Summary
Vi rapporterer en metode for mesoskopisk rekonstruksjon av hele musehjertet ved å kombinere nye fremskritt i vevstransformasjon og farging med utvikling av et aksialt skannet lysarkmikroskop.
Abstract
Både genetiske og ikke-genetiske hjertesykdommer kan forårsake alvorlige remodeling prosesser i hjertet. Strukturell ombygging, som kollagenavsetning (fibrose) og cellulær feiljustering, kan påvirke elektrisk ledning, introdusere elektromekaniske dysfunksjoner og til slutt føre til arytmi. Nåværende prediktive modeller av disse funksjonelle endringene er basert på ikke-integrert og lavoppløselig strukturell informasjon. Å plassere dette rammeverket på en annen størrelsesorden er utfordrende på grunn av ineffektiviteten til standard bildebehandlingsmetoder ved å utføre høyoppløselig avbildning i massivt vev. I dette arbeidet beskriver vi et metodologisk rammeverk som tillater avbildning av hele musehjerter med mikrometrisk oppløsning. Oppnåelsen av dette målet har krevd en teknologisk innsats der fremskritt innen vevstransformasjon og avbildningsmetoder har blitt kombinert. Først beskriver vi en optimalisert CLARITY-protokoll som er i stand til å transformere et intakt hjerte til en nanoporøs, hydrogelhybridisert, lipidfri form som gir høy gjennomsiktighet og dyp farging. Deretter beskrives et fluorescenslysmikroskop som raskt kan skaffe bilder av et mesoskopisk synsfelt (mm-skala) med mikronskalaoppløsningen. Etter mesoSPIM-prosjektet tillater det unnfangede mikroskopet rekonstruksjon av hele musehjertet med mikrometrisk oppløsning i en enkelt tomografisk skanning. Vi tror at dette metodologiske rammeverket vil gjøre det mulig å avklare involveringen av cytoarkitektur-uorden i de elektriske dysfunksjonene og bane vei for en omfattende modell som vurderer både funksjonelle og strukturelle data, og dermed muliggjøre en enhetlig undersøkelse av de strukturelle årsakene som fører til elektriske og mekaniske endringer etter vevsremodelleringen.
Introduction
Strukturell ombygging forbundet med hjertesykdommer kan påvirke elektrisk ledning og introdusere elektromekaniske dysfunksjoner av orgelet 1,2. Nåværende tilnærminger som brukes til å forutsi funksjonelle endringer, bruker ofte MR og DT-MR for å oppnå en generell rekonstruksjon av fibroseavsetning, vaskulær tre og fiberfordeling av hjertet, og de brukes til å modellere fortrinnsrett til handlingspotensial forplantning (APP) -baner over orgelet 3,4. Disse strategiene kan gi en vakker oversikt over hjerteorganisasjonen. Imidlertid er deres romlige oppløsning utilstrekkelig til å undersøke virkningen av strukturell ombygging på hjertefunksjonen på mobilnivå.
Å plassere dette rammeverket i en annen størrelsesorden, hvor enkeltceller kan spille individuelle roller på handlingspotensialutbredelse, er utfordrende. Hovedbegrensningen er ineffektiviteten til standard bildebehandlingsmetoder for å utføre høyoppløselig bildebehandling (mikrometrisk oppløsning) i massive (centimeterstore) vev. Faktisk er avbildning av biologisk vev i 3D ved høy oppløsning svært komplisert på grunn av vevs ugjennomsiktighet. Den vanligste tilnærmingen til å utføre 3D-rekonstruksjoner i hele organer er å forberede tynne seksjoner. Presis seksjonering, montering og bildebehandling krever imidlertid betydelig innsats og tid. En alternativ tilnærming som ikke krever kutting av prøven, er å generere et gjennomsiktig vev. I løpet av de siste årene har flere metoder for å avklare vev blitt foreslått 5,6,7,8. Utfordringen med å produsere massivt, gjennomsiktig og fluorescerende merket vev har nylig blitt oppnådd ved å utvikle sanne vevstransformasjonsmetoder (CLARITY9, SHIELD10). Spesielt er CLARITY-metoden basert på transformasjon av et intakt vev til en nanoporøs, hydrogelhybridisert, lipidfri form som gjør det mulig å gi høy gjennomsiktighet ved selektiv fjerning av membranlipid-dobbeltlag. Spesielt har denne metoden blitt funnet vellykket også i hjertepreparasjon11,12,13,14. Men siden hjertet er for skjørt til å være egnet for en aktiv rydding, må det ryddes ved hjelp av passiv tilnærming, noe som krever lang tid å gi fullstendig gjennomsiktighet.
I kombinasjon med avanserte bildebehandlingsteknikker som lysarkmikroskopi, har CLARITY potensialet til å avbilde 3D massive hjertevev ved mikrometrisk oppløsning. Ved lysarkmikroskopi utføres belysningen av prøven med et tynt lysark begrenset i fokusplanet til deteksjonsmålet. Fluorescensutslippet samles langs en akse vinkelrett på belysningsplanet15. Deteksjonsarkitekturen ligner bredfeltsmikroskopi, noe som gjør oppkjøpet mye raskere enn laserskanningsmikroskoper. Ved å flytte prøven gjennom lysarket kan du oppnå en fullstendig tomografi av store prøver, opp til centimeterstore prøver. På grunn av de iboende egenskapene til Gaussian-strålen er det imidlertid mulig å oppnå et veldig tynt (i størrelsesorden noen få mikron) lysark bare for en begrenset romlig utvidelse, og dermed drastisk begrense synsfeltet (FoV). Nylig har en ny eksitasjonsordning blitt introdusert for å overvinne denne begrensningen og søkt om hjerneavbildning, noe som tillater 3d-rekonstruksjoner med isotropisk oppløsning16.
I denne artikkelen presenteres en passiv clearing-tilnærming, noe som muliggjør en betydelig reduksjon av clearingtidspunktet som CLARITY-protokollen trenger. Det metodologiske rammeverket som er beskrevet her, gjør det mulig å rekonstruere et helt musehjerte med mikrometrisk oppløsning i en enkelt tomografisk skanning med en oppkjøpstid i størrelsesorden minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrehåndtering og prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra europaparlamentsdirektiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og i samsvar med prinsippene og forskriftene fra det italienske helsedepartementet. Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av det italienske helsedepartementet (protokollnummer 647/2015-PR). Alle dyrene ble levert av ENVIGO, Italia. For disse forsøkene ble 5 mannlige C57BL / 6J mus på 6 måneders alder brukt.
1. Oppløsning forberedelse
- Forbered 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS) (pH 7,6) i en kjemisk hette. Oppbevar 4% PFA aliquots ved -20 °C i flere måneder.
- Klargjør hydrogeloppløsning: Bland 4% akrylamid, 0,05% Bis-akrylamid, 0,25% Initiatior AV-044 i 0,01 M PBS i en kjemisk hette. Hold reagensene og løsningen på is under hele preparatet. Oppbevar hydrogel aliquots ved -20 °C i flere måneder.
- Forbered clearingløsning: Bland 200 mM Borsyre, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) i avionisert vann; pH 8,6 i en kjemisk hette. Oppbevar oppløsningen mellom 21-37 °C for å unngå SDS-utfelling.
- Forbered fersk Tyrode-løsning på forsøksdagen: Tilsett 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1,2 mM MgCl2 og 4,7 mM KCl; titrere til pH 7,4 ved bruk av 1 M NaOH.
2. Hjerte isolasjon
- Injiser 0,1 ml 500 IE Heparin subkutant 30 min før hjerteisolasjonsprosedyren.
- Fyll en 30 ml sprøyte og tre 6 cm petriskåler med fersk tyrodeoppløsning. Lag en liten rift (3-4 mm i dybden) på grensen til en av petriskålene og legg den under et stereoskopisk mikroskop.
- Fest en kanyle med en diameter på 1 mm til sprøyten og sett den inn i riften på petriskålen. Pass på at det ikke er noen luftbobler i sprøyten.
- Fyll en 20 ml sprøyte med 4 % PFA og oppbevar den i den kjemiske hetten. Tilbered en tom petriskål under panseret.
- Bedøv musen med 3 % isofluran/oksygen med en strømningshastighet på 1,0 l/min og ofre den ved cervikal dislokasjon i henhold til gjeldende dyrevelferdsregler.
- Etter offeret, fjern pelsen over brystet og åpne brystet for å få full tilgang til hjertet.
- Isoler hjertet, senk det ned i petriskålen som tidligere var fylt med 50 ml tyrodeløsning. Bruk kirurgisk saks for å kutte aorta umiddelbart nær aortabuen for å få hjertet utsatt.
- Overfør hjertet under et stereoskopisk mikroskop og utfør kanyleringen forsiktig. Ikke sett kanylen for dypt inn i aorta (ikke mer enn 2 mm) for å unngå vevskader.
- Bruk en liten klemme og en sutur (størrelse 5/0) for å feste hjertet til kanylen.
- Perfuse hjertet med 30 ml av Tyrode-løsningen med et konstant trykk på 10 ml / min for å fjerne blod fra karene.
- Løsne kanylen fra sprøyten og legg hjertet i petriskålen fylt med tyrodeoppløsning. Vær forsiktig så du ikke har luftbobler i kanylen; Ellers fjern luftboblene ordentlig.
- Fest 20-ml sprøyten fylt med kald 4% PFA til kanylen og perfuse hjertet ved samme konstante trykk.
- Inkuber hjertet i 10 ml 4 % PFA ved 4 °C over natten (O/N). For å unngå vevsnedbrytning, utfør trinn 2.6-2.13 på kortest mulig tid.
3. Hjerterydding
- Dagen etter, vask hjertet i 0,01 M PBS 3 ganger ved 4 °C i 15 minutter.
MERK: Etter dette trinnet kan hjertet lagres i PBS + 0,01% natriumazid (NaN3) ved 4 ° C i flere måneder. - Inkuber hjertet i 30 ml hydrogeloppløsning ved risting (15 o/min) ved 4 °C i 3 dager.
- Degas prøven ved romtemperatur ved hjelp av en tørketrommel, en vakuumpumpe og et rørsystem som kobler tørketrommelen til både pumpen og en nitrogenrørledning.
- Plasser prøven i tørketrommelen og åpne hetteglasset, hold hetten på den.
- Lukk tørketrommelen og fjern oksygenet fra røret ved å åpne nitrogenrørledningen.
- Slå på vakuumpumpen for å fjerne oksygenet fra tørketrommelen i 10 minutter.
- Slå av pumpen og bruk knappen på tørketrommelen for å åpne nitrogenrørledningen. Når trykket er lik atmosfæretrykket, åpner du tørketrommelen forsiktig og lukker hetteglasset raskt.
- Hold hjertet i den avgassede hydrogelløsningen ved 37 °C i 3 timer i hvile.
- Når hydrogelen er riktig polymerisert og virker helt gelatinøs, fjern hjertet forsiktig fra det og legg det i prøveholderen.
- Sett prøveholderen med hjertet inn i et av ryddekamrene og lukk den ordentlig for å unngå lekkasjer i klareringsløsningen.
- Slå på vannbadet der beholderen for ryddeløsning er plassert og den peristaltiske pumpen for å starte resirkuleringen av clearingløsningen.
- Bytt klareringsløsningen i beholderen en gang i uken for å fremskynde avklaringsprosedyren.
4. Cellulær membranfarging
- Når hjertet virker helt avklart, fjern det fra prøveholderen og vask det i 50 ml oppvarmet PBS i 24 timer. Vask igjen i 50 ml PBS + 1% Triton-X (PBS-T 1x) i 24 timer.
- Inkuber prøven i 0,01 mg / ml hvetekimagglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633 i 3 ml PBS-T 1x i risting (50 o / min) ved romtemperatur i 7 dager.
- Etter 7-dagers inkubasjon, vask prøven i 50 ml PBS-T 1x ved romtemperatur ved risting i 24 timer.
- Inkuber prøven i 4% PFA i 15 min og vask den deretter 3 ganger i PBS i 5 minutter hver.
MERK: Etter dette trinnet kan hjertet oppbevares i PBS + 0,01% NaN3 ved 4 °C i flere måneder. - Inkuber hjertet i økende konsentrasjoner av 2,2′-Thiodiethanol (TDE) i 0,01 M PBS (20% og 47% TDE / PBS) i 8 timer hver, opp til den endelige konsentrasjonen på 68% TDE i 0,01 M PBS for å gi den nødvendige brytningsindeksen (RI = 1,46). Dette er RI-samsvarsmediet (RI-medium) for å skaffe bilder16.
5. Hjertemontering og oppkjøp
MERK: Alle komponentene i det optiske systemet er oppført i detalj i materialtabellen.
- Fyll forsiktig ca. 80 % av den eksterne kyvetten (kvarts, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) med RI-mediet.
MERK: Her er det mulig å bruke forskjellige ikke-flyktige løsninger som garanterer en RI på 1,46. - Fyll forsiktig den indre kyvetten (kvarts, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) med samme RI-medium.
- Senk prøven inne i den interne kyvetten. Prøveinkubasjonene beskrevet ovenfor tillater prøven å forbli stabil inne i RI-mediet uten å bli holdt.
- Flytt prøven forsiktig til bunnen av kyvetten ved hjelp av tynn pinsett og ordne hjertet med sin lengdeakse parallelt med kyvettens hovedakse for å minimere eksitasjonslysbanen over vevet under skanningen.
- Fest den skreddersydde pluggen forsiktig over den interne kyvetten med to skruer.
- Monter prøven til mikroskopstadiet ved hjelp av magneter.
- Oversett det vertikale prøvetrinnet manuelt for å fordype den interne kyvetten i den eksterne.
- Slå på eksitasjonslyskilden (bølgelengde på 638 nm), sett lav effekt (i størrelsesorden 3 mW).
- Flytt prøven ved hjelp av den motoriserte oversetteren for å belyse et indre plan av vevet.
- Slå på bildebehandlingsprogramvaren (HCImageLive) og sett kameraets utløser på ekstern (lysark) modus for å drive kameraets utløser ved hjelp av den tilpassede programvaren som styrer hele oppsettet.
- Aktiver automatisk lagring i skanneinnstillingspanelet og angi utdatamappen der bildene må lagres.
- Juster prøveposisjonen manuelt i XY-planet med de lineære oversetterne for å flytte prøven til midten av FoV-en til kamerasensoren.
- Flytt prøven langs Z-aksen ved hjelp av den lineære motoriserte oversetteren for å identifisere hjertegrenser for tomografisk rekonstruksjon.
- Øk lasereffekten til ~20 mW, klar for bildeøkten.
- Start den tomografiske anskaffelsen, klikk på Start-knappen i sekvenspanelet til bildebehandlingsprogramvaren, og flytt samtidig prøven langs Z-aksen med konstant hastighet på 6 μm / s ved hjelp av den motoriserte oversetteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det utviklede passive clearingoppsettet gjør det mulig å oppnå et ryddet voksent musehjerte (med en dimensjon på 10 mm x 6 mm x 6 mm) på ca. 3 måneder. Alle komponentene i oppsettet er montert som vist i figur 1. Den ubetydelige temperaturgradienten mellom hvert clearingkammer (i størrelsesorden 3 °C) gjør det mulig å opprettholde temperaturen i et riktig område på tvers av alle kamre.
Figur 1: Skjematisk for oppsettet for passiv clearing. Clearingløsningen (etter filtrering) sirkulerer etter hverandre gjennom prøvekamrene ved hjelp av den peristaltiske pumpen. Vedlikehold av oppløsningsbeholderen i et vannbad satt til 50 °C gjør at løsningstemperaturen kan ligge mellom 37-45 °C i kamrene. Bilde opprettet med Biorender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 viser resultatet av ryddingsprosessen av et helt hjerte. Som allerede rapportert av Costantini et al.16, endrer kombinasjonen av CLARITY-metoden med TDE som RI-medium ikke signifikant prøvens endelige volum og fører heller ikke til anisotrop deformasjon av prøven.
Figur 2: Representativt bilde av et hjerte før (til venstre) og etter (til høyre) CLARITY-protokollen. Hjertene blir helt gjennomsiktige og litt overdimensjonerte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Når hjertet ble ryddet, ble cellulære membraner farget med en Alexa Fluor 633-konjugert WGA for å utføre cytoarkitekturrekonstruksjonen av hele organet. Det skreddersydde fluorescenslysmikroskopet (figur 3) var i stand til å sikre 3D mikronskalaoppløsning over hele FoV.
Figur 3: MesoSPIM. CAD-gjengivelse av det skreddersydde fluorescenslysarkmikroskopet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Med tanke på den numeriske blenderåpningen (NA = 0,1) av deteksjonsoptikken, kan systemets radiale (XY) punktspredningsfunksjon (PSF) estimeres i størrelsesorden 4-5 μm. På den annen side produserer eksitasjonsoptikken et lysark med en minimum midje på ca. 6 μm (Full bredde halv maksimum, FWHM) som divergerer opp til 175 μm ved kanten av FoV (figur 4A-C). Synkroniseringen av kameraets rullende lukker med den aksiale skanningen av laserstrålen sørget for å samle utslippssignalet bare i prøvedelen opphisset med midjen på lysarket, noe som resulterte i en gjennomsnittlig FWHM på ca. 6,7 μm langs hele FoV (figur 4B-D).
Figur 4: Generering og karakterisering av lysark . (A) Et eksitasjonslysark generert med en laserkilde på 638 nm er fokusert på midten av synsfeltet (FoV) og ervervet med en pikselstørrelse på 3,25 μm og en eksponeringstid på 10 ms. Lysintensiteten normaliseres og rapporteres med et fargekart. Full bredde halv maksimum (FWHM) av lysintensitetsprofilen evalueres i 15 forskjellige posisjoner langs FoV. Resultatene er vist i C. (B) Bilde av eksitasjonslysarket som genereres av synkroniseringen mellom kameraets rullende lukker som opererer ved 1,92 Hz og lysstråleposisjonen drevet av det justerbare objektivet. FWHM for lysintensitetsprofilen evalueres langs FoV og resultatene vises i D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Z-PSF i mikroskopet ble også estimert ved en tomografisk rekonstruksjon av den fluorescerende nanosfæren (figur 5). En FWHM på 6,4 μm kan estimeres av passformen, i god overensstemmelse med forrige vurdering.
Figur 5: Punktspredningsfunksjon i Z-aksen. Point Spread Function (PSF) til det optiske systemet estimeres ved å avbilde fluorescerende nanosfærer i submikronskala (eksitert med et lysark med en bølgelengde på 638 nm) med en pikselstørrelse på 3,25 μm × 3,25 μm × 2,0 μm. PSF-intensitetsprofil langs den optiske aksen (Z) er representert som svarte prikker. PSF-profil er utstyrt med en Gauss-funksjon med μ = 18,6 μm og σ = 2,7 μm. FWHM for PSF estimert av passformen er 6,4 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
På grunn av vevets høye gjennomsiktighet var det mulig å belyse hele hjertet uten signifikant forvrengning av det aksialt skannede lysarket ved en eksitasjonsbølgelengde på 638 nm. Fluorescenssignalet ble samlet inn av sCMOS-sensoren som opererer ved 500 ms eksponeringstid og en bildefrekvens på 1,92 Hz. Basert på tidligere kvantifisering ble den tomografiske innsamlingen utført ved hjelp av en Z-skannehastighet på 6 μm / s, og forutsatt en bildefrekvens på 1,92 Hz, ble det oppnådd en ramme hver 3,12 μm, og oversampling systemet Z-PSF med omtrent to ganger. To representative rammer (på koronale og tverrplan) i venstre ventrikkelkammer er vist i figur 6. Dette resultatet bekrefter systemets potensialitet for å løse enkeltcellemembraner i tre dimensjoner med tilstrekkelig signal / støyforhold i hele organet (figur 6).
Figur 6: Rekonstruksjon av musehjertevev. Det avklarte hjertet ble farget med WGA konjugert til Alexa Fluor 633 og begeistret av en laserkilde med en bølgelengde på 638 nm. (A) Koronale og (B) tverrgående representative seksjoner. (C-D) Vevstransformasjon gir høy vevsgjennomsiktighet, noe som gjør det mulig å løse små strukturer i veggdybden. Det optiske systemet viser en aksial oppløsning som er tilstrekkelig til å løse mikrometriske strukturer (panel. D). (E) 3D hjertegjengivelse med lav oppløsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet ble en vellykket tilnærming til å fjerne, flekke og avbilde et helt musehjerte i høy oppløsning introdusert. Først ble en vevstransformasjonsprotokoll (CLARITY) optimalisert og utført, litt modifisert for anvendelse på hjertevevet. Faktisk, for å oppnå en effektiv rekonstruksjon i 3D av et helt hjerte, er det viktig å forhindre fenomenet lysspredning. CLARITY-metoden lar oss oppnå et svært gjennomsiktig intakt hjerte, men det krever lange inkubasjonstider når det utføres passivt (ca. 5 måneder). Med hensyn til hjernen er hjertevevet ikke egnet for en aktiv clearing, som utnytter et elektrisk felt. Selv ved lave spenninger fører det elektriske feltet til skader og vevsbrudd. Her ble en passiv clearing-tilnærming optimalisert for å oppnå et fullstendig ryddet hjerte på omtrent 3 måneder. Etter isolering og kanylering av hjertet gjennom proksimal aorta ble CLARITY-metodikken utført som beskrevet i protokollens avsnitt 3. For å fremskynde prosedyren ble det arrangert et hjemmelaget passivt clearingoppsett (figur 1), som endte med å redusere tidspunktet for vevsrydding med ca. 40%. Oppsettet består av en beholder for ryddeløsningen, et vannbad, en peristaltisk pumpe, flere kamre som inneholder forskjellige prøveholdere, kapselfiltre for hvert kammer og et rørsystem for resirkulering av løsningen. Pumpen trekker ut og sirkulerer løsningen fra beholderen etter hverandre gjennom hvert av kamrene, hvor prøvene holdes for rydding. Før den går inn i kamrene, strømmer løsningen gjennom et kapselfilter for å fange lipidene som skylles bort fra vev under clearing. Den optimale temperaturen for clearingløsningen, mellom 37-45 °C, opprettholdes i kamrene under resirkuleringen ved å oppbevare oppløsningsbeholderen i et vannbad ved 50 °C. Det anbefales å bytte clearingløsning i beholderen en gang i uken under prosedyren. Alle komponenter som brukes er oppført i detalj i materialtabellen. Den optimaliserte løsningen som presenteres her lar oss oppnå et helt passivt ryddet musehjerte på betydelig kortere tid med hensyn til standard passiv clearingteknikk, og dermed redusere den nødvendige eksperimentelle tiden uten å skade orgelet. Fargingsmetoden ble også optimalisert for homogen merking av cellemembranene og endotelet, ved hjelp av et fluorescerende lektin (WGA - Alexa Fluor 633).
Hjertecytoarkitekturen har blitt rekonstruert ved å utvikle en dedikert mesoSPIM som aksialt feier lysarket over prøven (https://mesospim.org). Det skreddersydde fluorescenslysarkmikroskopet (figur 3) var i stand til raskt å skaffe bilder av en mesoskopisk FoV (i størrelsesorden millimeter) med mikrometrisk oppløsning. På denne måten kan enkle kardiomyocytter løses og kartlegges i en 3D-rekonstruksjon av hele organet. Mikroskopet belyser den ryddede prøven med et lysark, dynamisk generert ved å skanne en laserstråle ved 638 nm ved hjelp av et galvanometrisk speil. Et sCMOS-kamera karakteriserer deteksjonsarmen i et 2x forstørrelsesskjema som gjør det mulig å skaffe hele FoV i en enkelt skanning. Fluorescenssignalet ble valgt ved å plassere et langpassfilter etter målet. Kameraet ble satt til å fungere i rullende lukkermodus: når som helst synkroniseres linjene med aktive kamerapiksler (dvs. utsatt for bildet) med forskyvningen i planet på fokalbåndet til lysarket, utført av en elektrisk justerbar linse. Denne tilnærmingen maksimerte den optiske seksjoneringsevnen i hele FoV ved bare å skaffe bilder i den tynneste delen av det fokuserte lysarket. Denne løsningen skiller seg fra konvensjonelle konfigurasjoner, der anskaffelsen innebærer hele spekteret av brennvidde på lysarket, noe som forhindrer topp optisk seksjoneringsoppløsning i store deler av FoV. Et integrert prøvetrinn støtter kyvetter, og optimaliserer dermed posisjonering og muliggjør aksial bevegelse av prøven under bildeprosessen. På denne måten er tomografiske rekonstruksjoner mulig ved å anskaffe påfølgende interne seksjoner. Bildene som er oppnådd har en mesoskopisk FoV og en mikrometrisk oppløsning, mens anskaffelsestiden som kreves for et helt musehjerte er ~ 15 min. Synkroniseringen mellom kameraets rullende lukker og eksitasjonslysstrålen som feier FoV, gjør det mulig å skaffe hele bildeplanet med høy romlig oppløsning (figur 4). Dette tillater direkte rekonstruksjon av prøven i en enkelt tomografisk anskaffelse, uten at det er nødvendig med prøveradial forskyvning og multi-tilstøtende stabler-basert avbildning. Spesielt tillot mikroskopet rekonstruksjon av hele orgelet på ca. (10 mm x 6 mm x 6 mm) i en enkelt bildebehandling, med en nesten isotropisk voxelstørrelse og et tilstrekkelig signal-til-bakgrunnsforhold for å løse enkeltceller over hele organet potensielt.
Det er bemerkelsesverdig at den foreslåtte protokollen presenterer noen kritiske skritt som må utføres nøye for å oppnå gode resultater. Spesielt kan hjertets kanylering gjennom proksimal aorta være ganske vanskelig, men det er et viktig skritt å vaske og fikse orgelet riktig. Judd et al.17, viste hvordan man kan utføre dette trinnet effektivt. Videre er avgassingsprosedyren som trengs av CLARITY-protokollen også ganske kompleks, men det er viktig for vevsbevaring; Hvis dette trinnet ikke utføres riktig, kan vevet støte på skader og forfall under inkubasjonen i clearingløsningen.
Videre, selv om den presenterte eksperimentelle arbeidsflyten er egnet for små fluorescerende prober, gir bruk av immunhistokjemi ikke alltid god effektivitet i fargingen på grunn av den høyere molekylvekten til antistoffene. Hver immunostaining-protokoll krever riktig optimalisering, og forskjellige tilnærminger har blitt unnfanget for å forbedre antistoffpenetrasjonen, for eksempel vevsutvidelse18 og / eller variasjoner i pH og ionisk styrke19.
MesoSPIM-oppsettet presenterer også to hovedbegrensninger: i) lysarkbevaringen over prøven er sterkt avhengig av vevets gjennomsiktighet, og ii) dimensjonen til kamerasensoren begrenser FoV. Å garantere en perfekt brytningsindeks som matcher inne i hele hjertet er svært utfordrende, og små variasjoner på brytningsindeksen kan produsere lysspredning, noe som fører til forringelse av bildekvaliteten. I denne forbindelse kan en tosidig belysningsordning innføres. To eksitasjonsarmer kan generere to forskjellige og justerte dynamiske lysark med maksimal fokusert belysning ved å veksle belysningen fra den ene siden til den andre av prøven. FoV kan også forbedres ved å bruke en ny generasjon høyoppløselig bakbelyst sCMOS med svært store sensorer i kombinasjon med telesentriske linser med høy numerisk blenderåpning med lav feltforvrengning. Denne implementeringen vil tillate oss å rekonstruere større organer eller utvidede vev som opprettholder den samme optiske seksjonsevnen og dermed produserer mikronskala 3D-bilder av centimeterstore ryddede prøver.
Selv om den presenterte protokollen fortsatt krever lang tid for prøvepreparering og et høyt nivå av gjennomsiktighet for å oppnå en pålitelig cytoarkitekturrekonstruksjon av hele organet, ligger den viktigste betydningen av tilnærmingen i forbedringene av clearingprotokollen og evnen til å utføre mesoskopisk rekonstruksjon i en enkelt skanning ved mikrometrisk oppløsning. I fremtiden kan disse fremskrittene kombineres med en multifargingsprotokoll for å oppnå rekonstruksjon av hele organer som integrerer forskjellige biologiske strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale No 952166 (REPAIR), MUR under FISR-programmet, prosjekt FISR2019_00320 og Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE-prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
