Summary
We rapporteren een methode voor mesoscopische reconstructie van het hele muizenhart door nieuwe ontwikkelingen in weefseltransformatie en kleuring te combineren met de ontwikkeling van een axiaal gescande lichtplaatmicroscoop.
Abstract
Zowel genetische als niet-genetische hartaandoeningen kunnen ernstige remodelleringsprocessen in het hart veroorzaken. Structurele remodellering, zoals collageenafzetting (fibrose) en cellulaire uitlijning, kan de elektrische geleiding beïnvloeden, elektromechanische disfuncties introduceren en uiteindelijk leiden tot aritmie. De huidige voorspellende modellen van deze functionele veranderingen zijn gebaseerd op niet-geïntegreerde structurele informatie met een lage resolutie. Het plaatsen van dit raamwerk op een andere orde van grootte is een uitdaging vanwege de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden bij het uitvoeren van beeldvorming met hoge resolutie in massief weefsel. In dit werk beschrijven we een methodologisch raamwerk dat beeldvorming van hele muizenharten met micrometrische resolutie mogelijk maakt. Het bereiken van dit doel heeft een technologische inspanning vereist waarbij vooruitgang in weefseltransformatie en beeldvormingsmethoden zijn gecombineerd. Ten eerste beschrijven we een geoptimaliseerd CLARITY-protocol dat in staat is om een intact hart te transformeren in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidenvrije vorm die een hoge transparantie en diepe kleuring mogelijk maakt. Vervolgens wordt een fluorescentie lichtplaatmicroscoop beschreven die in staat is om snel beelden te verkrijgen van een mesoscopisch gezichtsveld (mm-schaal) met de resolutie op micronschaal. In navolging van het mesoSPIM-project maakt de bedachte microscoop de reconstructie van het hele muizenhart met micrometrische resolutie in een enkele tomografische scan mogelijk. Wij geloven dat dit methodologische kader het mogelijk zal maken om de betrokkenheid van de cytoarchitectuur-wanorde in de elektrische disfuncties te verduidelijken en de weg vrij te maken voor een uitgebreid model dat zowel de functionele als structurele gegevens beschouwt, waardoor een uniform onderzoek mogelijk wordt naar de structurele oorzaken die leiden tot elektrische en mechanische veranderingen na de weefselremodellering.
Introduction
Structurele remodellering geassocieerd met hartaandoeningen kan de elektrische geleiding beïnvloeden en elektromechanische disfuncties van het orgaan introduceren 1,2. Huidige benaderingen die worden gebruikt om functionele veranderingen te voorspellen, maken vaak gebruik van MRI en DT-MRI om een algehele reconstructie van fibroseafzetting, vasculaire boom en vezelverdeling van het hart te verkrijgen, en ze worden gebruikt om preferentiële actiepotentiaalvoortplanting (APP) -paden over het orgaan te modelleren 3,4. Deze strategieën kunnen een mooi overzicht geven van de hartorganisatie. Hun ruimtelijke resolutie is echter onvoldoende om de impact van structurele remodellering op de hartfunctie op cellulair niveau te onderzoeken.
Het plaatsen van dit raamwerk in een andere orde van grootte, waar afzonderlijke cellen individuele rollen kunnen spelen bij de verspreiding van actiepotentialen, is een uitdaging. De belangrijkste beperking is de inefficiëntie van standaard beeldvormingsmethoden om beeldvorming met hoge resolutie (micrometrische resolutie) uit te voeren in massieve (centimetergrote) weefsels. In feite is het afbeelden van biologische weefsels in 3D met hoge resolutie erg ingewikkeld vanwege weefselondoorzichtigheid. De meest gebruikelijke aanpak om 3D-reconstructies in hele organen uit te voeren, is het voorbereiden van dunne secties. Nauwkeurige secties, assemblage en beeldvorming vereisen echter aanzienlijke inspanning en tijd. Een alternatieve aanpak die niet vereist dat het monster wordt gesneden, is het genereren van een transparant weefsel. In de afgelopen jaren zijn verschillende methoden voor het ophelderen van weefsels voorgesteld 5,6,7,8. De uitdaging om massieve, transparante en fluorescerend gelabelde weefsels te produceren, is onlangs bereikt door echte weefseltransformatiebenaderingen te ontwikkelen (CLARITY9, SHIELD10). In het bijzonder is de CLARITY-methode gebaseerd op de transformatie van een intact weefsel in een nanoporeuze, hydrogel-gehybridiseerde, lipidevrije vorm die het mogelijk maakt om hoge transparantie te verlenen door de selectieve verwijdering van membraanlipide-bilayers. Opmerkelijk is dat deze methode ook succesvol is gebleken bij hartvoorbereiding 11,12,13,14. Omdat het hart echter te kwetsbaar is om geschikt te zijn voor een actieve opruiming, moet het worden geklaard met behulp van de passieve benadering, die veel tijd nodig heeft om volledige transparantie te verlenen.
In combinatie met geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals light-sheet microscopie, heeft CLARITY het potentieel om 3D massieve hartweefsels met micrometrische resolutie in beeld te brengen. Bij lichtplaatmicroscopie wordt de verlichting van het monster uitgevoerd met een dunne vellen licht die zijn opgesloten in het brandpuntsvlak van het detectieobjectief. De fluorescentie-emissie wordt verzameld langs een as loodrecht op het verlichtingsvlak15. De detectiearchitectuur is vergelijkbaar met widefield-microscopie, waardoor de acquisitie veel sneller is dan laserscanmicroscopen. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen, kan een volledige tomografie van grote monsters worden verkregen, tot centimeters groot. Vanwege de intrinsieke eigenschappen van de Gaussische bundel is het echter mogelijk om een zeer dunne (in de orde van enkele micron) lichtplaat alleen voor een beperkte ruimtelijke uitbreiding te verkrijgen, waardoor het gezichtsveld (FoV) drastisch wordt beperkt. Onlangs is een nieuw excitatieschema geïntroduceerd om deze beperking te overwinnen en toegepast voor beeldvorming van de hersenen, waardoor 3D-reconstructies met isotrope resolutie16 mogelijk zijn.
In dit document wordt een passieve clearingbenadering gepresenteerd, waardoor de clearingtiming die nodig is voor het CLARITY-protocol aanzienlijk kan worden verminderd. Het hier beschreven methodologische raamwerk maakt het mogelijk om een heel muizenhart met micrometrische resolutie te reconstrueren in een enkele tomografische scan met een acquisitietijd in de orde van minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierbehandeling en -procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en in overeenstemming met de beginselen en voorschriften van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. Het experimentele protocol werd goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (protocolnummer 647/2015-PR). Alle dieren werden geleverd door ENVIGO, Italië. Voor deze experimenten werden 5 mannelijke C57BL/6J muizen van 6 maanden oud gebruikt.
1. Oplossingsvoorbereiding
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,6) in een chemische kap. Bewaar de 4% PFA aliquots bij -20 °C gedurende enkele maanden.
- Hydrogeloplossing bereiden: Meng 4% Acrylamide, 0,05% Bis-acrylamide, 0,25% Initiatior AV-044 in 0,01 M PBS in een chemische kap. Bewaar de reagentia en de oplossing gedurende de gehele bereiding op ijs. Bewaar de hydrogel aliquots bij -20 °C gedurende enkele maanden.
- Bereid clearingoplossing voor: Meng 200 mM boorzuur, 4% natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedeïoniseerd water; pH 8,6 in een chemische kap. Bewaar de oplossing tussen 21-37 °C om SDS-neerslag te voorkomen.
- Bereid verse Tyrode-oplossing op de dag van het experiment: voeg 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 en 4,7 mM KCl toe; titreer tot pH 7,4 met 1 M NaOH.
2. Hartisolatie
- Injecteer 0,1 ml 500 I.U. Heparine subcutaan 30 minuten vóór de hartisolatieprocedure.
- Vul een spuit van 30 ml en drie petrischalen van 6 cm met verse Tyrode-oplossing. Maak een kleine scheur (3-4 mm diep) op de rand van een van de petrischalen en plaats deze onder een stereoscopische microscoop.
- Bevestig een canule met een diameter van 1 mm op de spuit en steek deze in de spleet van de petrischaal. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit zitten.
- Vul een spuit van 20 ml met 4% PFA en bewaar deze in de chemische kap. Maak een lege petrischaal onder de motorkap.
- Verdoof de muis met 3% isofluraan/zuurstof bij een stroomsnelheid van 1,0 l/min en offer deze op door cervicale dislocatie volgens de geldende dierenwelzijnsregels.
- Verwijder na het offer de vacht over de borst en open de borst om volledige toegang tot het hart te hebben.
- Isoleer het hart, dompel het onder in de petrischaal die eerder gevuld was met 50 ml Tyrode-oplossing. Gebruik een chirurgische schaar om de aorta direct in de buurt van de aortaboog te knippen om het hart bloot te leggen.
- Breng het hart over onder een stereoscopische microscoop en voer de cannulatie zorgvuldig uit. Steek de canule niet te diep in de aorta (niet meer dan 2 mm) om weefselschade te voorkomen.
- Gebruik een kleine klem en een hechtdraad (maat 5/0) om het hart aan de canule te bevestigen.
- Perfuseer het hart met 30 ml van de Tyrode-oplossing met een constante druk van 10 ml / min om bloed uit de bloedvaten te verwijderen.
- Maak de canule los van de spuit en plaats het hart in de petrischaal gevuld met Tyrode-oplossing. Pas op dat u geen luchtbellen in de canule heeft; verwijder anders de luchtbellen op de juiste manier.
- Bevestig de spuit van 20 ml gevuld met koude 4% PFA aan de canule en perfuseer het hart met dezelfde constante druk.
- Incubeer het hart in 10 ml van 4% PFA bij 4 °C 's nachts (O/N). Om weefselafbraak te voorkomen, voert u stappen 2.6-2.13 in de kortst mogelijke tijd uit.
3. Hart opruiming
- Was de volgende dag het hart in 0,01 M PBS 3 keer bij 4 °C gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden bewaard in PBS + 0,01% natriumazide (NaN3) bij 4 °C. - Incubeer het hart in 30 ml Hydrogel-oplossing bij schudden (15 tpm) bij 4 °C gedurende 3 dagen.
- Ontgas het monster bij kamertemperatuur met behulp van een droger, een vacuümpomp en een buizensysteem dat de droger verbindt met zowel de pomp als een stikstofleiding.
- Plaats het monster in de droger en open de injectieflacon, houd de dop erop.
- Sluit de droger en haal de zuurstof uit de buis door de stikstofleiding te openen.
- Zet de vacuümpomp aan om de zuurstof gedurende 10 minuten uit de droger te verwijderen.
- Schakel de pomp uit en gebruik de knop van de droger om de stikstofleiding te openen. Zodra de druk gelijk is aan de atmosferische druk, opent u de droger voorzichtig en sluit u de injectieflacon snel.
- Houd het hart in de ontgaste Hydrogel-oplossing bij 37 °C gedurende 3 uur in rust.
- Wanneer de Hydrogel goed gepolymeriseerd is en er volledig gelatineus uitziet, verwijdert u voorzichtig het hart en plaatst u het in de monsterhouder.
- Plaats de monsterhouder met het hart in een van de opruimkamers en sluit deze goed om lekken van de opruimoplossing te voorkomen.
- Schakel het waterbad in waar de container met de opruimoplossing is geplaatst en de peristaltische pomp om de recirculatie van de opruimoplossing te starten.
- Vervang de opruimoplossing in de container eenmaal per week om de verduidelijkingsprocedure te versnellen.
4. Kleuring van het celmembraan
- Zodra het hart volledig helder lijkt, verwijdert u het uit de monsterhouder en wast u het gedurende 24 uur in 50 ml opgewarmde PBS. Was opnieuw in 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) gedurende 24 uur.
- Incubeer het monster in 0,01 mg / ml Wheat Germ Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 in 3 ml PBS-T 1x bij schudden (50 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 7 dagen.
- Was het monster na de incubatie van 7 dagen in 50 ml PBS-T 1x bij kamertemperatuur in schudden gedurende 24 uur.
- Incubeer het monster in 4% PFA gedurende 15 minuten en was het vervolgens 3 keer in PBS gedurende 5 minuten elk.
OPMERKING: Na deze stap kan het hart gedurende enkele maanden worden opgeslagen in PBS + 0,01% NaN3 bij 4 °C. - Incubeer het hart in toenemende concentraties van 2,2′-Thiodiethanol (TDE) in 0,01 M PBS (20% en 47% TDE/PBS) gedurende elk 8 uur, tot de uiteindelijke concentratie van 68% TDE in 0,01 M PBS om de vereiste brekingsindex (RI = 1,46) te leveren. Dit is het RI matching medium (RI-medium) om beelden te verkrijgen16.
5. Hartmontage en -acquisitie
OPMERKING: Alle componenten van het optische systeem worden in detail vermeld in de tabel met materialen.
- Vul voorzichtig ongeveer 80% van het externe cuvette (kwarts, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) met het RI-medium.
OPMERKING: Hier is het mogelijk om verschillende niet-vluchtige oplossingen te gebruiken die een RI van 1,46 garanderen. - Vul het interne cuvet (kwarts, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) voorzichtig met hetzelfde RI-medium.
- Dompel het monster onder in de interne cuvette. De hierboven beschreven monsterincubaties zorgen ervoor dat het monster stabiel blijft in het RI-medium zonder te worden vastgehouden.
- Verplaats het monster voorzichtig naar de bodem van de cuvette met een dun pincet en rangschik het hart met zijn lengteas evenwijdig aan de hoofdas van de cuvette om het excitatielichtpad door het weefsel tijdens het scannen te minimaliseren.
- Bevestig de op maat gemaakte plug voorzichtig boven de interne cuvette met twee schroeven.
- Monteer het monster met behulp van de magneten op de microscooptrap.
- Vertaal de verticale monstertrap handmatig om de interne cuvette onder te dompelen in de externe.
- Schakel de excitatielichtbron (golflengte van 638 nm) in en stel een laag vermogen in (in de orde van grootte van 3 mW).
- Verplaats het monster met behulp van de gemotoriseerde vertaler om een binnenvlak van het weefsel te verlichten.
- Schakel de beeldbewerkingssoftware (HCImageLive) in en stel de cameratrigger in op de externe (light-sheet) modus om de acquisitietrigger van de camera aan te sturen door de aangepaste software die de volledige installatie regelt.
- Schakel Automatisch opslaan in het deelvenster Scaninstellingen in en stel de uitvoermap in waarin de afbeeldingen moeten worden opgeslagen.
- Pas de monsterpositie in het XY-vlak handmatig aan met de lineaire vertalers om het monster naar het midden van de FoV van de camerasensor te verplaatsen.
- Verplaats het monster langs de Z-as met behulp van de lineair gemotoriseerde vertaler om hartgrenzen te identificeren voor tomografische reconstructie.
- Verhoog het laservermogen tot ~20 mW, klaar voor de beeldverwerkingssessie.
- Start de tomografische acquisitie, klik op de knop Start in het sequence panel van de imaging software en verplaats tegelijkertijd het monster langs de Z-as met de constante snelheid van 6 μm/s met behulp van de gemotoriseerde vertaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ontwikkelde passieve clearing setup maakt het mogelijk om een geklaard volwassen muishart (met een afmeting van de orde 10 mm x 6 mm x 6 mm) te verkrijgen in ongeveer 3 maanden. Alle componenten van de opstelling zijn gemonteerd zoals weergegeven in figuur 1. De verwaarloosbare temperatuurgradiënt tussen elke clearingkamer (in de orde van 3 °C) maakt het mogelijk om de temperatuur in alle kamers in een goed bereik te houden.
Figuur 1: Schema van de passieve clearing setup. De clearingoplossing (na te zijn gefilterd) circuleert achtereenvolgens door de monsterkamers met behulp van de peristaltische pomp. Het onderhoud van de oplossingscontainer in een waterbad op 50 °C zorgt ervoor dat de oplossingstemperatuur in de kamers tussen 37-45 °C ligt. Afbeelding gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 toont het resultaat van het opruimproces van een heel hart. Zoals reeds gemeld door Costantini et al.16, verandert de combinatie van de CLARITY-methodologie met TDE als RI-medium het uiteindelijke volume van het monster niet significant en leidt dit niet tot anisotrope vervorming van het monster.
Figuur 2: Representatief beeld van een hart voor (links) en na (rechts) het CLARITY-protocol. De harten worden volledig transparant en iets te groot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Zodra het hart was gewist, werden cellulaire membranen gekleurd met een Alexa Fluor 633-geconjugeerde WGA om de cytoarchitectuurreconstructie van het hele orgaan uit te voeren. De op maat gemaakte fluorescentie lichtplaatmicroscoop (figuur 3) was in staat om een resolutie op 3D-micronschaal over de gehele FoV te garanderen.
Figuur 3: MesoSPIM. CAD-weergave van de op maat gemaakte fluorescentie lichtplaatmicroscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Rekening houdend met het numerieke diafragma (NA = 0,1) van de detectieoptiek, kan de radiale (XY) Point Spread Function (PSF) van het systeem worden geschat in de orde van 4-5 μm. Aan de andere kant produceert de excitatie-optiek een lichtplaat met een minimale taille van ongeveer 6 μm (Volledige breedte half maximum, FWHM) die divergeert tot 175 μm aan de rand van de FoV (figuur 4A-C). De synchronisatie van de rolluik van de camera met de axiale scan van de laserstraal zorgde ervoor dat het emissiesignaal alleen in het monstergedeelte werd verzameld dat werd opgewonden met de taille van het lichtvel, wat resulteerde in een gemiddelde FWHM van ongeveer 6,7 μm langs de gehele FoV (figuur 4B-D).
Figuur 4: Light-sheet generatie en karakterisering. (A) Een excitatie light-sheet gegenereerd met een laserbron van 638 nm is gericht op het centrum van het Field of View (FoV) en verkregen met een pixelgrootte van 3,25 μm en een exposure tijd van 10 ms. De lichtintensiteit wordt genormaliseerd en gerapporteerd met een kleurenkaart. De Full Width Half Maximum (FWHM) van het lichtintensiteitsprofiel wordt geëvalueerd in 15 verschillende posities langs de FoV. De resultaten worden weergegeven in C. (B) Afbeelding van het excitatielichtblad dat wordt gegenereerd door de synchronisatie tussen de rolluik van de camera die op 1,92 Hz werkt en de lichtbundelpositie die door de afstembare lens wordt aangedreven. De FWHM van het lichtintensiteitsprofiel wordt langs de FoV geëvalueerd en de resultaten worden weergegeven in D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De Z-PSF van de microscoop werd ook geschat door een tomografische reconstructie van de fluorescerende nanosfeer (figuur 5). Een FWHM van 6,4 μm kan worden geschat door de fit, in goede overeenstemming met de vorige beoordeling.
Figuur 5: Point Spread Functie in de Z-as. De Point Spread Function (PSF) van het optische systeem wordt geschat door het in beeld brengen van fluorescerende nanosferen op submicronschaal (geëxciteerd met een lichtplaat met een golflengte van 638 nm) met een pixelgrootte van 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. PSF-intensiteitsprofiel langs de optische as (Z) wordt weergegeven als zwarte stippen. Psf-profiel is uitgerust met een Gaussiaanse functie met μ = 18,6 μm en σ = 2,7 μm. De FWHM van de PSF geschat door de fit is 6,4 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Door de hoge transparantie van het weefsel was het mogelijk om het hele hart te verlichten zonder significante vervorming van de axiaal gescande lichtplaat bij een excitatiegolflengte van 638 nm. Het fluorescentiesignaal werd verzameld door de sCMOS-sensor die werkte met een blootstellingstijd van 500 ms en een framesnelheid van 1,92 Hz. Op basis van eerdere kwantificering werd de tomografische acquisitie uitgevoerd met een Z-scansnelheid van 6 μm / s, en uitgaande van een framesnelheid van 1,92 Hz, werd één frame per 3,12 μm verkregen, waardoor het systeem Z-PSF met ongeveer twee keer werd oversampled. Twee representatieve frames (op de coronale en transversale vlakken) van de linker ventrikelkamer zijn weergegeven in figuur 6. Dit resultaat bevestigt de mogelijkheid van het systeem om enkelvoudige celmembranen in drie dimensies op te lossen met een voldoende signaal/ruisverhouding in het gehele orgaan (figuur 6).
Figuur 6: Reconstructie van het hartweefsel van de muis. Het geklaarde hart werd gekleurd met WGA geconjugeerd aan Alexa Fluor 633 en opgewonden door een laserbron met een golflengte van 638 nm. (A) Coronale en (B) transversale representatieve secties. (C-D) Weefseltransformatie produceert een hoge weefseltransparantie, waardoor kleine structuren in de wanddiepte kunnen worden opgelost. Het optische systeem vertoont een axiale resolutie die voldoende is om micrometrische structuren (paneel. D). (E) 3D lage resolutie hartweergave. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk werd een succesvolle aanpak geïntroduceerd om een heel muizenhart op hoge resolutie te zuiveren, te beitsen en in beeld te brengen. Eerst werd een weefseltransformatieprotocol (CLARITY) geoptimaliseerd en uitgevoerd, enigszins aangepast voor de toepassing ervan op het hartweefsel. Inderdaad, om een efficiënte reconstructie in 3D van een heel hart te verkrijgen, is het essentieel om het fenomeen van lichtverstrooiing te voorkomen. De CLARITY-methodologie stelt ons in staat om een zeer transparant intact hart te verkrijgen, maar het vereist lange incubatietijden wanneer het passief wordt uitgevoerd (ongeveer 5 maanden). Met betrekking tot de hersenen is het hartweefsel niet geschikt voor een actieve opruiming, die gebruik maakt van een elektrisch veld. Zelfs bij lage spanningen leidt het elektrische veld tot beschadigingen en weefselbreuken. Hier werd een passieve clearingbenadering geoptimaliseerd om in ongeveer 3 maanden een volledig gezuiverd hart te verkrijgen. Na het isoleren en cannuleren van het hart via de proximale aorta, werd de CLARITY-methodologie uitgevoerd zoals beschreven in sectie 3 van het protocol. Om de procedure te versnellen, werd een zelfgemaakte passieve clearing-opstelling geregeld (figuur 1), die uiteindelijk de timing van weefselopruiming met ongeveer 40% verminderde. De opstelling bestaat uit een container voor de reinigingsoplossing, een waterbad, een peristaltische pomp, verschillende kamers met verschillende monsterhouders, capsulefilters voor elke kamer en een buizensysteem voor de recirculatie van de oplossing. De pomp extraheert en circuleert de oplossing achtereenvolgens uit de container door elk van de kamers, waar de monsters worden bewaard om te worden opgeruimd. Voordat de kamers worden betreden, stroomt de oplossing door een capsulefilter om de lipiden op te vangen die tijdens het opruimen uit weefsels worden weggespoeld. De optimale temperatuur voor de opruimoplossing, tussen 37-45 °C, wordt tijdens de recirculatie in de kamers gehandhaafd door de oplossingscontainer in een waterbad op 50 °C te houden. Het wordt geadviseerd om de clearingoplossing in de container eenmaal per week tijdens de procedure te vervangen. Alle gebruikte componenten worden in detail vermeld in de materiaaltabel. De geoptimaliseerde oplossing die hier wordt gepresenteerd, stelt ons in staat om een heel passief gezuiverd muizenhart te verkrijgen in een aanzienlijk kortere tijd ten opzichte van de standaard passieve clearingtechniek, waardoor de vereiste experimentele tijd wordt verkort zonder het orgaan te beschadigen. De kleuringsbenadering werd ook geoptimaliseerd voor homogene etikettering van de cellulaire membranen en endotheel, met behulp van een fluorescerend lectine (WGA - Alexa Fluor 633).
De hartcytoarchitectuur is gereconstrueerd door een speciale mesoSPIM te ontwikkelen die axiaal het lichtvel over het monster veegt (https://mesospim.org). De op maat gemaakte fluorescentie lichtplaatmicroscoop (figuur 3) was in staat om snel beelden te verkrijgen van een mesoscopische FoV (in de orde van millimeters) met micrometrische resolutie. Op deze manier kunnen enkele cardiomyocyten worden opgelost en in kaart worden gebracht tot een 3D-reconstructie van het hele orgaan. De microscoop verlicht het gewiste monster met een lichtplaat, dynamisch gegenereerd door een laserstraal bij 638 nm te scannen met behulp van een galvanometrische spiegel. Een sCMOS-camera karakteriseert de detectiearm in een 2x vergrotingsschema waarmee deze de volledige FoV in één scan kan verkrijgen. Het fluorescentiesignaal werd geselecteerd door een long-pass filter achter het doel te plaatsen. De camera werd ingesteld om te werken in de rolling shutter-modus: op elk moment worden de lijnen van actieve camerapixels (d.w.z. blootgesteld aan het beeld) gesynchroniseerd met de in-plane verschuiving van de brandpuntsband van de lichtplaat, uitgevoerd door een elektrisch instelbare lens. Deze aanpak maximaliseerde de optische sectiecapaciteit in de hele FoV door alleen beelden te verkrijgen in het dunste deel van de gefocuste lichtplaat. Deze oplossing verschilt van conventionele configuraties, waarbij acquisitie betrekking heeft op het volledige bereik van de scherptediepte van de lichtplaat, waardoor een maximale optische sectieresolutie in een groot deel van de FoV wordt voorkomen. Een geïntegreerde monstertrap ondersteunt cuvetten, waardoor de positionering wordt geoptimaliseerd en axiale beweging van het monster tijdens het beeldvormingsproces mogelijk wordt. Op deze manier zijn tomografische reconstructies mogelijk door opeenvolgende interne secties te verwerven. De verkregen beelden hebben een mesoscopische FoV en een micrometrische resolutie, terwijl de acquisitietijd die nodig is voor een heel muizenhart ~ 15 min is. De synchronisatie tussen de rolluik van de camera en de excitatielichtbundel die de FoV veegt, maakt het mogelijk om het volledige beeldvlak met een hoge ruimtelijke resolutie te verwerven (figuur 4). Dit maakt directe reconstructie van het monster mogelijk in een enkele tomografische acquisitie, zonder de noodzaak van radiale verplaatsing van het monster en op multi-aangrenzende stapels gebaseerde beeldvorming. Met name de microscoop maakte de reconstructie van het hele orgaan van ongeveer (10 mm x 6 mm x 6 mm) in een enkele beeldvormingssessie mogelijk, met een bijna-isotrope voxelgrootte en een voldoende signaal-achtergrondverhouding om afzonderlijke cellen over het hele orgaan mogelijk op te lossen.
Het is opmerkelijk dat het voorgestelde protocol enkele kritieke stappen presenteert die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd om goede resultaten te bereiken. Met name de cannulatie van het hart door de proximale aorta kan vrij moeilijk zijn, maar het is een essentiële stap om het orgaan goed te wassen en te repareren. Judd et al.17, lieten zien hoe deze stap effectief uit te voeren. Bovendien is de ontgassingsprocedure die nodig is voor het CLARITY-protocol ook vrij complex, maar het is essentieel voor weefselbehoud; als deze stap niet goed wordt uitgevoerd, kan het weefsel tijdens de incubatie in de oplossing schade en verval ondervinden.
Bovendien, hoewel de gepresenteerde experimentele workflow geschikt is voor kleine fluorescerende sondes, biedt het gebruik van immunohistochemie niet altijd een goede efficiëntie in de kleuring vanwege het hogere molecuulgewicht van de antilichamen. Elk immunostainingprotocol vereist de juiste optimalisatie en er zijn verschillende benaderingen bedacht om de penetratie van antilichamen te verbeteren, bijvoorbeeld weefselexpansie18 en / of variaties in pH en ionische sterkte19.
De mesoSPIM-opstelling heeft ook twee belangrijke beperkingen: i) de conservering van de lichtplaat over het monster is sterk afhankelijk van de weefseltransparantie en ii) de afmeting van de camerasensor beperkt de FoV. Het garanderen van een perfecte refractieve indexmatching in het hele hart is zeer uitdagend en kleine variaties op de brekingsindex kunnen lichtverstrooiing veroorzaken, wat leidt tot verslechtering van de beeldkwaliteit. In dit verband kan een dubbelzijdig verlichtingsschema worden ingevoerd. Twee excitatiearmen kunnen twee verschillende en uitgelijnde dynamische lichtplaten genereren met maximaal gerichte verlichting door de verlichting van de ene naar de andere kant van het monster af te wisselen. Ook kan de FoV worden verbeterd door gebruik te maken van een nieuwe generatie hoge resolutie back-illuminated sCMOS met zeer grote sensoren in combinatie met telecentrische lenzen met een hoog numeriek diafragma met lage veldvervorming. Deze implementatie zou ons in staat stellen om grotere organen of uitgebreide weefsels te reconstrueren met behoud van dezelfde optische sectiecapaciteit en zo 3D-beelden op micronschaal te produceren van gewiste monsters ter grootte van een centimeter.
Hoewel het gepresenteerde protocol nog steeds veel tijd nodig heeft voor monstervoorbereiding en een hoge mate van transparantie om een betrouwbare cytoarchitectuurreconstructie van het hele orgaan te verkrijgen, ligt de belangrijkste betekenis van de aanpak in de verbeteringen van het clearingprotocol en het vermogen om mesoscopische reconstructie uit te voeren in een enkele scan met micrometrische resolutie. In de toekomst kunnen deze ontwikkelingen worden gecombineerd met een multi-kleuringsprotocol om reconstructie van hele organen te bereiken waarbij verschillende biologische structuren worden geïntegreerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project heeft financiering ontvangen van het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 952166 (REPAIR), MUR in het kader van het FISR-programma, project FISR2019_00320 en Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
