IL-2 acuut werden verhoogd op het tijdspunt van 4 uur. Bal eotaxin-2 en IL-2 niveaus werden significant verlaagd na blootstelling, wat wijst op ofwel afbraak in de alveolaire ruimte of beknelling in de long vasculatuur. Meer chemokinen geanalyseerd in long vasculair perfusaat onthulden hogere niveaus van de eosinofiele chemokine (eotaxin-1), TNFα, IFNγ, lymfeklier afgeleide mononucleaire cel chemokinen (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), epitheel afgeleide neutrofiele chemokine (CXCL5), en de alarmine (IL-16) vrijgegeven na secundaire necrose. Na 36 uur was het beenmerg afgeleide pan-leukocyten chemokine, SDF1α28, hoger in het long vasculaire perfusaat. De van het beenmerg afgeleide SDF1α-concentraties correleren met cytologische bevindingen waarbij CD11b- en Gr1-positieve cellen na blootstelling 24 en 36 uur overvloedig aanwezig zijn. De chemokine- en cytologische profielen weerspiegelen dus een significante mobilisatie van leukocyten uit de beenmergcompartimenten (tabel 2).

Ons diermodel en onderzoeksresultaten zijn van vitaal belang, rekening houdend met de situaties in de echte wereld waarin levende wezens in stedelijke omgevingen waarschijnlijk worden blootgesteld aan dergelijke subklinische O3- en infectieuzeagentia 8. Ons muriene model dient als een gemakkelijk toegankelijk prototype dat kan worden gereproduceerd in niveau-2 containment labs voor het bestuderen van long- en extrapulmonale mechanismen van invasieve celdood en infecties, zoals het geval is met COVID-19-infecties29. Toekomstige studies moeten gericht zijn op het visualiseren van de herstel- of late fase follow-up en chronische blootstellingen om de cellulaire aanpassingen op lange termijn te onderzoeken. Dus, voor uitgebreide longontstekingsstudies met levend orgaan15 en dier16,30,31 beeldvormingstechnieken, kan het huidige eindpuntstudieontwerp essentiële inzichten bieden in de gastheerrespons op gecombineerde lage dosis O3 (celdood) en LPS (immuunstimulatie), en zo de mechanismen van acuut longletsel ontcijferen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten of openbaarmakingen te maken.

Acknowledgments

Het uitgevoerde onderzoek wordt gefinancierd door de NSERC-subsidie van president en startfondsen van het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation wordt gefinancierd door Innovation Saskatchewan. Fluorescentie beeldvorming werd uitgevoerd in het WCVM Imaging Centre, dat wordt gefinancierd door NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) en Manpreet Kaur (MSc Student) werden gefinancierd door de start-up fondsen van het Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Tags

Immunologie en infectie Ozon LPS acute longontsteking F1F0 ATP synthase (complex V) subeenheden immuun fluorescerende cytologie IL-16
Visualiseren van long cellulaire aanpassingen tijdens gecombineerde ozon en LPS geïnduceerde murine acute longletsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. … More

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. K. Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury. J. Vis. Exp. (169), e62097, doi:10.3791/62097 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter