Summary
ここでは、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、その 場で 巨核球の超構造を解析するプロトコルを紹介する。マウス骨マロウは、収集され、固定され、エポキシ樹脂に埋め込まれ、超薄切片で切断される。コントラスト染色後、骨髄は120kVのTEM顕微鏡下で観察される。
Abstract
巨核球の分化および成熟は、骨髄の細胞および細胞外成分と密接に関連して起こる。これらのプロセスは、多倍体および多球状核などの巨核球細胞質の必須構造の徐々に出現することを特徴とし、境界膜系(DMS)と呼ばれる内部膜ネットワークおよび循環血小板に見られる緻密およびアルファ顆粒である。本稿では、トランスミッション電子顕微鏡(TEM)を用いたマウス巨核球のin situ 超構造研究における標準化プロトコルについて述べ、骨髄における成熟段階および細胞密度を定義する主要な特性を同定することを可能にする。骨髄は、フラッシュ、固定、エタノール中の脱水、プラスチック樹脂に埋め込まれ、そして、断面を生成するために取り付けられる。半薄いセクションと薄いセクションは、それぞれ組織学的およびTEMの観察のために準備されています。この方法は、任意のEM施設で、任意の骨髄細胞に使用することができ、同じマウス上のいくつかのイメージングアプローチの組み合わせを可能にする小さなサンプルサイズを使用する利点を有する。
Introduction
巨核球は、骨髄に局在する大型多倍数細胞を専門とし、血小板産生を担う1.それらは複雑な成熟プロセスを通して造血幹細胞に由来し、その間に巨核球前駆体は徐々にサイズが増加し、細胞質および核2の広範な付随的形態変化を受ける。成熟の間、巨核球は、多球状核、境界膜系(DMS)を形成する表面膜の内在、アクチン系細胞骨格網に囲まれた小器官の末梢領域、およびα-顆粒、高密度顆粒、リゾソーム、リゾソーム、および多重体を含む多数の顕著な構造要素を開発する。超構造レベルでは、観察される大きな変化は、DMS3で区切られた離散領域への細胞質区画化である。膜のこの広範な供給は、血小板生産の初期段階で長い細胞質プロセスの延長を促進し、その後、循環内の血小板に改造します。巨核球分化および成熟時の欠陥は、血小板数および/または血小板機能の用語で血小板産生に影響を与える可能性があります。
薄層透過型電子顕微鏡(TEM)は、血栓形成4,5の生理学の理解を形作った巨核球の高品質な超構造を提供する何十年もの間、選択のイメージングアプローチであった。本論文は、骨髄細胞の種類を分析する基礎となる可能性のある、天然骨髄微小環境内で起こる血小板生物新生の過程を捉えることができる標準化されたTEM法に焦点を当てる。我々は、細胞質プロセスをサイヌソード6の微小循環に拡張する未熟から完全に成熟までの巨核球の開発の超構造的な例を提供する。また、骨髄の再生能力と血小板生産能力を説明する、異なる巨核球成熟段階を定量化する簡単な手順についても説明する。
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Protocol
すべての動物実験は、ヨーロッパの基準2010/63/EUとストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コンテテ・レジオナル・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール)に従って行われました。プロトコルは図 1に概略的に示されています。
1. 骨髄の収集と固定 (図 1A)
注意:この手順は、発がん性、変異原性、および/または毒性物質を含み、化学的抽出フードの下で行われます。手袋や保護メガネなどの適切な保護具を着用してください。
- カコジレートバッファー内の 2.5% グルタルアルデヒドからなる固定溶液を準備します ( 補足ファイルを参照してください)。
- 骨髄コレクション
- 成人C57BL/6マウスのいずれかの性別12-18週齢を使用してください。CO2窒息と子宮頸部脱臼によりマウスを安楽死させる。
- 薄いはさみで、太ももの周りの皮膚を切り、ピンセットを使用して皮膚を剥がします。足の四肢を取り除き、股関節と太ももの間を切ります。膝の関節で切断することによって大腿骨から脛骨を取り外し、メスを使用して脛骨および大腿骨の付着組織を除去する。
- 鋭いカミソリの刃で骨端を取り除きます。大腿骨をピンセットで保持しながら、21G針のカコジレートバッファーで満たされた5mLシリンジを使用して、骨髄を2mLカコダイレートバッファーで満たされた15 mLチューブに洗い流します。これを行うには、骨髄開口部に針のベベルを挿入し、骨髄が排出されるまでプランジャーをゆっくりと押します。
- 固定液への急速な浸漬による骨髄固定。
- フラッシュの直後に、プラスチックピペットを使用して、骨髄シリンダーを新鮮なグルタルアルデヒド固定液(以前は1.1で調製)の1 mLに室温で60分間移動します。
注:組織を保存するには、骨解剖から固定ステップまでのプロセス全体が10分以内に完了していることを確認してください。固定のために、固定液が熱ショックを避けるために室温であることを確認してください。
- フラッシュの直後に、プラスチックピペットを使用して、骨髄シリンダーを新鮮なグルタルアルデヒド固定液(以前は1.1で調製)の1 mLに室温で60分間移動します。
2. アガロースに骨髄を埋め込む
注:骨髄組織は、異なる洗浄ステップの間にその完全性を維持するために十分に凝集していないし、材料は容易に失われる可能性があります。この問題を克服するために、骨髄は脱水前に寒天のゲルで覆われています。
- 補助ファイルに記載されているアガロース溶液を準備します。
- カコジレートバッファーでセクション1.3から固定骨髄を洗浄し、プラスチックピペットを使用してガラススライドに慎重に転送します。暖かいピペットを使用して、すぐに骨髄シリンダーに2%液体寒天の低下を適用します。
注: 寒天は冷却中にすばやく固めます。骨髄の均質な覆いを確実にするために、寒天溶液はスライドに堆積するまで暖かく保たれる必要があります。 - 寒天が固まるまで、スライドを素早く氷の上に置きます(1-2分)。
- 顕微鏡下では、これらの領域で組織圧縮が可能なため、鋭利なカミソリの刃を使用して骨髄シリンダーの四肢を切断し、廃棄します。カコジレートバッファーの 1 mL を含む 1.5 mL マイクロ遠心分離チューブ内の骨髄ブロックを移動します。
3. 樹脂に骨髄を埋め込む
注意:樹脂成分は有毒です。いくつかは発がん性があり、化学抽出フードの下で注意して処理する必要があります。手袋や保護眼鏡などの適切な保護具を使用してください。四酸化オスミウムは室温で揮発性が高く、蒸気は目、鼻、喉に非常に有害です。廃棄される前に、2%オスミウム四酸化は、植物油の2倍の量を加えることによって中和されなければならない。
- 補足ファイルに記載されているエポキシ樹脂を準備します。
- 樹脂埋め込み
注:オスミウム、酢酸ウラニル、エタノールの連続した浴中のインキュベーション中に同じマイクロ遠心分離管にサンプルを保管してください。パスツールピペットで上清を吸引します。各浴槽に使用される溶液の容積は、サンプルの少なくとも10倍の体積と等しくなければならない。- 4°Cで1時間カコジレート緩衝液に1%オスミウムを入れたブロックを後固定し、カコジレート緩衝液で1回洗浄し、次に蒸留水で1回洗浄します。
- 4%の酢酸ウラニルを蒸留水に1時間染色し、蒸留水で2回洗浄する。
- 蒸留水中の一連のエタノールを脱水する:75%エタノール中に5分間4回、95%エタノールで20分間3回、20分間100%エタノールで3回乾燥する。このステップでは、エポキシ樹脂の注射器を冷凍庫から取り出します。
注:プロトコルは100%エタノールで1時間一時停止することができます。 - 骨髄内部のエポキシ樹脂の均一な浸潤と重合を得るために、まず15分間のプロピレンオキシドの2つの連続した浴でブロックをインキュベートする。
- 100%プロピレンオキシドとエポキシ樹脂の1:1混合物を加え、1時間インキュベートします。サンプルを室温でゆっくりとした回転式シェーカーに置きます。
- 100%エポキシ樹脂を加えて、攪拌下で一晩インキュベーションのためにサンプルを残します。
- 100%エポキシ樹脂を2時間インキュベーションに加え、撹拌下に置いてください。
- 顕微鏡下で、骨髄ブロックを平らなシリコーン型に入れます。骨髄全体のその後の横断的な断面を可能にするサンプルを配向する。金型にエポキシ樹脂を充填し、60°Cで48時間置きます。
注:すべての溶液(エタノールおよびプロピレンオキシドを除く)は、0.22 μmのフィルターを通して濾過され、サンプル汚染を回避します。樹脂の適切な重合を確保するために、金型を充填しながら気泡を避けてください。
4. 超薄切除 (図1B)
注:トランスミッションEMは、電子が細胞の内部、構造、および内部小器官(顆粒、小胞体、ゴルジ)の配置の投影画像を生成し、細胞内細胞膜の配置を通過することができる薄い組織切片を必要とします。
- サンプルブロックを超ミクロトームサポートに取り付ける。サンプルホルダーに置きます。回転ダイヤモンドまたはタングステンフライスカッターで組織の周りの樹脂の過剰を除去するために45°でサンプルをトリミングします。
- 水タンクを装備したダイヤモンドナイフブレードでウルトラミクロトームにサンプルを取り付けます。組織学的分析とTEM分析のために、500 nmと100 nmの厚さの横断断面をそれぞれカットします。ループで水面上の浮遊セクションを収集します。
- ガラススライドに厚さ500 nmのセクションを、下に紙フィルターを付けて200メッシュの薄い棒銅グリッドに100 nmの厚いセクションを堆積させます。1 つの条件に対して 5 つのグリッドを準備します: 最初に 2 つのグリッドを染色し、必要に応じて残りの 3 つのグリッドをバックアップとして保持します。
5. トールイジンブルー染色
注:組織学のためのセクションを染色することは、3つの理由で重要です:1)組織が実際に切断され、樹脂ではないことを確認するために、2)包含の品質を確認し、3)迅速に骨髄サンプルを評価します。これが正しくない場合は、ブロックの深いところで切り取ります。
- ヒートプレート(60°C)で半薄切片スライドを乾燥させます。
- 濾過1%トルイジンブルー/1%ホウ酸ナトリウムをスライド上の蒸留水に加え、ホットプレート(60°C)で1〜2分間加熱します。蒸留水でスライドを洗い、ヒートプレートで乾かします。
- Poly(ブチルメタクリレート-コメチルメタクリレート)実装媒体を滴下してカバースリップにセクションを取り付け、軽顕微鏡で検査します。
6. TEM観察用の重金属染色 (図1C)
注:コントラストのために、グリッドの上側はループを持つ各連続したバスの100 μLの滴で反転されます。使用前に、各溶液は0.22 μmのフィルタ処理を行います。濾紙のグリッド側にそっと接触して、各浴槽間の余分な液体を取り除きます。
- 4%のウラニル酢酸を蒸留水に5分間染色する。
- 蒸留水で3回5分間洗います。
- クエン酸鉛で3分間染色します。
- 蒸留水で3回5分間洗います。
- 下側のグリッドを濾紙に接触させて乾かします。
注:重金属は二酸化炭素の存在下で反応します。沈殿物を最小限に抑えるには、コントラスト中の空気の変位を避け、話さない、環境を穏やかに保ち、エアコンをオフにします。
7. TEM (図 1E)
注:セクションはTEM顕微鏡で導入され、120 kVで調べらされます。
- まず、低倍率(<500x)でセクションを調べて、調製の一般的な側面(樹脂に穴があかないこと、セクション内の折り目/圧縮、染色による沈殿)を理解してください。
- 次に、より高い倍率(〜2000x)でセクションを調べ、成熟の段階を区別することができます。全体の横断的なセクションの成熟の各段階から手動で巨核球を数える(各段階を視覚的に識別する方法については、代表的な結果を参照してください)。
注: グリッドの各正方形は、検査用の領域として定義されます(200 メッシュの銅格子では 16000 μm2 に相当します)。 - 巨核球の数を評価するには、セクションで覆われた四角形のみを定量化します。そのためには、範囲のスクリーニングに基づくモデルを使用します。断面の四肢から別の範囲に、次に別の範囲の正方形の最初の範囲を観察します。この手順を使用して、全体の骨髄横断の四角形を正方形で完全かつ体系的に画面化します。
- 各四角形について、ステージI、IIまたはIII巨核球の数をスコアします。
注:顆粒、DMS組織、細胞質領域の大きさ、ポリロブレン核を分析するには、より高い倍率が必要です。
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Representative Results
骨髄の神学
軽顕微鏡下での骨髄トルイジンブルー組織学の観察は、例えば組織のコンパクトさ、微小血管の連続性、および巨核球の大きさと形状の点で組織体系全体を迅速に分析する鍵である(図1D)。それは、骨髄ブロック内の深い切断の必要性を決定するために、超薄いセクションの前に行われます。巨大な大きさと核の凝縮のために、より成熟した巨核球は40倍の目的で容易に視覚化されるかもしれない。これは、組織中の成熟した巨核球の密度とマイクロ血管への相対的な局在の優れた、迅速な概要を提供します。このような半薄い部分では、巨核球増殖と成熟の異常はすでに検出できた。
骨髄超構造
特徴的な超構造特性に基づいて、マウス巨核球は、熟成における順次段階を表す4段階に分けられる(図2A)。ステージI巨核球は、大きな核が細胞の大部分を占め、豊富なリボソームと荒い小胞体を含む直径10〜15μmです。DMS の最も早い検出可能な段階の存在は、プレ DMS と呼ばれ、TEM 分析3でステージ I の MK を区別するための重要な基準でもあります。成熟の段階IIでは、顆粒形成が始まり、DMSの開発が開始される。巨核球は大きさが大きくなり、直径15~25μmを測定し、核の流量を発達させます。成熟期III巨核球は直径25~50μmの巨細胞です。細胞質には、明確に定義された細胞質領域とオルガネラを欠いた周辺帯を持つ、よく発達したDMSが含まれています。この段階では、核は一般に偏心に位置し、核膜に位置する凝縮クロマチンと非常に不規則に見える。最後のステップは、細胞質の大部分が排除された後、細胞膜に囲まれた大きな核からなるピレノサイトとも呼ばれる裸の核によって特徴付けられる。野生型C57BL/6マウスでは、骨髄は約8%のステージI、20%ステージII、71%ステージIII巨核球および<1%ピレノサイトを含む。巨核球の平均数は1平方あたり1.7〜2.2細胞の間です。この任意の分類は、細胞分化の連続的なプロセスを便利に監視し、その可能な異常を検出することができます。
これらの古典的な成熟段階のほかに、骨髄中の固定巨核球の観察は、巨核球がサイヌジアル壁と相互作用する一連の事象を分析することを可能にする(図2B)。内皮細胞と接触する巨核球は、薄い切片で頻繁に観察される。時折、小さい侵襲性突起を形成する巨核球が、内皮を貫通したり、細胞質の大きな突起を正弦腔内に広げたりする7,8を観察する。驚くべきことに、これらの血管内細胞質プロセスは、可変サイズ、長さ、および直径を示し、循環における進行性血小板リモデリングを示す。一般的な循環に既に存在する血小板は、周微小管コイルによって維持される円盤状を有し、この内腔内の中でも見える。血小板のこの典型的な形態は、標本の正しい固定を示す。
透過型電子顕微鏡は、核の大きさ、形状、分布の観点から、核の微細構造、DMSや顆粒の空間的な構成など、超構造の詳細を可視化するために必要な解像度のレベルを有する。図2Cは、α顆粒、ゴルジシステルネ、ミトコンドリア、および小胞子の存在を示すステージIII巨核球における核期領域の一例である。また図2Cでは注目すべきは、多面体であり、アルファと緻密顆粒の形成における中間段階を表し、直径9,10で200Å未満を測定するエキソソームの倍数を含む。最後に、透過型電子顕微鏡法は、巨核球の内部に存在する好中球および他の造血細胞を可視化することを可能にし、(図2D)細胞が別の生細胞11に浸透するエンペリポレシスと呼ばれる珍しいプロセスに従う。このプロセスは、正常な生理学的状態における巨核球の4%に関して、ある病態12において有意に増加することができる。
図1: 実験用セットアップの模式図 (A)骨髄埋め込み手順.骨髄は、グルタルアルデヒド溶液に急速に浸漬することによって洗い流され、固定される。写真は、紅潮後の骨髄シリンダーの典型的な外観を示しています。室温で1時間固定した後、骨髄はアガロースに囲まれ、四酸化オスミウムに後固定され、酢酸ウラニルでインキュベートされる。その後、組織を緩衝液にして、一連の等級エタノールで脱水し、プロピレンオキシドでインキュベートし、エポキシ樹脂で浸潤する。(B)骨マロウは断面をブロックします。埋め込まれた骨髄は、ウルトラミクロトームホルダーに取り付けられ、45°でトリミングされ、半薄(500 nm)または薄い(100 nm)セクションで切断されます。超構造研究では、フローティングセクションはループでピックアップされ、下に紙のフィルターを持つグリッドに堆積します。(C)TEM観測のためのコントラスト染色。グリッドは、ウラニル酢酸滴で反転し、蒸留水滴で洗浄し、洗浄の別の実行の前にクエン酸鉛でインキュベートされます。乾燥後(セクションの上側)、サンプルはTEMの下で検査する準備ができています。(D) トルイジンブルーで染色されたマウス大腿骨髄部のヒストロジー巨大細胞は成熟した巨核球(1)に相当し、一部はシヌソード(2)と接触している。このシヌサイドは大きな中央静脈(3)に収束する。Bar: 20 μm. インセット: 40倍の倍率で成熟した巨核球の正常な出現。(E) 低倍率で骨髄部の代表TEM画像。細胞は細胞外空間がほとんど詰まっています。断面の各グリッドの正方形は、回路図の矢印のパス(赤い矢印)に従って、四肢から別の四角形に観察されます。棒:200 μm. この図のより大きいバージョンを見るにはここをクリックしてください。
図2:巨核球超構造の現場画像の代表である(A)野生型巨核球の特徴的な成熟段階巨核球は4つの成熟段階に分類される:ステージI、大きな核を有する直径10-15μmの細胞;ステージII、開発中のDMSを含む直径のセル15〜30 μm;ステージIIIは、細胞質領域を定義し、細胞質のない周辺領域を有する、よく発達した境界膜系(DMS)を含む30〜50μmの細胞である。ピレノサイトは、完全な細胞質拡張に続く骨髄に残っている裸のポリロブレット核に相当する。バー:10μm(B)巨核細胞- 内皮細胞相互作用と血管内細胞質プロセス。(i)巨核球の周辺帯(PZ)は、心座内皮のアブリュミナル表面に密接にアパポーズされる。(ii) 内皮層(矢印頭)に深く浸透する短い侵襲的突起を形成する巨核球。(iii-v)矢印は、直径が異なる巨核球の細胞質プロセスを示し、そのうちのいくつかは非常に大きく、血流に入ったばかりの断片を表す末梢領域を有する。(vi)中腔内に観察される典型的なディスコド血小板(P)各顕微鏡写真では、赤い線は内皮バリアの明るい側を示し、星は副弦界の内腔を示す。バー: 2 μm(C) 成熟した巨核球の核内領域の高倍率。α、アルファ顆粒;rer,荒い小胞体;G, ゴルジ;MVB, 多面体;m, ミトコンドリア.棒:0.5μm(D)エンペリポレシスを示す巨核球の例。巻き込まれた好中球は、巨核球との相互作用によって形態学的に変化していないように見える。棒:2 μm.この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助ファイル:試薬の調製。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
巨核代の直接検査は、巨核球の形成や血小板形成を理解するために不可欠です。本稿では、骨髄紅潮と浸漬による固定を組み合わせた透過電子顕微鏡法を提供し、骨髄中で起こっている巨核球形態形成の全過程の形態特性を その場で 解剖することを可能にする。
骨髄の洗い流しは、高品質のフラッシングの成功はオペレータの練習とトレーニングに依存するので、この方法の重要なステップです。繊細ではあるが、骨髄を洗い流すは、通常、巨核球形態に重要なアーチファクトに関連する完全な脱灰のための2週間のEDTA治療を必要とする、ミネラル化された骨の除去を避けるための最良の方法である。さらに、脛骨および大腿骨から固定されていない骨髄全体を採取する主な利点は、同じマウスに対していくつかのイメージングアプローチを組み合わせる能力である。実際には、単一の骨髄のみが、超構造研究のために必要とされ、他の3つの標本は相補的な分析のために利用できる。第2骨髄は、次に、新鮮な骨髄の外植物の調製に使用することができ、天然巨核球6のプロ血小板形成のダイナミクスをリアルタイムで研究する。第3のサンプルは、通常、厚いセクションの免疫染色研究のために設計されており、自然環境内での巨核球の3Dイメージングおよび分布を提供します。最後のサンプルは、タンパク質の細胞内局在化を高分解能4で調査するイムノゴールド電子顕微鏡法によって、凍結してさらなる研究のために保存することができる。これらの組み合わせイメージング法は、マウスにおける遺伝子の標的欠失/突然変異の入手可能性と共に、血栓形成における所定のタンパク質の生物学的役割を その場所で 解剖する重要な手段を提供する。しかし、この方法の1つの制限は、骨髄を洗い流すために必要な骨端の撤退であることをここで指摘すべきである。骨端は造血のための重要な領域であることが知られており、したがってそれらの除去は造血幹細胞および婚約の初期段階13を分析する可能性を妨げる。もう一つの制限は、未熟な段階の前駆体は、これらの細胞が特定の超構造的特徴を持っていないため、私は特定できないということです。この制限を克服するために、EMイムノゴールドアプローチを使用することができます。
この方法の第2の重要なステップは、浸漬による骨髄固定である。ここで説明した条件下で行う場合、すなわち、コンパクト骨髄シリンダーを洗い流した直後の固定は、次の利点を有する:(i)迅速かつ容易に行い、(ii)灌流6によって観察されたそれに近い超構造を維持し、(iii)それ以外の場合は失われた/失われた後に流し込まれるシヌシド血流中の自由な巨核球プロセスおよび血小板を維持する。この技術により、巨核球の中循環への侵入を調査し、血小板が生じる細胞質プロセスのすべての中間形態を特徴付けることを可能にする。これに伴い、 最近、生体内の 巨核球から侵入する大型突起は 、ビトロで巨核球によって形成される薄い拡張と構造的に異なっており、特に微小管7の配置が異なっていると報告されている。同様に、我々は最近、 生体内で 血小板形成を支配するメカニズムが 、in vitro14で同定されたものとは異なっていることを示した。
インビトロ培養とin vivo生成天然の巨核球との間で重要な超構造の違いがますます認識され、完全な巨核球分化/成熟のための骨髄微小環境の必要性を強調しています。本稿で説明した浸漬による骨髄紅潮と固定の組み合わせに続いて、従来の透過電子顕微鏡は、依然として、生理学的および病理学的条件下で巨核球生物学および血小板形成を研究するための非常に貴重なツールであり続けている。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、ファビエンヌ・プロアマー、ジャン=イヴ・リンケル、デビッド・ホフマン、モニーク・フロイントに技術支援を感謝したいと考えている。この研究は、ARMESA(メデシン・エ・サンテ・パブリケ協会)、欧州地域開発基金(ERDF)を通じた欧州連合(EU)、グラントANR-17-CE14-0001-01からH.d.S.に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
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