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Immunology and Infection

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Abstract

Los pulmones se enfrentan continuamente a insultos directos e indirectos en forma de condiciones inflamatorias estériles (partículas o toxinas reactivas) e infecciosas (bacterianas, virales o fúngicas). Una respuesta abrumadora del anfitrión puede dar lugar a la respiración comprometida y a lesión de pulmón aguda, que es caracterizada por el reclutamiento del neutrófilo del pulmón como resultado de la respuesta de remodelación inmune, coagulativa y del tejido pato-lógica del anfitrión. Los métodos microscópicos sensibles para visualizar y cuantificar las adaptaciones celulares pulmonares murinas, en respuesta al ozono de dosis bajas (0,05 ppm), un potente contaminante ambiental en combinación con lipopolisacárido bacteriano, un agonista TLR4, son cruciales para comprender los mecanismos inflamatorios y de reparación del huésped. Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo del vario pulmón y de los compartimientos sistémicos del cuerpo, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar, el perfusate vascular del pulmón, los cryosections izquierdos del pulmón, y el perfusate esternal de la médula. Mostramos daño de macrófagos alveolares, neutrófilos, tejido parenquimatoso pulmonar, así como células de médula ósea en correlación con una respuesta inmune retrasada (hasta 36-72 h) que se caracteriza por gradientes discretos de quimioquinas en los compartimentos analizados. Además, presentamos la matriz extracelular pulmonar y las interacciones citoesqueléticos celulares (actina, tubulina), especies de oxígeno mitocondrial y reactivo, plasminógeno anticoagulante, su fragmento peptídico antiangiogénico angiostatina, las subunidades mitocondriales del complejo V atp sintasa, α y β. Estos marcadores sustitutos, cuando están complementados con análisis célula-basados ines vitro adecuados y técnicas de proyección de imagen animales in vivo tales como microscopia intravital, pueden proporcionar la información vital hacia la comprensión de la respuesta del pulmón a los agentes inmunomoduladores nuevos.

Introduction

La lesión pulmonar aguda (LPA) es una respuesta patológica crucial de los pulmones a estímulos infecciosos u otros estímulos dañinos que se caracteriza por la activación simultánea de los sistemas inmunitario coagulativo, fibrinolítico e innato1. Los neutrófilos detectan rápidamente patrones de daño microbiano e intracelular a través de la familia de receptores toll-like (TLR)2,3,4. Los neutrófilos liberan citoquinas preformadas y contenido de gránulos citotóxicos, que luego pueden causar daño tisular colateral. El daño alveolar subsiguiente se empaña con la muerte celular secundaria que lleva al lanzamiento de moléculas tales como trifosfato de adenosina (ATP)5,así fijando en un círculo vicioso del inmune-dysregulation.

Un problema sin resolver en la comprensión de ALI se relaciona con la cuestión de cómo se inicia la lesión dentro de la membrana alveolar. El complejo de transporte de electrones V, F1F0 ATP sintasa, es una proteína mitocondrial conocida por expresarse ubicuamente, en la membrana plasmática celular (incluyendo endotelial, leucocito, epitelial) durante la inflamación. El citoesqueleto celular que se compone de actina y tubulina, alberga muchas formas celulares y modulación de la función, así como proteínas mitocondriales, respectivamente. Recientemente hemos demostrado que el bloqueo de la ATP sintasa por una molécula endógena, angiostatina, silencia el reclutamiento de neutrófilos, la activación y el lipopolisacárido (LPS) indujo la inflamación pulmonar6. Así, los mecanismos bioquímicos (synthase del ATP) e inmunes (TLR4) pudieron regular la barrera alveolar durante la inflamación del pulmón.

La exposición al ozono (O3),un contaminante ambiental, deteriora la función pulmonar, aumenta la susceptibilidad a las infecciones pulmonares, y los niveles bajos cortos de exposiciones a O3 aumentan el riesgo de mortalidad en aquellos con afecciones cardiorrespiratorias subyacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Así, la exposición a concentraciones fisiológicamente relevantes deO3 proporciona un modelo significativo de ALÍ para estudiar los mecanismos fundamentales de la inflamación7,8. Nuestro laboratorio ha establecido recientemente un modelo murino de dosis bajas de O3 inducida por ALI15. Después de realizar una dosis y tiempo-respuesta a bajas concentraciones deO3, observamos que la exposición a 0,05 ppmO3 durante 2 h, induce una lesión pulmonar aguda que está marcada por la subunidad de la subunidad β del complejo V de ATP sintasa pulmonar (ATPβ) y la expresión de angiostatina, similar al modelo LPS. Las imágenes pulmonares intravitales revelaron desorganización de los microfilamentos de actina alveolar que indican daño pulmonar, y la ablación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) septal alveolares (que indican la abrogación de la señalización celular basal) y el potencial de membrana mitocondrial (que indica muerte celular aguda) después de la exposición de 2 h a 0,05 ppm O315 que se correlacionaron con un pulmón heterogéneo 18Retención de FDG16,reclutamiento de neutrófilos y liberación de citoquinas, sobre todo IL-16 y SDF-1α. El mensaje para llevar a casa de nuestros estudios recientes es que O3 produce una toxicidad exponencialmente alta cuando se expone a concentraciones por debajo de los límites permitidos de 0,063 ppm durante 8 h (por día) para la exposición humana. Es importante destacar que no existe una comprensión clara sobre si estas exposiciones subclínicas a O3 pueden modular mecanismos mediados por TLR4, como por la endotoxina bacteriana17. Por lo tanto, se estudió un doble golpe O3 y lps modelo de exposición y observó las adaptaciones celulares inmunes y no inmunes.

Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo de varios compartimientos del pulmón y del cuerpo sistémico, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar (es decir, BAL) que muestrea los espacios alveolares, el perfusate vascular del pulmón (es decir, LVP) que muestrea la vasculatura pulmonar y el intersticio septal alveolar en caso de una barrera endotelial comprometida, criosecciones izquierdas del pulmón, para mirar en los leucocitos parenquimales y adherentes residentes dejados en el tejido pulmonar lavado , sangre periférica que representa los leucocitos circulantes y los perfundsatos de médula ósea esternal y fémur que muestrean los sitios proximales y distales de movilización de células hematopoyéticas durante la inflamación, respectivamente.

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Protocol

El diseño del estudio fue aprobado por la Junta de Ética de La Investigación Animal de la Universidad de Saskatchewan y se adhirió a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal para el uso humano de los animales. Seis-ocho ratones masculinos de la semana C57BL/6J fueron procurados. NOTA: Eutanasiar a cualquier animal que desarrolle letargo severo, dificultad respiratoria u otros signos de angustia grave antes del punto final programado.

NOTA: Prepare lo siguiente: 27-18 G embotados con aguja (dependerá del diámetro traqueal del ratón), tubo de PE de tamaño apropiado para adaptarse a la aguja roma (hacer una cánula de PE para cada ratón), cánula, 2 tijeras afiladas, 2 fórceps romos (pequeños), 1 fórceps afilado (pequeño), 3 jeringas de 1 ml, tubos de microfuge etiquetados (para BAL, sangre, vascular y recolección de perfusato de médula ósea) y viales etiquetados (para fijación de tejidos), bolsas de muestra / crioviales para la recolección de tejidos, rollo de hilo de algodón de carnicero (cortado en ligaduras de tamaño adecuado). Todos los productos químicos utilizados para los experimentos se indican en la Tabla de Materiales.

1. Exposiciones al ozono y a lps para la inducción de lesión pulmonar murina

  1. Exposición al ozono
    1. Prepare un cuadro de inducción personalizado de O3. Agregue alimento para ratones, botellas de agua, juguetes de enriquecimiento y ropa de cama limpia en orden e imite el entorno de la vivienda de los ratones.
      NOTA: Estos pasos garantizarán que los ratones tengan acceso gratuito a alimentos y agua cuando se alojan en la caja de inducción personalizada y ayudarán a aliviar el estrés indebido.
    2. Cambie el calibrador/generador O3 "ON" (colocado hacia el puerto de entrada) para estabilizar la lámpara UV antes de la mano (alrededor de 15 minutos antes de las exposiciones) y conéctese con el monitor O3 en línea.
      NOTA: El monitor O3 debe leer un promedio de 0.05 ppm, según la muestra de la salida a temperatura constante del aire de la cámara (72 ±3 ° F) y humedad relativa (50±15%).
    3. Para exposiciones de O3, coloque suavemente los ratones en la caja de inducción personalizada y exponga continuamente a los ratones a 0,05 ppm O3 durante 2 h.
  2. Anestesia y administración intranasal de LPS
    1. Prepare 10 mg/mL de existencias para ketamina y xilazina, por separado.
    2. Preparar un cóctel mezclando 20 partes de ketamina y 1 parte de xilazina. Si el ratón pesa X g, inyecte (X/200) mL de cóctel de ketamina/xilazina en la cavidad peritoneal. Para un ratón, prepare 1 mL de cóctel que comprende 1000 μL de la cepa de ketamina de 10 mg/mL y 50 μL de la cepa de xilazina. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo en un tubo de microfuge.
      NOTA: Las existencias de ketamina y xilazina se pueden preparar con una semana de antelación.
    3. Anestesiar a los ratones bajo mezcla ligera de ketamina intraperitoneal (IP) (50 mg/kg)/xilazina (1 mg/kg) (por ejemplo, para un ratón de 25 g, inyecte 0,125 mL del cóctel).
    4. Prepare una solución de 1 mg/mL de LPS, en solución salina, y llene 50 μL de la solución en una pipeta.
    5. Sostenga el ratón en posición vertical con su espalda / lado dorsal en la palma de la mano, sosteniendo las orejas con la misma mano. Ahora, coloque 50 μL de la solución lps18 suavemente fuera de las fosas nasales (es decir, 25 μL en cada fosa nasal o 50 μL en una fosa nasal; no importa siempre y cuando el procedimiento sea rápido) y permita que los ratones inhalen la solución LPS.
    6. Infundir a los ratones control 50 μL de solución salina estéril.
      Precaución:No exceda más de 100 μL para la instilación, que podría ser fatal. Demasiado menos volumen (es decir, <50 μL) y hay riesgo de solo deposición nasal.
    7. Después de la administración de LPS, coloque suavemente los ratones, ya sea sobre su estómago o su espalda sobre el montículo de ropa de cama con la cabeza ligeramente hacia abajo.
      NOTA: Esta orientación prolonga la retención de la solución en la cavidad nasal19.
    8. A las 0, 2, 4, 24, 36 y 72 h después de la exposición, anestesiar a los ratones i.p. con dosis completa de mezcla de ketamina (200 mg/kg)/xilazina (4 mg/kg) (es decir, X/50 mL del cóctel, donde X es el peso del ratón en gramos o 0,50 mL para un ratón de 25 g).
    9. Observe el ratón hasta que pierda el conocimiento y el reflejo correcto (es decir, no se vuelve hacia atrás cuando se coloca en posición supina). Ahora, revise el ratón para la profundidad de la anestesia, mediante el seguimiento de la respiración (excursiones rítmicas de pecho) y la frecuencia cardíaca, que debe caer notablemente, después de 1-2 minutos.
    10. A continuación, compruebe si hay reflejos del pedal, es decir, pellizque cualquiera de los dígitos de las extremidades posteriores y observe la retracción de la extremidad, como un reflejo. Si el ratón responde, insótese con inyecciones adicionales de 0,1 mL o más, según sea necesario.
      NOTA: Para lograr la anestesia profunda, tenga en cuenta que ciertas cepas o ratones obesos suelen tener un mayor volumen de distribución y por lo tanto pueden ser fácilmente sobredosificados, si se permite el tiempo suficiente si no se permite para la anestesia completa (que puede ser de alrededor de 10 minutos o más). En consecuencia, algunas cepas pueden ser resistentes a la anestesia y, por lo tanto, requieren más recargas. Este conocimiento se adquiere después de muchas observaciones prácticas y experiencia con ratones de diferentes cepas y edades. Pues algunos experimentos experimentales también fueron realizados inmediatamente después de las exposiciones de O3 y de los LPS (es decir, en el tiempo-punto de 2 h), también incluimos un cierto análisis muy temprano de la célula del BAL de esos experimentos para destacar los efectos inmediatos de la exposición combinada de O3y de los LPS.

2. Recogida de muestras

  1. Coloque el ratón en la bandeja quirúrgica. Ahora, coloque suavemente ungüento lubricante para los ojos en ambos ojos para evitar la pérdida de líquido y desinfecte el ratón con un aerosol de etanol al 70%.
    1. Haga pequeños cortes a través de las membranas superiores e inferiores de la piel con tijeras, para exponer la tráquea y el tórax.
    2. Haga un corte justo debajo del esternón y exponga el corazón.
  2. Punción cardíaca
    1. Coloque una aguja 25G unida a la jeringa heparinizada en el ventrículo derecho y extraiga sangre mediante punción cardíaca.
      NOTA: La sangre generalmente se extrae con un mínimo de extracción del émbolo, si el tiempo desde la exposición del corazón a la punción cardíaca es inferior a un minuto. Después de recolectar alrededor de 0.4-0.5 mL, es posible que deba hacer una pausa durante unos segundos antes de recolectar la sangre restante. Esto se hace para dejar que el corazón bombee cualquier volumen restante en la cámara ventricular derecha. Al final de la recolección de sangre, el corazón se detiene para bombear.
    2. Recoja la sangre y guárdelo en tubos de microfugos para su posterior procesamiento.
  3. traqueostomía
    1. Use cuidadosamente pinzas/fórceps contundentes para eliminar la región traqueal del tejido sobre la sobreaforma. Use las manos enguantadas más que los instrumentos quirúrgicos para evitar el sangrado. Si una gran cantidad de sangre está rezumando, hay riesgo de contaminar las muestras de BAL. Use hisopos de algodón, si es necesario, aunque no sea preferible. Kimwipes son mejores alternativas.
    2. Ahora, corte a través de la caja torácica para exponer los pulmones. Una vez más, tenga cuidado de no cortar el esternón y las arterias intercostales o la aorta ascendente; hacer cortes más pequeños mientras avanza a través de la caja torácica)
    3. Pase una ligadura de algodón por debajo del recorte traqueal y déjelo como tal por el momento.
    4. Snip la tráquea en una localización conveniente en la porción distal 1/3rd, señalando hacia los pulmones, para permitir el acceso para una cánula traqueal de 28 G.
    5. Inserte una cánula de PE de 28 G (una longitud mínima de 3-5 mm y un extremo distal recortado para facilitar la inserción) en la tráquea. Tenga cuidado con el extremo de la tráquea antes de la bifurcación y luego tire de aproximadamente un mm hacia atrás para evitar el muestreo de un solo lóbulo.
    6. Firmemente, ate la ligadura de algodón para mantener la cánula en su lugar. No colapse la cánula.
  4. Lavado bronco-alveolar (BAL)
    1. Llene 0,5 ml de PBS en una jeringa de 1 mL.
    2. Ahora inyecte gradualmente 0.5 mL de PBS en la cánula con la ayuda de 1 mL de jeringa.
    3. Después de inyectar PBS, aspire la jeringa siempre y cuando no resista la succión.
      NOTA: Si hay resistencia mientras se aspira el líquido BAL hacia fuera, eso indica el colapso del tejido alveolar o bronquial. En ese caso, tire hacia atrás de la cánula por un minúsculo para separar la cánula de las paredes del tejido.
    4. Recoja el líquido aspirado en un tubo de microfugo marcado y colóquelos sobre hielo.
    5. Realizar dos lavados más de manera similar recogiendo en el mismo vial (es decir, un total de 0.5 X 3 = 1.5 mL lavado).
    6. Mida el volumen de líquido BAL recogido. La recuperación del lavado debe ser cercana al 90%.
  5. Perfusato vascular pulmonar (LVP)
    1. Corte la aorta torácica descendente en una ubicación entre las mitades torácica y abdominal, para evitar cualquier respaldo de perfusato en los pulmones mientras se perfunde a través del ventrículo derecho.
    2. Limpie la cavidad cerca del extremo de la aorta cortada, libre de sangre.
    3. A continuación, perfunda los pulmones con 0,5 mL de solución salina heparinizada a temperatura ambiente inyectada a través del ventrículo derecho.
    4. Recoger el perfusato vascular de la cavidad en el extremo de corte de la aorta torácica descendente, en un tubo de microfugio, colocado sobre hielo y medir su volumen.
    5. Ligar el bronquio derecho proximal a su ramificación de la tráquea (con hilo de algodón).
  6. Fijación pulmonar izquierda in situ
    1. Conecte una jeringa de 1 ml a la cánula traqueal, que es lo suficientemente larga como para insertarla a través de la incisión traqueal anterior.
    2. Extraiga aire en la jeringa hasta 0.6 mL de marca.
    3. Luego, llene la jeringa restante (hasta el final) con paraformadehído al 2% a temperatura ambiente. Asegúrese de que el émbolo esté listo para salir sin succionar el aire de la cánula.
    4. Ahora, coloque la jeringa con una cinta escocesa, a un recipiente vertical, medido hasta 20 cm de altura.
    5. Suavemente, saque el émbolo para dejar que el fijador fluya hacia la tráquea. En caso de que haya algunas burbujas de aire en la cánula, coloque suavemente el émbolo en la parte superior de la jeringa y el líquido comenzará a fluir después de unos segundos.
    6. Dejar que el pulmón izquierdo se infla a su capacidad total insitu, durante 5 minutos, desde una altura de 20 cm formando una columna de agua de 20 cm.
    7. Durante este procedimiento, asegúrese de proteger los lóbulos del pulmón derecho de entrar en contacto con el paraformaformadehído, ya que esto afectará los ensayos aguas abajo.
    8. Coloque tejidos de laboratorio plegados para absorber cualquier paraformacionaldehído que pueda entrar en contacto con los lóbulos pulmonares derechos.
      PRECAUCIÓN: El paraformacionaldehído es altamente tóxico. Por lo tanto, no inhale ni ponga contacto con ninguna parte expuesta del cuerpo. Tenga mucho cuidado al manipular.
    9. Durante el tiempo de instilación de paraformaformadehído, desinfecte el abdomen.
    10. Corte los lóbulos del pulmón derecho de la tráquea asegurándose de eliminar cualquier hilo y coloque inmediatamente los lóbulos en un cryovial etiquetado y déjelo caer en nitrógeno líquido para el análisis molecular/bioquímico rio abajo del análisis de citoquinas/RT-PCR/western blot del homogeneato pulmonar.
    11. Recorte cuidadosamente el pulmón izquierdo para cualquier tejido conectivo o membrana pleural y sumérjalo en paraformadehído al 2% durante 24 h a 4 °C.
    12. Incruste el pulmón fijo en la parafina según el protocolo de incrustación estándar.
      Precaución:No sobrecale las muestras pulmonares.
    13. Corte la parte abdominal y descorte la piel del hueso pélvico (cadera).
    14. Separe los huesos del fémur izquierdo y derecho de la porción pélvica, en una placa de Petri llena de solución salina mantenida sobre hielo.
  7. Colección aspirada de médula ósea esternal y fémur
    1. Limpie el tejido y los músculos de los huesos mediante el uso de tejidos de laboratorio.
    2. Recoger la caja torácica ventral y el esternón en una placa de Petri llena de solución salina mantenida en el hielo.
    3. Corte las puntas distales y proximales de los huesos esternal y del fémur.
    4. Perfundir los huesos 4 veces con 0,5 ml de solución salina, utilizando agujas bien ajustadas (24 a 28 G) en jeringas de 1 ml, y recoger las fracciones de cada hueso en tubos etiquetados equipados con filtros y colocados en hielo.
      NOTA: El calibre de la aguja varía entre el tamaño del animal. Después del enrojecimiento, el hueso del fémur debe mostrarse transparente.
    5. Una vez que se hayan recogido las muestras, meter el ratón en una bolsa de plástico y colocarlo en un congelador de cadáveres de animales para su correcta eliminación, de acuerdo con las directrices de la instalación animal institucional.

3. Procesamiento de muestras

  1. Recuentos totales (TLC) y diferenciales (DLC) de leucocitos
    1. Centrífuga sangre periférica, BAL, perfusato vascular pulmonar y muestras de médula ósea (esternal y fémur) durante 10 min a 500 g.
    2. Recoger los sobrenadantes, flash congelarlos y almacenarlos a -80 °C hasta su posterior análisis.
    3. Reconstituir las células en un mínimo de 200 μL de PBS.
    4. Realice tlc contando BAL, sangre, perfusato vascular pulmonar y células de médula ósea en un hemocitómetro.
    5. Manche otra alícuota de 9 μL de BAL con una mezcla de 1 μL de calqueína verde y rojo etidio homodímero-1 para cuantificar las células vivas (verdes) debido a la actividad intracelular de la esterasa y cualquier célula BAL dañada (en rojo) debido a la pérdida de integridad de la membrana plasmática.
    6. Agregue el ácido acético del 2% a lyse RBCs, en un ratio del 1:10 para el TLC de la sangre y el ratio 1:2 para el TLC vascularperfusate del pulmón.
      PRECAUCIÓN: Ajuste las concentraciones celulares diluyendo en PBS si la concentración es superior a 1x106 células por mL (muy importante para las muestras de médula ósea).
    7. Centrifugar las células para preparar citospins en diapositivas y manchar como se explica a continuación para dlcs. Contar un mínimo de 100 células para recuentos de células leucocitarias diferenciales (DLCs).
      NOTA: Típicamente, uno puede preparar dos cytospins en una diapositiva. Y después de 10-15 minutos de secado al aire, proceda con el paso de tinción.
    8. Parta el BAL recogido a partir de tres ratones experimentales por grupo en dos cytospins cada uno y manche para la actinia/la tubulina y las mitocondrias con la fosforilación oxidativa activa (mitotracker reducido). Utilice el BAL de tres ratones más para dividir en dos citoespinos cada uno, para NK1.1/Gr1/CX3CR1 y ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin diapositivas teñidas. Dividir el BAL de tres ratones más en dos citoespinos cada uno para teñir para ATPα /Ly6G y CX3CR1 / Siglec-F.
  2. Cuantificación de proteínas totales de lavado broncoalveolar (BAL) y perfusato vascular pulmonar (LVP)
    1. Para cuantificar O3 y lps indujeron perturbaciones de la barrera vascular o de la presión oncótica relativa en los dos compartimientos pulmonares (es decir, los compartimientos septales (intersticiales) y vasculares alveolares del perfusate (vascular) ), mida el contenido total de la proteína en los líquidos recogidos.
    2. Analice las fracciones sobrenadantes descongeladas para su concentración total de proteínas utilizando un ensayo colorimétrico estándar resistente al detergente.
    3. Análisis de quimioquinas de lavado broncoalveolar (BAL) y perfusato vascular pulmonar (LVP)
      1. Después, analice las quimiocinas en el BAL y los sobrenadantes vasculares del perfusate del pulmón (LVP) usando un immunoensayo perla-basado magnético de 33 plex. Esto informará sobre la direccionalidad de las vías respiratorias / intersticio frente a los gradientes de quimioquinas vasculares establecidos después de exposiciones combinadas.
      2. Analice el siguiente panel de quimiocinas: CXCL13 (quimioatrayente de linfocitos B), CCL27 (quimioquina IL-11 R-alfa-locus (ILC)), CXCL5 (péptido activador de neutrófilos derivado de epiteliales 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxina-1), eotaxina-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalquina), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferón gamma), IL-10 (interleucina-10), IL-16 (interleucina-16), IL-1β (interleucina-1 beta), IL-2 (interleucina-2), IL-4 (interleucina-4), IL-6 (interleucina-6), CXCL-10 (proteína inducida por interferón gamma 10 (IP-10)), CXCL11 (proteína inducible por interferón gamma 9 (IP-9)), KC (quimioatrayactocitos queratinocitos MCP-1 (proteína quimioatrayente monocitos-1), MCP-3 (proteína quimioatrayente monocitos-3), MCP-5 (proteína quimioatrayente monocitos-5), MDC (quimioquina derivada de macrófagos (CCL22)), MIP-1α (proteína inflamatoria de macrófagos-1 alfa), MIP-1β (proteína inflamatoria de macrófagos-1 beta), MIP-2 (proteína inflamatoria de macrófagos-2), MIP-3α (proteína inflamatoria de macrófagos-3 alfa), MIP-3β (inflamatorio macrófago protein-3 beta), RANTES (regulado en la activación, célula T normal expresada y secretada (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (factor derivado de células del estroma 1), TARC (quimioquina regulada por timo y activación (TARC)), TECK (Chemokine expresada en timo (CCL25)) y TNFα (factor de necrosis tumoral alfa).

