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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS

Published: March 21, 2021 doi: 10.3791/62097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

Summary

Les souris exposées à l’ozone et à l’endotoxine bactérienne combinées montrent une mort cellulaire largement répandue, y compris celle des neutrophiles. Nous avons observé des adaptations cellulaires telles que la rupture du lamellipodia cytosquelettique, l’expression cellulaire accrue de la sous-unité complexe de synthase de V ATP β et l’angiostatin dans le lavage broncho-alvéolaire, la suppression de l’immuno-réaction de poumon et le recrutement retardé de neutrophile.

Abstract

Les poumons sont continuellement confrontés à des insultes directes et indirectes sous la forme de conditions inflammatoires stériles (particules ou toxines réactives) et infectieuses (bactériennes, virales ou fongiques). Une réponse écrasante de centre serveur peut avoir comme conséquence la respiration compromise et la lésion pulmonaire aiguë, qui est caractérisée par le recrutement de neutrophile de poumon en raison de la réponse patho-logique de retouche immunisée, coagulative et de tissu de centre serveur. Des méthodes microscopiques sensibles pour visualiser et quantifier les adaptations cellulaires pulmonaires murines, en réponse à une faible dose (0,05 ppm) d’ozone, un puissant polluant environnemental en combinaison avec le lipopolysaccharide bactérien, un agoniste TLR4, sont cruciales pour comprendre les mécanismes inflammatoires et de réparation de l’hôte. Nous décrivons une analyse microscopique fluorescente complète de divers compartiments de poumon et systémiques de corps, à savoir le fluide broncho-alvéolaire de lavage, le perfusat vasculaire de poumon, les cryosections gauches de poumon, et le perfusate sternal de moelle. Nous montrons des dommages des macrophages alvéolaires, des neutrophiles, du tissu parenchymal de poumon, aussi bien que des cellules de moelle en corrélation avec une réponse immunitaire retardée (jusqu’à 36-72 h) qui est marquée par des gradients discrets de chemokine dans les compartiments analysés. En outre, nous présentons la matrice extracellulaire de poumon et les interactions cytosquelettiques cellulaires (actine, tubuline), les espèces mitochondriques et réactives de l’oxygène, le plasminogen anti-coagulatif, son angiostatin anti-angiogénique de fragment de peptide, les sous-unités Mitochondriques de V de complexe de synthase d’ATP, α et β. Ces marqueurs de substitution, lorsqu’ils sont complétés par des essais cellulaires in vitro adéquats et des techniques d’imagerie animale in vivo telles que la microscopie intravitale, peuvent fournir des informations vitales vers la compréhension de la réponse pulmonaire à de nouveaux agents immunomodulateurs.

Introduction

La lésion pulmonaire aiguë (LAI) est une réponse pathologique cruciale des poumons aux stimuli infectieux ou autres stimuli nocifs qui est marquée par l’activation simultanée des systèmes immunitaires coagulatif, fibrinolytique et inné1. Les neutrophiles détectent rapidement les modèles de dommages microbiens et intracellulaires à travers la famille des récepteurs toll-like (TLR)2,3,4. Les neutrophiles libèrent des cytokines préformées et le contenu cytotoxique de granule, qui peuvent alors causer des dommages collatéraux de tissu. Les dommages alvéolaires qui s’ensuivent sont gâchés par la mort cellulaire secondaire conduisant à la libération de molécules telles que l’adénosine triphosphate (ATP)5, mettant ainsi dans un cercle vicieux d’immuno-dysrégulation.

Un problème non résolu dans la compréhension d’ALI se rapporte à la question de savoir comment les dommages sont initiés dans la membrane alvéolaire. Le complexe de transport d’électrons V, F1F0 ATP synthase, est une protéine mitochondriale connue pour être exprimée de manière omniprésente, sur la membrane plasmique cellulaire (y compris endothéliale, leucocytaire, épithéliale) pendant l’inflammation. Le cytosquelette cellulaire qui est composé d’actine et de tubuline, héberge de nombreuses formes cellulaires et fonction modulant ainsi que des protéines mitochondriales, respectivement. Nous avons récemment montré que le blocage de l’ATP synthase par une molécule endogène, l’angiostatine, réduit au silence le recrutement des neutrophiles, l’activation et le lipopolysaccharide (LPS) induit une inflammation pulmonaire6. Ainsi, les mécanismes biochimiques (SYNTHASE D’ATP) et immunisés (TLR4) pourraient régler la barrière alvéolaire pendant l’inflammation de poumon.

L’exposition à l’ozone (O3),un polluant environnemental, altère la fonction pulmonaire, augmente la susceptibilité aux infections pulmonaires, et de faibles niveaux d’exposition à L’O3 augmentent le risque de mortalité chez les personnes atteintes d’affections cardiorespiratoires sous-jacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Ainsi, l’exposition à des concentrations physiologiquement pertinentes d’O3 fournit un modèle significatif d’ALI pour étudier les mécanismes fondamentaux de l’inflammation7,8. Notre laboratoire a récemment établi un modèle murin de faible doseO3 induite ALI15. Après avoir effectué une dose et une réponse temporelle à de faibles concentrationsd’O3, nous avons observé que l’exposition à 0,05 ppmO3 pendant 2 h, induit une lésion pulmonaire aiguë marquée par l’ATP synthase du poumon complexe V sous-unité β (ATPβ) et l’expression de l’angiostatine, similaire au modèle LPS. L’imagerie pulmonaire intravitale a révélé une désorganisation des microfilaments alvéolaires d’actine indiquant des lésions pulmonaires, et l’ablation des niveaux alvéolaires des espèces réactives septales de l’oxygène (ROS) (indiquant l’abrogation de la signalisation cellulaire de base) et du potentiel mitochondrique membranaire (indiquant une mort cellulaire aiguë) après une exposition de 2 h à 0,05 ppm O315 qui était corrélée avec un poumon hétérogène 18rétention FDG16,le recrutement des neutrophiles et la libération de cytokines, plus particulièrement IL-16 et SDF-1α. Le message à retenir de nos études récentes est que l’O3 produit une toxicité exponentiellement élevée lorsqu’il est exposé à des concentrations inférieures aux limites autorisées de 0,063 ppm sur 8 h (par jour) pour l’exposition humaine. Il est important de ne pas comprendre clairement si ces expositions subcliniques àO3 peuvent moduler les mécanismes médiés par TLR4 tels que l’endotoxine bactérienne17. Ainsi, nous avons étudié un modèle d’expositiono3 et LPS à double succès et avons observé les adaptations cellulaires immunitaires et non immunitaires.

Nous décrivons une analyse microscopique fluorescente complète de divers compartiments pulmonaires et systémiques du corps, à savoir le liquide de lavage broncho-alvéolaire (c.-à-d., BAL) qui échantillonne les espaces alvéolaires, le perfusat vasculaire pulmonaire (c.-à-d., LVP) qui échantillonne la vascularisation pulmonaire et l’interstitium septal alvéolaire en cas de barrière endothéliale compromise, cryosections pulmonaires gauches, pour examiner les leucocytes parenchymateux et adhérents résidents laissés dans le tissu pulmonaire lavage , le sang périphérique qui représente les leucocytes circulants et les perfusats sternaux et fémurs qui échantillonnent les sites proximaux et distaux de la mobilisation des cellules hématopoïétiques pendant l’inflammation, respectivement.

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Protocol

La conception de l’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche sur les animaux de l’Université de la Saskatchewan et a respecté les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux pour l’utilisation sans cruauté des animaux. Des souris masculines C57BL/6J de six-huit semaines ont été obtenues. NOTA : Euthanasier tout animal qui développe une léthargie sévère, une détresse respiratoire ou d’autres signes de détresse grave avant le point final prévu.

NOTA : Préparez ce qui suit : 27-18 G émoussés à l’aiguille (dépendra du diamètre trachéal de la souris), tubes en PE de taille appropriée pour s’adapter à l’aiguille émoussée (faire une canule pe pour chaque souris), canule, 2 ciseaux tranchants, 2 pinces émoussées (petites), 1 pince tranchante (petite), seringues de 3 1 mL, tubes de microfuges marqués (pour la collecte de BAL, de sang, de perfusat vasculaire et de moelle osseuse) et flacons étiquetés (pour la fixation des tissus), sacs d’échantillons/cryovials pour la collecte des tissus, rouleau de fil de coton de boucher (coupé en ligatures de taille adéquate). Tous les produits chimiques utilisés pour les expériences sont indiqués dans la table des matériaux.

1. Expositions à l’ozone et au LPS pour l’induction d’une lésion pulmonaire murine

  1. Exposition à l’ozone
    1. Préparez une boîte d’induction O3 personnalisée. Ajoutez de l’alimentation pour souris, une bouteille d’eau, des jouets d’enrichissement et une literie propre dans l’ordre et imitez l’environnement de logement des souris.
      REMARQUE: Ces étapes garantiront que les souris ont un accès gratuit à la nourriture et à l’eau lorsqu’elles sont logées dans la boîte à induction personnalisée et aideront à atténuer le stress excessif.
    2. Allumez l’étalonneur/générateur O3 « ON » (placé vers le port d’entrée) pour stabiliser la lampe UV avant la main (environ 15 min avant les expositions) et connectez-vous avec le moniteur O3 en ligne.
      NOTA : Le moniteur O3 doit indiquer une moyenne de 0,05 ppm, tel qu’échantillonné à la sortie à température de l’air de la chambre (72 ±3 °F) et humidité relative (50 ±15 %).
    3. Pour les expositions àl’O3, placez délicatement les souris dans la boîte à induction personnalisée et exposez continuellement les souris à 0,05 ppmO3 pendant 2 h.
  2. Anesthésie et administration intranasale de LPS
    1. Préparer séparément des stocks de 10 mg/mL pour la kétamine et la xylazine.
    2. Préparez un cocktail en mélangeant 20 parties de kétamine et 1 partie de xylazine. Si la souris pèse X g, injecter (X/200) mL de cocktail kétamine/xylazine dans la cavité péritonéale. Pour une souris, préparer 1 mL de cocktail comprenant 1000 μL du stock de kétamine à 10 mg/mL et 50 μL du bouillon de xylazine. Bien mélanger en pipetant de haut en bas dans un tube de microfuge.
      REMARQUE: Les stocks de kétamine et de xylazine peuvent être préparés une semaine à l’avance.
    3. Anesthésier les souris sous un léger mélange intrapéritonéal (IP) kétamine (50 mg/kg)/xylazine (1 mg/kg) (p. ex., pour une souris de 25 g, injecter 0,125 mL du cocktail).
    4. Préparer une solution à 1 mg/mL de LPS, dans une solution saline, et remplir 50 μL de la solution dans une pipette.
    5. Tenez la souris debout avec son dos / côté dorsal sur la paume, tenant les oreilles avec la même main. Maintenant, placez 50 μL de la solution LPS18 doucement à l’extérieur des narines (c.-à-d. 25 μL sur chaque narine ou 50 μL sur une narine; peu importe tant que la procédure est rapide) et laissez les souris inhaler la solution LPS.
    6. Instiller des souris témoins avec 50 μL de solution saline stérile.
      Attention: Ne pas dépasser plus de 100 μL pour l’instillation, qui pourrait être fatale. Trop peu de volume (c.-à-d. <50 μL) et il y a un risque de dépôt nasal seulement.
    7. Après l’administration de LPS, posez doucement les souris, soit sur leur ventre ou leur dos sur le monticule de litière avec leur tête inclinée légèrement vers le bas.
      NOTE : Cette orientation prolonge la rétention de la solution dans la cavité nasale19.
    8. À 0, 2, 4, 24, 36 et 72 h après l’exposition, anesthésier les souris i.p. avec une dose complète de mélange de kétamine (200 mg/kg)/xylazine (4 mg/kg) (c.-à-d. X/50 mL du cocktail, où X est le poids de la souris en grammes ou 0,50 mL pour une souris de 25 g).
    9. Observez la souris jusqu’à ce qu’elle perde conscience et le bon réflexe (c.-à-d. qu’elle ne se retourne pas lorsqu’elle est couchée en décubitus dorsal). Maintenant, vérifiez la souris pour la profondeur de l’anesthésie, en surveillant la respiration (excursions thoraciques rythmiques) et la fréquence cardiaque, qui devrait tomber sensiblement, après 1-2 minutes.
    10. Ensuite, vérifiez les réflexes de pédale, c’est-à-dire pincez l’un ou l’autre des doigts du membre postérieur et observez la rétraction du membre, comme un réflexe. Si la souris répond, rechargez avec des injections supplémentaires de 0,1 mL ou plus, au besoin.
      REMARQUE: Pour obtenir une anesthésie profonde, gardez à l’esprit que certaines souches ou souris obèses ont généralement un plus grand volume de distribution et peuvent donc être facilement surdosées, si suffisamment de temps si elles ne sont pas autorisées pour une anesthésie complète (qui peut être d’environ 10 minutes ou plus). En conséquence, certaines souches peuvent être résistantes à l’anesthésie et nécessitent donc plus de recharges. Ces connaissances sont acquises après de nombreuses observations pratiques et expériences avec des souris de différentes souches et de différents âges. Comme quelques expériences pilotes ont également été réalisées immédiatement après les expositions àO3 et à LPS (c.-à-d. au point de temps de 2 h), nous avons également inclus une analyse très précoce des cellules BAL de ces expériences pour mettre en évidence les effets immédiats de l’exposition combinée à O3et À LPS.

2. Prélèvement d’échantillons

  1. Placez la souris sur le plateau chirurgical. Maintenant, mettez doucement une pommade lubrification sur les deux yeux pour éviter la perte de liquide et désinfectez la souris avec un spray éthanol à 70%.
    1. Faites de petites coupures à travers les membranes supérieures et inférieures de la peau avec des ciseaux, pour exposer la trachée et le thorax.
    2. Faites une coupe juste en dessous du sternum et exposez le cœur.
  2. Ponction cardiaque
    1. Placez une aiguille 25G attachée à une seringue héparinisée dans le ventricule droit et prélevez du sang par ponction cardiaque.
      REMARQUE: Le sang tire généralement avec un tirage minimal du piston, si le temps entre l’exposition du cœur à une ponction cardiaque est de moins d’une minute. Après avoir recueilli environ 0,4 à 0,5 mL, il peut être nécessaire de faire une pause de quelques secondes avant de recueillir le sang restant. Ceci est fait pour laisser le cœur pomper tout volume restant dans la chambre ventriculaire droite. À la fin de la collecte de sang, le cœur s’arrête pour pomper.
    2. Recueillir le sang et stocker dans des tubes de microfuges pour un traitement ultérieur.
  3. Trachéotomie
    1. Utilisez soigneusement une pince à épiler/pince émoussé pour dégager la région trachéale du tissu qui se délite. Utilisez les mains gantées plus que les instruments chirurgicaux pour éviter les saignements. Si beaucoup de sang suinte, il y a un risque de contamination des échantillons de BAL. Utilisez des cotons-tiges, si nécessaire, mais pas préféré. Les kimwipes sont de meilleures alternatives.
    2. Maintenant, coupez à travers la cage thoracique pour exposer les poumons. Encore une fois, soyez prudent de ne pas couper le sternum et les artères intercostales ou l’aorte ascendante; faire des coupes plus petites tout en avançant à travers la cage thoracique)
    3. Passez une ligature de coton sous l’herbe trachéale et laissez-la telle pour le moment.
    4. Pincez la trachée à un endroit approprié dans la partie distale 1/3rd, pointant vers les poumons, pour permettre l’accès à une canule trachéale de 28 G.
    5. Insérez une canule PE de 28 G (d’une longueur minimale de 3 à 5 mm et une extrémité distale coupée pour faciliter l’insertion) dans la trachée. Méfiez-vous de l’extrémité de la trachée avant la bifurcation, puis tirez environ un mm en arrière pour éviter d’échantillonner un seul lobe.
    6. Attachez fermement la ligature de coton pour maintenir la canule en place. Ne pas effondrer la canule.
  4. Lavage broncho-alvéolaire (BAL)
    1. Remplissez 0,5 mL de PBS dans une seringue de 1 mL.
    2. Maintenant, injectez progressivement 0,5 mL de PBS dans la canule à l’aide d’une seringue de 1 mL.
    3. Après avoir injecté du PBS, aspirez la seringue tant qu’elle ne résiste pas à l’aspiration.
      REMARQUE: S’il y a une résistance lors de l’aspiration du liquide BAL, cela indique un effondrement du tissu alvéolaire ou bronchique. Dans ce cas, retirez la canule par une minuscule pour détacher la canule des parois du tissu.
    4. Recueillir le liquide aspiré dans un tube de microfuge marqué et le placer sur la glace.
    5. Effectuer deux autres lavages de la même façon en recueillant dans le même flacon (c.-à-d. un total de 0,5 X 3 = lavage de 1,5 mL).
    6. Mesurer le volume de liquide BAL collecté. La récupération du lavage devrait être proche de 90%.
  5. Perfusat vasculaire pulmonaire (LVP)
    1. Couper l’aorte thoracique descendante à un endroit entre les moitiés thoracique et abdominale, pour éviter tout recul de perfusat dans les poumons tout en perfusant à travers le ventricule droit.
    2. Éponger la cavité près de l’extrémité de l’aorte coupée, exempte de sang.
    3. Ensuite, perfuser les poumons avec 0,5 mL de solution saline héparinisée à température ambiante injectée à travers le ventricule droit.
    4. Recueillir le perfusat vasculaire de la cavité à l’extrémité coupée de l’aorte thoracique descendante, dans un tube de microfuge, placé sur de la glace et mesurer son volume.
    5. Lilaguer la bronche droite proximale à sa ramification de la trachée (avec du fil de coton).
  6. Fixation in situ du poumon gauche
    1. Connectez une seringue de 1 mL à la canule trachéale, qui est assez longue pour s’insérer à travers l’incision trachéale précédente.
    2. Aspirez l’air dans la seringue jusqu’à 0,6 mL.
    3. Ensuite, remplissez la seringue restante (jusqu’à la toute fin) avec du paraformaldéhyde à 2% à température ambiante. Assurez-vous que le piston est prêt à sortir sans aspirer l’air de la canule.
    4. Maintenant, fixez la seringue avec un scotch, sur un récipient vertical, mesure jusqu’à 20 cm de hauteur.
    5. Retirez doucement le piston pour laisser s’écouler la fixatrice vers la trachée. Dans le cas où il y a quelques bulles d’air dans la canule, placez doucement le piston sur le dessus de la seringue et le liquide commencera à s’écouler après quelques secondes.
    6. Laisser le poumon gauche gonfler à sa capacité totale insitu, pendant 5 minutes, à partir d’une hauteur de 20 cm formant une colonne d’eau de 20 cm.
    7. Au cours de cette procédure, assurez-vous de protéger les lobes pulmonaires droits contre le contact avec le paraformaldéhyde, car cela affectera les tests en aval.
    8. Placez les tissus de laboratoire pliés pour absorber tout paraformaldéhyde qui pourrait entrer en contact avec les lobes pulmonaires droits.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est très toxique. Par conséquent, n’inhalez pas et ne placez pas de contact avec les parties exposées du corps. Faites preuve d’une extrême prudence lors de la manipulation.
    9. Pendant le temps de l’instillation du paraformaldéhyde, désinfectez l’abdomen.
    10. Couper les lobes pulmonaires droits de la trachée en vous assurant d’enlever n’importe quel fil et mettre immédiatement les lobes dans un cryovial marqué et le laisser tomber dans de l’azote liquide pour l’analyse moléculaire / biochimique en aval des cytokines / RT-PCR / analyse western blot de l’homogénat pulmonaire.
    11. Coupez soigneusement le poumon gauche pour tout tissu conjonctif ou membrane pleurale et trempez-le dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 24 h à 4 °C.
    12. Incorporez le poumon fixe dans la paraffine conformément au protocole d’incorporation standard.
      Attention: Ne pas trop chauffer les échantillons pulmonaires.
    13. Coupez la partie abdominale et dépeint de l’os pelvien (hanche).
    14. Séparez les os gauche et droit du fémur de la partie pelvienne, dans une boîte de Pétri remplie de solution saline conservée sur la glace.
  7. Collecte aspirée de moelle osseuse sternale et fémur
    1. Nettoyez les tissus et les muscles des os à l’aide de tissus de laboratoire.
    2. Recueillir la cage thoracique ventrale et le sternum dans une boîte de Petri remplie de solution saline conservée sur la glace.
    3. Couper les extrémités distales et proximales des os sternaux et fémurs.
    4. Impréner les os 4 fois avec 0,5 mL de solution saline, à l’aide d’aiguilles bien ajustées (24 à 28 G) sur des seringues de 1 mL, et recueillir les fractions de chaque os dans des tubes étiquetés munis de filtres et placés sur de la glace.
      REMARQUE: La jauge à aiguille varie selon la taille de l’animal. Après le rinçage, l’os du fémur devrait apparaître transparent.
    5. Une fois les échantillons prélevés, mettez la souris dans un sac en plastique et mettez-la dans un congélateur de carcasse d’animal pour une élimination appropriée, conformément aux lignes directrices de l’établissement pour animaux de l’établissement pour animaux de l’établissement.

3. Traitement des échantillons

  1. Nombre total (CCM) et différentiel (DLC) de leucocytes
    1. Centrifuger les échantillons de sang périphérique, de BAL, de perfusat vasculaire pulmonaire et de moelle osseuse (sternale et fémur) pendant 10 min à 500 g.
    2. Recueillir les surnageants, les congeler instantanément et les stocker à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
    3. Reconstituer les cellules dans un minimum de 200 μL de PBS.
    4. Effectuer la CCM en comptant le BAL, le sang, le perfusat vasculaire pulmonaire et les cellules de moelle osseuse sur un hémocytomètre.
    5. Colorer une autre aliquote de 9 μL de BAL avec un mélange de 1 μL de vert calcéine et d’éthidium homodimer-1 rouge pour quantifier les cellules vivantes (vertes) en raison de l’activité de l’estérase intracellulaire et de toutes les cellules BAL endommagées (en rouge) en raison de la perte d’intégrité de la membrane plasmique.
    6. Ajouter 2% d’acide acétique aux globules rouges de lyse, dans un rapport de 1:10 pour le TLC de sang et de rapport de 1:2 pour le TLC de vasculaire de poumon.
      ATTENTION : Ajuster les concentrations cellulaires en diluant dans le PBS si la concentration est supérieure à 1x106 cellules par mL (très important pour les échantillons de moelle osseuse).
    7. Centrifuger les cellules pour préparer des cytospins sur les lames et la tache comme expliqué ci-dessous pour les DLC. Comptez un minimum de 100 cellules pour le compte différentiel de cellules de leucocyte (DLC).
      REMARQUE: Typiquement, on peut préparer deux cytospins sur une lame. Et après 10-15 minutes de séchage à l’air, procédez à l’étape de coloration.
    8. Divisez le BAL collecté de trois souris pilotes par groupe en deux cytospins chacun et tachez l’actine/tubuline et les mitochondries avec phosphorylation oxydative active (mitotracker réduit). Utilisez la BAL de trois souris supplémentaires pour diviser en deux cytospins chacune, pour les lames colorées par NK1.1/Gr1/CX3CR1 et ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatine. Diviser la BAL de trois souris supplémentaires en deux cytospins chacune pour tacher l’ATPα/Ly6G et le CX3CR1/Siglec-F.
  2. Lavage bronchoalvéolaire (BAL) et quantification des protéines totales du perfusat vasculaire pulmonaire (LVP)
    1. Afin de quantifier les perturbations induites parO3 et LPS de la barrière vasculaire ou de la pression oncotique relative dans les deux compartiments pulmonaires (c.-à-d. les compartiments septaux alvéolaires (interstitiels) et vasculaires pulmonaires (vasculaires)), mesurer la teneur totale en protéines dans les fluides collectés.
    2. Analyser les fractions surnageantes décongelées pour leur concentration totale en protéines à l’aide d’un test colorimétrique standard résistant aux détergents.
    3. Lavage bronchoalvéolaire (BAL) et analyse des chimiokines du perfusat vasculaire pulmonaire (LVP)
      1. Ensuite, analysez les chimiokines dans les surnageants bal et de perfusate vasculaire pulmonaire (LVP) utilisant un immunoessai à base de perles magnétiques de 33-plex. Cela renseignera sur la directionnalité des gradients de chimiokines des voies respiratoires/interstitium par rapport aux chimiokines vasculaires établies après des expositions combinées.
      2. Analyser le panel suivant de chimiokines : CXCL13 (chimioattractant des lymphocytes B), CCL27 (chimiokine IL-11 R-alpha-locus (ILC)), CXCL5 (peptide 78 activant les neutrophiles dérivé de l’épithélial (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interféron gamma), IL-10 (interleukine-10), IL-16 (interleukine-16), IL-1β (interleukine-1 bêta), IL-2 (interleukine-2), IL-4 (interleukine-4), IL-6 (interleukine-6), CXCL-10 (protéine induite par l’interféron gamma 10 (IP-10)), CXCL11 (protéine inductible interféron-gamma 9 (IP-9)), KC (kératinocytes chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory 1 protéine-3 bêta), RANTES (régulé lors de l’activation, cellule T normale exprimée et sécrétée (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (facteur 1 dérivé des cellules stromales), TARC (thymus et chimiokine régulée d’activation (TARC)), TECK (Thymus-Expressed Chemokine (CCL25)) et TNFα (facteur de nécrose tumorale alpha).

4. Coloration cytospin et histologie pulmonaire

  1. Coloration biochimique de cytospin
    1. Entourez les cytospins d’un stylo hydrophobe pour contenir les produits chimiques pour l’incubation pendant la procédure.
    2. Réhydratez les cytospins dans le PBS pendant 5 minutes.
    3. Fixer les échantillons de cytospin dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 10 minutes, laver trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
    4. Perméabiliser avec de l’acétone glacée à 70% pendant 7 minutes et laver à nouveau trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune.
    5. Coloration pour l’actine et la tubuline ou Mitotracker réduit (incuber avec un mélange de 2 μg/50 μL de phalloïde conjuguée Alexa 488 en vert et 2 μg/μL de souris conjuguée Alexa 555 anti-α de tubuline ou de Mitotracker réduit représenté en rouge, respectivement) pendant 15 minutes.
      REMARQUE: Utilisez l’anticorps de contrôle d’isotype IgG1 de souris, dans un cytospin séparé, pour valider le protocole de coloration de la tubuline. Effectuer les mêmes étapes que celles expliquées des sections 4.1.1 à 4.1.8, mais pour les contrôles d’isotype.
    6. Enlevez les taches en faisant basculer doucement le mélange de la lame. Incuber les lames avec DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) pendant 5-10 min pour colorer les noyaux.
    7. Laver les cytospins 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacune, la lamelle de couverture avec un support de montage anti-fondu et conserver pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante avant l’imagerie.
    8. Acquérir des images sous un microscope droit à large champ équipé d’une caméra scientifique. Assurez des temps d’exposition de caméra cohérents définis pour les différents canaux fluorescents lors de l’imagerie des diapositives.
  2. Coloration cytospin immunisée-fluorescente:
    1. Entourez les cytospins d’un stylo hydrophobe pour contenir les produits chimiques pour l’incubation pendant la procédure. Réhydratez les cytospins dans le PBS pendant 5 minutes.
    2. Fixer les échantillons de cytospin en incubant dans du paraformaldéhyde à 2% pendant 10 minutes, laver trois fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
    3. Perméabiliser avec 0,1% de triton froid X-100 pendant 2 minutes, laver trois fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
    4. Ensuite, fc bloquer pendant 15 minutes en incubant le cytospin avec une dilution 1:50 du stock d’anticorps bloc Fc (pour s’assurer que l’anticorps primaire de souris ne réagit pas de manière non spécifique avec les anticorps fc de souris).
    5. Faites basculer les lames pour enlever le bloc Fc et passer à 1% BSA pour et incuber le cytospin avec un mélange de 3 anticorps primaires d’intérêt (voir le tableau 1 pour les différentes combinaisons) pendant 30 minutes.
      REMARQUE: Assurez-vous d’exécuter des anticorps de contrôle d’isotype (incuber avec un mélange d’anticorps primaires IgG1 de souris et de kappa IgG2b de rat en effectuant les étapes 4.2.1 à 4.2.9 et en remplaçant les anticorps par des contrôles d’isotype) en parallèle avec les anticorps secondaires correspondants comme discuté dans notre étude récente20.
    6. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacun. Incuber les cytospins avec un mélange d’anticorps secondaires bien conçus (veuillez vous référer au tableau 1 pour les détails).
    7. Enlevez les taches en faisant basculer doucement le mélange de la lame, incuber avec du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylétoïne) pendant 5-10 min pour tacher les noyaux. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacun.
    8. Lamelle de couverture avec support de montage anti-fondu et conserver pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante avant l’imagerie.
    9. Acquérir des images sous un microscope droit à large champ équipé d’une caméra scientifique. Assurez des temps d’exposition de caméra cohérents pour tous les canaux de fluorophores lors de l’imagerie des diapositives.
  3. Hématoxyline et histologie de l’éosine (H&E)
    1. Effectuer une coloration H&E modifiée3 sur les cryo-sections pulmonaires pour tous les groupes.
  4. Analyse d’image
    1. Traiter et analyser les fichiers image data (.tiff) dans le logiciel ouvert Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Vérifiez les paramètres requis (Surface, Périmètre, Densité intégrée, Descripteurs de forme, Diamètre du feret, Circularité, Étiquette d’affichage) à enregistrer sous l’onglet Analyser et Définir les mesures.
    3. À l’aide du gestionnaire de retour sur investissement,décrivez manuellement environ 50 à 200 cellules dans le panneau d’images fusionnées à l’aide de l’outil « sélections à main levée ». Enregistrez les régions d’intérêt (ROI) avec la commande Ctrl+T et copiez les ROIs enregistrés pour chaque cellule sur tous les canaux de fluorophore.
    4. Appuyez ensuite sur Ctrl+M pour mesurer les paramètres prédéfinis pour tous les canaux fluorescents (par exemple, 405 nm (DAPI ou ATPβ en bleu), 488 nm (actine ou NK1.1 ou Ki-67 en vert), 568 nm (tubuline ou Gr1 ou CD61 en rouge) et 633 nm (CX3CR1 ou angiostatine en magenta)).
    5. Enregistrez les résultats en tant que fichier .csv sous un nom approprié qui représente votre analyse. Copiez les résultats du fichier .csv dans une feuille de calcul et divisez l’intensité de fluorescence (FI) (qui est la colonne Densité intégrée brute du fichier de résultats) de la molécule colorée par celle de DAPI ou CD61 FI, selon la conception de coloration. Ces ratios sont appelés « ratios FI normalisés DAPI ou CD61 ».
    6. Ensuite, tracez ces rapports normalisés, la circularité, le périmètre cellulaire et le diamètre du férode, pour évaluer tout changement dans la taille de la cellule après l’exposition combinée à O3 et À LPS.
    7. Utilisez un logiciel statistique approprié pour vérifier la normalité des données recueillies et pour tester l’hypothèse nulle (veuillez vous référer à la section analyse statistique ci-dessous).
  5. analyse statistique
    1. Exprimer les résultats sous forme de moyenne ± SEM. Un minimum de trois souris ont été employées par groupe.
    2. Pour l’analyse des données de chimiokines, ajustez les valeurs de p de l’ANOVA unidirectionnelle pour le taux de fausses découvertes en fonction de la correction de Benjamini et de Hoshberg.
    3. Analyser les paramètres de l’image, la cellularité, le diamètre du feret, le périmètre, les rapports d’intensité de fluorescence normalisés DAPI ou CD61 par test U de Mann-Whitney (pour comparer deux groupes) ou test de Kruskal Wallis (pour comparer plusieurs groupes) car ces données n’étaient pas distribuées normalement.
    4. Pour le reste des expériences d’imagerie, analysez les résultats à l’aide d’une analyse à sens unique de la variance suivie des comparaisons multiples de Sidak. Les valeurs de p <0,05 ont été jugées significatives.

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Representative Results

L’exposition combinée d’O3 et de LPS mène à l’inflammation systémique et à la mobilisation de moelle à 72 h : Les comptes de cellules dans différents compartiments ont indiqué des changements significatifs dans le sang périphérique et les comptes totaux de cellules de moelle fémur sur des expositions combinées d’O3 et de LPS. Bien que les expositions combinées à l’O3 et au LPS n’aient induit aucun changement dans le nombre total de cellules de bal (figure 1A) ou de LVP (figure 1B), les cellules polymorphonucléaires se sont présentées comme le type de cellule prédominant à 24(figure 1F, figure supplémentaire 1), 36 et 72 h après l’exposition. Veuillez noter l’absence de coloration Siglec-f et CX3CR1 dans les cellules polymorphonucléaires à l’image cytospin BAL 24 h(Figure 1F). La triple souillure DAPI/CD11b/Gr1 des cytospins de BAL a montré la présence de grandes cellules mononucléaires de CD11b- et de Gr1-positive qui sont des macrophages à 0 h, qui change aux plus petites cellules polymorphonucléaires montrant Gr1staining ponctué mais dépourvues de souillure de CD11b à 4 h (comme montré dans l’encart dans le supplément 1F). La majorité des cellules BAL sont polymorphonucléaires et positives pour CD11b et Gr1, à 24 h après l’exposition(figure supplémentaire 1).

Les souris présentaient une leucocytose systémique à 24 h (3,3 fois vs 0 h, p<0,05, figure 1C),suivie d’une leucopénie à 72 h qui a été marquée par des comptes inférieurs de 13 fois dans le sang périphérique par rapport à 24 h (p<0,01) et 8,6 fois plus bas par rapport à 4 h (p<0,05) après une exposition combinée à O3 et à LPS(figure 1C). Les cellules sternales de la moelle osseuse étaient également inchangées par rapport à 0 h ou après une exposition combinée àO3 et à LPS (figure 1D). Le nombre de médullaires du fémur a montré un pic tardif de 28,8 fois à 72 h par rapport à 0 h (p<0,01, figure 1E)ainsi que d’autres points temporels (p<0,01, figure 1E). La visualisation de la LVP, et des cellules sternales ainsi que de la moelle osseuse du fémur a également montré des changements dans les types de cellules aux cellules principalement polymorphonucléaires (Figure supplémentaire 1). Les cellules sternal de moelle ont montré des signes des dommages comme démontré par le matériel nucléaire extracellulaire. La moelle fémur a montré des nombres plus élevés de cellules CD11b et Gr1 positives(figure supplémentaire 1),qui coïncident avec les comptes de cellules.

La teneur totale en protéines de BAL était la plus élevée à 36 h après exposition combinée d’O3 et de LPS : La quantification des protéines totales dans les compartiments de LVP et de BAL a été effectuée pour corréler l’oedème de poumon induit par ozone, c.-à-d., exsudation de protéine de plasma due à l’affaiblissement vasculaire et épithélial résultant de barrière due à l’exposition combinée. La protéine totale de BAL était 4,5 fois plus haute à 36 h (p<0,05) par rapport à 4 h(figure 2A). Cependant, la protéine LVP était inchangée après l’exposition(figure 2B).

L’exposition combinée d’O3 et de LPS induit des gradients forts de chemokine dans le compartiment vasculaire de poumon et pas bal : des essais multiplex de chemokine ont été conduits sur des surnageants de BAL et de LVP. Veuillez noter que les différences relatives entre ces deux compartiments représentent une rétention préférentielle dans un compartiment particulier. L’émoattractant éosinophile eotaxin-2 était 4,3 fois plus élevé à 4 h dans le compartiment LVP comparé à 0 h (p<0,05, figure 3A). Dans le compartiment bal, l’eotaxin-2 était 3,2 fois plus bas à 4 h par rapport à 0 h (p<0,01, figure 3B). Les niveaux d’eotaxin-2 de BAL ont continué à diminuer uniformément jusqu’à 72 h avec une réduction de 12,6 fois par rapport à 0 h (p<0,01, figure 3B). Le lymphocyte chimioattractant IL-2 était 10,1 fois plus haut à 4 h dans le compartiment LVP comparé à 0 h (p<0,05, figure 3C). Dans le compartiment BAL, l’IL-2 était 5,0 fois plus bas à 36 h par rapport à 0 h (p<0,05, figure 3D). Les niveaux d’eotaxin-2 de BAL ont continué à diminuer uniformément 5.9-fois réduction à 72 h comparés à 0 h (p<0.05, Figure 3D).

Intéressant, beaucoup de chemokines ont été changés à 4 h, dans le LVP et pas le BAL. La plupart de ces chemokines ont montré l’augmentation modeste, pourtant significative, des niveaux de LVP à 4 h une fois comparés aux points de temps postérieurs. Bien que les niveaux d’otaxine-1 n’aient pas été élevés après les expositions par rapport à 0 h, les niveaux étaient significativement élevés à 4 h par rapport à 24 (2,7 fois, p<0,05) et 72 h (5,0 fois, p<0,01, figure 4A)après exposition combinée. Les niveaux de LVP TNFα étaient 3,4 fois plus élevés à 4 h par rapport à 36 h (p<0,05, Figure 4B). De même, LVP IFNγ était 2,9 fois plus élevé à 4 h par rapport à 72 h (p<0,05, figure 4C). Les niveaux de CX3CL1 étaient également élevés à 4 h, comparativement à 24 (1,7 fois, p<0,05), 36 (1,6 fois, p<0,05) et 72 h (2,2 fois, p<0,01) après des expositions combinées(figure 4D). Les niveaux de CCL27 ont également montré des niveaux plus élevés à 4 h par rapport à 24 (2,7 fois, p<0,05), 36 (3,9 fois, p<0,01) et 72 h (2,9 fois, p<0,05) après des expositions combinées(figure 4E).

Quelques chemokines ont eu une forte présence dans le LVP à 4 h après expositions combinées, et n’ont pas changé dans le BAL avant et après exposition, , indiquant une réponse forte de chemokine des capillaires pulmonaires. À 4 h, les niveaux de LVP d’IL-16 étaient multipliés par 3,4 par rapport à 0 h (p<0,01), 3,2 fois par rapport à 24 h (p<0,01), 4,5 fois par rapport à 36 h (p<0,01) et 4,6 fois par rapport à 72 h (p<0,01) après expositions combinées(figure 4F). À 4 h, la chimiokine neutrophile, cxcl5 LVP niveaux étaient 2,0 fois comparés à 0 h (p<0,01), 4,7 fois par rapport à 24 h (p<0,01), 2,2 fois par rapport à 36 h (p<0,01) et 2,7 fois par rapport à 72 h (p<0,01) après expositions combinées(figure 4G). À 4 h, les niveaux de CXCL10 LVP étaient multipliés par 2,3 par rapport à 0 h (p<0,01), 2,1 fois par rapport à 24 h (p<0,05), 2,5 fois contre 36 h (p<0,01) et 2,7 fois par rapport à 72 h (p<0,01) après expositions combinées(figure 4H). À 36 h, la chimiokine neutrophile, les niveaux de LVP de SDF1α étaient 4,2 fois par rapport à 0 h (p<0,01), 2,9 fois par rapport à 24 h (p<0,05), 6,8 fois par rapport à 72 h (p<0,01) après expositions combinées(figure 4I). À 4 h, les niveaux de LVP MIP3β étaient multipliés par 2,3, comparativement à 0 h (p<0,05) et à 2,3 fois par rapport à 72 h (p<0,05) après expositions combinées(figure 4J).

L’exposition combinée à O3 et à LPS induit une nécrose, perturbe l’intégrité cytosquelettique, membranaire et mitochondriale cellulaire: Comme le nombre de leucocytes compartimentaux et le contenu en protéines n’étaient pas en corrélation avec les gradients de chimiokineS LVP, il est devenu plus important de visualiser les cellules obtenues à partir de ces compartiments. La coloration ex vivo de l’actine/tubuline des cellules bal de ligne de base (0 h) a montré la présence d’actine corticale, de fibres de stress ainsi que de lamellipodia (en vert, figure 5 panneau supérieur gauche) et de réseau de microtubules (en rouge, figure 5 panneau supérieur gauche) qui a coïncidé avec la réduction de la coloration de mitotracker indiquant la présence de mitochondries actives (en rouge, figure 5 panneau inférieur gauche). Plus de 95% des cellules de BAL étaient mononucléaires à la ligne de base. À 4 h, les cellules bal ont montré le matériel nucléaire extracellulaire, la souillure cytoplasmique ponctuée d’actine dépourvue de lamellipodia et la souillure corticale réduite d’actine (montrée en vert, panneau supérieur droit de figure 5), réseau de microtubules fanned (montré en rouge, panneau supérieur droit de figure 5) qui ne correspondait pas à la souillure réduite de mitotracker (montrée en rouge, panneau droit gauche de figure 5). L’analyse de l’intensité fluorescente normalisée de l’actine DAPI a montré une diminution de 3,7 fois du rapport indiquant une réduction de la coloration de l’actine à 4 h après l’exposition (p<0,01, figure 6A). De même, l’intensité fluorescente normalisée de la tubuline DAPI a également diminué de 1,5 fois après l’exposition (p<0,01, figure 6B),ce qui indique une réduction de la coloration à la tubuline. La perte de lamellipodia était évidente avec une augmentation de la circularité du cytosquelette cellulaire BAL immédiatement, c’est-à-dire à 2 h (p<0,01, figure 6C)et 4 h (p<0,05, figure 6C)après exposition par rapport à 0 h et une diminution de la circularité cytosquelettique à 24 (p<0,05) et 36 h (p<0,01) après l’exposition, par rapport à 0 h(figure 6C).

Jusqu’à 24 h, les cellules bal de l’exposition combinée étaient doublement positives pour la calcénine (en vert, figure 7)indiquant la présence de l’activité d’estérase active, et l’homodimer d’ethidium (en rouge, figure 7), indiquant que bien que certaines cellules étaient mortes (rouge), la majorité étaient des cellules partiellement compromises. A 36 h, les cellules BAL étaient largement viables (vertes), indiquant le remplacement des cellules compromises par des leucocytes recrutés dans d’autres compartiments systémiques(figure 7).

La coloration spécifique d’ATPα et de Ly6G des cellules BAL a révélé une localisation intracellulaire discrète(Films 1 et 2)des protéines dans les macrophages alvéolaires ainsi que des neutrophiles après exposition (Figure 7). L’exposition combinée a entraîné une réduction du rapport d’intensité fluorescente normalisé DAPI de l’ATPα(figure 7,8A) et une augmentation de la teneur en protéines Ly6G intracellulaires(figure 7, figure 8B,films 1 et 2). Réduction de la coloration à l’ATPα, à 24 h après l’exposition, corrélée avec une diminution de la tubuline et, dans une certaine mesure, une réduction de la coloration de mitotracker. Nous avons également observé des corps cellulaires positifs à l’ATPα anucléaire après l’exposition, qui pourraient être des plaquettes. Toutefois, nous n’avons pas confirmé nos constatations. A 2 h, nous avons observé des cellules BAL mononucléaires plus petites (p<0,01 Figure 8C,p<0,01 Figure 8D)par rapport à 0 h mais à 4 h, les cellules mononucléaires étaient plus grandes (p<0,01 Figure 8C,p<0,01 Figure 8D)par rapport à 0 h. A 24 (p<0.01 Figure 8C,p<0.01 Figure 8D)et 36 h (p<0.01 Figure 8C,p<0.01 Figure 8D),les cellules BAL sont devenues progressivement plus petites en raison d’un déplacement vers les cellules polymorphonucléaires, par rapport à 0 h.

Immunophenotyping des cellules de BAL a indiqué des expressions passagères de NK1.1, de l’ATP β et de Ki-67 et des expressions soutenues des cellules gr1, CX3CR1 et angiostatin positives de BAL après des expositions combinées d’O3 et de LPS : La souillure immunofluorescente du premier ensemble de cytospins de BAL ont été normalisées à la souillure de DAPI. Il y avait une augmentation des cellules cellulaires NK1.1 positives à 24 h (p<0,05 vs 0 h, figure 9,10A). À 36 h, les cellules de BAL ont eu l’intensité fluorescente cellulaire inférieure de NK1.1 (p<0.01 contre 0 et 24 h, figure 9,10A). L’intensité fluorescente gr1 cellulaire était plus élevée à 24 h (p<0,01 vs 0 h, figure 9,10B)ainsi qu’à 36 h (p<0,01 vs 0 h, figure 9,10B). De même, l’intensité fluorescente cx3CR1 cellulaire était plus élevée à 24 h (p<0,01 vs 0 h, figure 9,10C)ainsi qu’à 36 h (p<0,01 vs 0 h, figure 9,10C).

Une fois normalisé à CD61 cellulaire, qui est également omniprésent dans l’expression, a révélé une augmentation de l’intensité fluorescente atpβ cellulaire à 24 h (p<0.01 vs 0 h, Figure 9,10D)et une diminution de l’intensité fluorescente atpβ cellulaire à 36 h (p<0.01 vs 0 et 24 h, Figure 9,10D). Notamment, l’ATPβ a montré une localisation principalement nucléaire à 24 h par rapport à la localisation périphérique à 36 h(figure 9). L’intensité fluorescente cellulaire du BAL Ki-67, un indicateur de prolifération cellulaire, était plus élevée à 24 h (p<0,01 vs 36 h, figure 9,10E)par rapport à 0 et 36 h. Les niveaux étaient inférieurs aux niveaux de référence à 36 h (p<0,01, figure 9,10E),très probablement en raison d’une expression polymorpho-nucléaire cd61 plus élevée vs Ki-67 à 36 h(figure 9). Enfin, l’intensité fluorescente cellulaire de l’angiostatine bal était uniformément haute à 24 et 36 h (p<0,01 contre 0 h, figure 9,10F),indiquant une augmentation spécifique de ce fragment plasminogène clivé de métalloprotéinase, pendant la réponse inflammatoire de poumon.

Les expositions combinées produisent des lésions pulmonaires très répandues : L’histologie pulmonaire a révélé que les expositions combinées produisent des dommages prolongés aux poumons, comme on l’a vu dans les cryosections colorées en H&E (figure 11). Bien que l’on s’attende à des dommages septaux bronchiolaires et alvéolaires, il était surprenant d’observer des dommages endothéliaux de vaisseaux plus gros, à 36 h après l’exposition(figure 11). Il y avait des leucocytes intravasculaires adhérents, des plaques d’agrégats de leucocytes (y compris des neutrophiles) dans les régions septales et péri-bronchiolaires alvéolaires endommagées(figure 11).

Figure 1
Figure 1: Numération des leucocytes compartimentaux : A) Numération des leucocytes totaux par lavage broncho-alvéolaire (BAL) à 0 (c.-à-d. niveau de référence), 4, 24, 36 et 72 h après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone (O3)et de 50 μg de LPS intranasale chez les souris. B) Concentration totale de leucocytes de perfusat vasculaire pulmonaire (LVP) à 0 (c.-à-d. ligne de base), 4, 24, 36 et 72 h après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone(O3)et de 50 μg de LPS intranasal chez les souris. C) Concentration totale de leucocytes dans le sang périphérique (PB) à 0 (c.-à-d. au départ), 4, 24, 36 et 72 h après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone (O3)et de 50 μg de LPS intranasal chez les souris. D) Concentration totale de leucocytes dans la moelle osseuse sternale (BM) à 0 (c.-à-d. au départ), 4, 24, 36 et 72 h après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone(O3)et de 50 μg de LPS intranasal chez les souris. E) Concentration totale de leucocytes dans la moelle osseuse du fémur (BM) à 0 (c.-à-d. niveau de référence), 4, 24, 36 et 72 h après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone (O3)et de 50 μg de LPS intranasal chez les souris. Pour les graphiques A-E, 0 h est représenté en bleu, 4 h en rouge, 24 h en vert, 36 h en violet et 72 h en orange; * p<0,05 et ** p<0,01. F) Lame représentative de cytospin BAL d’exposition de 24 h, montrant des cellules mononucléaires et polymorphonucléaires lorsqu’elles sont colorées pour les noyaux avec DAPI (en bleu), CX3CR1 (en vert) et Siglec-F (en rouge). Notez que la fusion de CX3CR1 et Siglec-F apparaît comme orange-jaune. La majorité des cellules mononucléaires sont positives pour Siglec-F, qui est une caractéristique des macrophages alvéolaires. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Quantification des protéines totales : A) Lavage bronchoalvéolaire (BAL) teneur totale en protéines et B) Concentration totale en protéines du perfusat vasculaire pulmonaire (LVP) a été estimée par analyse des protéines de 660 nm (Thermoscientifique, IL, US). Pour les graphiques A-B, 0 h est représenté en bleu, 4 h en rouge, 24 h en vert, 36 h en violet et 72 h en orange; * p<0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Gradients dechimiokines de l’eotaxine pulmonaire-2 et de l’IL-2 : Sur les 33 chimiokines, deux chimiokines ont été significativement modifiées dans le perfusat vasculaire pulmonaire (LVP) et le lavage bronchoalvéolaire (BAL) et le liquide après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone (O3)et de 50 μg de LPS intranasal à des souris A) LVP eotaxin-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 et D) BAL IL-2. Les données ont été analysées par anova à sens unique et la valeur de p pour le taux de fausse découverte de plusieurs variables a été ajustée selon la correction de Benjamini et de Hoshberg. Pour les graphiques A-D, 0 h est représenté en bleu, 4 h en rouge, 24 h en vert, 36 h en violet et 72 h en orange. Des comparaisons paire-sages ont été analysées après Bonferroni' correction de s. * représente p<0,05, ** représente p<0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Concentrations de chimiokines de perfusat vasculaire pulmonaire : Les concentrations de dix chimiokines supplémentaires ont été modifiées, mais seulement dans le compartiment du perfusat vasculaire pulmonaire (LVP). A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α et J) MIP3β. Pour les graphiques A-J, 0 h est représenté en bleu, 4 h en rouge, 24 h en vert, 36 h en violet et 72 h en orange. Des comparaisons paire-sages ont été analysées après Bonferroni' correction de s. * représente p<0,05, ** représente p<0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Lavage bronchoalvéolaire (BAL) actine/tubuline cytospin et coloration réduite de mitotracker : Images représentatives des cytospins de BAL colorés par la maladie/tubuline de A) 0 h et B) 4 h après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone (O3)et de 50 μg de LPS intranasal chez les souris. Notez que le DAPI est représenté en bleu, l’actine en vert et la tubuline en rouge. Images représentatives de cytospins bal colorés par mitotracker réduits de A) 0 h et B) 4 h après une exposition combinée de 0,05 ppb d’ozone (O3) et de 50 μg de LPS intranasal chez les souris. Notez que DAPI est affiché en bleu et mitotracker réduit en rouge. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Analyse des protéines cytosquelettiques et de la circularité du lavage bronchoalvéolaire (BAL) : Les cytospins bal colorés pour l’actine et la tubuline ont été analysés pour les paramètres normalisés du DAPI, c’est-à-dire A) rapport d’intensité fluorescente (FI) actine/DAPI à 0 et 4 h, B) rapport de l’intensité fluorescente (FI) de la tubuline au rapport d’intensité fluorescente (FI) à 0 et 4 h et C) la cellularité des cellules BAL à 0 (n = 75 cellules), 2 (n = 105 cellules), 4 (n = 66 cellules), 24 (n = 31 cellules), 36 (n = 154 cellules) h. Comme quelques expériences pilotes ont également été réalisées immédiatement après les expositions àO3 et À LPS, c’est-à-dire à un point de temps de 2 h, nous avons également inclus une analyse très précoce de la cellularité bal à partir du point de temps de 2 h pour mettre en évidence les effets immédiats deO3. Pour les graphiques A-C, 0 h est représenté en bleu, 2 h en rouge, 4 h en vert, 24 h en violet et 36 h en orange. * représente p<0,05, ** représente p<0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Lavage bronchoalvéolaire (BAL) état intracellulaire et membranaire plasmique : Les cellules BAL ont été colorées pour des taches vitales, de la calcéne (en vert) et des homodimères d’éthidium/EthHD (en rouge) comme indiqué dans des panneaux d’image supérieurs représentatifs à A) 0, B) 24 et C) 36 h après des expositions àO3 et À LPS. Barre d’échelle = 200 μm. Les cytospins bal ont été immunostained pour DAPI (en bleu), ATPα (en vert) et Ly6G (en rouge). Les images représentatives sont montrées dans les panneaux d’image inférieurs à A) 0 et B) 24 h après les expositions O3 et LPS. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Lavage bronchoalvéolaire (BAL) protéine mitochondriale ATPα, protéine lysosomale Ly6G et analyse de la taille des cellules : Les cellules BAL immunostained ont été normalisées pour que le DAPI calcule A) le rapport d’intensité fluorescente (FI) ATPα/DAPI et le rapport FI B6G/DAPI, à 0 et 24 h après les expositionso3 et LPS. Des cellules Immunostained de BAL ont été également analysées pour leur A) plus long c.-à-d., diamètre de furet et périmètre de B), à 0, 2, 4, 24 et 36 h après des expositions d’O3 et de LPS. Pour les graphiques A-D, 0 h (n=119 cellules) est représenté en bleu, 2 h (n=105 cellules) en rouge, 4 h (n=66 cellules) en vert, 24 h (n=309 cellules) en violet et 36 h (n=154 cellules) en orange. * représente p<0,05, ** représente p<0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9: Phénotypage intracellulaire de lavage bronchoalvéolaire (BAL) : Les cellules DE BAL ont été immunostained pour DAPI (en bleu), NK1.1 (en vert), Gr1 (en rouge) et CX3CR1 (en magenta) comme indiqué dans les panneaux d’image supérieurs représentatifs à A) 0, B) 24 et C) 36 h après les expositions à O3 et LPS. Barre d’échelle = 50 μm. Les cytospins bal ont été immunostained pour l’ATPβ (en bleu), le Ki-67 (en vert), le CD61 (en rouge) et l’angiostatine (en magenta). Des images représentatives sont montrées dans les panneaux d’image inférieurs à A) 0, B) 24 et C) 36 h après les expositionsO3 et LPS. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10: Lavage bronchoalvéolaire (BAL) protéine mitochondriale ATPβ, protéine lysosomale Gr1, CX3CR1 intracellulaire et analyse de l’angiostatine : Les cellules BAL immuno-colorées ont été normalisées pour le DAPI afin de calculer A) le rapport d’intensité fluorescente (FI) NK1,1 à DAPI, le rapport B) Gr1 au rapport FI DAPI et C) le rapport FI CX3CR1/DAPI, à 0, 24 et 36 h après les expositions àO3 et au LPS. Les cellules DE BAL immuno-colorées ont été normalisées pour CD61 pour calculer A) ATPβ à DAPI intensité fluorescente (FI) rapport B) Ki-67 à rapport DAPI FI et B) angiostatine (ANG) à rapport DAPI FI, à 0, 24 et 36 h après O3 et expositions LPS. Pour les graphiques A-F, 0 h (n=21 cellules) est représenté en bleu, 24 h (n=796 cellules) en rouge et 36 h (n=2692 cellules) en points de données verts. * représente p<0,05, ** représente p<0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11
Figure 11: Hématoxyline pulmonaire et histologie de l’éosine (H&E). L’ozone (O3)et LPS ont induit l’histologie de H&E de cryosection de poumon à 0, 24 et 36 h après expositions combinées d’O3 et de LPS. Des régions des dommages épithéliaux alvéolaires sont marquées par les flèches noires pleines et les dommages endothéliaux par les têtes noires de flèche. Les astérisques jaunes (*) représentent des plaques de leucocytes dans les régions septales alvéolaires. A = espace alvéolaire, B = bronches, V = vascularisation, barre d’échelle = 100 μm pour les panneaux d’image de gauche et 50 μm pour les panneaux d’image sur le côté droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

S.No. Anticorps primaires Anticorps secondaire Invitrogen
1 Souris anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136), n° de catalogue Invitrogen 16-5941-82 Alexa 488 chèvre conjuguée anti-souris IgG (H +L), Numéro de catalogue. A11002
2 Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5), n° de catalogue Invitrogen 53-5931-82 Alexa 568 chèvre conjuguée anti-rat IgG (H +L), Numéro de catalogue A11077
3 Lapin anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), numéro de catalogue Invitrogen 14-6093-81 Alexa 633 chèvre conjuguée anti-lapin IgG (H +L), Numéro de catalogue. A21070
4 Souris anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9), numéro de catalogue Invitrogen 459240 Alexa 488 chèvre conjuguée anti-souris IgG (H +L), Numéro de catalogue. A11002
5 Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8), catalogue Invitrogen n ° 16-9668-82 Alexa 568 chèvre conjuguée anti-rat IgG (H +L), Numéro de catalogue A11077
6 Souris anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1), Numéro de catalogue Thermofisher A-21351 Alexa 350 conjugué chèvre anti-souris IgG (H +L), Numéro de catalogue A11045
7 Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa, n° de catalogue Invitrogen 14-5698-82 Alexa 568 chèvre conjuguée anti-rat IgG (H +L), Numéro de catalogue A11077
8 Hamster arménien anti-CD61 (clone 2C9. G2) IgG1 kappa, N° de catalogue BD 553343 Alexa 568 chèvre conjuguée anti-hamster IgG (H +L), Numéro de catalogue. A21112
9 Lapin anti-angiostatine (souris aa 98-116) IgG, Abcam Catalogue No. ab2904 Alexa 633 chèvre conjuguée anti-lapin IgG (H +L), Numéro de catalogue. A21070

Tableau 1 : Combinaisons d’anticorps primaires et secondaires utilisées pour colorer les cytospins préparés à partir des échantillons.

Lecture BAL LVP Pb SBM FBM
TLC * * + à 24 h ; - à 36, 72 h + à 72 h
Neutrophiles + à 24, 36, 72 h + à 24 h * + à 4, 24, 36, 72 h + à 4, 24, 36, 72 h
protéine + à 36 h * s.d. s.d. s.d.
Profil de chimiokine - Pour eotaxin-2, IL-2 à 4, 24, 36, 72 h + pour Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β à 4 h ; + pour SDF1α à 36 h s.d. s.d. s.d.
Taille de cellule + à 4 h ; - à 24, 36 h s.d. s.d. s.d. s.d.
ATPα - à 24 h s.d. s.d. s.d. s.d.
NK1.1/Ki-67 + à 24 h s.d. s.d. s.d. s.d.
ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG + à 24, 36 h s.d. s.d. s.d. s.d.

Tableau 2 : Un résumé complet des principales conclusions de l’étude dans différents compartiments. * indique qu’il n’y a pas de changement, + indique une augmentation et - indique une diminution des paramètres mesurés. Bal désigne le fluide de lavage broncho-alvéolaire, LVP indique le perfusat vasculaire pulmonaire, PB désigne le sang périphérique, SBM indique la moelle osseuse sternum et FBM désigne le compartiment de moelle osseuse de fémur.

Figure supplémentaire 1 : Immunomarquage gr1 et CD11b : Images représentatives de DAPI (en bleu), Gr1 (en vert) et CD11b (en rouge) lames immunospin fluorescentes de cytospin des compartiments de perfusat vasculaire pulmonaire (LVP), de moelle osseuse sternale (BM) et de moelle fémur (BM) à 0, 4 et 24 h après des expositions combinées à O3 et À LPS. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 1 Volume rendu tridimensionnel des macrophages BAL à partir du point de temps de 0 h (c’est-à-dire, ligne de base), montrant le noyau (montré en bleu) et immunostained pour ATPα (montré en vert) et Ly6G (montré en rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 2: Volume rendu tridimensionnel des macrophages BAL à partir du point de temps de 24 h après des expositions combinées à O3 et À LPS, montrant le noyau (en bleu) et immunostained pour ATPα (en vert) et Ly6G (en rouge). Notez la présence de corps positifs ATPα anucléaires ainsi que d’une cellule fragmentée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

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Discussion

Les méthodes présentées dans l’étude actuelle mettent en évidence l’utilité de l’analyse de compartiments multiples pour étudier des événements cellulaires multiples pendant l’inflammation de poumon. Nous avons résumé les constatations dans le tableau 2. Nous et beaucoup de laboratoires avons étudié intensivement la réponse murine à l’instillation intranasale de LPS, qui est marquée par le recrutement rapide des neutrophiles de poumon, qui culmine entre 6-24 h suivant quoi, la résolution entre en jeu. Et récemment, nous avons montré que L’O3 subclinique (à 0,05 ppm pendant 2 h) seul peut induire des lésions pulmonaires significatives dans la sous-souche15 de C57BL/6NJ,qui est marquée par la partition des neutrophiles dans le compartiment vasculaire pulmonaire, tandis que des macrophages et des débris endommagés ont été observés dans la BAL, indiquant ainsi le potentiel inflammatoire deO3. Dans ce modèle nous avons observé une absence des neutrophiles dans le compartiment alvéolaire en raison des dommages épithéliaux alvéolaires induits par O3 et de la phagocytose résultante par les macrophages alvéolaires. Non seulement avons-nous observé l’ADN et les débris extracellulaires dans le modèle d’O3, les macrophages de BAL étaient dysmorphic qui se corrèlent avec les niveaux élevés IL-16, un alarmin habituellement libéré par les neutrophiles mourants. Par conséquent, il est important de comprendre si ces niveaux subcliniques d’O3 peuvent affecter la réponse immunitaire dans la sous-souche C57BL/6J par ailleurs robuste, comme indiqué avec les niveaux supra-physiologiques d’O3 21. Nous avons observé que l’O3 combiné et l’endotoxine bactérienne intranasale ont induit le recrutement de neutrophile dans les compartiments pulmonaires aussi bien que systémiques, marqués par la présence des neutrophiles endommagées dans bal, perfusat vasculaire de poumon, compartiments sternal et fémur de moelle à partir de 4 h qui sont restés hauts à 24, 36 et 72 h. Les dommages cellulaires ont été représentés en tant que perte d’actine et de lamellipodia corticaux et augmentation de taille de cellules dans des leucocytes de BAL ; les neutrophiles, analysées dans le compartiment de BAL, ont montré la réactivité positive sensiblement réduite aux microtubule, à la sous-unité du complexe V de synthase d’ATP α (ATPα) et à la tache mitochondrique active. Les poumons s’adaptent à cette exposition combinée en régulant à la hausse l’expression de la sous-unité V du complexe ATP synthase cellulaire β (ATPβ) ainsi que celle du ligand ATPβ, l’angiostatine(tableau 2).

Un aspect important de l’étude de l’inflammation est de comprendre la nécrose cellulaire ainsi que les gradients de chimiokines. Il était intéressant de noter que les comptes totaux de leucocyte n’étaient pas différents excepté dans le sang périphérique et le compartiment de moelle de fémur. Ces observations nous ont menés étudier les modèles cytosquelettiques cellulaires, la taille et immunophenotyping. Nous avons observé une perte de lamellipodia et de mitochondries actives en cellules de BAL indiquant des dommages cellulaires. L’organisation corticale de l’actine est une caractéristique essentielle de la signalisation intercellulaire et des propriétés de barrière qui en résultent. La désorganisation cytosquelettique est ainsi un bon marqueur des dommages de cellules quand la nécrose n’est pas aussi évidente à évaluer. Même à 36 h, les cellules de BAL avaient compromis la membrane de plasma comme indiqué par la souillure d’homodimer d’ethidium. Immédiatement après les expositions combinées, les neutrophiles dans BAL ont montré la positivité Gr1 mais une coloration essentiellement négative pour CD11b, qui se localise vers le bord d’attaque et aide à ramper septal alvéolaire22. Ainsi, les expositions combinées conduisent à l’accumulation de neutrophiles atypiques dépourvues de la protéine CD11b. LPS n’induit pas de régulation à la baisse du CD11b. Ainsi, ce dispositif est probablement un résultat des dommages induits par O3 aux neutrophiles.

Les cellules BAL avaient une signature protéique unique avec une coloration plus élevée de NK1.1, Ki-67 et ATPβ à 24 h par rapport à 0 h(tableau 2). Les cellules BAL ont eu l’expression plus élevée de Gr1, CX3CR1 aussi bien que d’angiostatine, à 24 aussi bien que 36 h par rapport à 0 h (Tableau 2). Ces résultats ont été corroborés par la présence de neutrophiles gr1 positifs progressivement plus dans bal, à 24 et 36 h, après exposition (tableau 2). La présence de cellules positives NK1.1, CX3CR1 et Gr1, à 24 h, indique le recrutement de cellules mononucléaires et polymorphonucléaires dans la BAL. Parmi les cellules mononucléaires, les cellules CX3CR1 positives ont dominé à 36 h indiquant la présence de macrophages interstitiels, de plaquettes ou de macrophages dérivés de monocytes. L’inclusion de Ki-67 et d’angiostatin comme marqueurs nous a informés au sujet du milieu prolifératif contre anti-angiogénique, respectivement dans le BAL. Ainsi, les expositions combinées d’O3 et de LPS mènent à la prolifération des macrophages probablement suivis d’un milieu anti-angiogénique dû à l’infiltration neutrophile. L’augmentation transitoire de la coloration ATPβ peut indiquer une adaptation importante vers une survie accrue des leucocytes BAL à 24 h. Il faut noter que l’ATPβ peut se lier à l’angiostatine et inhiber la survie prolongée6,23, ce qui se reflète en fait dans l’indice Ki-67 inférieur à 36 h après l’exposition.

Bien que la protéine de BAL ait été la plus haute à 36 h, et pas d’autres points de temps, le perfusat vasculaire de poumon n’a montré aucun changement de la concentration en protéine avant ou après exposition. Il est possible que le compartiment vasculaire n’ait pas été affecté mais ceci est très probablement confondu en raison de l’oxydation des acides aminés riches en électrons tels que la méthionine, l’histidine et la cystéine parO3 induits radicaux libres et protéines tensioactives résultantes (SP-A, SP-B) dégradation ainsi que fuite vasculaire24,25,26. La quantification des IgM BAL, des protéines tensioactives BAL, de l’albumine BAL ou de l’extravasation colorante (à l’aide du bleu Evans ou du dextrane de l’iso-thiocyanate de fluorescéine (FITC)) sont des méthodes alternatives pour évaluer l’intégrité épithéliale et endothéliale.

Intéressant, des niveaux vasculaires de perfusate de poumon d’eotaxin-2 et d’IL-2 ont été intensément augmentés au point de temps de 4 h. Des niveaux eotaxin-2 et IL-2 de BAL ont été sensiblement réduits après exposition, indiquant la dégradation dans l’espace alvéolaire ou l’occlusion dans la vascularisation de poumon. Plus de chimiokines analysées dans le perfusat vasculaire pulmonaire ont révélé des niveaux plus élevés de la chimiokine éosinophile (eotaxin-1), TNFα, IFNγ, chimiokine mononucléaire dérivée des ganglions lymphatiques (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), chimiokine neutrophile dérivée épithéliale (CXCL5), et l’alarmine (IL-16) libérée après la nécrose secondaire des neutrophiles27, mais seulement à 4 h après l’exposition. À 36 h, la moelle osseuse dérivée de la chimiokine pan-leucocytaire, SDF1α28, était plus élevée dans le perfusat vasculaire pulmonaire. Les concentrations de SDF1α dérivées de la moelle osseuse sont en corrélation avec les résultats de la cytologie selon lesquels les cellules CD11b et Gr1 positives sont abondantes à 24 et 36 h après l’exposition. Ainsi, les profils de chimiokine et de cytologie reflètent une mobilisation importante des leucocytes à partir des compartiments de la moelle osseuse (tableau 2).

Notre modèle animal et les résultats de nos recherches sont essentiels en gardant à l’esprit les situations réelles dans lesquelles les êtres vivants en milieu urbain sont probablement exposés à de tels agents subcliniques O3 et infectieux8. Notre modèle murin sert de prototype facilement accessible qui peut être reproduit dans des laboratoires de confinement de niveau 2 pour étudier les mécanismes pulmonaires et extra-pulmonaires de la mort cellulaire invasive et des infections, comme c’est le cas pour les infections COVID-1929. Les études futures devraient viser à visualiser la réparation ou le suivi en phase tardive ainsi que les expositions chroniques afin d’étudier les adaptations cellulaires à long terme. Ainsi, pour des études complètes d’inflammation de poumon impliquant l’organe vivant15 et l’animal16,30,31 techniques d’imagerie, la conception actuelle d’étude de point final peut fournir des informations essentielles dans la réponse de l’hôte à la bas-dose combinée O3 (mort cellulaire) et au LPS (stimulation immunisée), et déchiffrant ainsi les mécanismes de la lésion pulmonaire aiguë.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts ou divulgation à faire.

Acknowledgments

La recherche menée est financée par la subvention du président du CRSNG ainsi que par des fonds de démarrage du Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Le Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation est financé par Innovation Saskatchewan. L’imagerie par fluorescence a été réalisée au Centre d’imagerie WCVM, qui est financé par le CRSNG. Jessica Brocos (étudiante à la maîtrise) et Manpreet Kaur (étudiante à la maîtrise) ont été financées par les fonds de démarrage du Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
33-plex Bioplex chemokine panel Biorad 12002231
63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives Leica HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11045
Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A11002
Alexa 488 conjugated phalloidin Invitrogen A12370
Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A Millipore 05-829X-555
Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) Invitrogen A21112
Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077
Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A21070
Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa BD Pharmingen 553343
C57BL/6 J Mice Jackson Laboratories 64
Confocal laser scanning microscope Leica Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Invitrogen D1306 aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C
Inverted fluorescent wide field microscope Olympus Olympus IX83
Ketamine (Narketan) Vetoquinol 100 mg/ml Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock
Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit Invitrogen L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) Invitrogen 459240
Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) Invitrogen A-21351
Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) Invitrogen 16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay Thermoscientific 22660
Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG Abcam ab2904
Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) Invitrogen 14-6093-81
Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa Invitrogen 14-5698-82
Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) Invitrogen 16-9668-82
Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) Invitrogen 53-5931-82
Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) BD Pharmingen 553142
Reduced mitotracker orange Invitrogen M7511
Xylazine (Rompun) Bayer 20 mg/ml Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock

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Immunologie et infection Numéro 169 Ozone LPS inflammation pulmonaire aiguë sous-unités F1F0 ATP synthase (complexe V) cytologie fluorescente immunitaire IL-16
Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS
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