Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.

Abstract

Die Lunge ist ständig mit direkten und indirekten Beleidigungen in Form von sterilen (Partikeln oder reaktiven Toxinen) und infektiösen (bakteriellen, viralen oder pilzlichen) Entzündlichenzuständen konfrontiert. Eine überwältigende Wirtsreaktion kann zu einer beeinträchtigten Atmung und einer akuten Lungenverletzung führen, die durch lungenneutrophile Rekrutierung als Folge der pathologischen Immun-, Koagulativ- und Gewebeumbaureaktion des Wirts gekennzeichnet ist. Empfindliche mikroskopische Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Anpassungen der Mauslunge als Reaktion auf niedrig dosiertes (0,05 ppm) Ozon, einen starken Umweltschadstoff in Kombination mit bakteriellem Lipopolysaccharid, einem TLR4-Agonisten, sind entscheidend, um die Entzündungs- und Reparaturmechanismen des Wirts zu verstehen. Wir beschreiben eine umfassende fluoreszierende mikroskopische Analyse verschiedener Lungen- und systemischer Körperkompartimente, nämlich der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit, des Lungengefäßperfusats, der kryosektionen linken Lunge und des sternalen Knochenmarkperfusatsats. Wir zeigen Schäden an alveolären Makrophagen, Neutrophilen, Lungenparenchymgewebe sowie Knochenmarkzellen in Korrelation mit einer verzögerten (bis zu 36-72 h) Immunantwort, die durch diskrete Chemokingradienten in den analysierten Kompartimenten gekennzeichnet ist. Darüber hinaus präsentieren wir lungenextrazelluläre Matrix und zelluläre zytoskelettale Interaktionen (Aktin, Tubulin), mitochondriale und reaktive Sauerstoffspezies, antikoagulatives Plasminogen, sein antiangiogenes Peptidfragment Angiostatin, die mitochondrialen ATP-Synthase-Komplex-V-Untereinheiten, α und β. Diese Surrogatmarker können, wenn sie mit adäquaten zellbasierten In-vitro-Assays und In-vivo-Tierbildgebungsverfahren wie intravitaler Mikroskopie ergänzt werden, wichtige Informationen zum Verständnis der Lungenreaktion auf neuartige immunmodulatorische Wirkstoffe liefern.

Introduction

Akute Lungenverletzung (ALI) ist eine entscheidende pathologische Reaktion der Lunge auf infektiöse oder andere schädliche Reize, die durch die gleichzeitige Aktivierung des koagulativen, fibrinolytischen und angeborenen Immunsystems gekennzeichnet ist1. Neutrophile erkennen sofort mikrobielle sowie intrazelluläre Schädigungsmuster durch die Toll-like-Rezeptor (TLR) Familie2,3,4. Neutrophile setzen vorgeformte Zytokine und zytotoxische Granulatinhalte frei, die dann Kollateralgewebeschäden verursachen können. Die daraus resultierende Alveolarschädigung wird durch sekundären Zelltod getrübt, der zur Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat (ATP)5führt und damit in einen Teufelskreis der Immundysregulation einleitet.

Ein ungelöstes Problem im Verständnis von ALI bezieht sich auf die Frage, wie die Verletzung innerhalb der Alveolarmembran ausgelöst wird. Der Elektronentransportkomplex V, F1F0 ATP-Synthase, ist ein mitochondriales Protein, von dem bekannt ist, dass es während einer Entzündung ubiquitär auf der Plasmamembran von Zellen (einschließlich Endothel, Leukozyten, Epithel) exprimiert wird. Das Zellzytoskelett, das aus Aktin und Tubulin besteht, beherbergt viele zellform- und funktionsmodulierende sowie mitochondriale Proteine. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Blockade der ATP-Synthase durch ein endogenes Molekül, Angiostatin, die Rekrutierung, Aktivierung und Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Lungenentzündung zum Schweigen bringt6. So könnten sowohl biochemische (ATP-Synthase) als auch Immunmechanismen (TLR4) die Alveolarbarriere während einer Lungenentzündung regulieren.

Die Exposition gegenüber Ozon (O3), einemUmweltschadstoff, beeinträchtigt die Lungenfunktion, erhöht die Anfälligkeit für Lungeninfektionen, und kurze niedrige O3-Expositionen erhöhen das Mortalitätsrisiko bei Personen mit zugrunde liegenden kardiorespiratorischen Erkrankungen7,8,9,10,11,12,13,14. Somit liefert die Exposition gegenüber physiologisch relevanten Konzentrationen vonO3 ein aussagekräftiges Modell von ALI zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der Entzündung7,8. Unser Labor hat kürzlich ein murines Modell von niedrig dosiertemO3 induziertem ALI15etabliert. Nach Durchführung einer Dosis- und Zeitreaktion auf niedrigeO3-Konzentrationen beobachteten wir, dass die Exposition bei 0,05 ppm O3 für 2 h eine akute Lungenverletzung induziert, die durch die AtP-Synthase-Komplex-V-Untereinheit β (ATPβ) und die Angiostatinexpression gekennzeichnet ist, ähnlich dem LPS-Modell. Die intravitale Lungenbildgebung zeigte eine Desorganisation der alveolären Aktin-Mikrofilamente, die auf eine Lungenschädigung hinweisen, und eine Ablation der Alveolarseptum-REAKTIVSauerStoffspezies (ROS) (was auf eine Aufhebung der Ausgangszellsignalisierung hinweist) und das mitochondriale Membranpotential (was auf einen akuten Zelltod hinweist) nach 2 h Exposition bei 0,05 ppm O315, was mit einer heterogenen Lungen-18-FDG-Retention16,Neutrophilenrekrutierung und Zytokinfreisetzung, insbesondere IL-16 und SDF-1α, korrelierte. Die Botschaft aus unseren jüngsten Studien ist, dass O 3 eine exponentiell hoheToxizität erzeugt, wenn es bei Konzentrationen unterhalb der zulässigen Grenzwerte von 0,063 ppm über 8 h (pro Tag) für die Exposition des Menschen exponiert wird. Wichtig ist, dass es kein klares Verständnis darüber gibt, ob diese subklinischen O3-Expositionen TLR4-vermittelte Mechanismen wie durch bakterielles Endotoxin17modulieren können. Daher untersuchten wir einDual-Hit-O-3- und LPS-Expositionsmodell und beobachteten die immun- und nicht-immunen zellulären Anpassungen.

Wir beschreiben eine umfassende fluoreszierende mikroskopische Analyse verschiedener Lungen- und systemischer Körperkompartimente, nämlich der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit (d.h. BAL), die die alveolären Räume beprobt, der Lungengefäßdifugelat (d.h. LVP), der das Lungengefäßgefäß abstimmt, und des alveolären septalen Interstitiums im Falle einer kompromittierten Endothelbarriere, der linken Lungenkriosektionen, um die im lavatierten Lungengewebe verbleibenden parenchymalen und adhärenten Leukozyten zu untersuchen , peripheres Blut, das die zirkulierenden Leukozyten darstellt, und das Sternal- und Femurknochenmark perfusiert, die die proximalen bzw. distalen Stellen der hämatopoetischen Zellmobilisierung während der Entzündung abtasten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Das Studiendesign wurde vom Animal Research Ethics Board der University of Saskatchewan genehmigt und entsprach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care für den humanen Tiergebrauch. Sechs bis acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden beschafft. HINWEIS: Euthanasiern Sie alle Tiere, die vor dem geplanten Endpunkt schwere Lethargie, Atemnot oder andere Anzeichen schwerer Belastung entwickeln.

HINWEIS: Bereiten Sie Folgendes vor: 27-18 G nadelabstumpft (hängt vom Trachealdurchmesser der Maus ab), PE-Schlauch in geeigneter Größe, um die stumpfe Nadel zu passen (machen Sie eine PE-Kanüle für jede Maus), Kanüle, 2 scharfe Schere, 2 stumpfe Zange (klein), 1 scharfe Zange (klein), 3 1 ml Spritzen, markierte Mikrofugenröhrchen (für BAL-, Blut-, Gefäß- und Knochenmarkperfusatsammlung) und markierte Fläschchen (zur Gewebefixierung), Probenbeutel / Kryoviale zur Gewebeentnahme, Baumwollfadenrolle des Metzgers (in ausreichend große Ligaturen geschnitten). Alle für die Experimente verwendeten Chemikalien sind in der Materialtabelle angegeben.

1. Ozon- und LPS-Expositionen zur Induktion von Lungenverletzungen bei Der Maus

  1. Ozonbelastung
    1. Bereiten Sie eine benutzerdefinierte O3 Induktionsbox vor. Fügen Sie Mausfutter, Wasserflasche, Anreicherungsspielzeug und saubere Bettwäsche hinzu und ahmen Sie die Wohnumgebung der Mäuse nach.
      HINWEIS: Diese Schritte stellen sicher, dass die Mäuse freien Zugang zu Nahrung und Wasser haben, wenn sie in der benutzerdefinierten Induktionsbox untergebracht sind, und helfen, übermäßigen Stress zu lindern.
    2. Schalten Sie den O3 Kalibrator/Generator "ON" (in Richtung Einlassöffnung platziert), um die UV-Lampe vor der Hand zu stabilisieren (ca. 15 min vor der Belichtung) und verbinden Sie ihn mit dem Inline-O3 Monitor.
      HINWEIS: Der O3-Monitor sollte durchschnittlich 0,05 ppm ablesen, wie er vom Auslass bei konstanter Kammerlufttemperatur (72 ±3 °F) und relativer Luftfeuchtigkeit (50±15%) abgetastet wird.
    3. Legen Sie die Mäuse bei O3-Expositionen vorsichtig in die benutzerdefinierte Induktionsbox und setzen Sie die Mäuse 2 h lang kontinuierlich 0,05 ppm O3 aus.
  2. Anästhesie und intranasale LPS-Verabreichung
    1. Bereiten Sie 10 mg / ml Bestände für Ketamin und Xylazin separat vor.
    2. Bereiten Sie einen Cocktail zu, indem Sie 20 Teile Ketamin und 1 Teil Xylazin mischen. Wenn die Maus X g wiegt, injizieren Sie (X/200) ml Ketamin/Xylazin-Cocktail in die Peritonealhöhle. Bereiten Sie für eine Maus 1 ml Cocktail vor, der aus 1000 μL des 10 mg/ml Ketaminstocks und 50 μL des Xylazinstocks besteht. Gut mischen, indem Sie in einem Mikrofugenröhrchen auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Die Ketamin- und Xylazin-Bestände können eine Woche im Voraus zubereitet werden.
    3. Betäuben Sie die Mäuse unter leichter intraperitonealer (IP) Ketamin (50 mg/kg)/Xylazin (1 mg/kg) Mischung (z. B. für eine 25 g Maus, injizieren Sie 0,125 ml des Cocktails).
    4. Bereiten Sie eine 1 mg / ml LPS-Lösung in Kochsalzlösung vor und füllen Sie 50 μL der Lösung in eine Pipette.
    5. Halten Sie die Maus aufrecht mit ihrer Rücken- / Rückenseite auf der Handfläche und halten Sie die Ohren mit derselben Hand. Legen Sie nun 50 μL der LPS-Lösung18 vorsichtig außerhalb der Nasenlöcher (d. H. 25 μL auf jedes Nasenloch oder 50 μL in einem Nasenloch; spielt keine Rolle, solange der Vorgang schnell ist) und lassen Sie die Mäuse die LPS-Lösung einatmen.
    6. Instillieren Sie Kontrollmäusen mit 50 μL steriler Kochsalzlösung.
      Vorsicht:Überschreiten Sie nicht mehr als 100 μL für die Instillation, die tödlich sein kann. Zu wenig Volumen (d.h. <50 μL) und es besteht die Gefahr, dass nur Nasenablagerungen entstehen.
    7. Legen Sie die Mäuse nach der LPS-Verabreichung vorsichtig entweder auf den Bauch oder den Rücken auf den Einstreuhügel mit leicht nach unten geneigten Kopf.
      HINWEIS: Diese Orientierung verlängert die Retention der Lösung in der Nasenhöhle19.
    8. Bei 0, 2, 4, 24, 36 und 72 h nach der Exposition betäuben Sie die Mäuse i.p. mit der vollen Dosis Ketamin (200 mg/ kg) / Xylazin (4 mg / kg) Mischung (dh X / 50 ml des Cocktails, wobei X das Mausgewicht in Gramm oder 0,50 ml für eine 25 g Maus ist).
    9. Beobachten Sie die Maus, bis sie das Bewusstsein und den rechten Reflex verliert (d.h. sich nicht umdreht, wenn sie in Rückenlage liegt). Überprüfen Sie nun die Maus auf die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Atmung (rhythmische Brustausschläge) und die Herzfrequenz überwachen, die nach 1-2 Minuten merklich sinken sollte.
    10. Als nächstes überprüfen Sie auf Pedalreflexe, dh kneifen Sie eine der Hintergliedmaßenziffern und beobachten Sie das Zurückziehen der Extremität als Reflex. Wenn die Maus reagiert, werden Sie je nach Bedarf mit zusätzlichen Injektionen von 0,1 ml oder mehr aufgeladen.
      HINWEIS: Um eine Tiefenanästhesie zu erreichen, beachten Sie, dass bestimmte Stämme oder fettleibige Mäuse in der Regel ein größeres Verteilungsvolumen haben und daher leicht überdosiert werden können, wenn genügend Zeit für eine Vollnarkose (die etwa 10 Minuten oder mehr dauern kann) nicht vorgesehen ist. Dementsprechend können einige Stämme gegen Anästhesie resistent sein und erfordern daher mehr Aufzüge. Dieses Wissen wird nach vielen praktischen Beobachtungen und Erfahrungen mit Mäusen unterschiedlicher Stämme und Alters erworben. Da einige Pilotexperimente auch unmittelbar nachO-3- und LPS-Expositionen (d.h. zum 2-Stunden-Zeitpunkt) durchgeführt wurden, schlossen wir auch einige sehr frühe BAL-Zellanalysen aus diesen Experimenten ein, um die unmittelbaren Auswirkungen der kombiniertenO3-und LPS-Exposition hervorzuheben.

2. Probenentnahme

  1. Legen Sie die Maus auf das OPERATIONSTABLETT. Tragen Sie nun sanft schmierende Augensalbe auf beide Augen auf, um Flüssigkeitsverlust zu vermeiden, und desinfizieren Sie die Maus mit 70% Ethanolspray.
    1. Machen Sie kleine Schnitte durch die oberen und unteren Hautmembranen mit einer Schere, um die Luftröhre und den Thorax freizulegen.
    2. Machen Sie einen Schnitt direkt unter dem Brustbein und legen Sie das Herz frei.
  2. Herzpunktion
    1. Legen Sie eine 25G-Nadel, die an einer heparinisierten Spritze befestigt ist, in den rechten Ventrikel und ziehen Sie Blut durch Herzpunktion.
      HINWEIS: Blut zieht normalerweise mit minimaler Kolbenzugzug, wenn die Zeit von der Exposition des Herzens bis zur Herzpunktion weniger als eine Minute beträgt. Nach dem Sammeln von etwa 0,4-0,5 ml muss man möglicherweise einige Sekunden pausieren, bevor man das verbleibende Blut sammelt. Dies geschieht, damit das Herz das verbleibende Volumen in die rechte Kammer pumpen kann. Am Ende der Blutentnahme hört das Herz auf zu pumpen.
    2. Sammeln Sie das Blut und lagern Sie es in Mikrofugenröhrchen zur weiteren Verarbeitung.
  3. Tracheostomy
    1. Verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette / stumpfe Pinzette, um die Trachealregion von darüber liegendem Gewebe zu befreien. Verwenden Sie behandschuhte Hände mehr als die chirurgischen Instrumente, um Blutungen zu vermeiden. Wenn viel Blut austritt, besteht die Gefahr, dass die BAL-Proben kontaminiert werden. Verwenden Sie bei Bedarf Wattestäbchen, wenn auch nicht bevorzugt. Kimwipes sind bessere Alternativen.
    2. Schneiden Sie nun den Brustkorb durch, um die Lunge freizulegen. Seien Sie auch hier vorsichtig, das Brustbein und die Interkostalarterien oder die aufsteigende Aorta nicht zu schneiden; kleinere Schnitte machen, während man durch den Brustkorb vordringt)
    3. Eine Baumwollligatur unterhalb der Trachealschnipsel passieren und vorerst als solche belassen.
    4. Snipsen Sie die Luftröhre an einer geeigneten Stelle im distalen 1/3. Teil, der auf die Lunge zeigt, um den Zugang zu einer 28 G Trachealkanüle zu ermöglichen.
    5. Legen Sie eine 28 G PE-Kanüle (eine minimale Länge von 3-5 mm und distales Ende, das für ein einfaches Einsetzen getrimmt ist) in die Luftröhre ein. Achten Sie vor der Verzweigung auf das Ende der Luftröhre und ziehen Sie dann etwa einen Millimeter zurück, um zu vermeiden, dass nur ein einzelner Lappen beprobt wird.
    6. Binden Sie die Baumwollligatur fest, um die Kanüle an Ort und Stelle zu halten. Brechen Sie die Kanüle nicht zusammen.
  4. Broncho-Alveolarspülung (BAL)
    1. Füllen Sie 0,5 ml PBS in eine 1 ml Spritze.
    2. Jetzt nach und nach 0,5 ml PBS mit Hilfe einer 1 ml Spritze in die Kanüle injizieren.
    3. Nach der Injektion von PBS saugen Sie die Spritze aus, solange sie dem Absaugen nicht widersteht.
      HINWEIS: Wenn beim Absaugen der BAL-Flüssigkeit Widerstand herrscht, deutet dies auf einen Kollaps des Alveolar- oder Bronchialgewebes hin. In diesem Fall ziehen Sie die Kanüle um ein Winziges zurück, um die Kanüle von den Wänden des Gewebes zu lösen.
    4. Sammeln Sie die abgesaugte Flüssigkeit in einem markierten Mikrofugenröhrchen und legen Sie es auf Eis.
    5. Führen Sie zwei weitere Spülungen auf ähnliche Weise durch und sammeln Sie in derselben Durchstechflasche (d. h. insgesamt 0,5 x 3 = 1,5 ml Lavage).
    6. Messen Sie das Volumen der gesammelten BAL-Flüssigkeit. Die Lavage-Erholung sollte nahe bei 90% liegen.
  5. Lungengefäßperfusat (LVP)
    1. Schneiden Sie die absteigende thorakale Aorta an einer Stelle zwischen der Brust- und Bauchhälfte, um eine Wiederaufschärfung von Perfusat in der Lunge zu vermeiden, während Sie durch den rechten Ventrikel perfusieren.
    2. Tupfen Sie die Höhle in der Nähe des geschnittenen Aortenendes ab, frei von Blut.
    3. Als nächstes perfundieren Sie die Lunge mit 0,5 ml raumtemperatur-heparinisierter Kochsalzlösung, die durch den rechten Ventrikel injiziert wird.
    4. Sammeln Sie das vaskuläre Perfusat aus der Höhle am geschnittenen Ende der absteigenden thorakalen Aorta in einem Mikrofugenröhrchen, das auf Eis gelegt wird, und messen Sie sein Volumen.
    5. Ligatieren Sie den rechten Bronchus proximal zu seiner Verzweigung von der Luftröhre (mit Baumwollfaden).
  6. In-situ-Fixierung der linken Lunge
    1. Verbinden Sie eine 1-ml-Spritze mit der Trachealkanüle, die lang genug ist, um durch den vorherigen Trachealschnitt eingeführt zu werden.
    2. Ziehen Sie luft in der Spritze bis zu 0,6 ml Mark zurück.
    3. Dann füllen Sie die restliche Spritze (bis zum Ende) mit 2% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass der Kolben bereit ist, herauszuspringen, ohne Luft aus der Kanüle anzusaugen.
    4. Befestigen Sie nun die Spritze mit einem Klebeband an einem aufrechten Behälter, der bis zu 20 cm hoch ist.
    5. Ziehen Sie den Kolben vorsichtig heraus, damit das Fixiermittel in Richtung Luftröhre fließen kann. Falls sich einige Luftblasen in der Kanüle befinden, legen Sie den Kolben vorsichtig auf die Spritze und die Flüssigkeit beginnt nach einigen Sekunden zu fließen.
    6. Lassen Sie die linke Lunge insitu für 5 Minuten aus einer Höhe von 20 cm auf ihre Gesamtkapazität aufblasen und bilden Sie eine 20 cm große Wassersäule.
    7. Stellen Sie während dieses Verfahrens sicher, dass die richtigen Lungenlappen vor dem Kontakt mit Paraformaldehyd geschützt sind, da dies die nachgeschalteten Assays beeinträchtigt.
    8. Legen Sie gefaltetes Laborgewebe, um Paraformaldehyd zu absorbieren, das mit den rechten Lungenlappen in Kontakt kommen könnte.
      ACHTUNG: Paraformaldehyd ist hochgiftig. Atmen Sie daher nicht ein oder stellen Sie keinen Kontakt zu exponierten Körperteilen auf. Seien Sie bei der Handhabung äußerst vorsichtig.
    9. Während der Zeit der Paraformaldehyd-Instillation den Bauch desinfizieren.
    10. Schneiden Sie die rechten Lungenlappen von der Luftröhre ab, um sicherzustellen, dass Sie jeden Faden entfernen und die Lappen sofort in ein markiertes Kryovial legen und in flüssigen Stickstoff für die nachgeschaltete molekulare / biochemische Zytokinanalyse / RT-PCR / Western Blot-Analyse von Lungenhomogenat fallen lassen.
    11. Schneiden Sie die linke Lunge vorsichtig für Bindegewebe oder Pleuramembranen ab und tauchen Sie sie 24 h lang bei 4 °C in 2% Paraformaldehyd.
    12. Betten Sie die feste Lunge gemäß dem Standard-Einbettungsprotokoll in Paraffin ein.
      Achtung:Überhitzen Sie die Lungenproben nicht.
    13. Schneiden Sie den Bauchteil ab und enthäuten Sie ihn vom Beckenknochen (Hüftknochen).
    14. Trennen Sie die linken und rechten Oberschenkelknochen vom Beckenteil in einer mit Kochsalzlösung gefüllten Petrischale, die auf Eis gehalten wird.
  7. Sternal- und Femurknochenmark-Aspirat-Sammlung
    1. Reinigen Sie das Gewebe und die Muskeln von den Knochen, indem Sie Laborgewebe verwenden.
    2. Sammeln Sie den ventralen Brustkorb und das Brustbein in einer mit Kochsalzlösung gefüllten Petrischale, die auf Eis gehalten wird.
    3. Schneiden Sie die distalen und proximalen Spitzen der Sternal- und Femurknochen ab.
    4. Die Knochen 4 mal mit 0,5 ml Kochsalzlösung durchziehen, mit gut sitzenden Nadeln (24 bis 28 G) auf 1 ml Spritzen und die Fraktionen von jedem Knochen in markierten Röhrchen sammeln, die mit Filtern ausgestattet und auf Eis gelegt werden.
      HINWEIS: Das Nadelmessgerät variiert je nach Tiergröße. Nach der Spülung sollte der Oberschenkelknochen transparent erscheinen.
    5. Sobald die Proben gesammelt wurden, beuteln Sie die Maus in eine Plastiktüte und legen Sie sie zur ordnungsgemäßen Entsorgung gemäß den Richtlinien der institutionellen Tiereinrichtung in einen Tierkörpergefrierschrank.

3. Probenverarbeitung

  1. Gesamt- (TLC) und differentielle (DLC) Leukozytenzahl
    1. Zentrifugen-peripheres Blut, BAL, Lungengefäßperfusat und Knochenmarkproben (Sternal und Femur) für 10 min bei 500 g.
    2. Sammeln Sie die Überstände, frieren Sie sie blitzgefroren und lagern Sie sie bei -80 °C bis zur weiteren Analyse.
    3. Rekonstituieren Sie die Zellen in mindestens 200 μL PBS.
    4. Führen Sie TLC durch, indem Sie BAL-, Blut-, Lungengefäßperfusat- und Knochenmarkzellen auf einem Hämozytometer zählen.
    5. Färben Sie weitere 9 μL Aliquot von BAL mit einer 1 μL Mischung aus Calcein grün und rotem Ethidium Homodimer-1, um lebende (grüne) Zellen aufgrund der intrazellulären Esteraseaktivität und beschädigte BAL-Zellen (in rot) aufgrund des Verlusts der Plasmamembranintegrität zu quantifizieren.
    6. Fügen Sie 2% Essigsäure hinzu, um RBCs zu lysieren, in einem Verhältnis von 1: 10 für Blut TLC und 1: 2 Verhältnis für Lungengefäßperfusat TLC.
      ACHTUNG: Passen Sie die Zellkonzentrationen durch Verdünnung in PBS an, wenn die Konzentration mehr als 1x106 Zellen pro ml beträgt (sehr wichtig für die Knochenmarkproben).
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen, um Zytospins auf Objektträgern vorzubereiten und zu färben, wie unten für DLCs erläutert. Zählen Sie mindestens 100 Zellen für differentielle Leukozytenzellzahlen (DLCs).
      HINWEIS: Normalerweise kann man zwei Zytospinen auf einem Objektträger vorbereiten. Und nach 10-15 Minuten Lufttrocknung fahren Sie mit dem Färbeschritt fort.
    8. Teilen Sie das gesammelte BAL von drei Pilotmäusen pro Gruppe in jeweils zwei Zytospine auf und färben Sie Esin/Tubulin und Mitochondrien mit aktiver oxidativer Phosphorylierung (reduzierter Mitotracker) an. Verwenden Sie die BAL von drei weiteren Mäusen, um sich in jeweils zwei Zytospine für NK1.1 / Gr1 / CX3CR1 und ATPβ / Ki-67 / CD61 / Angiostatin-gefärbte Dias aufzuteilen. Teilen Sie die BAL von drei weiteren Mäusen in jeweils zwei Zytospine auf, um sie für ATPα/Ly6G und CX3CR1/Siglec-F zu färben.
  2. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) und Lung Vascular Perfusate (LVP) Gesamtproteinquantifizierung
    1. UmO3- und LPS-induzierte Störungen der Gefäßbarriere oder des relativen onkotischen Drucks in den beiden Lungenkompartimenten (d.h. den alveolären Septum- (interstitiellen) und lungenvaskulären Perfusat-Kompartimenten (vaskulär) zu quantifizieren, messen Sie den Gesamtproteingehalt in den gesammelten Flüssigkeiten.
    2. Analysieren Sie die aufgetauten Überstandsfraktionen auf ihre Gesamtproteinkonzentration mit einem standardwaschmittelresistenten kolorimetrischen Assay.
    3. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) und Lungengefäßperfusat (LVP) Chemokinanalyse
      1. Als nächstes analysieren Sie die Chemokine in BAL- und LVP-Überständen (Lung Vascular Perfusate) mit einem 33-Plex-Immunoassay auf Basis magnetischer Perlen. Dies wird über die Richtungsalität von Atemwegen / Interstitium vs. vaskulären Chemokingradienten informieren, die nach kombinierten Expositionen festgestellt wurden.
      2. Analysieren Sie die folgende Chemokinplatte: CXCL13 (B-Lymphozyten-Chemoattraktant), CCL27 (IL-11 R-alpha-Locus-Chemokin (ILC)), CXCL5 (epithelial-abgeleitetes neutrophilaktivierendes Peptid 78 (ENA-78)), CCL-11 (Eotaxin-1), Eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (Fractalkin), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (Interferon gamma), IL-10 (Interleukin-10), IL-16 (Interleukin-16), IL-1β (Interleukin-1 beta), IL-2 (Interleukin-2), IL-4 (Interleukin-4), IL-6 (Interleukin-6), CXCL-10 (Interferon gamma-induziertes Protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-induzierbares Protein 9 (IP-9)), KC (Keratinozyten-Chemoattraktant), MCP-1 (Monozyten-Chemoattractant Protein-1), MCP-3 (Monozyten-Chemoattractant Protein-3), MCP-5 (Monozyten-Chemoattractant Protein-5), MDC (Makrophagen-abgeleitetes Chemokin (CCL22)), MIP-1α (Makrophagen-Entzündungsprotein-1 alpha), MIP-1β (Makrophagen-Entzündungsprotein-1 beta), MIP-2 (Makrophagen-Entzündungsprotein-2), MIP-3α (Makrophagen-Entzündungsprotein-3 alpha), MIP-3β (Makrophagen-Inflammatory Proteiny Protein-3 beta), RANTES (reguliert bei Aktivierung, normale T-Zelle exprimiert und sezerniert (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (Stromazell-abgeleiteter Faktor 1), TARC (Thymus und Aktivierung reguliertes Chemokin (TARC)), TECK (Thymus-Exprimiertes Chemokin (CCL25)) und TNFα (Tumornekrosefaktor alpha).

4. Cytospin-Färbung und Lungenhistologie

  1. Cytospin biochemische Färbung
    1. Umschließen Sie die Zytospine mit einem hydrophoben Pen, um die Chemikalien für die Inkubation während des Verfahrens zu enthalten.
    2. Rehydrieren Sie die Zytospins in PBS für 5 Minuten.
    3. Fixieren Sie die Cytospin-Proben in 2% Paraformaldehyd für 10 Minuten, waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
    4. Mit eiskaltem 70% Aceton für 7 Minuten permeabilisieren und erneut dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten waschen.
    5. Färbung für Aktin und Tubulin oder reduziertes Mitotracker (inkubieren mit einer Mischung aus 2 μg/50 μL Alexa 488 konjugierigem Phalloidin in grün und 2 μg/μL Alexa 555 konjugiertem Maus-Anti-α Tubulin bzw. reduziertem Mitotracker in Rot) für 15 Minuten.
      HINWEIS: Verwenden Sie den IgG1-Isotypkontrollantikörper der Maus in einem separaten Cytospin, um das Tubulin-Färbeprotokoll zu validieren. Führen Sie die gleichen Schritte aus wie von 4.1.1 bis 4.1.8 beschrieben, jedoch für Isotypsteuerelemente.
    6. Entfernen Sie die Flecken, indem Sie die Mischung vorsichtig vom Dia kippen. Inkubieren Sie die Objektträger mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) für 5-10 min, um die Kerne zu färben.
    7. Die Zytospine 3 mal mit PBS für jeweils 5 min waschen, mit Anti-Fade-Montagemedien abdecken und vor der Bildgebung über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren.
    8. Erfassen Sie Bilder unter einem aufrechten Weitfeldmikroskop, das mit einer wissenschaftlichen Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie bei der Abbildung von Dias konsistente Kamerabelichtungszeiten für die verschiedenen Fluoreszenzkanäle sicher.
  2. Cytospin immunfluoreszierende Färbung:
    1. Umschließen Sie die Zytospine mit einem hydrophoben Pen, um die Chemikalien für die Inkubation während des Verfahrens zu enthalten. Rehydrieren Sie die Zytospins in PBS für 5 Minuten.
    2. Fixieren Sie die Cytospin-Proben, indem Sie sie 10 Minuten lang in 2% Paraformaldehyd inkubieren, dreimal mit PBS für jeweils 5 minuten waschen.
    3. Permeabilisieren Sie mit 0,1% kaltem Triton X-100 für 2 Minuten, waschen Sie dreimal mit PBS für jeweils 5 min.
    4. Als nächstes blockieren Sie fc für 15 Minuten, indem Sie den Cytospin mit 1:50 Verdünnung des Fc-Block-Antikörperbestands inkubieren (um sicherzustellen, dass der primäre Maus-Antikörper nicht unspezifisch mit den Fc-Antikörpern der Maus kreuzreagiert).
    5. Kippen Sie die Objektträger, um den Fc-Block zu entfernen und wechseln Sie zu 1% BSA für und inkubieren Sie den Cytospin mit einer Mischung aus 3 primären Antikörpern von Interesse (siehe Tabelle 1 für die verschiedenen Kombinationen) für 30 Minuten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Isotyp-Kontrollantikörper (inkubieren Sie mit einer Mischung aus Maus IgG1 und Ratten IgG2b Kappa Primären Antikörpern, indem Sie die Schritte 4.2.1 bis 4.2.9 ausführen und die Antikörper durch Isotypkontrollen ersetzen) parallel zu entsprechenden sekundären Antikörpern ausführen, wie in unserer aktuellen Studie20beschrieben.
    6. 3 mal mit PBS für je 5 min waschen. Inkubieren Sie die Zytospine mit einer Mischung aus entsprechend entwickelten sekundären Antikörpern (siehe Tabelle 1 für die Details).
    7. Entfernen Sie die Flecken, indem Sie die Mischung vorsichtig vom Objektträger kippen, inkubieren Sie sie mit DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol) für 5-10 minuten, um die Kerne zu färben. 3 mal mit PBS für je 5 min waschen.
    8. Coverslip mit Anti-Fade-Montagemedien und vor der Bildgebung über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahren.
    9. Erfassen Sie Bilder unter einem aufrechten Weitfeldmikroskop, das mit einer wissenschaftlichen Kamera ausgestattet ist. Stellen Sie bei der Abbildung von Dias konsistente Kamerabelichtungszeiten für alle Fluorophorkanäle sicher.
  3. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Histologie
    1. Führen Sie eine modifizierte H &E-Färbung 3 an Lungen-Kryo-Abschnitten für alle Gruppen durch.
  4. Bildanalyse
    1. Verarbeiten und analysieren Sie Bilddatendateien (.tiff) in Der offenen Software Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Überprüfen Sie die erforderlichen Parameter (Fläche, Umfang, integrierte Dichte, Formdeskriptoren, Feret-Durchmesser, Zirkularität, Display-Label), die auf der Registerkarte Analysieren und Messen festlegen aufgezeichnet werden sollen.
    3. Mit dem ROI-Managerkönnen Sie mit dem Werkzeug "Freihandauswahl" manuell etwa 50-200 Zellen im zusammengeführten Bildfenster skizzieren. Speichern Sie die Regionen von Interesse (ROI) mit dem Befehl Strg+T und kopieren Sie die gespeicherten ROIs für jede Zelle auf alle Fluorophorkanäle.
    4. Drücken Sie anschließend Strg+M, um die voreingestellten Parameter für alle fluoreszierenden Kanäle zu messen (z. B. 405 nm (DAPI oder ATPβ in blau), 488 nm (Aktin oder NK1.1 oder Ki-67 in grün), 568 nm (Tubulin oder Gr1 oder CD61 in rot) und 633 nm (CX3CR1 oder Angiostatin in Magenta)).
    5. Speichern Sie die Ergebnisse als .csv Datei unter einem geeigneten Namen, der Ihre Analyse darstellt. Kopieren Sie die Ergebnisse aus der .csv-Datei in eine Tabelle und teilen Sie die Fluoreszenzintensität (FI) (die Spalte Raw Integrated Density aus der Ergebnisdatei) des gefärbten Moleküls durch die von DAPI oder CD61 FI gemäß Färbedesign. Diese Verhältnisse werden als "DAPI- oder CD61-normalisierte FI-Verhältnisse" bezeichnet.
    6. Als nächstes zeichnen Sie diese normalisierten Verhältnisse, Zirkularität, Zellumfang und Feretdurchmesser auf, um jede Änderung der Zellgröße nach der kombiniertenO3- und LPS-Exposition zu bewerten.
    7. Verwenden Sie geeignete statistische Software, um die Normalität der gesammelten Daten zu überprüfen und die Nullhypothese zu testen (siehe Abschnitt zur statistischen Analyse unten).
  5. statistische Analyse
    1. Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± SEM aus. Pro Gruppe wurden mindestens drei Mäuse verwendet.
    2. Für die Chemokin-Datenanalyse passen Sie die Einweg-ANOVA-p-Werte für die Falscherkennungsrate gemäß der Benjamini- und Hoshberg-Korrektur an.
    3. Analysieren Sie Bildparameter, Zellularität, Feret-Durchmesser, Perimeter, DAPI oder CD61 normalisierte Fluoreszenzintensitätsverhältnisse durch Mann-Whitney U-Test (zum Vergleich von zwei Gruppen) oder Kruskal Wallis-Test (zum Vergleich mehrerer Gruppen), da diese Daten nicht normal verteilt waren.
    4. Für den Rest der bildgebungsexperimente Analysieren Sie die Ergebnisse mit einer Einseitigen Varianzanalyse, gefolgt von Sidaks mehrfachen Vergleichen. p-Werte <0,05 wurden als signifikant angesehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kombinierte O3- und LPS-Exposition führt zu systemischen Entzündungen und Knochenmarkmobilisierung nach 72 h: Zellzählungen in verschiedenen Kompartimenten zeigten signifikante Veränderungen im peripheren Blut und der Gesamtzellzahlen des Femurknochenknochenmarks bei kombinierten O3- und LPS-Expositionen. Obwohl kombinierteO3- und LPS-Expositionen keine Veränderungen der Gesamtzellzahl von BAL (Abbildung 1A) oder LVP (Abbildung 1B) induzierten, stellten polymorphonukleäre Zellen bei 24 (Abbildung 1F,Ergänzende Abbildung1 ), 36 und 72 h nach der Exposition als vorherrschender Zelltyp dar. Bitte beachten Sie das Fehlen einer Siglec-f- und CX3CR1-Färbung in polymorphonukleären Zellen bei 24 h BAL Cytospin-Bild (Abbildung 1F). Die dreifache DAPI/CD11b/Gr1-Färbung von BAL-Zytospinen zeigte das Vorhandensein großer CD11b- und Gr1-positiver mononukleärer Zellen, die Makrophagen bei 0 h sind, die sich zu kleineren polymorphonukleären Zellen mit punktuellem Gr1-Färbung, aber ohne CD11b-Färbung bei 4 h ändern (wie im Einschub in Supplemental 1Fgezeigt). Die Mehrheit der BAL-Zellen ist polymorphonukleär und sowohl für CD11b als auch für Gr1 nach 24 Stunden nach der Exposition positiv(ergänzende Abbildung 1).

Die Mäuse zeigten eine systemische Leukozytose nach 24 h (3,3-fach vs. 0 h, p<0,05, Abbildung 1C),gefolgt von Leukopenie nach 72 h, die durch 13-fach niedrigere Zahlen im peripheren Blut im Vergleich zu 24 h (p<0,01) und eine 8,6-fache niedrigere anzahl im Vergleich zu 4 h (p<0,05) nach kombinierterO3- und LPS-Exposition gekennzeichnet war(Abbildung 1C). Die sternalen Knochenmarkzellen waren auch im Vergleich zu 0 h oder nach kombinierterO3- und LPS-Exposition unverändert (Abbildung 1D). Die Femurknochenmarkzahlen zeigten eine späte 28,8-fache Spitze nach 72 h im Vergleich zu 0 h (p<0,01, Abbildung 1E)sowie anderen Zeitpunkten (p<0,01, Abbildung 1E). Die Visualisierung der LVP- und Sternal- sowie Femurknochenmarkzellen zeigte ebenfalls Veränderungen in den Zelltypen zu überwiegend polymorphonukleären Zellen (Ergänzende Abbildung 1). Die sternalen Knochenmarkzellen zeigten Anzeichen von Schäden, wie durch extrazelluläres Kernmaterial belegt wird. Das Femurknochenmark zeigte eine höhere Anzahl von CD11b- und Gr1-positiven Zellen (Ergänzende Abbildung 1), die mit den Zellzahlen übereinstimmen.

Der BAL-Gesamtproteingehalt war nach 36 h nach kombinierterO3- und LPS-Exposition am höchsten: Die Quantifizierung der Gesamtproteine in den LVP- und BAL-Kompartimenten wurde durchgeführt, um ozoninduzierte Lungenödeme zu korrelieren, d. H. Plasmaproteinexsudation aufgrund der resultierenden vaskulären und epithelialen Barrierebeeinträchtigung aufgrund der kombinierten Exposition. Das BAL-Gesamtprotein war nach 36 h (p<0,05) im Vergleich zu 4 h 4,5-fach höher(Abbildung 2A). Das LVP-Protein blieb jedoch nach der Exposition unverändert (Abbildung 2B).

KombinierteO3- und LPS-Exposition induziert starke Chemokingradienten im Lungengefäßkompartiment und nicht BAL: Chemokin-Multiplex-Assays wurden sowohl an BAL- als auch an LVP-Überständen durchgeführt. Bitte beachten Sie, dass die relativen Unterschiede zwischen diesen beiden Fächern eine bevorzugte Aufbewahrung in einem bestimmten Fach darstellen. Der eosinophile Chemoattraktant Eotaxin-2 war nach 4 h im LVP-Kompartiment 4,3-fach höher als 0 h (p<0,05, Abbildung 3A). Im BAL-Kompartiment war Eotaxin-2 nach 4 h im Vergleich zu 0 h 3,2-fach niedriger (p<0,01, Abbildung 3B). Die BAL-Eotaxin-2-Spiegel sanken bis 72 h mit einer 12,6-fachen Reduktion gegenüber 0 h (p<0,01, Abbildung 3B)kontinuierlich ab. Der Lymphozyten-Chemoattraktant IL-2 war nach 4 h im LVP-Kompartiment 10,1-fach höher als 0 h (p<0,05, Abbildung 3C). Im BAL-Fach war IL-2 nach 36 h im Vergleich zu 0 h 5,0-fach niedriger (p<0,05, Abbildung 3D). Die BAL-Eotaxin-2-Spiegel sanken bei 72 h im Vergleich zu 0 h konstant um das 5,9-fache im Vergleich zu 0 h (p<0,05, Abbildung 3D).

Interessanterweise wurden viele Chemokine nach 4 h im LVP und nicht im BAL verändert. Die meisten dieser Chemokine zeigten einen bescheidenen, aber signifikanten Anstieg der LVP-Spiegel nach 4 Stunden im Vergleich zu späteren Zeitpunkten. Obwohl die Eotaxin-1-Spiegel nach den Expositionen im Vergleich zu 0 h nicht hoch waren, waren die Werte nach 4 h im Vergleich zu 24 (2,7-fach, p<0,05) und 72 h (5,0-fach, p<0,01, Abbildung 4A)nach kombinierter Exposition signifikant hoch. Die LVP-TNFα-Spiegel waren nach 4 h im Vergleich zu 36 h 3,4-fach höher (p<0,05, Abbildung 4B). In ähnlicher Weise war LVP IFNγ bei 4 h im Vergleich zu 72 h 2,9-fach höher (p<0,05, Abbildung 4C). Die CX3CL1-Werte waren auch mit 4 h im Vergleich zu 24 (1,7-fach, p<0,05), 36 (1,6-fach, p<0,05) und 72 h (2,2-fach, p<0,01) nach kombinierten Expositionen hoch (Abbildung 4D). Die CCL27-Spiegel zeigten auch höhere Werte nach 4 h im Vergleich zu 24 (2,7-fach, p<0,05), 36 (3,9-fach, p<0,01) und 72 h (2,9-fach, p<0,05) nach kombinierten Expositionen(Abbildung 4E).

Einige Chemokine hatten eine starke Präsenz im LVP nach 4 h nach kombinierten Expositionen und änderten sich nicht in der BAL vor und nach der Exposition, was auf eine starke Chemokinreaktion der Lungenkapillaren hindeutet. Nach 4 h waren die IL-16 LVP-Spiegel 3,4-fach im Vergleich zu 0 h (p<0,01), 3,2-fach im Vergleich zu 24 h (p<0,01), 4,5-fach im Vergleich zu 36 h (p<0,01) und 4,6-fach im Vergleich zu 72 h (p<0,01) nach kombinierten Expositionen(Abbildung 4F). Nach 4 h waren die neutrophilen Chemokin-, CXCL5-LVP-Spiegel 2,0-fach im Vergleich zu 0 h (p<0,01), 4,7-fach im Vergleich zu 24 h (p<0,01), 2,2-fach im Vergleich zu 36 h (p<0,01) und 2,7-fach im Vergleich zu 72 h (p<0,01) nach kombinierten Expositionen(Abbildung 4G). Nach 4 h waren die CXCL10 LVP-Werte 2,3-fach im Vergleich zu 0 h (p<0,01), 2,1-fach im Vergleich zu 24 h (p<0,05), 2,5-fach im Vergleich zu 36 h (p<0,01) und 2,7-fach im Vergleich zu 72 h (p<0,01) nach kombinierten Expositionen(Abbildung 4H). Nach 36 h waren die neutrophilen Chemokin-, SDF1α-LVP-Spiegel 4,2-fach im Vergleich zu 0 h (p<0,01), 2,9-fach im Vergleich zu 24 h (p<0,05), 6,8-fach im Vergleich zu 72 h (p<0,01) nach kombinierten Expositionen(Abbildung 4I). Nach 4 h waren die MIP3β LVP-Spiegel 2,3-fach im Vergleich zu 0 h (p<0,05) und 2,3-fach im Vergleich zu 72 h (p<0,05) nach kombinierten Expositionen(Abbildung 4J).

KombinierteO3- und LPS-Exposition induziert Nekrose, stört zelluläre Zytoskelett-, Plasmamembran- und mitochondriale Integrität: Da die kompartimentären Leukozytenzahlen und Proteingehalte nicht mit den LVP-Chemokingradienten korrelierten, wurde es wichtiger, die aus diesen Kompartimenten gewonnenen Zellen zu visualisieren. Ex-vivo-Aktin/Tubulin-Färbung der Baseline (0 h) BAL-Zellen zeigten das Vorhandensein von kortikalem Aktin, Stressfasern sowie Lamellipodie (dargestellt in grün, Abbildung 5 links oberes Feld) und Mikrotubuli-Netzwerk (in rot dargestellt, Abbildung 5 links oberes Panel), die mit einer reduzierten Mitotracker-Färbung zusammenfielen, die auf das Vorhandensein aktiver Mitochondrien hinweist (in rot, Abbildung 5 links unteres Feld). Mehr als 95% der BAL-Zellen waren zu Studienbeginn mononukleär. Nach 4 h zeigten BAL-Zellen extrazelluläres Kernmaterial, punktierte zytoplasmatische Aktinfärbung ohne Lamellipodie und reduzierte kortikale Aktinfärbung (grün dargestellt, Abbildung 5 rechtes oberes Panel), aufgefächertes Mikrotubuli-Netzwerk (in rot dargestellt, Abbildung 5 rechte oberes Panel), das nicht der reduzierten Mitotracker-Färbung entsprach (in rot, Abbildung 5 links rechts). Die DAPI-normalisierte Aktin-Fluoreszenzintensitätsanalyse zeigte eine 3,7-fache Abnahme des Verhältnisses, was auf eine Verringerung der Aktinfärbung nach 4 h nach der Exposition hinweist (p<0,01, Abbildung 6A). In ähnlicher Weise reduzierte DAPI die Tubulin-Fluoreszenzintensität nach der Exposition ebenfalls um das 1,5-fache (p<0,01, Abbildung 6B),was auf eine Verringerung der Tubulinfärbung hindeutet. Der Verlust der Lamellipodie zeigte sich bei einer Erhöhung der Zirkularität des zellulären BAL-Zytoskeletts sofort, d. h. bei 2 h (p<0,01, Abbildung 6C) und 4 h (p<0,05, Abbildung 6C)nach Exposition im Vergleich zu 0 h und einer Abnahme der zytoskelettalen Zirkularität bei 24 (p<0,05) und 36 h (p<0,01) nach expositions, im Vergleich zu 0 h(Abbildung 6C).

Bis zu 24 h waren die BAL-Zellen aus der kombinierten Exposition doppelt positiv für Calcein (in grün, Abbildung 7),was auf das Vorhandensein einer aktiven Esteraseaktivität hinweist, und Ethidiumhomdimer (in rot, Abbildung 7),was darauf hindeutet, dass, obwohl einige Zellen tot waren (rot), die Mehrheit teilweise kompromittierte Zellen waren. Nach 36 h waren die BAL-Zellen weitgehend lebensfähig (grün), was darauf hindeutet, dass die kompromittierten Zellen durch Leukozyten ersetzt wurden, die aus anderen systemischen Kompartimenten rekrutiert wurden (Abbildung 7).

Die spezifische ATPα- und Ly6G-Färbung der BAL-Zellen zeigte eine diskrete intrazelluläre Lokalisation (Movies 1 und 2) sowohl der Proteine in alveolären Makrophagen als auch der Neutrophilen nach Exposition (Abbildung 7). Die kombinierte Exposition führte zu einer Verringerung des DAPI-normalisierten Fluoreszenzintensitätsverhältnisses von ATPα (Abbildung 7, 8A) und zu einem Anstieg des intrazellulären Ly6G-Proteingehalts (Abbildung 7, Abbildung 8B, Filme 1 und 2). Die Verringerung der ATPα-Färbung nach 24 Stunden nach der Exposition korrelierte mit niedrigerem Tubulin und reduzierte bis zu einem gewissen Grad die Mitotracker-Färbung. Wir beobachteten auch anukleäre ATPα-positive Zellkörper nach der Exposition, bei denen es sich um Blutplättchen geben könnte. Wir haben unsere Ergebnisse jedoch nicht bestätigt. Nach 2 h beobachteten wir kleinere mononukleäre BAL-Zellen (p<0,01 Abbildung 8C,p<0,01 Abbildung 8D)im Vergleich zu 0 h, aber nach 4 h waren die mononukleären Zellen größer (p<0,01 Abbildung 8C,p<0,01 Abbildung 8D) im Vergleich zu 0 h. Bei 24 (p<0.01 Abbildung 8C, p<0.01 Abbildung 8D) und 36 h (p<0.01 Abbildung 8C, p<0.01 Abbildung 8D) wurden die BAL-Zellen aufgrund einer Verschiebung zu polymorphonukleären Zellen im Vergleich zu 0 h zunehmend kleiner.

Die Immunphänotypisierung von BAL-Zellen zeigte transiente Expressionen von NK1.1, ATP-β und Ki-67 und anhaltende Expressionen von Gr1-, CX3CR1- und Angiostatin-positiven BAL-Zellen nach kombiniertenO-3- und LPS-Expositionen: Die immunfluoreszierende Färbung des ersten Satzes von BAL-Zytospinen wurde auf DAPI-Färbung normalisiert. Es gab einen Anstieg der zellulären NK1.1-positiven Zellen nach 24 h (p<0,05 vs 0 h, Abbildung 9,10A). Nach 36 h hatten die BAL-Zellen eine geringere zelluläre NK1.1-Fluoreszenzintensität (p<0,01 vs 0 und 24 h, Abbildung 9,10A). Die zelluläre Gr1-Fluoreszenzintensität war mit 24 h (p<0,01 vs 0 h, Abbildung 9,10B)sowie 36 h (p<0,01 vs 0 h, Abbildung 9,10B)höher. In ähnlicher Weise war die zelluläre CX3CR1-Fluoreszenzintensität bei 24 h (p<0,01 vs 0 h, Abbildung 9,10C)sowie 36 h (p<0,01 vs 0 h, Abbildung 9,10C)höher.

Bei Normalisieren auf zelluläres CD61, das auch in der Expression allgegenwärtig ist, zeigte sich eine Zunahme der zellulären ATPβ-Fluoreszenzintensität bei 24 h (p<0,01 vs 0 h, Abbildung 9,10D)und eine Abnahme der zellulären ATPβ-Fluoreszenzintensität bei 36 h (p<0,01 vs. 0 und 24 h, Abbildung 9,10D). Bemerkenswerterweise zeigte ATPβ eine überwiegend nukleare Lokalisation nach 24 h im Vergleich zur peripheren Lokalisierung nach 36 h (Abbildung 9). Die zelluläre Fluoreszenzintensität von BAL Ki-67, einem Indikator für die Zellproliferation, war mit 24 h (p<0,01 vs. 36 h, Abbildung 9,10E)höher als bei 0 und 36 h. Die Werte lagen unter den Ausgangswerten bei 36 h (p<0,01, Abbildung 9,10E),höchstwahrscheinlich aufgrund einer höheren polymorphonuklearen CD61 vs. Ki-67-Expression nach 36 h (Abbildung 9). Schließlich war die zelluläre Fluoreszenzintensität von BAL-Angiostatin sowohl bei 24 als auch bei 36 h konstant hoch (p<0,01 vs. 0 h, Abbildung 9,10F), was auf einen spezifischen Anstieg dieses Metalloproteinase-gespaltenen Plasminogenfragments während der Entzündungsreaktion der Lunge hinweist.

Kombinierte Expositionen führen zu weit verbreiteten Lungenschäden: Die Lungenhistologie zeigte, dass die kombinierten Expositionen zu längeren Schäden an der Lunge führen, wie sie bei H & E-gefärbten Kryosektionen beobachtet werden (Abbildung 11). Obwohl bronchioläre und alveoläre Septumschäden erwartet wurden, war es überraschend, endotheliale Schäden größerer Gefäße um 36 h nach exposition zu beobachten (Abbildung 11). Es gab adhärente intravaskuläre Leukozyten, Flecken von Leukozytenaggregaten (einschließlich Neutrophilen) in den geschädigten alveolären septalen und peribronchiolären Regionen (Abbildung 11).

Figure 1
Abbildung 1: Kompartimentleukozytenzahl: A) Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Gesamtleukozytenzahl bei 0 (d.h. Ausgangswert), 4, 24, 36 und 72 h nach kombinierter 0,05 ppb Ozon (O3)und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen. B) Lungengefäßperfusat (LVP) Gesamtleukozytenkonzentration bei 0 (d.h. Ausgangswert), 4, 24, 36 und 72 h nach kombinierter 0,05 ppb Ozon (O3)und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen. C) Periphere Blutkonzentration (PB) Gesamtleukozytenkonzentration bei 0 (d.h. Ausgangswert), 4, 24, 36 und 72 h nach kombinierter 0,05 ppb Ozon (O3)und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen. D) Sternale Knochenmark (BM) Gesamtleukozytenkonzentration bei 0 (d. h. Ausgangswert), 4, 24, 36 und 72 h nach kombinierter 0,05 ppb Ozon (O3)und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen. E) Femurknochenmark (BM) Gesamtleukozytenkonzentration bei 0 (d. h. Ausgangswert), 4, 24, 36 und 72 h nach kombinierter 0,05 ppb Ozon (O3)und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen. Für die Diagramme A-E wird 0 h in blau, 4 h in rot, 24 h in grün, 36 h in lila und 72 h in orangefarbenen Datenpunkten dargestellt; * S<0.05 und ** S<0.01. F) Repräsentativer BAL Cytospin-Objektträger aus 24-Stunden-Exposition, der mononukleäre und polymorphonukleäre Zellen zeigt, wenn sie mit DAPI (blau), CX3CR1 (grün) und Siglec-F (rot) für Kerne gefärbt werden. Beachten Sie, dass die Zusammenführung von CX3CR1 und Siglec-F orange-gelb angezeigt wird. Die Mehrheit der mononukleären Zellen ist positiv für Siglec-F, was ein Merkmal von alveolären Makrophagen ist. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Gesamtproteinquantifizierung: A) Bronchoalveolarspülung (BAL) Gesamtproteingehalt und B) Lungenvaskuläres Perfusat (LVP) Gesamtproteinkonzentration wurde durch 660 nm Proteinassay (Thermoscientific, IL, US) geschätzt. Für die Diagramme A-B wird 0 h in blau, 4 h in rot, 24 h in grün, 36 h in lila und 72 h in orangefarbenen Datenpunkten dargestellt; * S<0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Lungen-Eotaxin-2- und IL-2-Chemokingradienten: Von den 33 Chemokinen waren zwei Chemokine, die signifikant in der Lungengefäßperfusat (LVP) und bronchoalveolären Lavage (BAL) und Flüssigkeit nach kombinierten 0,05 ppb Ozon (O3 ) und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen A) LVP Eotaxin-2, B) BAL Eotaxin-2, C) LVP IL-2 und D) BAL IL-2 verändert waren. Die Daten wurden durch Einweg-Anova analysiert und der p-Wert für die Falscherkennungsrate mehrerer Variablen wurde gemäß Benjamini- und Hoshberg-Korrektur angepasst. Für die Graphen A-D wird 0 h in blau, 4 h in rot, 24 h in grün, 36 h in lila und 72 h in orangen Datenpunkten dargestellt. Paarweise Vergleiche wurden nach Bonferronis Korrektur analysiert. * steht für P<0,05, ** für P<0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Lungenvaskuläres Perfusat-Chemokin-Konzentrationen: Konzentrationen von zehn weiteren Chemokinen wurden verändert, jedoch nur im Lungengefäßperfusatkompartiment (LVP). A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α und J) MIP3β. Für die Graphen A-J wird 0 h in blau, 4 h in rot, 24 h in grün, 36 h in lila und 72 h in orangefarbenen Datenpunkten dargestellt. Paarweise Vergleiche wurden nach Bonferronis Korrektur analysiert. * steht für P<0,05, ** für P<0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Bronchoalveoläre Lavage (BAL) Cytospin Actin/Tubulin und reduzierte Mitotracker-Färbung: Repräsentative Bilder von mit Aktin/Tubulin gefärbten BAL-Zytospinen aus A) 0 h und B) 4 h nach kombinierter 0,05 ppb Ozon (O3) und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen. Beachten Sie, dass DAPI in Blau, Aktin in Grün und Tubulin in Rot angezeigt wird. Repräsentative Bilder von mitreduzierten mitotrackergefärbten BAL-Zytospinen aus A) 0 h und B) 4 h nach kombinierter 0,05 ppb Ozon (O3)und 50 μg intranasaler LPS-Exposition bei Mäusen. Beachten Sie, dass DAPI blau und reduzierter Mitotracker rot angezeigt wird. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Bronchoalveoläre Lavage (BAL) Zytoskelettprotein und Zirkularitätsanalyse: BAL-Zytospins, die für Aktin und Tubulin gefärbt waren, wurden auf DAPI-normalisierte Parameter analysiert, d.h. A) Actin zu DAPI Fluoreszenzintensität (FI) Verhältnis bei 0 und 4 h, B) Tubulin zu DAPI Fluoreszenzintensität (FI) Verhältnis bei 0 und 4 h und C) BAL Zellzellularität bei 0 (n = 75 Zellen), 2 (n = 105 Zellen), 4 (n = 66 Zellen), 24 (n = 31 Zellen), 36 (n = 154 Zellen) h. Da einige Pilotexperimente auch unmittelbar nachO-3- und LPS-Expositionen durchgeführt wurden, d.h. zum 2-Stunden-Zeitpunkt, haben wir auch einige sehr frühe BAL-Zellularitätsanalysen ab dem 2-Stunden-Zeitpunkt einbezogen, um die unmittelbaren Auswirkungen von O3hervorzuheben. Für die Graphen A-C wird 0 h in blau, 2 h in rot, 4 h in grün, 24 h in lila und 36 h in orangefarbenen Datenpunkten dargestellt. * steht für P<0,05, ** für P<0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Bronchoalveoläre Lavage (BAL) intrazellulärer und Plasmamembranstatus: BAL-Zellen wurden für lebenswichtige Flecken, Calcein (in grün) und Ethidiumhomdimere/EthHD (in rot) gefärbt, wie in repräsentativen oberen Bildtafeln bei A) 0, B) 24 und C) 36 h nachO3- und LPS-Expositionen gezeigt. Skalenbalken = 200 μm. BAL-Zytospine wurden immungefärbt für DAPI (blau), ATPα (grün) und Ly6G (rot). Repräsentative Bilder werden in den unteren Bildfeldern bei A) 0 und B) 24 h nach O3 und LPS Belichtungen gezeigt. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Bronchoalveoläre Lavage (BAL) mitochondriales Protein ATPα, lysosomales Protein Ly6G und Zellgrößenanalyse: Immungefärbte BAL-Zellen wurden normalisiert, damit DAPI A) ATPα zu DAPI Fluoreszenzintensität (FI) Verhältnis und B) Ly6G zu DAPI FI Verhältnis, bei 0 und 24 h nach O3 und LPS Exposition berechnen. Immungefärbte BAL-Zellen wurden auch auf ihre a) längsten, d.h. Frettchendurchmesser und B) Perimeter, bei 0, 2, 4, 24 und 36 h nachO3- und LPS-Expositionen analysiert. Für die Graphen A-D werden 0 h (n=119 Zellen) in Blau, 2 h (n=105 Zellen) in Rot, 4 h (n=66 Zellen) in Grün, 24 h (n=309 Zellen) in Lila und 36 h (n=154 Zellen) in orangefarbenen Datenpunkten dargestellt. * steht für P<0,05, ** für P<0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Bronchoalveoläre Lavage (BAL) intrazelluläre Phänotypisierung: BAL-Zellen wurden immungefärbt für DAPI (in blau), NK1.1 (in grün), Gr1 (in rot) und CX3CR1 (in magenta), wie in repräsentativen oberen Bildtafeln bei A) 0, B) 24 und C) 36 h nach O3- und LPS-Expositionen gezeigt. Skalenbalken = 50 μm. BAL-Zytospine wurden immungefärbt für ATPβ (in blau), Ki-67 (in grün), CD61 (in rot) und Angiostatin (in Magenta). Repräsentative Bilder werden in den unteren Bildfeldern bei A) 0, B) 24 und C) 36 h nach O3 und LPS Belichtungen gezeigt. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: Bronchoalveoläre Lavage (BAL) mitochondriales Protein ATPβ, lysosomales Protein Gr1, intrazelluläre CX3CR1- und Angiostatinanalyse: Immungefärbte BAL-Zellen wurden für DAPI normalisiert, um A) NK1.1 zu DAPI Fluoreszenzintensität (FI) Verhältnis, B) Gr1 zu DAPI FI Verhältnis und C) CX3CR1 zu DAPI FI Verhältnis, bei 0, 24 und 36 h nach O3 und LPS Expositionen zu berechnen. Immungefärbte BAL-Zellen wurden für CD61 normalisiert, um A) ATPβ zu DAPI Fluoreszenzintensität (FI) Verhältnis B) Ki-67 zu DAPI FI Verhältnis und B) Angiostatin (ANG) zu DAPI FI Verhältnis, bei 0, 24 und 36 h nach O3 und LPS Exposition zu berechnen. Für die Graphen A-F wird 0 h (n=21 Zellen) in blau, 24 h (n=796 Zellen) in rot und 36 h (n=2692 Zellen) in grünen Datenpunkten dargestellt. * steht für P<0,05, ** für P<0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 11
Abbildung 11: Lungenhämatoxylin und Eosin (H & E) Histologie. Ozon (O3)und LPS induzierte Lungenschreibesektion H&E Histologie bei 0, 24 und 36 h nach kombinierten O3 und LPS Expositionen. Regionen von Alveolarepithelschäden sind durch feste schwarze Pfeile und Endotheliale Schäden durch schwarze Pfeilspitzen gekennzeichnet. Gelbe Sternchen (*) stellen Leukozytenflecken in den alveolären Septumregionen dar. A = Alveolarraum, B = Bronchus, V = Gefäß, Maßstabsbalken = 100 μm für linke Bildtafeln und 50 μm für Bildtafeln auf der rechten Seite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

