Summary
L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.
Abstract
I polmoni si trovano continuamente di fronte a insulti diretti e indiretti sotto forma di condizioni infiammatorie sterili (particelle o tossine reattive) e infettive (batteriche, virali o fungine). Una risposta ospite travolgente può comportare respirazione compromessa e lesioni polmonari acute, che è caratterizzata dal reclutamento di neutrofili polmonari a seguito della risposta immunitaria, coagulativa e rimodellante dei tessuti dell'ospite pato-logico. Metodi microscopici sensibili per visualizzare e quantificare gli adattamenti cellulari polmonari murini, in risposta all'ozono a basse dosi (0,05 ppm), un potente inquinante ambientale in combinazione con lipopolysaccharide batterico, un agonista TLR4, sono cruciali per comprendere i meccanismi infiammatori e riparatori dell'ospite. Descriviamo un'analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare, il perfusato vascolare polmonare, le criosezioni polmonari sinistra e il perfusato di midollo osseo sternale. Mostriamo danni di macrofagi alveolari, neutrofili, tessuto parenchimico polmonare, così come cellule del midollo osseo in correlazione con una risposta immunitaria ritardata (fino a 36-72 ore) che è contrassegnata da gradienti discreti di chemiochina nei compartimenti analizzati. Inoltre, presentiamo la matrice extracellulare polmonare e le interazioni citoscheletriche cellulari (actina, tubulina), specie di ossigeno mitocondriale e reattivo, plasminogeno antico coagulativo, angiostatina del frammento peptidico anti-angiogenico, subunità V complesso mitocondriale di ATP sintasi, α e β. Questi marcatori surrogati, se integrati con adeguati saggi a base cellulare in vitro e tecniche di imaging animale in vivo come la microscopia intravitale, possono fornire informazioni vitali per comprendere la risposta polmonare a nuovi agenti immunomodulatori.
Introduction
La lesione polmonare acuta (ALI) è una risposta patologica cruciale dei polmoni a stimoli infettivi o altri stimoli dannosi che è contrassegnata dall'attivazione simultanea di sistemi immunitari coagulativi, fibrinolitici e innati1. I neutrofili percepisce prontamente modelli di danni microbici e intracellulari attraverso la famiglia di recettori simili a pedaggio (TLR)2,3,4. I neutrofili rilasciano citochine preformate e contenuti di granuli citotossici, che possono quindi causare danni collaterali ai tessuti. Il conseguente danno alveolare è rovinato dalla morte cellulare secondaria che porta al rilascio di molecole come il trifosfato di adenosina (ATP)5, stabilendo così in un circolo vizioso di disregolazione immunitaria.
Un problema irrisolto nella comprensione dell'ALI si riferisce alla questione di come la lesione sia iniziata all'interno della membrana alveolare. Il complesso di trasporto elettronico V, F1F0 ATP sintasi, è una proteina mitocondriale nota per essere espressa onnipresentemente, sulla membrana plasmatica cellulare (inclusa endoteliale, leucocita, epiteliale) durante l'infiammazione. Il citoscheletro cellulare, composto da actina e tubulina, ospita rispettivamente molte forme cellulari e funzioni modulanti, nonché proteine mitocondriali. Abbiamo recentemente dimostrato che il blocco dell'ATP sintasi da parte di una molecola endogena, angiostatina, silenzia il reclutamento neutrofilo, l'attivazione e l'infiammazione polmonare indotta dal lipopolysaccharide (LPS)6. Pertanto, sia i meccanismi biochimici (ATP sintasi) che immunitari (TLR4) potrebbero regolare la barriera alveolare durante l'infiammazione polmonare.
L'esposizione all'ozono (O3),un inquinante ambientale, compromette la funzione polmonare, aumenta la suscettibilità alle infezioni polmonari e brevi bassi livelli di esposizioni O3 aumentano il rischio di mortalità in quelli con condizioni cardiorespiratorie sottostanti7,8,9,10,11,12,13,14. Pertanto, l'esposizione a concentrazioni fisiologicamente rilevanti di O3 fornisce un modello significativo di ALI per studiare i meccanismi fondamentali dell'infiammazione7,8. Il nostro laboratorio ha recentemente stabilito un modello murino di ALI15indotto da O3 a basso consumo. Dopo aver eseguito una dose e una risposta nel tempo a basse concentrazioni di O3, abbiamo osservato che l'esposizione a 0,05 ppm O3 per 2 ore, induce una lesione polmonare acuta che è contrassegnata dalla subunità V complessa di ATP sintasi polmonare β (ATPβ) e dall'espressione di angiostatina, simile al modello LPS. L'imaging polmonare intravitale ha rivelato la disorganizzazione dei microfilamenti di actina alveolare che indicano danni polmonari, e l'ablazione dei livelli di ossigeno reattivo del setto alveolare (ROS) (che indica l'abrogazione della segnalazione cellulare basale) e del potenziale della membrana mitocondriale (che indica la morte acuta delle cellule) dopo 2 h di esposizione a 0,05 ppm O315 che era correlato con un polmone eterogeneo 18ritenzione di FDG16, reclutamento neutrofilo e rilascio di citochine, in particolare IL-16 e SDF-1α. Il messaggio da portare a casa dai nostri recenti studi è che O 3 produce tossicità esponenzialmenteelevata se esposto a concentrazioni inferiori ai limiti consentiti di 0,063 ppm su 8 h (al giorno) per l'esposizione umana. È importante sottolineare che non esiste una chiara comprensione se queste esposizioni subclinica O3 possano modulare meccanismi mediati da TLR4 come l'endotossinabatterica 17. Pertanto, abbiamo studiato un modello di esposizione O3 e LPS a doppio colpo e abbiamo osservato gli adattamenti cellulari immunitari e non immuni.
Descriviamo un'analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare (cioè, BAL) che campiona gli spazi alveolari, il perfusato vascolare polmonare (cioè l'LVP) che campiona la vascolarizzazione polmonare e l'interstizio settale alveolare in caso di barriera endoteliale compromessa, criosezioni polmonari sinistra, per esaminare i leucociti parenchimici e aderenti residenti lasciati nel tessuto polmonare lavato , sangue periferico che rappresenta i leucociti circolanti e i perfusati del midollo osseo sternale e femore che campionano rispettivamente i siti prossimali e distale della mobilitazione cellulare ematopoietica durante l'infiammazione.
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Protocol
Il progetto dello studio è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca sugli animali dell'Università del Saskatchewan e ha aderito alle linee guida del Canadian Council on Animal Care per l'uso umano degli animali. Sono stati acquistati topi maschi di sei-otto settimane C57BL/6J. NOTA: Eutanasia di tutti gli animali che sviluppano letargia grave, angoscia respiratoria o altri segni di grave disagio prima del punto finale programmato.
NOTA: Preparare quanto segue: 27-18 G smussato con ago (dipenderà dal diametro del tracheale del mouse), tubi in PE di dimensioni appropriata per adattarsi all'ago smussato (fare una cannula PE per ogni topo), cannula, 2 forbici affilate, 2 forcelle smussate (piccole), 1 forcep affilato (piccolo), 3 siringhe da 1 ml, tubi di microfugo etichettati (per la raccolta di BAL, sangue, perfusato di midollo vascolare e osseo) e fiale etichettate (per la fissazione dei tessuti), sacchetti di campioni / crioviali per la raccolta dei tessuti, rotolo di filo di cotone della macellaio (tagliato in legature di dimensioni adeguate). Tutte le sostanze chimiche utilizzate per gli esperimenti sono indicate nella tabella dei materiali.
1. Esposizioni all'ozono e all'LPS per induzione di lesioni polmonari murine
- Esposizione all'ozono
- Preparare una scatola di induzione O3 personalizzata. Aggiungere mangime per topi, bottiglia d'acqua, giocattoli di arricchimento e biancheria da letto pulita in ordine e imitare l'ambiente abitativo dei topi.
NOTA: Questi passaggi garantiranno che i topi abbiano libero accesso a cibo e acqua quando sono ospitati nella scatola di induzione personalizzata e aiuteranno ad alleviare lo stress indebito. - Cambiare ilcalibratore/generatore O 3 "ON" (posizionato verso la porta di ingresso) per stabilizzare la lampada UV prima della mano (circa 15 minuti prima delle esposizioni) e connettersi con il monitor O3 in linea.
NOTA: Il monitor O 3 deve leggere una media di 0,05 ppm, come campionaredall'uscita a temperatura dell'aria a camera costante (72 ±3 ° F) e umidità relativa (50±15%). - Per le esposizioni O3, posizionare delicatamente i topi nella scatola di induzione personalizzata ed esporre continuamente i topi a 0,05 ppm O3 per 2 ore.
- Preparare una scatola di induzione O3 personalizzata. Aggiungere mangime per topi, bottiglia d'acqua, giocattoli di arricchimento e biancheria da letto pulita in ordine e imitare l'ambiente abitativo dei topi.
- Anestesia e somministrazione intranasale di LPS
- Preparare separatamente 10 mg/mL di alcole e xiazina.
- Preparare un cocktail mescolando 20 parti di ketamina e 1 parte di xiazina. Se il topo pesa X g, iniettare (X/200) mL di chetamina/xiazina nella cavità peritoneale. Per un topo, preparare 1 mL di cocktail composto da 1000 μL del 10 mg/mL di ketamina e 50 μL dello stock di xiazina. Mescolare bene tubazione su e giù in un tubo di microfugo.
NOTA: Le scorte di ketamina e xiazina possono essere preparate con una settimana di anticipo. - Anestetizzare i topi sotto una leggera miscela di chetamina intraperitoneale (IP) (50 mg/kg)/xiazina (1 mg/kg) (ad esempio, per un topo da 25 g, iniettare 0,125 mL del cocktail).
- Preparare una soluzione da 1 mg/mL di LPS, in salina, e riempire 50 μL della soluzione in una pipetta.
- Tenere il mouse in posizione verticale con il lato posteriore/dorsale sul palmo, tenendo le orecchie con la stessa mano. Ora, posizionare 50 μL della soluzione LPS18 delicatamente al di fuori delle narici (cioè 25 μL su ogni narice o 50 μL in una narice; non importa finché la procedura è rapida) e consentire ai topi di inalare la soluzione LPS.
- Infondere topi di controllo con 50 μL di soluzione salina sterile.
Attenzione: Non superare più di 100 μL per l'instillazione, che potrebbe essere fatale. Troppo meno di un volume (cioè <50 μL) e c'è il rischio di una deposizione nasale. - Dopo la somministrazione di LPS, posare delicatamente i topi, sullo stomaco o sulla schiena sul tumulo della biancheria da letto con la testa leggermente inclinata verso il basso.
NOTA: Questo orientamento prolunga la ritenzione della soluzione nella cavitànasale 19. - A 0, 2, 4, 24, 36 e 72 ore dopo l'esposizione, anestetizzare i topi i.p. con dose completa di ketamina (200 mg/kg)/xiazina (4 mg/kg) mix (cioè X/50 mL del cocktail, dove X è il peso del topo in grammi o 0,50 mL per un topo da 25 g).
- Osserva il mouse fino a quando non perde conoscenza e il riflesso giusto (cioè non torna indietro quando è posato in posizione supina). Ora, controlla il mouse per la profondità dell'anestesia, monitorando la respirazione (escursioni toraciche ritmiche) e la frequenza cardiaca, che dovrebbe cadere notevolmente, dopo 1-2 minuti.
- Quindi, controllare la presenza di riflessi del pedale, ad esempio pizzicare una delle cifre degli arti posteriori e osservare per la retrazione dell'arto, come riflesso. Se il mouse risponde, ricaricare con ulteriori iniezioni da 0,1 mL o più, a richiesta.
NOTA: Per ottenere un'anestesia profonda, tenere presente che alcuni ceppi o topi obesi di solito hanno un volume maggiore di distribuzione e quindi possono essere facilmente sovradosati, se non è consentito un tempo sufficiente se non consentito per l'anestesia completa (che può essere di circa 10 minuti o più). Di conseguenza, alcuni ceppi possono essere resistenti all'anestesia e quindi richiedere più ricarica. Questa conoscenza viene acquisita dopo molte osservazioni pratiche ed esperienza con topi di diversi ceppi ed età. Poiché alcuni esperimenti pilota sono stati eseguiti anche immediatamente dopo le esposizioni O3 e LPS (cioè al momento di 2 ore), abbiamo anche incluso alcune analisi delle cellule BAL molto presto da quegli esperimenti per evidenziare gli effetti immediati dell'esposizione combinata O3eLPS.
2. Raccolta dei campioni
- Posizionare il mouse sul vassoio chirurgico. Ora, mettere delicatamente un unguento oculare lubrificante su entrambi gli occhi per evitare la perdita di liquidi e sanificare il mouse con spray al 70% di etanolo.
- Fai piccoli tagli attraverso le membrane della pelle superiore e inferiore con le forbici, per esporre la trachea e il torace.
- Fai un taglio appena sotto lo sterno ed esponi il cuore.
- Puntura cardiaca
- Posizionare un ago 25G attaccato alla siringa eparinizzata nel ventricolo destro e prelevare il sangue per puntura cardiaca.
NOTA: Il sangue di solito disegna con un disegno minimo dello stantuffo, se il tempo dall'esposizione del cuore alla puntura cardiaca è inferiore a un minuto. Dopo aver raccolto circa 0,4-0,5 mL, potrebbe essere necessario fermarsi per alcuni secondi prima di raccogliere il sangue rimanente. Questo viene fatto per lasciare che il cuore pompa il volume rimanente nella camera ventricolare destra. Alla fine della raccolta del sangue, il cuore si ferma per pompare. - Raccogliere il sangue e conservare in tubi di microfugo per un'ulteriore lavorazione.
- Posizionare un ago 25G attaccato alla siringa eparinizzata nel ventricolo destro e prelevare il sangue per puntura cardiaca.
- tracheostomia
- Utilizzare con cura pinzette /pinze smussate per liberare la regione tracheale dal tessuto sovrascrivimento. Utilizzare le mani guantate più degli strumenti chirurgici per evitare sanguinamenti. Se molto sangue trasuda, c'è il rischio di contaminare i campioni di BAL. Utilizzare tamponi di cotone, se necessario, anche se non preferito. I kimwipes sono alternative migliori.
- Ora, taglia la gabbia toracica per esporre i polmoni. Ancora una volta, fare attenzione a non tagliare lo sterno e le arterie intercostali o l'aorta ascendente; fare tagli più piccoli mentre si avanza attraverso la gabbia toracica)
- Passare una legatura di cotone sotto il taglio tracheale e lasciare come tale per il momento.
- Tagliare la trachea in una posizione adatta nella porzione distale 1/3rd, puntando verso i polmoni, per consentire l'accesso a una cannula tracheale da 28 G.
- Inserire una cannula da 28 G PE (una lunghezza minima di 3-5 mm e un'estremità distale tagliata per facilitarne l'inserimento) nella trachea. Fare attenzione alla fine della trachea prima della biforcazione e quindi tirare indietro di circa un mm per evitare di campiostare un solo lobo.
- Saldamente, legare la legatura del cotone per tenere la cannula in posizione. Non comprimere la cannula.
- Lavanda bronco-alveolare (BAL)
- Riempire 0,5 ml di PBS in una siringa da 1 ml.
- Ora iniettare gradualmente 0,5 ml di PBS nella cannula con l'aiuto di una siringa da 1 ml.
- Dopo aver iniettato PBS, aspirare la siringa purché non resista all'aspirazione.
NOTA: Se c'è resistenza durante l'aspirazione del fluido BAL, ciò indica il collasso del tessuto alveolare o bronchiale. In tal caso, tirare indietro la cannula da un minuscolo per staccare la cannula formare le pareti del tessuto. - Raccogliere il fluido aspirato in un tubo di microfugo etichettato e posizionare sul ghiaccio.
- Eseguire altri due lavaggi in modo simile raccogliendo nello stesso flaconcino (cioè, un totale di 0,5 X 3 = 1,5 mL di lavanda).
- Misurare il volume del fluido BAL raccolto. Il recupero del lavage dovrebbe essere vicino al 90%.
- Perfusato vascolare polmonare (LVP)
- Tagliare l'aorta toracica discendente in una posizione tra la metà toracica e addominale, per evitare qualsiasi backup di perfusato nei polmoni mentre si perfonde attraverso il ventricolo destro.
- Macchiare la cavità vicino all'estremità tagliata dell'aorta, senza sangue.
- Successivamente, perfondere i polmoni con 0,5 mL di soluzione salina eparinata a temperatura ambiente iniettata attraverso il ventricolo destro.
- Raccogliere il perfusato vascolare dalla cavità all'estremità tagliata dell'aorta toracica discendente, in un tubo di microfugo, posto sul ghiaccio e misurarne il volume.
- Legare il bronco destro prossimale alla sua ramificazione dalla trachea (con filo di cotone).
- Fissazione polmonare sinistra in situ
- Collegare una siringa da 1 ml alla cannula tracheale, che è abbastanza lunga da essere inserito attraverso la precedente incisione tracheale.
- Tirare indietro l'aria nella siringa fino a 0,6 mL.
- Quindi, riempire la siringa rimanente (fino alla fine) con paraformaldeide al 2% a temperatura ambiente. Assicurarsi che lo stantuffo sia pronto a uscire senza aspirare aria dalla cannula.
- Ora, apporre la siringa con un nastro adesivo, su un contenitore verticale, misurato fino a 20 cm di altezza.
- Delicatamente, disegnare lo stantuffo per lasciare che il fissatore fluisce verso la trachea. Nel caso in cui ci siano alcune bolle d'aria nella cannula, posizionare delicatamente lo stantuffo sopra la siringa e il fluido inizierà a fluire dopo alcuni secondi.
- Lasciare gonfiare il polmone sinistro alla sua capacità totale insitu, per 5 minuti, da un'altezza di 20 cm formando una colonna d'acqua di 20 cm.
- Durante questa procedura, assicurarsi di proteggere i lobi polmonari giusti dall'entrare in contatto con la paraformaldeide in quanto ciò influenzerà i test a valle.
- Posizionare tessuti di laboratorio piegati per assorbire qualsiasi paraformaldeide che potrebbe entrare in contatto con i lobi polmonari giusti.
ATTENZIONE: La paraformaldeide è altamente tossica. Pertanto, non inalare o posizionare il contatto con parti esposte del corpo. Esercitare estrema cautela durante la manipolazione. - Durante il tempo di instillazione della paraformaldeide, sanificare l'addome.
- Tagliare i lobi polmonari giusti dalla trachea assicurandosi di rimuovere qualsiasi filo e mettere immediatamente i lobi in un crioviogenico marcato e lasciarlo cadere in azoto liquido per l'analisi molecolare /biochimica a valle delle citochine/RT-PCR/analisi western blot dell'omogeneato polmonare.
- Tagliare con cura il polmone sinistro per qualsiasi tessuto connettivo o membrana pleurica e immergerlo in paraformaldeide al 2% per 24 ore a 4 °C.
- Incorporare il polmone fisso in paraffina secondo il protocollo di incorporamento standard.
Attenzione:non scaldare esosi i campioni polmonari. - Tagliare la parte addominale e de-skin dall'osso pelvico (anca).
- Separare le ossa del femore sinistro e destro dalla porzione pelvica, in una piastra di Petri piena di salina tenuta sul ghiaccio.
- Collezione aspirata di midollo osseo sternale e femore
- Pulire il tessuto e i muscoli dalle ossa utilizzando tessuti di laboratorio.
- Raccogliere la gabbia toracica ventrale e lo sterno in una piastra di Petri piena di salina tenuta sul ghiaccio.
- Tagliare le punte distali e prossimali delle ossa sternali e del femore.
- Perfondere le ossa 4 volte con 0,5 ml di soluzione salina, utilizzando aghi ben montati (da 24 a 28 G) su siringhe da 1 ml, e raccogliere le frazioni da ciascun osso in tubi etichettati dotati di filtri e posti sul ghiaccio.
NOTA: L'ago varia tra le dimensioni dell'animale. Dopo il lavaggio, l'osso del femore dovrebbe presentarsi trasparente. - Una volta raccolti i campioni, insacca il topo in un sacchetto di plastica e metti in un congelatore di carcasse animali per un corretto smaltimento, secondo le linee guida dell'impianto istituzionale per gli animali.
3. Elaborazione del campione
- Conteggio dei leucociti totali (TLC) e differenziali (DLC)
- Campioni di sangue periferico centrifuga, BAL, perfusato vascolare polmonare e midollo osseo (sterno e femore) per 10 min a 500 g.
- Raccogli i supernatanti, bloccali e conservali a -80 °C fino a ulteriori analisi.
- Ricostituire le cellule in un minimo di 200 μL di PBS.
- Eseguire TLC contando bal, sangue, perfusato vascolare polmonare e cellule del midollo osseo su un emocitometro.
- Macchiare un'altra aliquota di 9 μL di BAL con un mix di 1 μL di omodimero di etidio verde e rosso di calceina-1 per quantificare le cellule vive (verdi) a causa dell'attività esterasi intracellulare e di eventuali cellule BAL danneggiate (in rosso) a causa della perdita dell'integrità della membrana plasmatica.
- Aggiungere il 2% di acido acetico agli RBC a lire, in un rapporto 1:10 per il TLC nel sangue e un rapporto 1:2 per il TLC vascolare polmonare.
ATTENZIONE: Regolare le concentrazioni cellulari diluindo in PBS se la concentrazione è superiore a 1x106 cellule per mL (molto importante per i campioni di midollo osseo). - Centrifugare le cellule per preparare i citospini su diapositive e macchie, come spiegato di seguito per i DLC. Contare un minimo di 100 cellule per il conteggio differenziale delle cellule leucociti (DLC).
NOTA: In genere, si possono preparare due citospin su una diapositiva. E dopo 10-15 minuti di asciugatura ad aria, procedere con la fase di colorazione. - Dividere il BAL raccolto da tre topi pilota per gruppo in due citospini ciascuno e macchiare per actina / tubulina e mitocondri con fosforilazione ossidativa attiva (mitotracker ridotto). Utilizzare il BAL da altri tre topi per dividersi in due citospini ciascuno, per diapositive macchiate NK1.1/Gr1/CX3CR1 e ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin. Dividere il BAL da altri tre topi in due citospin ciascuno per macchiare per ATPα/Ly6G e CX3CR1/Siglec-F.
- Lavanda broncoalveolare (BAL) e Perfusato vascolare polmonare (LVP) quantificazione totale delle proteine
- Al fine di quantificare le perturbazioni indotte da O3 e LPS della barriera vascolare o la relativa pressione oncotica nei due compartimenti polmonari (cioè il setto alveolare (interstiziale) e i compartimenti perfusato vascolare polmonare (vascolare), misurare il contenuto proteico totale nei fluidi raccolti.
- Analizzare le frazioni supernatanti scongelate per la loro concentrazione totale di proteine utilizzando un saggio colorimetrico standard resistente ai detergenti.
- Analisi delle chemiochine broncoalveolare (BAL) e perfusato vascolare polmonare (LVP)
- Quindi, analizzare le chemiochine nei supernaganti BAL e perfusato vascolare polmonare (LVP) utilizzando un test immunologico a base di perline magnetiche a 33 plex. Ciò informerà sulla direzionalità dei gradienti di chemiochina delle vie aeree / interstizio vs chemiochina vascolare stabiliti dopo esposizioni combinate.
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (regolato all'attivazione, normale cellula T espressa e secreta (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (fattore derivato da cellule stromali 1), TARC (timo e chemiochina regolata dall'attivazione (TARC)), TECK (Chemiochina espressa dal timo (CCL25)) e TNFα (fattore di necrosi tumorale alpha).
4. Colorazione dei citospini e istologia polmonare
- Colorazione biochimica dei citospin
- Circonda i citospini con una penna idrofobica per contenere le sostanze chimiche per l'incubazione durante la procedura.
- Reidratare i citospini in PBS per 5 minuti.
- Fissare i campioni di citospino in paraformaldeide al 2% per 10 minuti, lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Permeabilizzare con ghiaccio freddo 70% acetone per 7 minuti e lavare di nuovo tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Macchia per actina e tubulina o mitotracker ridotto (incubare con una miscela di 2 μg/50 μL di Alexa 488 phalloidin coniugata mostrata in verde e 2 μg/μL di Alexa 555 topo coniugato anti-α tubulina o mitotracker ridotto mostrato rispettivamente in rosso) per 15 minuti.
NOTA: Utilizzare l'anticorpo di controllo dell'isotipo IgG1 del mouse, in un citospino separato, per convalidare il protocollo di colorazione della tubulina. Eseguire gli stessi passaggi illustrati da 4.1.1 a 4.1.8, ma per i controlli isotipo. - Rimuovere le macchie ribaltando delicatamente il mix dalla diapositiva. Incubare le diapositive con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per 5-10 min per macchiare i nuclei.
- Lavare i citospini 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno, copriscili con mezzi di montaggio anti dissolvenza e conservare durante la notte al buio a temperatura ambiente prima dell'imaging.