4. Tinción de citoespino e histología pulmonar

  1. Tinción bioquímica de cytospin
    1. Rodee las citospinas con una pluma hidrofóbica para contener los productos químicos para la incubación durante el procedimiento.
    2. Rehidrate los cytospins en PBS por 5 minutos.
    3. Fije las muestras de citoespino en paraformaformadehído al 2% durante 10 minutos, lave tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
    4. Permeabilizar con acetona helada al 70% durante 7 minutos y volver a lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
    5. Tinción para actina y tubulina o Mitotracker reducido (incubar con una mezcla de 2 μg/50 μL de alexa 488 faloidina conjugada mostrada en verde, y 2 μg/μL de alexa 555 conjugado ratón anti-α tubulina o Mitotracker reducido mostrado en rojo, respectivamente) durante 15 minutos.
      NOTA: Utilice el anticuerpo de control del isotipo IgG1 del ratón, en un cytospin separado, para validar el protocolo de la coloración de la tubulina. Realice los mismos pasos que se explican de 4.1.1 a 4.1.8, pero para los controles de isotipo.
    6. Retire las manchas inclinando suavemente la mezcla de la diapositiva. Incubar los portaobjetos con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) durante 5-10 min para teñir núcleos.
    7. Lave las citospinas 3 veces con PBS durante 5 minutos cada una, cubre con medios de montaje anti-desvanecimiento y guárdelos durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente antes de tomar la imagen.
    8. Adquiera imágenes bajo un microscopio vertical de campo amplio equipado con una cámara científica. Asegúrese de que los tiempos de exposición de la cámara sean constantes para los diferentes canales fluorescentes al obtener imágenes de las diapositivas.
  2. Tinción inmuno-fluorescente de cytospin:
    1. Rodee las citospinas con una pluma hidrofóbica para contener los productos químicos para la incubación durante el procedimiento. Rehidrate los cytospins en PBS por 5 minutos.
    2. Fije las muestras de citoespino incubando en paraformadehído al 2% durante 10 minutos, lave tres veces con PBS durante 5 minutos cada una.
    3. Permeabilizar con tritón X-100 al 0,1% frío durante 2 minutos, lavar tres veces con PBS durante 5 min cada una.
    4. A continuación, el bloque Fc durante 15 minutos incubando el citoespino con la dilución 1:50 del stock de anticuerpos del bloque Fc (para asegurarse de que el anticuerpo primario del ratón no reaccione de forma cruzada no específicamente con los anticuerpos Fc del ratón).
    5. Incline las diapositivas para eliminar el bloqueo Fc y cambiar a BSA al 1% e incubar el citoespino con una mezcla de 3 anticuerpos primarios de interés (consulte la Tabla 1 para las diversas combinaciones) durante 30 minutos.
      NOTA: Asegúrese de ejecutar anticuerpos de control de isotipo (incubar con una mezcla de ratón IgG1 y rata IgG2b kappa anticuerpos primarios mediante la realización de los pasos 4.2.1 a 4.2.9 y la sustitución de los anticuerpos con controles de isotipo) en paralelo con los anticuerpos secundarios correspondientes como se discutió en nuestro reciente estudio20.
    6. Lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada uno. Incube los citoespinos con una mezcla de anticuerpos secundarios adecuadamente diseñados (consulte la Tabla 1 para obtener más detalles).
    7. Retire las manchas inclinando suavemente la mezcla de la diapositiva, incubar con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) durante 5-10 min para manchar los núcleos. Lavar 3 veces con PBS durante 5 min cada uno.
    8. Cubrebocas con medios de montaje anti-desvanecimiento y almacenar durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente antes de la toma de imágenes.
    9. Adquiera imágenes bajo un microscopio vertical de campo amplio equipado con una cámara científica. Asegúrese de que los tiempos de exposición de la cámara sean consistentes para todos los canales de fluoróforo al obtener imágenes de las diapositivas.
  3. Hematoxilina e histología de eosina (H&E)
    1. Realice la tinción modificada de H&E3 en las criosecciones del pulmón para todos los grupos.
  4. análisis de imágenes
    1. Procesar y analizar archivos de datos de imagen (.tiff) en Fiji ImageJ software abierto (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Compruebe los parámetros requeridos (Área, Perímetro, Densidad integrada, Descriptores de forma, Diámetro de Feret, Circularidad, Etiqueta de visualización) que se registrarán en la pestaña Analizar y Establecer medidas.
    3. Utilizando el gestor de ROI,delinee manualmente alrededor de 50-200 celdas en el panel de imágenes fusionadas utilizando la herramienta "selecciones a mano alzada". Guarde las regiones de interés (ROI) con el comando Ctrl+T y copie los ROI guardados para cada celda en todos los canales de fluoróforo.
    4. A continuación, pulse Ctrl+M para medir los parámetros preestablecidos para todos los canales fluorescentes (por ejemplo, 405 nm (DAPI o ATPβ en azul), 488 nm (actina o NK1,1 o Ki-67 en verde), 568 nm (tubulina o Gr1 o CD61 en rojo) y 633 nm (CX3CR1 o angiostatina en magenta)).
    5. Guarde los resultados como .csv archivo con un nombre adecuado que represente su análisis. Copie los resultados del archivo de .csv en una hoja de cálculo y divida la intensidad de fluorescencia (FI) (que es la columna de densidad integrada sin procesar del archivo de resultados) de la molécula teñida por la de DAPI o CD61 FI, según el diseño de tinción. Estas relaciones se denominan "relaciones FI normalizadas DAPI o CD61".
    6. A continuación, trace estas relaciones normalizadas, circularidad, perímetro de celda y diámetro de Feret, para evaluar cualquier cambio en el tamaño de la celda después de la exposición combinada de O3 y LPS.
    7. Utilice el software estadístico apropiado para comprobar la normalidad de los datos recopilados y para probar la hipótesis nula (consulte la sección de análisis estadístico a continuación).
  5. análisis estadístico
    1. Resultados expresos como sem medio ±. Un mínimo de tres ratones fueron utilizados por el grupo.
    2. Para el análisis de datos de quimioquinas, ajuste los valores p de ANOVA unidireccionales para la tasa de descubrimiento falso de acuerdo con la corrección de Benjamini y Hoshberg.
    3. Analizar los parámetros de la imagen, la celularidad, el diámetro de Feret, el perímetro, las relaciones de intensidad de fluorescencia normalizadas DAPI o CD61 mediante la prueba U de Mann-Whitney (para comparar dos grupos) o la prueba de Kruskal Wallis (para comparar múltiples grupos) ya que estos datos no estaban distribuidos normalmente.
    4. Para el resto de los experimentos de imágenes, analice los resultados utilizando un análisis unidireccional de varianza seguido de comparaciones múltiples de Sidak. Los valores p <0,05 se consideraron significativos.

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Representative Results

La exposición combinada de O3 y de los LPS lleva a la movilización sistémica de la inflamación y de la médula en 72 h: Las cuentas de célula en diversos compartimientos revelaron cambios significativos en sangre periférica y las cuentas totales de la célula de la médula del fémur sobre exposiciones combinadas de O3 y de los LPS. Aunque las exposiciones combinadas deO3 y LPS no indujeron ningún cambio en los recuentos celulares totales de BAL(Figura 1A)o LVP(Figura 1B),las células polimorfonucleares se presentaron como el tipo de célula predominante a las 24(Figura 1F,Figura suplementaria 1),36 y 72 h después de la exposición. Tenga en cuenta la ausencia de tinción de Siglec-f y CX3CR1 en las células polimorfonucleares a 24 h de imagen de citoespino BAL(Figura 1F). La coloración triple DAPI/CD11b/Gr1 de los cytospins del BAL demostró la presencia de células mononucleares grandes de CD11b- y de Gr1-positive que son macrófagos en 0 h, que cambia a las células polimorfonucleares más pequeñas que demuestran Gr1staining punteado pero desprovisto de la coloración de CD11b en 4 h (como se muestra en la inscripción en 1F suplemental). La mayoría de las células BAL son polimorfonucleares y positivas tanto para CD11b como para Gr1, a las 24 h después de la exposición(Figura Suplementaria 1).

Los ratones mostraron leucocitosis sistémica a las 24 h (3,3 veces vs 0 h, p<0,05, Figura 1C)seguida de leucopenia a las 72 h que estuvo marcada por recuentos menores de 13 veces en sangre periférica en comparación con 24 h (p<0,01) y 8,6 veces menor en comparación con 4 h (p<0,05) después de la exposición combinada aO3 y LPS(Figura 1C). Las células esternales de la médula ósea también se mantuvieron sin cambios en comparación con 0 h o después de la exposición combinada aO3 y LPS(Figura 1D). Los recuentos de médula ósea del fémur mostraron un pico tardío de 28,8 veces a las 72 h en comparación con 0 h (p<0,01, Figura 1E),así como otros puntos de tiempo (p<0,01, Figura 1E). La visualización de la LVP, y las células esternales y de la médula ósea del fémur también mostró cambios en los tipos de células a las células predominantemente polimorfonucleares (Figura suplementaria 1). Las células esternales de la médula demostraron muestras del daño según lo evidenciado por el material nuclear extracelular. La médula ósea del fémur mostró mayores números de células CD11b y Gr1 positivas(Figura Suplementaria 1),que coinciden con los recuentos celulares.

El contenido total de la proteína del BAL era el más alto en 36 h después de la exposición combinada de O3 y de los LPS: La cuantificación de las proteínas totales en los compartimientos de LVP y del BAL fue realizada para correlacionar el edema inducido ozono del pulmón es decir, la exudación de la proteína de plasma debido a la debilitación vascular y epitelial resultante de la barrera debido a la exposición combinada. La proteína total del BAL era 4,5 dobleces más arriba en 36 h (p<0,05) en comparación con 4 h (cuadro 2A). Sin embargo, la proteína LVP se mantuvo sin cambios después de la exposición(Figura 2B).

La exposición combinada de O3 y LPS induce gradientes fuertes de quimioquinas en el compartimiento vascular pulmonar y no en bal: Los análisis múltiplex de quimioquinas se realizaron en sobrenadantes BAL y LVP. Tenga en cuenta que las diferencias relativas entre estos dos compartimentos representan la retención preferencial en un compartimento determinado. El quimioatrayente eosinófilo eotaxina-2 fue 4,3 veces mayor a las 4 h en el compartimento LVP en comparación con 0 h (p<0,05, Figura 3A). En el compartimiento bal, la eotaxina-2 fue 3,2 veces menor a las 4 h en comparación con 0 h (p<0,01, Figura 3B). Los niveles de bal eotaxina-2 siguieron disminuyendo consistentemente hasta 72 h con reducción de 12,6 veces en comparación con 0 h (p<0,01, Figura 3B). El linfocito quimioatrayente IL-2 fue 10,1 veces mayor a las 4 h en el compartimento LVP en comparación con 0 h (p<0,05, Figura 3C). En el compartimiento bal, il-2 fue 5,0 veces menor a 36 h en comparación con 0 h (p<0,05, Figura 3D). Los niveles de bal eotaxina-2 siguieron disminuyendo consistentemente la reducción de 5,9 veces a 72 h en comparación con 0 h (p<0,05, Figura 3D).

Interesante, muchos chemokines fueron alterados en 4 h, en el LVP y no el BAL. La mayor parte de estos chemokines mostraron modesto, con todo significativo, aumento en niveles de LVP en 4 h en comparación con tiempo-puntos más últimos. Aunque los niveles de eotaxina-1 no fueron altos después de las exposiciones en comparación con 0 h, pero los niveles fueron significativamente altos a 4 h en comparación con 24 (2,7 veces, p<0,05) y 72 h (5,0 veces, p<0,01, Figura 4A)después de la exposición combinada. Los niveles de LVP TNFα fueron 3,4 veces mayores a las 4 h en comparación con 36 h (p<0,05, Figura 4B). Del mismo modo, LVP IFNγ fue 2,9 veces mayor a las 4 h en comparación con 72 h (p<0,05, Figura 4C). Los niveles de CX3CL1 también fueron altos a 4 h en comparación con 24 (1,7 veces, p<0,05), 36 (1,6 veces, p<0,05) y 72 h (2,2 veces, p<0,01) después de exposiciones combinadas(Figura 4D). Los niveles de CCL27 mostraron niveles más altos en 4 h también cuando están comparados a 24 (2,7 dobleces, p<0,05), 36 (doblez 3,9, p<0,01) y 72 h (doblez 2,9, p<0,05) después de exposiciones combinadas(cuadro 4E).

Algunos chemokines tenían una presencia fuerte en el LVP en 4 h después de exposiciones combinadas, y no cambiaron en el BAL antes y después de la exposición, , indicando una respuesta fuerte del chemokine de los tubos capilares pulmonares. En 4 h, los niveles de LVP IL-16 eran 3,4 dobleces comparados a 0 h (p<0,01), 3,2 dobleces comparados a 24 h (p<0,01), doblez 4,5 comparados a 36 h (p<0,01) y 4,6 dobleces comparados a 72 h (p<0,01) después de exposiciones combinadas (cuadro 4F). A las 4 h, la quimioquina neutrófila, los niveles de LVP cxcl5 fueron de 2,0 veces en comparación con 0 h (p<0,01), 4,7 veces en comparación con 24 h (p<0,01), 2,2 veces en comparación con 36 h (p<0,01) y 2,7 veces en comparación con 72 h (p<0,01) después de exposiciones combinadas(Figura 4G). A las 4 h, los niveles de LVP de CXCL10 fueron de 2,3 veces en comparación con 0 h (p<0,01), 2,1 veces en comparación con 24 h (p<0,05), 2,5 veces en comparación con 36 h (p<0,01) y 2,7 veces en comparación con 72 h (p<0,01) después de exposiciones combinadas(Figura 4H). A las 36 h, la quimioquina neutrófila, los niveles de LVP de SDF1α fueron de 4,2 veces en comparación con 0 h (p<0,01), 2,9 veces en comparación con 24 h (p<0,05), 6,8 veces en comparación con 72 h (p<0,01) después de exposiciones combinadas(Figura 4I). A las 4 h, los niveles de LVP de MIP3β fueron de 2,3 veces en comparación con 0 h (p<0,05), y 2,3 veces en comparación con 72 h (p<0,05) después de exposiciones combinadas (Figura 4J).

La exposición combinada aO3 y LPS induce necrosis, interrumpe el citoesqueleto celular, la membrana plasmática y la integridad mitocondrial: Como los recuentos de leucocitos compartimentales y el contenido de proteínas no se correlacionaban con los gradientes de quimioquinas de LVP, se hizo más importante visualizar las células obtenidas de estos compartimentos. La tinción ex vivo de actina/tubulina de las células BAL basales (0 h) mostró presencia de actina cortical, fibras de estrés, así como lamellipodia (mostrada en verde, Figura 5 panel superior izquierdo) y red de microtúbulos (mostrada en rojo, Figura 5 panel superior izquierdo) que coincidió con una tinción reducida de mitotracker que indica la presencia de mitocondrias activas (mostrada en rojo, Figura 5 panel inferior izquierdo). Más el de 95% de las células del BAL eran mononucleares en la línea de fondo. A las 4 h, las células BAL mostraron material nuclear extracelular, tinción de actina citoplasmática punteada desprovista de lamellipodia y tinción de actina cortical reducida (mostrada en verde, panel superior derecho de la Figura 5), red de microtúbulos avivada (mostrada en rojo, Figura 5 panel superior derecho) que no correspondía a la tinción reducida del mitotracker (mostrada en rojo, panel izquierdo de la Figura 5). El análisis de intensidad fluorescente de actina normalizada dapi mostró una disminución de 3,7 veces en la relación que indica la reducción en la tinción de actina a las 4 h después de la exposición (p<0,01, Figura 6A). Del mismo modo, dapi normalizó la intensidad fluorescente de tubulina también se redujo en 1,5 veces después de la exposición (p<0,01, Figura 6B),lo que indica una reducción en la tinción de tubulina. La pérdida de lamellipodia fue evidente con un aumento de la circularidad del citoesqueleto celular BAL inmediatamente, es decir, a las 2 h (p<0,01, Figura 6C)y 4 h (p<0,05, Figura 6C)después de la exposición en comparación con 0 h y una disminución de la circularidad citoesquelético a 24 (p<0,05) y 36 h (p<0,01) después de la exposición, en comparación con 0 h(Figura 6C).

Hasta 24 h, las células BAL de la exposición combinada fueron doblemente positivas para la calcina (en verde, Figura 7)indicando la presencia de actividad activa de la esterasa, y el homodímero de etidio (en rojo, Figura 7),lo que indica que aunque algunas células estaban muertas (rojas), la mayoría eran células parcialmente comprometidas. A las 36 h, las células BAL fueron en gran parte viables (verde), indicando la sustitución de las células comprometidas por leucocitos reclutados de otros compartimentos sistémicos(Figura 7).

La tinción específica de ATPα y Ly6G de las células BAL reveló una localización intracelular discreta(Películas 1 y 2)tanto de las proteínas en macrófagos alveolares como de neutrófilos después de la exposición(Figura 7). La exposición combinada condujo a una reducción en la relación de intensidad fluorescente normalizada dapi de ATPα(Figura 7,8A) y un aumento en el contenido de proteína Ly6G intracelular(Figura 7, Figura 8B,Películas 1 y 2). La reducción de la tinción de ATPα, a las 24 h después de la exposición, se correlacionó con una menor tubulina y, hasta cierto punto, con una reducción de la tinción del mitotracker. También se observaron cuerpos celulares anucleares ATPα positivos después de la exposición, que podrían ser plaquetas. Sin embargo, no confirmamos nuestros hallazgos. A las 2 h, observamos células BAL mononucleares más pequeñas (p<0,01 Figura 8C,p<0,01 Figura 8D)en comparación con 0 h pero a las 4 h, las células mononucleares fueron más grandes (p<0,01 Figura 8C,p<0,01 Figura 8D)en comparación con 0 h. A las 24 (p<0,01 Figura 8C,p<0,01 Figura 8D)y 36 h (p<0,01 Figura 8C,p<0,01 Figura 8D),las células BAL se hicieron progresivamente más pequeñas debido a un desplazamiento hacia células polimorfonucleares, en comparación con 0 h.

Immunophenotyping de las células del BAL reveló expresiones transitorias de NK1.1, del ATP β y de Ki-67 y las expresiones continuas de Gr1, cx3CR1 y de las células positivas del BAL del angiostatin después de exposiciones combinadas de O3 y de los LPS: La coloración inmunofluorescente del primer sistema de cytospins del BAL fue normalizada a la coloración de DAPI. Hubo un aumento en las células celulares NK1,1 positivas a las 24 h (p<0,05 vs 0 h, Figura 9,10A). A las 36 h, las células BAL presentaron menor intensidad fluorescente celular NK1,1 (p<0,01 vs 0 y 24 h, Figura 9,10A). La intensidad fluorescente celular Gr1 fue mayor a las 24 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9,10B)así como a 36 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9,10B). Del mismo modo, la intensidad fluorescente celular CX3CR1 fue mayor a las 24 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9,10C)así como a 36 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9,10C).

Cuando se normalizó a CD61 celular, que también es ubicuo en su expresión, se reveló un aumento de la intensidad fluorescente celular atpβ a las 24 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9,10D)y una disminución en la intensidad fluorescente atpβ celular a las 36 h (p<0,01 vs 0 y 24 h, Figura 9,10D). Cabe destacar que el ATPβ mostró una localización predominantemente nuclear a las 24 h en comparación con la localización periférica a las 36 h (Figura 9). La intensidad fluorescente celular de BAL Ki-67, indicador de proliferación celular, fue mayor a las 24 h (p<0,01 vs 36 h, Figura 9,10E)en comparación con 0 y 36 h. Los niveles estuvieron por debajo de los niveles basales a las 36 h (p<0,01, Figura 9,10E),muy probablemente debido a una mayor expresión polimorfonuclear cd61 vs Ki-67 a las 36 h(Figura 9). Por último, la intensidad fluorescente celular de la angiostatina BAL fue consistentemente alta tanto a las 24 como a las 36 h (p<0,01 vs 0 h, Figura 9,10F),lo que indica un aumento específico en este fragmento de plasminógeno escindido metaloproteinasa, durante la respuesta inflamatoria pulmonar.

Las exposiciones combinadas producen un daño pulmonar muy extendido: La histología pulmonar reveló que las exposiciones combinadas producen daño prolongado a los pulmones como se ve en las criosecciones teñidas de H&E(Figura 11). Aunque se esperaba daño septal bronquiolar y alveolar, fue sobreprefioso observar daño endotelial de vasos más grandes, a las 36 h después de la exposición (Figura 11). Hubo leucocitos intravasculares adherentes, parches de agregados leucocitarios (incluyendo neutrófilos) en las regiones alveolares tabales y peri-bronquiolares dañadas(Figura 11).

Figure 1
Figura 1:Recuentos de leucocitos compartimentales: A) Recuentos totales de leucocitos de lavado bronco-alveolar (BAL) a 0 (es decir, basal), 4, 24, 36 y 72 h después de combinar 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de exposición intranasal de LPS a ratones. B) Concentración total de leucocitos de perfusato vascular pulmonar (LVP) a 0 (es decir, basal), 4, 24, 36 y 72 h después de la combinación de 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de exposición intranasal lps a ratones. C) Concentración total de leucocitos en sangre periférica (PB) a 0 (es decir, basal), 4, 24, 36 y 72 h después de la exposición combinada de 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de LPS intranasal a ratones. D) Concentración total de leucocitos de médula ósea esternal (BM) a 0 (es decir, basal), 4, 24, 36 y 72 h después de combinar 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de exposición intranasal lps a ratones. E) Concentración total de leucocitos de médula ósea del fémur (BM) a 0 (es decir, basal), 4, 24, 36 y 72 h después de combinar 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de exposición intranasal lps a ratones. Para las gráficas A-E, 0 h se representa en azul, 4 h en rojo, 24 h en verde, 36 h en púrpura y 72 h en puntos de datos naranja; * p<0,05 y ** p<0,01. F) Diapositiva representativa del citospino BAL a partir de la exposición de 24 h, mostrando células mononucleares y polimorfonucleares cuando se tiñen para núcleos con DAPI (en azul), CX3CR1 (en verde) y Siglec-F (en rojo). Tenga en cuenta que la combinación de CX3CR1 y Siglec-F aparece como naranja-amarillo. La mayoría de las células mononucleares son positivas para Siglec-F, que es una característica de los macrófagos alveolares. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2:Cuantificación total de proteínas: A) Lavado broncoalveolar (BAL) contenido total de proteínas y B) Perfusato vascular pulmonar (LVP) la concentración total de proteínas se estimó mediante el ensayo de proteína de 660 nm dePierce (Thermoscientific, IL, US). Para las gráficas A-B, 0 h se representa en azul, 4 h en rojo, 24 h en verde, 36 h en púrpura y 72 h en puntos de datos naranja; * p<0,05. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3:Gradientes de quimioquinas de Eotaxina-2 e IL-2 pulmonar: De las 33 quimiocinas, dos quimiocinas que fueron alteradas significativamente en el perfusato vascular pulmonar (LVP) y el lavado broncoalveolar (BAL) y el líquido después de combinar 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de exposición intranasal lps a ratones A) LVP eotaxina-2, B) BAL eotaxina-2, C) LVP IL-2 y D) BAL IL-2. Los datos se analizaron por anova unidireccional y el valor p para la tasa de descubrimiento falso de múltiples variables se ajustó según la corrección de Benjamini y Hoshberg. Para las gráficas A-D, 0 h se representa en azul, 4 h en rojo, 24 h en verde, 36 h en púrpura y 72 h en puntos de datos naranja. Las comparaciones por pares se analizaron después de la corrección de Bonferroni. * representa p<0.05, ** representa p<0.01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4:Concentraciones de quimioquinas de perfusato vascular pulmonar: Se alteraron las concentraciones de diez quimiocinas más, pero solo en el compartimento de perfusato vascular pulmonar (LVP). A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α y J) MIP3β. Para las gráficas A-J, 0 h se representa en azul, 4 h en rojo, 24 h en verde, 36 h en púrpura y 72 h en puntos de datos naranja. Las comparaciones por pares se analizaron después de la corrección de Bonferroni. * representa p<0.05, ** representa p<0.01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 5
Figura 5:Citospino de lavado broncoalveolar (BAL) actina/tubulina y tinción de mitotracker reducida: Imágenes representativas de actina/tubulina teñidas de citospinas BAL de A) 0 h y B) 4 h después de combinar 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de exposición intranasal lps a ratones. Tenga en cuenta que DAPI se muestra en azul, actina en verde y tubulina en rojo. Imágenes representativas de citospinos bal teñidos mitotracker de A) 0 h y B) 4 h después de la combinación de 0,05 ppb de ozono (O3)y 50 μg de exposición intranasal LPS a ratones. Tenga en cuenta que DAPI se muestra en azul, y mitotracker reducido en rojo. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6:Proteína citoesqueleta de lavado broncoalveolar (BAL) y análisis de circularidad: Los citoespinos BAL teñidos de actina y tubulina se analizaron para los parámetros normalizados de DAPI, es decir, A) relación de intensidad fluorescente (FI) actina a DAPI a 0 y 4 h, B) relación de tubulina a intensidad fluorescente DAPI (FI) a 0 y 4 h y C) celularidad celular BAL a 0 (n = 75 células), 2 (n = 105 células), 4 (n = 66 células), 24 (n = 31 células), 36 (n = 154 células) h. Pues algunos experimentos experimentales también fueron realizados inmediatamente después de las exposiciones de O3 y de los LPS es decir, en el tiempo-punto de 2 h, también incluimos un cierto análisis muy temprano de la celularidad del BAL del tiempo-punto de 2 h para destacar los efectos inmediatos de O3. Para los gráficos A-C, 0 h se representa en azul, 2 h en rojo, 4 h en verde, 24 h en púrpura y 36 h en puntos de datos naranja. * representa p<0.05, ** representa p<0.01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 7
Figura 7:Estado de la membrana intracelular y plasmática del lavado broncoalveolar (BAL): Las células BAL se tiñeron para manchas vitales, calqueína (en verde) y homodímeros de etidio/EthHD (en rojo) como se muestra en los paneles de imagen superiores representativos en A) 0, B) 24 y C) 36 h después de las exposiciones a O3 y LPS. Barra de escala = 200 μm. Los citospinos BAL fueron inmunotenidos para DAPI (en azul), ATPα (en verde) y Ly6G (en rojo). Las imágenes representativas se muestran en los paneles de imagen inferiores a A) 0 y B) 24 h después de las exposiciones O3 y LPS. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Proteína mitocondrial de lavado broncoalveolar (BAL) ATPα, proteína lisosomal Ly6G y análisis de tamaño celular: Se normalizaron las células BAL inmunotainidas para que DAPI calculara A) atpα a dapi relación intensidad fluorescente (FI) y B) Ly6G a DAPI fi ratio, a 0 y 24 h después de las exposiciones O3 y LPS. Las células immunostained del BAL también eran analizadas para su A) el más largo es decir, diámetro del hurón y B) perímetro, en 0, 2, 4, 24 y 36 h después de exposiciones de O3 y de los LPS. Para las gráficas A-D, 0 h (n=119 celdas) se representa en azul, 2 h (n=105 celdas) en rojo, 4 h (n=66 celdas) en verde, 24 h (n=309 celdas) en púrpura y 36 h (n=154 celdas) en puntos de datos naranjas. * representa p<0.05, ** representa p<0.01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 9
Figura 9:Lavado broncoalveolar (BAL) fenotipado intracelular: Las células BAL fueron inmunotained para DAPI (en azul), NK1.1 (en verde), Gr1 (en rojo) y CX3CR1 (en magenta) como se muestra en los paneles de imagen superiores representativos en A) 0, B) 24 y C) 36 h después de O3 y lps exposiciones. Barra de escala = 50 μm. Los citoespinos BAL fueron inmunotenidos para ATPβ (en azul), Ki-67 (en verde), CD61 (en rojo) y angiostatina (en magenta). Las imágenes representativas se muestran en los paneles de imagen inferiores a A) 0, B) 24 y C) 36 h después de las exposiciones O3 y LPS. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10:Proteína mitocondrial de lavado broncoalveolar (BAL) ATPβ, proteína lisosomal Gr1, CX3CR1 intracelular y análisis de angiostatina: Se normalizaron las células BAL inmunotainidas para que DAPI calculara A) relación de intensidad fluorescente (FI) NK1.1 a DAPI, B) relación Gr1 a DAPI FI y C) CX3CR1 a DAPI FI, a 0, 24 y 36 h después de las exposicionesA3 y LPS. Las células bal inmunotenidas se normalizaron para CD61 para calcular A) ATPβ a DAPI intensidad fluorescente (FI) relación B) Ki-67 a DAPI FI ratio y B) angiostatina (ANG) a DAPI FI relación, a 0, 24 y 36 h después de O3 y LPS exposiciones. Para las gráficas A-F, 0 h (n=21 celdas) se representa en azul, 24 h (n=796 celdas) en rojo y 36 h (n=2692 celdas) en puntos de datos verdes. * representa p<0.05, ** representa p<0.01. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Hematoxilina pulmonar e histología de eosina (H&E). El ozono (O3)y los LPS indujeron la histología del cryosection H&E del pulmón en 0, 24 y 36 h después de exposiciones combinadas de O3 y de los LPS. Las regiones del daño epitelial alveolar son marcadas por las flechas negras sólidas y el daño endotelial por las puntas negras de la flecha. Los asteriscos amarillos (*) representan parches de leucocitos en las regiones septales alveolares. A = espacio alveolar, B = bronquio, V = vasculatura, barra de escala = 100 μm para paneles de imagen de la mano izquierda y 50 μm para paneles de imagen en el lado derecho. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

S.No. Anticuerpo primario Anticuerpo secundario de Invitrogen
1 Ratón anti-NK1.1 IgG2a kappa (clon PK136), Catálogo Invitrogen No. 16-5941-82 Alexa 488 conjugado cabra anti-ratón IgG (H+L), Catalog No. A11002
2 Rata anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clon RB6-8C5), Catálogo Invitrogen No. 53-5931-82 Alexa 568 conjugado cabra anti-rata IgG (H+L), Catalog No. A11077
3 Conejo anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Catálogo Invitrogen No. 14-6093-81 Alexa 633 conjugado cabra anti-conejo IgG (H+L), Catalog No. A21070
4 Ratón anti-ATP5A1 IgG2b (clon 7H10BD4F9), Catálogo Invitrogen No. 459240 Alexa 488 conjugado cabra anti-ratón IgG (H+L), Catalog No. A11002
5 Rata anti-Ly6G IgG2a kappa (clon 1A8), Catálogo Invitrogen No. 16-9668-82 Alexa 568 conjugado cabra anti-rata IgG (H+L), Catalog No. A11077
6 Ratón anti-ATP5β IgG2b (clon 3D5AB1), Thermofisher Catalog No. A-21351 Alexa 350 conjugado cabra anti-ratón IgG (H+L), Catalog No. A11045
7 Rata anti-Ki-67 (clon SolA15) IgG2a kappa, Catálogo Invitrogen No. 14-5698-82 Alexa 568 conjugado cabra anti-rata IgG (H+L), Catalog No. A11077
8 Hámster armenio anti-CD61 (clon 2C9. G2) IgG1 kappa, BD Catalog No. 553343 Alexa 568 conjugado cabra anti-hámster IgG (H+L), Catalog No. A21112
9 Conejo anti-angiostatina (ratón aa 98-116) IgG, Abcam Catalog No. ab2904 Alexa 633 conjugado cabra anti-conejo IgG (H+L), Catalog No. A21070

Cuadro 1: Combinaciones primarias y secundarias de anticuerpos utilizadas para teñir citoespinos preparados a partir de las muestras.

Lectura Bal LVP Pb SBM FBM
Tlc * * + a las 24 h; - a las 36, 72 h + a las 72 h
Neutrófilos + a las 24, 36, 72 h + a las 24 h * + a las 4, 24, 36, 72 h + a las 4, 24, 36, 72 h
proteína + a las 36 h * n.d. n.d. n.d.
Perfil de quimioquinas - Para eotaxin-2, IL-2 en 4, 24, 36, 72 h + para Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β en 4 h; + para SDF1α a 36 h n.d. n.d. n.d.
Tamaño de celda + a las 4 h; - a las 24, 36 h n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPα - a las 24 h n.d. n.d. n.d. n.d.
NK1.1/Ki-67 + a las 24 h n.d. n.d. n.d. n.d.
ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG + a las 24, 36 h n.d. n.d. n.d. n.d.

Cuadro 2: Un resumen completo de las principales conclusiones del estudio en diferentes compartimentos. * denota ningún cambio, + denota un aumento y - denota una disminución en los parámetros medidos. El BAL denota el líquido de lavado bronco-alveolar, LVP denota el perfusate vascular del pulmón, el PB denota sangre periférica, el SBM denota médula del esternón y el FBM denota el compartimiento de la médula del fémur.

Figura suplementaria 1: Inmunotendación gr1 y CD11b: Imágenes representativas de dapi (en azul), Gr1 (en verde) y CD11b (en rojo) fluorescentes inmunostained cytospin diapositivas de perfusato vascular pulmonar (LVP), médula ósea esternal (BM) y médula ósea de fémur (BM) compartimentos a las 0, 4 y 24 h después de exposiciones combinadas de O3 y LPS. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 1 Volumen tridimensional renderizado de macrófagos BAL a partir de 0 h punto de tiempo (es decir, línea de base), mostrando núcleo (mostrado en azul) e inmunostained para ATPα (mostrado en verde) y Ly6G (mostrado en rojo). Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

Película suplementaria 2: Volumen renderizado tridimensional de macrófagos BAL a partir de 24 h punto de tiempo después de exposiciones combinadas de O3 y LPS, mostrando núcleo (mostrado en azul) e inmunotenido para ATPα (mostrado en verde) y Ly6G (mostrado en rojo). Tenga en cuenta la presencia de cuerpos positivos ATPα anucleares, así como una célula fragmentada. Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.

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Discussion

Los métodos presentados en el estudio actual destacan la utilidad del análisis del compartimiento múltiple para estudiar eventos celulares múltiples durante la inflamación del pulmón. Hemos resumido los resultados en el Cuadro 2. Nosotros y muchos laboratorios hemos estudiado extensivamente la respuesta murine a la instilación intranasal de los LPS, que es marcada por el reclutamiento rápido de neutrófilos del pulmón, que alcanza un máximo entre 6-24 h después de los cuales, la resolución patea adentro. Y recientemente, hemos demostrado que la sub-clínica O3 (a 0,05 ppm durante 2 h) sola puede inducir daño pulmonar significativo en la sub-cepa C57BL/6NJ15,que se caracteriza por la partición de neutrófilos en el compartimento vascular pulmonar, mientras que los macrófagos dañados y los restos se observaron en el BAL, lo que indica el potencial inflamatorio deO3. En ese modelo observamos una ausencia de neutrófilos en el compartimiento alveolar como resultado de daño epitelial alveolar inducidoO3 y de la fagocitosis resultante por los macrófagos alveolares. No sólo observamos la DNA y la ruina extracelulares en el modelo O3, los macrófagos del BAL eran dysmorphic que correlacionan con los altos niveles IL-16, un alarmin lanzado generalmente por los neutrófilos moribundos. Por lo tanto, es importante entender si estos niveles subclínicos deO3 pueden afectar la respuesta inmune en la sub-cepa C57BL/6J de otra manera robusta, como se observa con los niveles suprafisi fisiológicos de O3 21. Observamos que O combinado3 y la endotoxina bacteriana intranasal indujeron el reclutamiento del neutrófilo en los compartimientos pulmonares así como sistémicos, marcados por la presencia de neutrófilos dañados en bal, perfusate vascular del pulmón, compartimientos esternales y fémur de la médula que comenzaba en 4 h que seguían siendo altos en 24, 36 y 72 H. El daño celular fue representado como pérdida de actinia y de lamellipodia corticales y aumento de tamaño de célula en leucocitos del BAL; Los neutrófilos, analizados en el compartimiento del BAL, exhibieron reactividad positiva perceptiblemente reducida al microtubule, a la subunidad del complejo V del ATP sintasa α (ATPα) y a la mancha mitocondrial activa. Los pulmones se adaptan a esta exposición combinada regulando al alza la expresión de la subunidad celular del complejo ATP sintasa V β (ATPβ), así como la del ligando ATPβ, angiostatina (Tabla 2).

Un aspecto importante del estudio de la inflamación es entender la necrosis celular junto con los gradientes de quimioquinas. Era interesante observar que las cuentas totales del leucocito no eran diferentes excepto en sangre periférica y el compartimiento de la médula del fémur. Estas observaciones nos llevaron a investigar los patrones citoesqueléticos celulares, el tamaño y el immunophenotyping. Observamos una pérdida de lamellipodia y de mitocondrias activas en las células del BAL que indicaban daño celular. La organización cortical de la actina es una característica esencial de la señalización intercelular y de las propiedades resultantes de la barrera. La desorganización citoesqueleta es así un buen marcador del daño celular cuando la necrosis no es tan obvia evaluar. Incluso en 36 h, las células del BAL habían comprometido la membrana de plasma según lo indicado por la coloración del homodímero del etidio. Inmediatamente después de las exposiciones combinadas, los neutrófilos en BAL mostraron positividad Gr1 pero una tinción esencialmente negativa para CD11b, que se localiza hacia el borde de ataque y ayuda en el arrastre septal alveolar22. Así, las exposiciones combinadas llevan a la acumulación de neutrófilos anormales desprovistos de la proteína CD11b. Lps no induce la regulación a la baja de CD11b. Así, esta característica es probablemente un resultado del daño inducido O3 a los neutrófilos.

Las células BAL tenían una firma proteica única con mayor tinción de NK1.1, Ki-67 y ATPβ a las 24 h en comparación con 0 h(Tabla 2). Las células BAL presentaron mayor expresión de Gr1, CX3CR1 así como de angiostatina, a las 24 y 36 h en comparación con 0 h(Tabla 2). Estos hallazgos fueron corroborados por la presencia progresivamente más de neutrófilos Gr1 positivos en BAL, a las 24 y 36 h, después de la exposición(Tabla 2). La presencia de células positivas NK1.1, CX3CR1 y Gr1, a las 24 h, indica el reclutamiento de células mononucleares y polimorfonucleares en el BAL. Entre las células mononucleares, las células positivas CX3CR1 dominaron a las 36 h indicando la presencia de macrófagos intersticiales, plaquetas o macrófagos derivados de monocitos. La inclusión de Ki-67 y del angiostatin como marcadores nos informó sobre el medio proliferativo contra anti-angiogénico, respectivamente en el BAL. Así, las exposiciones combinadas de O3 y de los LPS llevan a la proliferación de macrófagos seguidos probablemente por un entorno anti-angiogénico debido a la infiltración neutrophilic. El aumento transitorio de la tinción de ATPβ puede indicar una adaptación importante hacia una mayor supervivencia de los leucocitos BAL a las 24 h. Cabe señalar que atpβ puede unirse a la angiostatina e inhibir la supervivencia prolongada6,23, que de hecho se refleja en el índice de Ki-67 inferior a 36 h después de la exposición.

Aunque la proteína del BAL fuera la más alta en 36 h, y no otros tiempo-puntos, el perfusate vascular del pulmón no demostró ningunos cambios en la concentración de la proteína antes o después de la exposición. Es posible que el compartimiento vascular no se viera afectado, pero esto es muy probablemente confundido debido a la oxidación de aminoácidos ricos en electrones como la metionina, la histidina y la cisteína por los radicales libres inducidos porO3 y la degradación resultante de las proteínas tensioactivas (SP-A, SP-B), así como el escape vascular24,25,26. La cuantificación de BAL IgM, proteínas de surfactante BAL, albúmina BAL o extravasación de colorantes (utilizando azul Evans o fluoresceína iso-tiocianato (FITC) dextrano) son métodos alternativos para evaluar la integridad epitelial y endotelial.

Interesante, los niveles vasculares del perfusate de pulmón de eotaxin-2 e IL-2 fueron levantados agudo en el tiempo-punto de 4 h. Los niveles del BAL eotaxin-2 e IL-2 fueron reducidos perceptiblemente después de la exposición, indicando la degradación en el espacio alveolar o la colocación de trampas en la vasculatura del pulmón. Más quimiocinas analizadas en perfusato vascular pulmonar revelaron niveles más altos de quimioquina eosinófila (eotaxina-1), TNFα, IFNγ, quimiocinas de células mononucleares derivadas de ganglios linfáticos (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), quimioquina de neutrófilos derivados de epiteliales (CXCL5) y la alarmina (IL-16) liberada después de la necrosis secundaria de neutrófilos27,pero solo a las 4 h después de la exposición. A las 36 h, la quimioquina pan-leucocitaria derivada de médula ósea, SDF1α28,fue mayor en el perfusato vascular pulmonar. Las concentraciones de SDF1α derivadas de la médula ósea se correlacionan con los hallazgos de la citología, por lo que las células CD11b y Gr1 positivas son abundantes a las 24 y 36 h después de la exposición. Así, la quimioquina y los perfiles citológicos reflejan una movilización significativa de leucocitos desde los compartimentos de la médula ósea (Tabla 2).

Nuestro modelo animal y los resultados de la investigación son vitales teniendo en cuenta las situaciones del mundo real en las que los seres vivos en entornos urbanos probablemente están expuestos a tales agentes subclínicos O3 y agentes infecciosos8. Nuestro modelo murino sirve como un prototipo de fácil acceso que puede ser reproducido en laboratorios de contención de nivel 2 para estudiar los mecanismos pulmonares y extrapulmonares de la muerte celular invasiva y las infecciones, como es el caso de las infecciones por COVID-1929. Los estudios futuros se deben dirigir en la visualización de la reparación o de la carta recordativa de la fase tardía así como exposiciones crónicas para investigar las adaptaciones celulares a largo plazo. Así, para los estudios comprensivos de la inflamación del pulmón que implican el órgano vivo15 y el animal16,30,31 técnicas de proyección de imagen, el diseño actual del estudio del punto final puede proporcionar penetraciones vitales en la respuesta del anfitrión a la bajo-dosis combinada O3 (muerte celular) y a los LPS (estímulo inmune), y así descifrar los mecanismos de lesión pulmonar aguda.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses ni revelaciones que hacer.

Acknowledgments

La investigación realizada está financiada por la subvención del Presidente NSERC, así como con fondos 19 del Centro Canadiense para la Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk. El Centro Canadiense de Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk está financiado por Innovation Saskatchewan. Las imágenes de fluorescencia se realizaron en el Centro de Imágenes WCVM, que es financiado por NSERC. Jessica Brocos (estudiante de maestría) y Manpreet Kaur (estudiante de maestría) fueron financiadas por los fondos de puesta en marcha del Centro Canadiense de Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

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