S.No. Primärer Antikörper Sekundärer Invitrogen-Antikörper
1 Maus anti-NK1.1 IgG2a kappa (Klon PK136), Invitrogen Katalog Nr. 16-5941-82 Alexa 488 konjugierte Ziege Anti-Maus IgG (H+L), Katalog-Nr. A11002
2 Ratte anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (Klon RB6-8C5), Invitrogen Katalog Nr. 53-5931-82 Alexa 568 konjugierte Ziege Anti-Ratte IgG (H+L), Katalog-Nr. A11077
3 Kaninchen anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Invitrogen Katalog Nr. 14-6093-81 Alexa 633 konjugierte Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), Katalog-Nr. A21070
4 Maus Anti-ATP5A1 IgG2b (Klon 7H10BD4F9), Invitrogen Katalog Nr. 459240 Alexa 488 konjugierte Ziege Anti-Maus IgG (H+L), Katalog-Nr. A11002
5 Ratte anti-Ly6G IgG2a kappa (Klon 1A8), Invitrogen Katalog Nr. 16-9668-82 Alexa 568 konjugierte Ziege Anti-Ratte IgG (H+L), Katalog-Nr. A11077
6 Maus anti-ATP5β IgG2b (Klon 3D5AB1), Thermofisher Katalog-Nr. A-21351 Alexa 350 konjugierte Ziegen-Antimaus IgG (H+L), Katalog-Nr. A11045
7 Ratte anti-Ki-67 (Klon SolA15) IgG2a kappa, Invitrogen Katalog Nr. 14-5698-82 Alexa 568 konjugierte Ziege Anti-Ratte IgG (H+L), Katalog-Nr. A11077
8 Armenischer Hamster Anti-CD61 (Klon 2C9. G2) IgG1 kappa, BD Katalog Nr. 553343 Alexa 568 konjugierte Ziege Antihamster IgG (H+L), Katalog-Nr. A21112
9 Kaninchen Anti-Angiostatin (Maus aa 98-116) IgG, Abcam Katalog-Nr. ab2904 Alexa 633 konjugierte Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), Katalog-Nr. A21070

Tabelle 1: Primäre und sekundäre Antikörperkombinationen zur Färbung von Zytospinen, die aus den Proben hergestellt wurden.

Auslesen Bal LVP Pb SBM FBM
Tlc * * + um 24 h; - um 36, 72 h + um 72 h
Neutrophilen + um 24, 36, 72 h + um 24 h * + um 4, 24, 36, 72 h + um 4, 24, 36, 72 h
Protein + um 36 h * n.d. n.d. n.d.
Chemokin-Profil - Für Eotaxin-2, IL-2 bei 4, 24, 36, 72 h + für Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β bei 4 h; + für SDF1α um 36 h n.d. n.d. n.d.
Zellengröße + um 4 h; - um 24, 36 h n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPα - um 24 h n.d. n.d. n.d. n.d.
NK1.1/Ki-67 + um 24 h n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG + um 24, 36 h n.d. n.d. n.d. n.d.

Tabelle 2: Eine umfassende Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse der Studie in verschiedenen Kompartimenten. * bezeichnet keine Veränderung, + bezeichnet eine Erhöhung und - bezeichnet eine Abnahme der gemessenen Parameter. BAL steht für broncho-alveoläre Lavageflüssigkeit, LVP für Lungengefäßperfusat, PB für peripheres Blut, SBM für Brustbeinknochenmark und FBM für Femurknochenmarkkompartiment.