- Acquisire immagini al microscopio verticale ad ampio campo dotato di una telecamera scientifica. Garantire tempi di esposizione coerenti della fotocamera impostati per i diversi canali fluorescenti durante le diapositive di imaging.
- Colorazione immuno-fluorescente cytospin:
- Circonda i citospini con una penna idrofobica per contenere le sostanze chimiche per l'incubazione durante la procedura. Reidratare i citospini in PBS per 5 minuti.
- Fissare i campioni di citospino incubando in paraformaldeide al 2% per 10 minuti, lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Permeabilizzare con 0,1% tritone freddo X-100 per 2 minuti, lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Successivamente, fc blocca per 15 minuti incubando il citospino con 1:50 diluizione del patrimonio anticorpale del blocco Fc (per assicurarsi che l'anticorpo primario del topo non reagisca in modo non specifico con gli anticorpi Fc del topo).
- In questa punta le diapositive per rimuovere il blocco Fc e passare all'1% di BSA e incubare la citospina con una miscela di 3 anticorpi primari di interesse (fare riferimento alla tabella 1 per le varie combinazioni) per 30 minuti.
NOTA: Assicurarsi di eseguire anticorpi di controllo dell'isotipo (incubare con un mix di anticorpi primari IgG1 e ratto IgG2b kappa eseguendo i passaggi da 4.2.1 a 4.2.9 e sostituendo gli anticorpi con controlli isotipo) in parallelo con anticorpi secondari corrispondenti come discusso nel nostro recente studio20. - Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Incubare i citospini con una miscela di anticorpi secondari opportunamente progettati (fare riferimento alla tabella 1 per i dettagli).
- Rimuovere le macchie ribaltando delicatamente la miscela dallo scivolo, incubare con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per 5-10 minuti per macchiare i nuclei. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
- Copriscivolo con supporti di montaggio anti dissolvenza e conservare durante la notte al buio a temperatura ambiente prima dell'imaging.
- Acquisire immagini al microscopio verticale ad ampio campo dotato di una telecamera scientifica. Garantire tempi di esposizione coerenti della fotocamera impostati per tutti i canali del fluorofore durante l'imaging delle diapositive.
- Istologia di ematossilina ed eosina (H&E)
- Eseguire la colorazione H&Emodificata 3 sulle crio-sezioni polmonari per tutti i gruppi.
- Analisi delle immagini
- Elaborare e analizzare i file di dati delle .tiff (in particolare) nel software aperto Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Controllare i parametri richiesti (Area, Perimetro, Densità integrata, Descrittori di forma, Diametro di Feret, Circolarità, Etichetta di visualizzazione) da registrare nella scheda Analizza e Imposta misure.
- Utilizzando gestione ROI, delineare manualmente circa 50-200 celle nel pannello immagine unito utilizzando lo strumento "selezioni a mano libera". Salvate le aree di interesse (ROI) con il comando CTRL+T e copiate le ROI salvate per ogni cella su tutti i canali del fluorofoforo.
- Premere quindi CTRL+M per misurare i parametri pre-impostati per tutti i canali fluorescenti (ad esempio, 405 nm (DAPI o ATPβ in blu), 488 nm (actin o NK1.1 o Ki-67 in verde), 568 nm (tubulina o Gr1 o CD61 in rosso) e 633 nm (CX3CR1 o angiostatina in magenta)).
- Salvare i risultati come .csv file con un nome appropriato che rappresenta l'analisi. Copiare i risultati del file .csv in un foglio di calcolo e dividere l'intensità di fluorescenza (FI) (che è la colonna Densità integrata grezza dal file Risultati) della molecola macchiata per quella di DAPI o CD61 FI, come disegno di colorazione. Questi rapporti sono definiti come "RAPPORTI FI normalizzati DAPI o CD61".
- Quindi, tracciare questi rapporti normalizzati, circolarità, perimetro cellulare e diametro Feret, per valutare eventuali cambiamenti nelle dimensioni delle celle dopo l'esposizione combinata O3 e LPS.
- Utilizzare un software statistico appropriato per verificare la normalità dei dati raccolti e testare l'ipotesi nulla (si rimanda alla sezione di analisi statistica qui sotto).
- analisi statistica
- Esprimere i risultati come ± SEM. Sono stati utilizzati almeno tre topi per gruppo.
- Per l'analisi dei dati delle chemiochine, regolare i valori p ANOVA unidirezione per il tasso di scoperta falso in base alla correzione di Benjamini e Hoshberg.
- Analizzare i parametri dell'immagine, la cellularità, il diametro feret, il perimetro, i rapporti di intensità della fluorescenza normalizzati DAPI o CD61 mediante il test Mann-Whitney U (per il confronto di due gruppi) o il test Kruskal Wallis (per il confronto di più gruppi) poiché questi dati non erano normalmente distribuiti.
- Per il resto degli esperimenti di imaging, analizzare i risultati utilizzando un'analisi uni-way della varianza seguita dai confronti multipli di Sidak. i valori p <0,05 sono stati considerati significativi.
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Representative Results
L'esposizione combinata A3 e LPS porta all'infiammazione sistemica e alla mobilizzazione del midollo osseo a 72 ore: il numero di cellule in diversi compartimenti ha rivelato cambiamenti significativi nel sangue periferico e nel midollo osseo del femore il conteggio totale delle cellule su esposizioni combinate O3 e LPS. Sebbene leesposizioni combinate O 3 e LPS non inducano a variazioni nel numero totale di cellule BAL (Figura 1A) o LVP ( Figura1B), le cellule polimorfonucleari presentate come tipo di cellula predominante a 24(figura 1F, figura supplementare 1),36 e 72 ore dopo l'esposizione. Si noti l'assenza di colorazione Siglec-f e CX3CR1 nelle cellule polimorfonucleari a 24 h immagine di citospin BAL (Figura 1F). La colorazione tripla DAPI/CD11b/Gr1 dei citospin BAL ha mostrato la presenza di grandi cellule mononucleari positive cd11b e Gr1 che sono macrofagi a 0 h, che si trasformano in cellule polimorfonucleari più piccole che mostrano una colorazione Gr1 del punctato ma priva di colorazione CD11b a 4 h (come mostrato nell'inserto in Supplemental 1F). La maggior parte delle cellule BAL sono polimorfonucleari e positive sia per CD11b che per Gr1, a 24 ore dopo l'esposizione(Figura supplementare 1).
I topi mostrarono leucocitosi sistemica a 24 ore (3,3 volte contro 0 h, p<0,05, Figura 1C) seguita dalla leucopenia a 72 ore, caratterizzata da un numero inferiore di 13 volte nel sangue periferico rispetto a 24 ore (p<0,01) e da un 8,6 volte inferiore rispetto a 4 h (p<0,05) dopo l'esposizione combinata di O3 e LPS (Figura 1C). Anche le cellule del midollo osseo sternale sono rimaste invariate rispetto a 0 h o dopo l'esposizione combinata O3 e LPS(figura 1D). Il numero di midollo osseo del femore ha mostrato un picco di 28,8 volte alla fine a 72 ore rispetto a 0 h (p<0,01, Figura 1E) e altri punti di tempo (p<0,01, Figura 1E). La visualizzazione dell'LVP e delle cellule del midollo osseo sternale e femore ha anche mostrato cambiamenti nei tipi di cellule a cellule prevalentemente polimorfonucleari (Figura supplementare 1). Le cellule del midollo osseo sternale mostravano segni di danno come evidenziato dal materiale nucleare extracellulare. Il midollo osseo del femore ha mostrato un numero maggiore di cellule positive CD11b e Gr1 (Figura supplementare 1), che coincidono con il conteggio delle cellule.
Il contenuto totale di proteine BAL è stato più elevato a 36 ore dopo l'esposizione combinata A3 e LPS: la quantificazione delle proteine totali nei compartimenti LVP e BAL è stata effettuata per correlare l'edema polmonare indotto dall'ozono, cioè l'essudazione delle proteine plasmatiche a causa della conseguente compromissione della barriera vascolare ed epiteliale dovuta all'esposizione combinata. La proteina totale BAL è stata 4,5 volte superiore a 36 ore (p<0,05) rispetto a 4 ore(figura 2A). Tuttavia, la proteina LVP è rimasta invariata dopo l'esposizione(figura 2B).
L'esposizione combinata O3 e LPS induce forti gradienti di chemiochina nel compartimento vascolare polmonare e non BAL: i test multiplex chemiochina sono stati condotti su supernanti BAL e LVP. Si prega di notare che le differenze relative tra questi due compartimenti rappresentano una ritenzione preferenziale in un particolare compartimento. L'eotassina chemioatattica eosinofila-2 era 4,3 volte più alta a 4 ore nel compartimento LVP rispetto a 0 h (p<0,05, Figura 3A). Nel compartimento BAL, l'eotassina-2 era 3,2 volte più bassa a 4 ore rispetto a 0 h (p<0,01, figura 3B). I livelli di eotossina-2 del BAL hanno continuato a diminuire costantemente fino a 72 ore con una riduzione di 12,6 volte rispetto a 0 h (p<0,01, figura 3B). Il chemioattrattante linfocitare IL-2 era 10,1 volte più alto a 4 ore nel compartimento LVP rispetto a 0 h (p<0,05, Figura 3C). Nel vano BAL, IL-2 era 5,0 volte più basso a 36 ore rispetto a 0 h (p<0,05, Figura 3D). I livelli di eotossina-2 del BAL hanno continuato a diminuire costantemente di 5,9 volte la riduzione a 72 ore rispetto a 0 h (p<0,05, figura 3D).
È interessante notare che molte chemiochine sono state alterate a 4 ore, nella LVP e non nel BAL. La maggior parte di queste chemiochine ha mostrato un aumento modesto, ma significativo, dei livelli di LVP a 4 ore rispetto ai punti di tempo successivi. Sebbene i livelli di eotossina-1 non fossero elevati dopo le esposizioni rispetto a 0 h, ma i livelli erano significativamente alti a 4 ore rispetto a 24 (2,7 volte, p<0,05) e 72 h (5,0 volte, p<0,01, figura 4A)dopo l'esposizione combinata. I livelli di LVP TNFα erano 3,4 volte superiori a 4 ore rispetto ai 36 h (p<0,05, figura 4B). Allo stesso modo, LVP IFNγ era 2,9 volte più alto a 4 ore rispetto a 72 h (p<0,05, Figura 4C). Anche i livelli di CX3CL1 erano elevati a 4 ore rispetto a 24 (1,7 volte, p<0,05), 36 (1,6 volte, p<0,05) e 72 h (2,2 volte, p<0,01) dopo esposizioni combinate (figura 4D). I livelli di CCL27 hanno mostrato livelli più elevati anche a 4 ore rispetto a 24 (2,7 volte, p<0,05), 36 (3,9 volte, p<0,01) e 72 h (2,9 volte, p<0,05) dopo esposizioni combinate (figura 4E).
Alcune chemiochine avevano una forte presenza nell'LVP a 4 ore dopo esposizioni combinate, e non cambiate nel BAL prima e dopo l'esposizione, indicando una forte risposta chemiochina dai capillari polmonari. Alle 4 h, I livelli di IL-16 LVP sono stati di 3,4 volte rispetto a 0 h (p<0,01), 3,2 volte rispetto a 24 h (p<0,01), 4 5 volte rispetto a 36 h (p<0,01) e 4,6 volte rispetto a 72 h (p<0,01) dopo esposizioni combinate(figura 4F). A 4 ore, la chemiochina neutrofila, I livelli di LVP CXCL5 sono stati 2,0 volte rispetto a 0 h (p<0,01), 4,7 volte rispetto a 24 h (p<0,01), 2,0 2 volte rispetto a 36 h (p<0,01) e 2,7 volte rispetto a 72 h (p<0,01) dopo esposizioni combinate(figura 4G). Alle 4 h, I livelli di LVP CXCL10 sono stati di 2,3 volte rispetto a 0 h (p<0,01), 2,1 volte rispetto a 24 h (p<0,05), 2 5 volte rispetto a 36 h (p<0,01) e 2,7 volte rispetto a 72 h (p<0,01) dopo esposizioni combinate(figura 4H). A 36 ore, la chemiochina neutrofila, i livelli di SDF1α LVP erano 4,2 volte rispetto a 0 h (p<0,01), 2,9 volte rispetto a 24 h (p<0,05), 6,8 volte rispetto a 72 h (p<0,01) dopo esposizioni combinate(figura 4I). A 4 ore, i livelli di MIP3β LVP erano 2,3 volte rispetto a 0 h (p<0,05) e 2,3 volte rispetto a 72 h (p<0,05) dopo esposizioni combinate(figura 4J).
L'esposizione combinata O3 e LPS induce necrosi, interrompe la citoscheletro cellulare, la membrana plasmatica e l'integrità mitocondriale: poiché il conteggio compartimentale dei leucociti e il contenuto proteico non erano correlati con i gradienti di chemiochina LVP, divenne più importante visualizzare le cellule ottenute da questi compartimenti. La colorazione ex vivo actina/tubulina delle cellule BAL di base (0 h) ha mostrato presenza di actina corticale, fibre di stress, lamellipodia (mostrata in verde, figura 5 pannello superiore sinistro) e rete di microtubuli (mostrata in rosso, figura 5 pannello superiore sinistro) che ha coinciso con la colorazione dei mitotracker ridotta che indica la presenza di mitocondri attivi (mostrata in rosso, figura 5 pannello inferiore sinistro). Più del 95% delle cellule BAL erano mononucleari al basale. A 4 ore, le cellule BAL mostravano materiale nucleare extracellulare, colorazione dell'actina citoplasmatica del punctato priva di lamellipodia e colorazione dell'actina corticale ridotta (mostrata in verde, figura 5 pannello superiore destro), rete di microtubuli a ventaglio (mostrata in rosso, figura 5 pannello superiore destro) che non corrispondeva alla colorazione ridotta dei mitotracker (mostrata in rosso, figura 5 pannello destro sinistro). L'analisi dell'intensità fluorescente ad azione normalizzata DAPI ha mostrato una diminuzione di 3,7 volte del rapporto che indica una riduzione della colorazione dell'actina a 4 ore dopo l'esposizione (p<0,01, figura 6A). Analogamente, anche l'intensità fluorescente della tubulina normalizzata DAPI si è ridotta di 1,5 volte dopo l'esposizione (p<0,01, Figura 6B),indicando una riduzione della colorazione della tubulina. La perdita di lamellipodia è stata evidente con un aumento della circolarità del citoscheletro cellulare BAL immediatamente, cioè a 2 h (p<0,01, Figura 6C) e 4 ore (p<0,05, figura 6C) dopo l'esposizione rispetto a 0 h e una diminuzione della circolarità citoscheletricha a 24 (p<0,05) e 36 h (p<0,01) dopo l'esposizione, rispetto a 0 h(figura 6C).
Fino a 24 ore, le cellule BAL dell'esposizione combinata erano due positive per la calceina (in verde, figura 7) che indicava la presenza di attività esterase attiva e di omodimero di etidio (in rosso, figura 7),indicando che sebbene alcune cellule fossero morte (rosso), la maggior parte erano cellule parzialmente compromesse. A 36 ore, le cellule BAL erano in gran parte vitali (verde), indicando la sostituzione delle cellule compromesse con leucociti reclutati da altri compartimenti sistemici(figura 7).
La colorazione specifica atpα e ly6G delle cellule BAL ha rivelato una localizzazione intracellulare discreta (Filmati 1 e 2) sia delle proteine nei macrofagi alveolari che dei neutrofili dopo l'esposizione (Figura 7). L'esposizione combinata ha portato a una riduzione del rapporto di intensità fluorescente normalizzata DAPI di ATPα(Figura 7, 8A) e ad un aumento del contenuto proteico intracellulare Ly6G(Figura 7, Figura 8B, Film 1 e 2). Riduzione della colorazione ATPα, a 24 ore dopo l'esposizione, correlata con la minore tubulina e in una certa misura ridotta colorazione dei mitotracker. Abbiamo anche osservato corpi cellulari positivi atpα anucleari dopo l'esposizione, che potrebbero essere piastrine. Tuttavia, non abbiamo confermato le nostre conclusioni. A 2 ore, abbiamo osservato cellule BAL mononucleari più piccole (p<0.01 Figura 8C, p<0.01 Figura 8D) rispetto a 0 h ma a 4 ore, le cellule mononucleari erano più grandi (p<0.01 Figura 8C, p<0.01 Figura 8D) rispetto a 0 h. A 24 (p<0.01 Figura 8C, p<0.01 Figura 8D) e 36 h (p<0.01 Figura 8C, p<0.01 Figura 8D), le cellule BAL sono diventate progressivamente più piccole a causa di uno spostamento verso cellule polimorfonucleari, rispetto a 0 h.
L'immunofenotipizzazione delle cellule BAL ha rivelato espressioni transitori di cellule BAL positive NK1.1, ATP β e Ki-67 ed espressioni sostenute di cellule BAL positive gr1, CX3CR1 e angiostatina dopo esposizioni combinate O3 e LPS: la colorazione immunofluorescente del primo set di citospin BAL è stata normalizzata alla colorazione DAPI. C'è stato un aumento delle cellule positive NK1.1 cellulari a 24 ore (p<0,05 vs 0 h, Figura 9, 10A). A 36 ore, le cellule BAL avevano un'intensità fluorescente NK1.1 cellulare inferiore (p<0,01 vs 0 e 24 ore, Figura 9, 10A). L'intensità fluorescente cellulare gr1 era più alta a 24 ore (p<0,01 vs 0 h, figura 9, 10B) e a 36 h (p<0,01 vs 0 h, figura 9, 10B). Allo stesso modo, l'intensità fluorescente del CX3CR1 cellulare era più alta a 24 ore (p<0,01 vs 0 h, Figura 9, 10C) e a 36 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9, 10C).
Quando normalizzato al CD61 cellulare, che è anche onnipresente nell'espressione, ha rivelato un aumento dell'intensità fluorescente atpβ cellulare a 24 ore (p<0,01 vs 0 h, Figura 9, 10D) e una diminuzione dell'intensità fluorescente atpβ cellulare a 36 h (p<0,01 vs 0 e 24 h, Figura 9, 10D). In particolare, l'ATPβ ha mostrato una localizzazione prevalentemente nucleare a 24 ore rispetto alla localizzazione periferica a 36 ore(figura 9). L'intensità fluorescente cellulare del BAL Ki-67, un indicatore di proliferazione cellulare, era più alta a 24 h (p<0,01 vs 36 h, Figura 9, 10E) rispetto a 0 e 36 h. I livelli erano inferiori ai livelli di riferimento a 36 h (p<0,01, figura 9, 10E), molto probabilmente a causa dell'espressione più elevata di POLImorfo-nucleare CD61 vs Ki-67 a 36 ore (Figura 9). Infine, l'intensità fluorescente cellulare dell'angiostatina BAL era costantemente elevata sia a 24 che a 36 ore (p<0,01 vs 0 h, Figura 9, 10F), indicando un aumento specifico di questo frammento di plasminogeno concimato metalloproteinasi, durante la risposta infiammatoria polmonare.
Le esposizioni combinate producono danni polmonari diffusi: L'istologia polmonare ha rivelato che le esposizioni combinate producono danni prolungati ai polmoni come si vede nelle criosezioni macchiate di H&E (Figura 11). Sebbene si prevedessero danni al setto bronchiolare e alveolare, si stava sorprendendo osservare i danni endoteliali dei vasi più grandi, a 36 ore dall'esposizione (figura 11). Vi erano leucociti intravascolari aderenti, macchie di aggregati di leucociti (compresi i neutrofili) nelle regioni alveolari danneggiate del setto e peri-bronchiolare(figura 11).
Figura 1: Conteggio compartimentale dei leucociti: A) Lavanda bronco-alveolare (BAL) il conteggio totale dei leucociti a 0 (cioè basale), 4, 24, 36 e 72 ore dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di LPS intranasale ai topi. B) Perfusato vascolare polmonare (LVP) concentrazione totale di leucociti a 0 (cioè basale), 4, 24, 36 e 72 ore dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di LPS intranasale ai topi. C) Concentrazione totale di leucociti nel sangue periferico (PB) a 0 (cioè basale), 4, 24, 36 e 72 ore dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di LPS intranasale ai topi. D) Concentrazione totale di leucociti di midollo osseo sternale (BM) a 0 (cioè basale), 4, 24, 36 e 72 ore dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di LPS intranasale ai topi. E) Midollo osseo del femore (BM) concentrazione totale di leucociti a 0 (cioè basale), 4, 24, 36 e 72 ore dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di LPS intranasale ai topi. Per i grafici A-E, 0 h è rappresentato in blu, 4 ore in rosso, 24 h in verde, 36 h in viola e 72 h in punti dati arancioni; * p<0,05 e ** p<0,01. F) Scivolo di citospino BAL rappresentativo da esposizione di 24 ore, che mostra cellule mononucleari e polimorfonucleari quando macchiate per nuclei con DAPI (in blu), CX3CR1 (in verde) e Siglec-F (in rosso). Si noti che l'unione di CX3CR1 e Siglec-F viene visualizzata come giallo-arancio. La maggior parte delle cellule mononucleari sono positive per Siglec-F, che è una caratteristica dei macrofagi alveolari. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Quantificazione totale delle proteine: A) Lavage broncoalveolare (BAL) contenuto proteico totale e B) Concentrazione totale di proteine del perfusato vascolare polmonare (LVP) è stata stimata da Test proteico di 660 nm diPierce (Termoscientifico, IL, USA). Per i grafici A-B, 0 h è rappresentato in blu, 4 ore in rosso, 24 h in verde, 36 h in viola e 72 h in punti dati arancioni; * p<0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gradienti di chemiochina Lung Eotaxin-2 e IL-2: Delle 33 chemiochine, due chemiochine che sono state significativamente alterate nel perfusato vascolare polmonare (LVP) e nel lavaggio broncoalveolare (BAL) e nel fluido dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di LPS intranasale ai topi A) LVP eotaxin-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 e D) BAL IL-2. I dati sono stati analizzati da anova unidireso e il valore p per il tasso di falsa scoperta di più variabili è stato regolato secondo la correzione di Benjamini e Hoshberg. Per i grafici A-D, 0 h è rappresentato in blu, 4 ore in rosso, 24 ore in verde, 36 h in viola e 72 h in punti dati arancioni. I confronti a coppie sono stati analizzati dopo la correzione di Bonferroni. * rappresenta p<0,05, ** rappresenta p<0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Concentrazioni di chemiochine perfusate vascolari polmonari: sono state alterate concentrazioni di altre dieci chemiochine, ma solo nel compartimento perfusato vascolare polmonare (LVP). A) Eotossina-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α e J) MIP3β. Per i grafici A-J, 0 h è rappresentato in blu, 4 h in rosso, 24 h in verde, 36 h in viola e 72 h in punti dati arancioni. I confronti a coppie sono stati analizzati dopo la correzione di Bonferroni. * rappresenta p<0,05, ** rappresenta p<0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Lavanda broncoalveolare (BAL) attoina/tubulina di citospino e colorazione ridotta dei mitotracker: Immagini rappresentative di citospin BAL macchiati di tatina/tubulina da A) 0 h e B) 4 ore dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di esposizione intranasale LPS ai topi. Si noti che DAPI è mostrato in blu, actina in verde e tubulina in rosso. Immagini rappresentative di citospini BAL macchiati di mitotracker dotti da A) 0 h e B) 4 ore dopo l'esposizione combinata di 0,05 ppb all'ozono (O3)e 50 μg di LPS intranasale ai topi. Si noti che DAPI è mostrato in blu e mitotracker ridotto in rosso. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Lavanda broncoallveolare (BAL) proteina citoscheletricha e analisi della circolarità: i citospini BAL macchiati di actina e tubulina sono stati analizzati per i parametri normalizzati DAPI, vale a dire: A) Rapporto di intensità fluorescente da Actin a DAPI (FI) a 0 e 4 h, B) Rapporto di intensità fluorescente da tubulina a DAPI (FI) a 0 e 4 h e C) cellularità cellulare BAL a 0 (n=75 cellule), 2 (n=105 cellule), 4 (n=66 cellule), 24 (n=31 cellule), 36 (n=154 celle) h. Poiché alcuni esperimenti pilota sono stati eseguiti anche immediatamente dopo le esposizioni O3 e LPS, cioè al momento di 2 ore, abbiamo anche incluso alcune analisi della cellularità BAL molto precoce dal punto di tempo di 2 ore per evidenziare gli effetti immediati di O3. Per i grafici A-C, 0 h è rappresentato in blu, 2 h in rosso, 4 h in verde, 24 h in viola e 36 h in punti dati arancioni. * rappresenta p<0,05, ** rappresenta p<0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Stato della membrana intracellulare e plasmatica del lavage broncoalveolare (BAL): le cellule BAL sono state macchiate per macchie vitali, calceina (in verde) e omodimeri dell'etidio/EthHD (in rosso) come mostrato nei pannelli di immagine superiore rappresentativi a A) 0, B) 24 e C) 36 ore dopo le esposizioni di O3 e LPS. I citospini BAL sono stati immunososticcati per DAPI (in blu), ATPα (in verde) e Ly6G (in rosso). Le immagini rappresentative sono mostrate nei pannelli immagine inferiori a A) 0 e B) 24 ore dopo le esposizioni O3 e LPS. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Lavanda broncoalveolare (BAL) proteina mitocondriale ATPα, proteina lisosomiale Ly6G e analisi delle dimensioni delle cellule: le cellule BAL immunososteniate sono state normalizzate per il calcolo da DAPI A) rapporto intensità fluorescente DAPα a DAPI (FI) e B) rapporto Ly6G-DAPI FI, a 0 e 24 ore dopo le esposizioni O3 e LPS. Le cellule BAL immunostained sono state anche analizzate per il loro perimetro A) più lungo, cioè diametro del furetto e B), a 0, 2, 4, 24 e 36 ore dopo le esposizioni O3 e LPS. Per i grafici A-D, 0 h (n=119 celle) è rappresentato in blu, 2 h (n=105 celle) in rosso, 4 h (n=66 celle) in verde, 24 h (n=309 celle) in viola e 36 h (n=154 celle) in punti dati arancioni. * rappresenta p<0,05, ** rappresenta p<0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Fenotipizzazione intracellulare broncoalveolare (BAL): le cellule BAL sono state immunosostenibili per DAPI (in blu), NK1.1 (in verde), Gr1 (in rosso) e CX3CR1 (in magenta) come mostrato nei pannelli di immagine superiore rappresentativi a A) 0, B) 24 e C) 36 ore dopo le esposizioni O3 e LPS. I citospini BAL sono stati immunososticcati per ATPβ (in blu), Ki-67 (in verde), CD61 (in rosso) e angiostatina (in magenta). Le immagini rappresentative sono mostrate nei pannelli immagine inferiori a A) 0, B) 24 e C) 36 h dopo le esposizioni O3 e LPS. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Lavanda broncoallveolare (BAL) proteina mitocondriale ATPβ, Proteina lisosomiale Gr1, analisi intracellulare CX3CR1 e angiostatina: le cellule BAL immunososteniate sono state normalizzate per il calcolo da DAPI A) rapporto di intensità fluorescente da NK1,1 a DAPI (FI), B) rapporto GR1 a DAPI FI e C) rapporto FI da CX3CR1 a DAPI, a 0, 24 e 36 ore dopo le esposizioni O3 e LPS. Le cellule BAL immunostained sono state normalizzate per il calcolo da CD61 A) rapporto di intensità fluorescente DAPβ a DAPI (FI) B) Ki-67 a DAPI FI ratio e B) rapporto Angiostatina (ANG) a DAPI FI, a 0, 24 e 36 ore dopo le esposizioni O3 e LPS. Per i grafici A-F, 0 h (n=21 celle) è rappresentato in blu, 24 h (n=796 celle) in rosso e 36 h (n=2692 celle) in punti dati verdi. * rappresenta p<0,05, ** rappresenta p<0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Ematossilina polmonare ed istologia dell'eosina (H&E). L'ozono (O3)e l'istologia H&E indotta da LPS hanno indotto l'istologia H&E a 0, 24 e 36 ore dopo le esposizioni combinate di O3 e LPS. Le regioni di danno epiteliale alveolare sono contrassegnate da solide frecce nere e danni endoteliali da teste di freccia nere. Gli asterischi gialli (*) rappresentano macchie di leucociti nelle regioni del setto alveolare. A = spazio alveolare, B = bronco, V = vascuola, barra di scala = 100 μm per i pannelli immagine della mano sinistra e 50 μm per i pannelli immagine sul lato destro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| S.No. | Anticorpo primario | Anticorpo secondario invitrogeno |
| 1 | Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136), Catalogo Invitrogen n. 16-5941-82 | Alexa 488 coniugato capra anti-topo IgG (H+L), Catalogo N. A11002 |
| 2 | Ratto anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5), Catalogo Invitrogen n. 53-5931-82 | Alexa 568 coniugato capra anti-ratto IgG (H+L), Catalogo N. A11077 |
| 3 | Coniglio anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Catalogo Invitrogen n. 14-6093-81 | Alexa 633 coniugato capra anti-coniglio IgG (H+L), Catalogo N. A21070 |
| 4 | Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9), Catalogo Invitrogen n. 459240 | Alexa 488 coniugato capra anti-topo IgG (H+L), Catalogo N. A11002 |
| 5 | Ratto anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8), Catalogo Invitrogen n. 16-9668-82 | Alexa 568 coniugato capra anti-ratto IgG (H+L), Catalogo N. A11077 |
| 6 | Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1), Catalogo Termosoeviatore N. A-21351 | Alexa 350 coniugato capra anti-topo IgG (H+L), Catalogo N. A11045 |
| 7 | Ratto anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa, Catalogo Invitrogen n. 14-5698-82 | Alexa 568 coniugato capra anti-ratto IgG (H+L), Catalogo N. A11077 |
| 8 | Criceto armeno anti-CD61 (clone 2C9. G2) IgG1 kappa, Catalogo BD n. 553343 | Alexa 568 coniugato capra anti-criceto IgG (H+L), Catalogo N. A21112 |
| 9 | Coniglio anti-angiostatina (mouse aa 98-116) IgG, Abcam Catalog No. ab2904 | Alexa 633 coniugato capra anti-coniglio IgG (H+L), Catalogo N. A21070 |
Tabella 1 : La commissione per l'unione Combinazioni di anticorpi primari e secondari utilizzate per macchiare i citospini preparati dai campioni.
| Lettura | Bal | LVP | Pb | SBM | Fbm |
| cure amorevoli | * | * | + a 24 ore; - a 36, 72 ore | + a 72 ore | |
| Neutrofili | + a 24, 36, 72 h | + a 24 ore | * | + a 4, 24, 36, 72 h | + a 4, 24, 36, 72 h |
| proteina | + a 36 ore | * | n.d. | n.d. | n.d. |
| Profilo chemiochina | - Per eotaxin-2, IL-2 a 4, 24, 36, 72 h | + per Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β a 4 h; + per SDF1α a 36 h | n.d. | n.d. | n.d. |
| Dimensioni cella | + a 4 ore; - alle 24, 36 ore | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPA | - ore 24 | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| NK1.1/Ki-67 | + a 24 ore | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG | + a 24, 36 ore | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabella 2 : La commissione per l'unione Una sintesi completa dei principali risultati dello studio in diversi comparti. * non denota alcuna variazione, + denota un aumento e - denota una diminuzione dei parametri misurati. BAL denota liquido di lavanda bronco-alveolare, LVP denota perfusato vascolare polmonare, PB denota sangue periferico, SBM denota midollo osseo sterno e FBM denota compartimento midollo osseo femore.
Figura complementare 1: Immunosomozione gr1 e CD11b: Immagini rappresentative da DAPI (in blu), Gr1 (in verde) e CD11b (in rosso) diapositive di citospino fluorescente immunosostenibile di perfusato vascolare polmonare (LVP), midollo osseo sternale (BM) e midollo osseo femore (BM) a 0, 4 e 24 ore dopo esposizioni combinate O3 e LPS. Scale bar = 50 μm. Fare clic qui per scaricare questo file.
Film supplementare 1 Volume tridimensionale reso di macrofagi BAL da 0 h punto di tempo (cioè basale), mostrando nucleo (mostrato in blu) e immunosomorato per ATPα (mostrato in verde) e Ly6G (mostrato in rosso). Clicca qui per scaricare questo film.
Filmato supplementare 2: Volume tridimensionale reso dei macrofagi BAL da 24 ore dopo le esposizioni combinate O3 e LPS, mostrando nucleo (mostrato in blu) e immunosostenibile per ATPα (mostrato in verde) e Ly6G (mostrato in rosso). Si noti la presenza di corpi positivi a atpα nucleare e di una cellula frammentata. Clicca qui per scaricare questo film.
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Discussion
I metodi presentati nello studio attuale evidenziano l'utilità dell'analisi a compartimento multiplo per studiare più eventi cellulari durante l'infiammazione polmonare. Abbiamo riassunto i risultati della tabella 2. Noi e molti laboratori abbiamo studiato ampiamente la risposta murina all'instillazione intranasale LPS, che è segnata dal rapido reclutamento di neutrofili polmonari, che raggiunge picchi tra 6-24 ore dopo di che, la risoluzione prende il via. E recentemente, abbiamo dimostrato che il sub-clinico O3 (a 0,05 ppm per 2 h) da solo può indurre danni polmonari significativi nel sotto-ceppo C57BL / 6NJ15, che è contrassegnato dalla partizionamento di neutrofili nel compartimento vascolare polmonare, mentre macrofagi e detriti danneggiati sono stati osservati nel BAL, indicando così il potenziale infiammatorio di O3. In quel modello abbiamo osservato un'assenza di neutrofili nel compartimento alveolare a causa del danno epiteliale alveolare indotto da O3 e della conseguente fagocitosi da parte dei macrofagi alveolari. Non solo abbiamo osservato DNA extracellulare e detriti nel modello O3, ma i macrofagi BAL erano dismorfici che sono correlati con alti livelli di IL-16, una alarmina solitamente rilasciata dai neutrofili morenti. Pertanto, è importante capire se questi livelli subcli clinici di O3 possono influenzare la risposta immunitaria in sotto-ceppo C57BL/6J altrimenti robusto, come notato con i livellisovra-fisiologici O 321. Abbiamo osservato che il reclutamento di neutrofili indotto daEndotossine batteriche combinate O 3 e intranasali nei compartimenti polmonari e sistemici, segnato dalla presenza di neutrofili danneggiati in BAL, perfusato vascolare polmonare, compartimenti del midollo osseo sternale e femore a partire da 4 h che è rimasto alto a 24, 36 e 72 ore. Il danno cellulare era rappresentato come perdita di actina corticale e lamellipodia e aumento delle dimensioni delle cellule nei leucociti BAL; i neutrofili, analizzati nel compartimento BAL, mostravano una reattività positiva significativamente ridotta al microtubulo, alla subunità V complessa di ATP sintasi α (ATPα) e alla macchia mitocondriale attiva. I polmoni si adattano a questa esposizione combinata regolando l'espressione della subunità V complessa di ATP sintasi cellulare β (ATPβ) e quella del ligando ATPβ, l'angiostatina (Tabella 2).
Un aspetto importante dello studio dell'infiammazione è capire la necrosi cellulare insieme ai gradienti di chemiochina. È stato interessante notare che il conteggio totale dei leucociti non era diverso tranne che nel sangue periferico e nel compartimento del midollo osseo del femore. Queste osservazioni ci hanno portato a studiare i modelli citoscheletrici cellulari, le dimensioni e l'immunofenotipizzazione. Abbiamo osservato una perdita di lamellipodia e mitocondri attivi nelle cellule BAL che indicano danni cellulari. L'organizzazione dell'actina corticale è una caratteristica essenziale della segnalazione intercellulare e delle proprietà barriera risultanti. La disorganizzazione citoscheletricha è quindi un buon marcatore del danno cellulare quando la necrosi non è così ovvia da valutare. Anche a 36 ore, le cellule BAL avevano compromesso la membrana plasmatica come indicato dalla colorazione dell'omodimero dell'etidio. Subito dopo le esposizioni combinate, i neutrofili in BAL hanno mostrato positività Gr1 ma una colorazione essenzialmente negativa per CD11b, che si localizza verso il bordo d'avanguardia e aiuta nel setto alveolarestrisciando 22. Pertanto, le esposizioni combinate portano all'accumulo di neutrofili atipici privi della proteina CD11b. LPS non induce la downregulation di CD11b. Pertanto, questa caratteristica è probabilmente il risultato di O3 danni indotti ai neutrofili.
Le cellule BAL avevano una firma proteica unica con una colorazione NK1.1, Ki-67 e ATPβ più elevata a 24 ore rispetto a 0 h(Tabella 2). Le cellule BAL avevano un'espressione più elevata di Gr1, CX3CR1 e angiostatina, a 24 e 36 ore rispetto a 0 h(Tabella 2). Questi risultati sono stati confermati dalla presenza di neutrofili positivi gr1 progressivamente più in BAL, a 24 e 36 ore, dopo esposizione(tabella 2). La presenza di cellule positive NK1.1, CX3CR1 e Gr1, a 24 ore, indica il reclutamento di cellule mononucleari e polimorfonucleari nel BAL. Tra le cellule mononucleari, le cellule positive CX3CR1 dominavano a 36 ore indicando la presenza di macrofagi interstiziali, piastrine o macrofagi derivati dal monocito. L'inclusione sia del Ki-67 che dell'angiostatina come marcatori ci ha informato dell'ambiente proliferatore vs anti-angiogenico, rispettivamente nel BAL. Pertanto, le esposizioni combinate di O3 e LPS portano alla proliferazione di probabilmente macrofagi seguiti da un ambiente anti-angiogenico a causa di infiltrazioni neutrofile. L'aumento transitorio della colorazione ATPβ può indicare un importante adattamento verso una maggiore sopravvivenza dei leucociti BAL a 24 ore. Va notato che l'ATPβ può legarsi all'angiostatina e inibire lasopravvivenza prolungata 6,23, che si riflette infatti nell'indice Ki-67 inferiore a 36 ore dopo l'esposizione.
Sebbene la proteina BAL fosse più alta a 36 ore, e non altri punti di tempo, il perfusato vascolare polmonare non mostrava cambiamenti nella concentrazione proteica prima o dopo l'esposizione. È possibile che il compartimento vascolare non sia stato interessato, ma questo è molto probabilmente confuso a causa dell'ossidazione di amminoacidi ricchi di elettroni come metiina, istidina e cisteina da O3 radicali liberi indotti e degradazione delle proteine tensioattanti risultanti (SP-A, SP-B) e perditavascolare 24,25,26. La quantificazione di BAL IgM, proteine tensioattive BAL, albumina BAL o estravasazione del colorante (usando l'iso-tiocianato di fluoresceina (FITC) dextran) sono metodi alternativi per valutare l'integrità epiteliale ed endoteliale.
È interessante notare che i livelli di perfusato vascolare polmonare di eotaxin-2 e IL-2 sono stati acutamente aumentati al momento di 4 ore. I livelli di BAL eotaxin-2 e IL-2 sono stati significativamente ridotti dopo l'esposizione, indicando sia la degradazione nello spazio alveolare che l'intrappolamento nella vascuola polmonare. Altre chemiochine analizzate nel perfusato vascolare polmonare hanno rivelato livelli più elevati della chemiochina eosinofila (eotaxin-1), TNFα, IFNγ, chemiochine a cellule mononucleari derivate da linfonodi (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), chemiochina neutrofila derivata epiteliale (CXCL5) e la alarmina (IL-16) rilasciata dopo necrosi secondaria dei neutrofili27, ma solo a 4 ore dopo l'esposizione. A 36 ore, la chemiochina pan-leucocitaria derivata dal midollo osseo, SDF1α28, era più alta nel perfusato vascolare polmonare. Le concentrazioni di SDF1α derivate dal midollo osseo sono correlate con i risultati citologico in cui le cellule positive CD11b e Gr1 sono abbondanti a 24 e 36 ore dopo l'esposizione. Pertanto, i profili chemiochina e citologico riflettono una significativa mobilitazione dei leucociti dai compartimenti del midollo osseo (tabella 2).
Il nostro modello animale e i risultati della ricerca sono fondamentali tenendo presente le situazioni del mondo reale in cui gli esseri viventi in contesti urbani sono probabilmente esposti a tali agenti subclitici O3 e infettivi 8. Il nostro modello murino funge da prototipo facilmente accessibile che può essere riprodotto nei laboratori di contenimento di livello 2 per lo studio dei meccanismi polmonari ed extrapolmonari di morte cellulare invasiva e infezioni, come nel caso delle infezioni da COVID-1929. Studi futuri dovrebbero essere orientati alla visualizzazione della riparazione o del follow-up in fase tardiva, nonché delle esposizioni croniche per studiare gli adattamenti cellulari a lungo termine. Pertanto, per studi completi sull'infiammazione polmonareche coinvolgono l'organo vivo 15 e le tecniche di imaging animali16,30,31, l'attuale progetto di studio end-point può fornire approfondimenti vitali sulla risposta dell'ospite alla combinazione di O3 a basse dosi (morte cellulare) e LPS (stimolazione immunitaria), decifrando così i meccanismi della lesione polmonare acuta.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni da fare.
Acknowledgments
La ricerca condotta è finanziata dalla sovvenzione NSERC del Presidente e dai fondi di start-up del Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Il Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation è finanziato da Innovation Saskatchewan. L'imaging a fluorescenza è stato eseguito presso il WCVM Imaging Centre, finanziato da NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) e Manpreet Kaur (studentessa di laurea magistro) sono state finanziate dai fondi di start-up del Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
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