Ergänzende Abbildung 1: Gr1- und CD11b-Immunfärbung: Repräsentative Bilder von DAPI (in blau), Gr1 (in grün) und CD11b (in rot) fluoreszierenden immungefärbten Cytospin-Objektträgern von Lungengefäßperfusat (LVP), sternalem Knochenmark (BM) und Femurknochenmark (BM) kompartimenten bei 0, 4 und 24 h nach kombinierten O3- und LPS-Expositionen. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzender Film 1 Dreidimensional gerendertes Volumen von BAL-Makrophagen ab einem Zeitpunkt von 0 h (d. h. Basislinie), mit Kern (blau dargestellt) und immungefärbt für ATPα (grün dargestellt) und Ly6G (rot dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Ergänzender Film 2: Dreidimensional gerendertes Volumen von BAL-Makrophagen ab 24 h Nach kombinierterO3- und LPS-Exposition, mit Kern (blau dargestellt) und immungefärbt für ATPα (grün dargestellt) und Ly6G (rot dargestellt). Beachten Sie das Vorhandensein von anukleären ATPα-positiven Körpern sowie einer fragmentierten Zelle. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die in der aktuellen Studie vorgestellten Methoden unterstreichen die Nützlichkeit der Multikompartimentanalyse zur Untersuchung mehrerer zellulärer Ereignisse während einer Lungenentzündung. Wir haben die Ergebnisse in Tabelle 2zusammengefasst. Wir und viele Labore haben die murine Reaktion auf die intranasale LPS-Instillation umfassend untersucht, die durch eine schnelle Rekrutierung von Lungenneutrophilen gekennzeichnet ist, die zwischen 6-24 Stunden ihren Höhepunkt erreicht, woraufhin die Auflösung einsetzt. Und kürzlich haben wir gezeigt, dass subklinisches O3 (bei 0,05 ppm für 2 h) allein signifikante Lungenschäden im C57BL/6NJ-Teilstamm15induzieren kann, der durch eine Partitionierung von Neutrophilen im Lungengefäßkompartiment gekennzeichnet ist, während beschädigte Makrophagen und Trümmer im BAL beobachtet wurden, was auf das Entzündungspotenzial vonO3hinweist. In diesem Modell beobachteten wir ein Fehlen von Neutrophilen im Alveolarkompartiment als Folge einerO3-induzierten alveolären Epithelschädigung und der daraus resultierenden Phagozytose durch die alveolären Makrophagen. Wir beobachteten nicht nur extrazelluläre DNA und Trümmer imO3-Modell, die BAL-Makrophagen waren dysmorph, die mit hohen IL-16-Spiegeln korrelierten, einem Alarmin, das normalerweise von sterbenden Neutrophilen freigesetzt wird. Daher ist es wichtig zu verstehen, ob diese subklinischenO3-Spiegel die Immunantwort in ansonsten robusten C57BL/6J-Substämmen beeinflussen können, wie bei supraphysiologischenO3-Spiegeln 21festgestellt. Wir beobachteten, dass kombinierteO3- und intranasale bakterielle Endotoxin-Rekrutierung von Neutrophilen in den pulmonalen sowie systemischen Kompartimenten induzierte, gekennzeichnet durch das Vorhandensein beschädigter Neutrophile in BAL, Lungengefäßperfusat, Sternal- und Femurknochenmarkkompartimenten ab 4 h, die nach 24, 36 und 72 h hoch blieben. Die Zellschädigung wurde als Verlust von kortikalem Aktin und Lamellipodie und Zunahme der Zellgröße in BAL-Leukozyten dargestellt; Neutrophile, die im BAL-Kompartiment analysiert wurden, zeigten eine signifikant reduzierte positive Reaktivität gegenüber Mikrotubuli, ATP-Synthase-Komplex V-Untereinheit α (ATPα) und aktiver mitochondrialer Färbung. Die Lunge passt sich dieser kombinierten Exposition an, indem sie die Expression des zellulären ATP-Synthase-Komplexes V-Untereinheit β (ATPβ) sowie des ATPβ-Liganden Angiostatin hochreguliert(Tabelle 2).

Ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung von Entzündungen ist das Verständnis der zellulären Nekrose zusammen mit Chemokingradienten. Es war interessant festzustellen, dass die Gesamtleukozytenzahl außer im peripheren Blut und im Femurknochenmarkkompartiment nicht unterschiedlich war. Diese Beobachtungen führten uns dazu, die zellulären Zytoskelettmuster, die Größe und die Immunphänotypisierung zu untersuchen. Wir beobachteten einen Verlust von Lamellipodie und aktiven Mitochondrien in BAL-Zellen, was auf Zellschäden hinweist. Die kortikale Aktinorganisation ist ein wesentliches Merkmal der interzellulären Signalübertragung und der daraus resultierenden Barriereeigenschaften. Zytoskelett-Desorganisation ist daher ein guter Marker für Zellschäden, wenn Nekrose nicht so offensichtlich zu beurteilen ist. Selbst nach 36 h hatten die BAL-Zellen eine kompromittierte Plasmamembran, wie die Ethidium-Homodimer-Färbung anzeigte. Unmittelbar nach den kombinierten Expositionen zeigten Neutrophile in BAL Eine Gr1-Positivität, aber eine im Wesentlichen negative Färbung für CD11b, die sich zur Vorderkante hin lokalisiert und beim Alveolarseptumkriechen22hilft. So führen die kombinierten Expositionen zur Ansammlung von atypischen Neutrophilen ohne das CD11b-Protein. LPS induziert keine Herunterregulierung von CD11b. Somit ist dieses Merkmal wahrscheinlich eine Folge einerO3-induzierten Schädigung der Neutrophilen.

Die BAL-Zellen hatten eine einzigartige Proteinsignatur mit höherer NK1.1-, Ki-67- und ATPβ-Färbung bei 24 h im Vergleich zu 0 h (Tabelle 2). Die BAL-Zellen hatten eine höhere Expression von Gr1, CX3CR1 sowie Angiostatin, sowohl bei 24 als auch bei 36 h im Vergleich zu 0 h (Tabelle 2). Diese Ergebnisse wurden durch das Vorhandensein von progressiv mehr Gr1-positiven Neutrophilen in BAL nach 24 und 36 h nach Exposition bestätigt (Tabelle 2). Das Vorhandensein von NK1.1-, CX3CR1- und Gr1-positiven Zellen nach 24 h zeigt die Rekrutierung von mononukleären und polymorphonukleären Zellen in der BAL an. Unter den mononukleären Zellen dominierten die CX3CR1-positiven Zellen nach 36 h, was auf das Vorhandensein von interstitiellen Makrophagen, Blutplättchen oder von Monozyten abgeleiteten Makrophagen hinweist. Die Aufnahme von Ki-67 und Angiostatin als Marker informierte uns über das proliferative vs. antiangiogene Milieu in der BAL. So führen die kombiniertenO3- und LPS-Expositionen zur Proliferation von wahrscheinlich Makrophagen, gefolgt von einem antiangiogenen Milieu aufgrund neutrophiler Infiltration. Die vorübergehende Zunahme der ATPβ-Färbung kann auf eine wichtige Anpassung hin zu einem erhöhten Überleben der BAL-Leukozyten nach 24 h hinweisen. Es muss beachtet werden, dass ATPβ an Angiostatin binden und ein verlängertes Überleben hemmen kann6,23, was sich tatsächlich im unteren Ki-67-Index bei 36 h nach der Exposition widerspiegelt.

Obwohl das BAL-Protein nach 36 h am höchsten war und nicht zu anderen Zeitpunkten, zeigte das Lungengefäßperfusat keine Veränderungen der Proteinkonzentration vor oder nach der Exposition. Es ist möglich, dass das Gefäßkompartiment nicht betroffen war, aber dies ist höchstwahrscheinlich durch oxidation von elektronenreichen Aminosäuren wie Methionin, Histidin und Cystein durch O3-induzierte freie Radikale unddaraus resultierende Tensidproteine (SP-A, SP-B) sowieGefäßleck 24,25,26verwirrt. Die Quantifizierung von BAL IgM, BAL Tensidproteinen, BAL-Albumin oder Farbstoffextravasation (unter Verwendung von Evansblau oder Fluorescein-Iso-Thiocyanat (FITC)-Dextran) sind alternative Methoden zur Beurteilung der epithelialen und endothelialen Integrität.

Interessanterweise waren die Lungengefäßperfusatspiegel von Eotaxin-2 und IL-2 zum Zeitpunkt von 4 Stunden akut erhöht. Die BAL-Eotaxin-2- und IL-2-Spiegel waren nach der Exposition signifikant reduziert, was entweder auf einen Abbau im Alveolarraum oder auf eine Einklemmung im Lungengefäßsystem hindeutet. Weitere Chemokine, die in Lungengefäßperfusat analysiert wurden, zeigten höhere Spiegel des eosinophilen Chemokins (Eotaxin-1), TNFα, IFNγ, lymphknotenabgeleiteter mononukleärer Zellchemokine (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), epithelial abgeleitetes neutrophiles Chemokin (CXCL5) und des Alarmins (IL-16), das nach sekundärer Nekrose von Neutrophilen27freigesetzt wurde, jedoch erst 4 h nach exposition. Nach 36 h war das aus dem Knochenmark gewonnene Pan-Leukozyten-Chemokin, SDF1α28,höher im Lungengefäßperfusat. Die aus dem Knochenmark abgeleiteten SDF1α-Konzentrationen korrelieren mit zytologischen Befunden, wobei CD11b- und Gr1-positive Zellen nach 24 und 36 h nach der Exposition reichlich vorhanden sind. So spiegeln die Chemokin- und zytologischen Profile eine signifikante Leukozytenmobilisation aus den Knochenmarkkompartimenten wider (Tabelle 2).

Unser Tiermodell und unsere Forschungsergebnisse sind unter Berücksichtigung der realen Situationen, in denen Lebewesen in städtischen Umgebungen wahrscheinlich solchen subklinischen O3- und Infektionserregern ausgesetzt sind8,von entscheidender Bedeutung. Unser mausines Modell dient als leicht zugänglicher Prototyp, der in Level-2-Containment-Labors reproduziert werden kann, um pulmonale und extrapulmonale Mechanismen des invasiven Zelltods und der Infektionen zu untersuchen, wie es bei COVID-19-Infektionen der Fall ist29. Zukünftige Studien sollten darauf ausgerichtet sein, die Reparatur oder Spätphasen-Nachsorge sowie chronische Expositionen zu visualisieren, um die langfristigen zellulären Anpassungen zu untersuchen. Für umfassende Lungenentzündungsstudien mitlebenden Organ-15- undTier-16,30,31-Bildgebungsverfahren kann das aktuelle Endpunkt-Studiendesign wichtige Einblicke in die Wirtsreaktion auf kombinierte niedrig dosierte O3 (Zelltod) und LPS (Immunstimulation) liefern und damit die Mechanismen einer akuten Lungenverletzung entschlüsseln.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder Offenlegungen vorzunehmen.

Acknowledgments

Die durchgeführte Forschung wird durch den NSERC-Zuschuss des Präsidenten sowie durch Start-up-Mittel des Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finanziert. Das Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation wird von Innovation Saskatchewan finanziert. Die Fluoreszenzbildgebung wurde im WCVM Imaging Centre durchgeführt, das von NSERC finanziert wird. Jessica Brocos (MSc Student) und Manpreet Kaur (MSc Student) wurden aus den Start-up-Mitteln des Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).

Tags

Immunologie und Infektion Ausgabe 169 Ozon LPS akute Lungenentzündung F1F0 ATP-Synthase (Komplex V) Untereinheiten immunfluoreszierende Zytologie IL-16
Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. … More

Duda, J. A. B., Kaur, M., Aulakh, G. K. Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury. J. Vis. Exp. (169), e62097, doi:10.3791/62097 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter