Summary
Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Hem genetik hem de genetik olmayan kalp hastalıkları kalpte ciddi yeniden şekillenme süreçlerine neden olabilir. Kollajen birikimi (fibrozis) ve hücresel yanlış hizalama gibi yapısal yeniden modelleme, elektriksel iletimi etkileyebilir, elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir ve sonunda aritmilere yol açabilir. Bu fonksiyonel değişikliklerin mevcut öngörücü modelleri, entegre olmayan ve düşük çözünürlüklü yapısal bilgilere dayanmaktadır. Bu çerçeveyi farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek, standart görüntüleme yöntemlerinin masif dokuda yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmedeki etkisizliği nedeniyle zordur. Bu çalışmada, tüm fare kalplerinin mikrometrik çözünürlükle görüntülenmesini sağlayan metodolojik bir çerçeve tanımladık. Bu hedefe ulaşmak, doku transformasyonu ve görüntüleme yöntemlerindeki gelişmelerin birleştirildiği teknolojik bir çaba gerektirmiştir. İlk olarak, sağlam bir kalbi yüksek şeffaflık ve derin lekelenmeye izin veren nanogözenekli, hidrojel hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürebilen optimize edilmiş bir CLARITY protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, mikron ölçeğinde çözünürlükte mezoskopik bir görüş alanının (mm ölçeğinde) görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilen bir floresan ışık tabakası mikroskobu açıklanmaktadır. MezoSPIM projesini takiben, tasarlanan mikroskop, tek bir tomografik taramada tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle yeniden yapılandırılmasına izin verir. Bu metodolojik çerçevenin, sitomimari kargaşanın elektriksel işlev bozukluklarına katılımının açıklığa kavuşturulmasına izin vereceğine ve hem işlevsel hem de yapısal verileri dikkate alan kapsamlı bir modelin önünü açacağına, böylece doku yeniden şekillenmesinden sonra elektriksel ve mekanik değişikliklere yol açan yapısal nedenlerin birleşik bir şekilde araştırılmasını sağlayacağına inanıyoruz.
Introduction
Kalp hastalıkları ile ilişkili yapısal yeniden yapılanma elektrik iletimini etkileyebilir ve organın elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir 1,2. Fonksiyonel değişiklikleri tahmin etmek için kullanılan güncel yaklaşımlar, fibroz birikiminin, vasküler ağacın ve kalbin lif dağılımının genel bir rekonstrüksiyonunu elde etmek için MRG ve DT-MRG'yi yaygın olarak kullanır ve organ boyunca tercihli eylem potansiyeli yayılım (APP) yollarını modellemek için kullanılır 3,4. Bu stratejiler kalp organizasyonuna güzel bir genel bakış sağlayabilir. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlükleri, yapısal yeniden yapılanmanın hücresel düzeyde kardiyak fonksiyon üzerindeki etkisini araştırmak için yetersizdir.
Bu çerçeveyi, tek hücrelerin eylem potansiyeli yayılımı üzerinde bireysel roller oynayabileceği farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek zordur. Temel sınırlama, masif (santimetre boyutlu) dokularda yüksek çözünürlüklü görüntüleme (mikrometrik çözünürlük) gerçekleştirmek için standart görüntüleme yöntemlerinin verimsizliğidir. Aslında, biyolojik dokuları 3D olarak yüksek çözünürlükte görüntülemek, doku opaklığı nedeniyle çok karmaşıktır. Tüm organlarda 3D rekonstrüksiyonları gerçekleştirmek için en yaygın yaklaşım, ince kesitler hazırlamaktır. Bununla birlikte, hassas kesitleme, montaj ve görüntüleme önemli çaba ve zaman gerektirir. Numunenin kesilmesini gerektirmeyen alternatif bir yaklaşım, şeffaf bir doku oluşturmaktır. Son yıllarda, dokuları berraklaştırmak için çeşitli metodolojiler önerilmiştir 5,6,7,8. Masif, şeffaf ve floresan olarak etiketlenmiş dokular üretme zorluğu, son zamanlarda gerçek doku dönüşüm yaklaşımları geliştirilerek elde edilmiştir (CLARITY9, SHIELD10). Özellikle, CLARITY yöntemi, bozulmamış bir dokunun, membran lipit çift katmanlarının seçici olarak çıkarılmasıyla yüksek şeffaflık kazandırmayı sağlayan nanogözenekli, hidrojel-hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürülmesine dayanır. Özellikle, bu yöntem kardiyak preparatta da başarılı bulunmuştur11,12,13,14. Bununla birlikte, kalp aktif bir temizlik için uygun olamayacak kadar kırılgan olduğundan, tam şeffaflık sağlamak için uzun zaman gerektiren pasif yaklaşım kullanılarak temizlenmelidir.
Işık tabakası mikroskobu gibi gelişmiş görüntüleme teknikleriyle birlikte, CLARITY 3D masif kalp dokularını mikrometrik çözünürlükte görüntüleme potansiyeline sahiptir. Işık tabakası mikroskobunda, numunenin aydınlatılması, algılama hedefinin odak düzleminde sınırlı ince bir ışık tabakası ile gerçekleştirilir. Floresan emisyonu, aydınlatma düzlemi15'e dik bir eksen boyunca toplanır. Algılama mimarisi geniş alan mikroskobuna benzer ve bu da edinimi lazer tarama mikroskoplarından çok daha hızlı hale getirir. Numunenin ışık tabakası boyunca hareket ettirilmesi, santimetre büyüklüğündeki numunelere kadar büyük örneklerin tam bir tomografisinin elde edilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gauss ışınının içsel özellikleri nedeniyle, yalnızca sınırlı bir uzamsal uzantı için çok ince (birkaç mikron mertebesinde) bir ışık tabakası elde etmek mümkündür, böylece görüş alanını (FoV) büyük ölçüde sınırlar. Son zamanlarda, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni bir uyarma şeması tanıtıldı ve beyin görüntüleme için uygulandı ve izotropik çözünürlük16 ile 3d rekonstrüksiyonlara izin verdi.
Bu yazıda, CLARITY protokolünün ihtiyaç duyduğu takas zamanlamasının önemli ölçüde azaltılmasını sağlayan pasif bir takas yaklaşımı sunulmuştur. Burada açıklanan metodolojik çerçeve, tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle tek bir tomografik taramada dakika sırasına göre bir edinme süresiyle yeniden yapılandırılmasına izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan elleçleme ve prosedürleri, bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/EU sayılı Direktifindeki kılavuzlara uygun olarak ve İtalya Sağlık Bakanlığı'nın ilke ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 647/2015-PR). Tüm hayvanlar ENVIGO, İtalya tarafından sağlandı. Bu deneyler için 6 aylık 5 erkek C57BL/6J fare kullanıldı.
1. Çözelti hazırlama
- Kimyasal bir başlıkta Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS) (pH 7.6) içinde% 4 Paraformaldehit (PFA) hazırlayın. % 4 PFA alikotlarını birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.
- Hidrojel çözeltisi hazırlayın:% 4 Akrilamid,% 0.05 Bis-akrilamid,% 0.25 Initiatior AV-044'ü kimyasal bir başlıkta 0.01 M PBS'de karıştırın. Tüm hazırlık boyunca reaktifleri ve çözeltiyi buz üzerinde tutun. Hidrojel alikotları birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.
- Temizleme çözeltisi hazırlayın: Deiyonize suda 200 mM Borik asit,% 4 Sodyum Dodesil-Sülfat (SDS) karıştırın; kimyasal bir başlıkta pH 8.6. SDS yağışını önlemek için çözeltiyi 21-37 °C arasında saklayın.
- Deney gününde taze Tyrode çözeltisi hazırlayın: 10 mM Glikoz, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1.2 mM MgCl2 ve 4.7 mM KCl ekleyin; 1 M NaOH kullanarak pH 7.4'e titre edin.
2. Kalp izolasyonu
- Kalp izolasyon prosedüründen 30 dakika önce deri altından 0.1 mL 500 I.U. Heparin enjekte edin.
- 30 mL'lik bir şırınga ve üç adet 6 cm'lik Petri kabını taze Tyrode çözeltisi ile doldurun. Petri çanaklarından birinin sınırında küçük bir yarık (3-4 mm derinlikte) yapın ve stereoskopik bir mikroskop altına yerleştirin.
- Şırıngaya 1 mm çapında bir kanül sabitleyin ve Petri kabının yarığına yerleştirin. Şırıngada hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- 20 mL'lik bir şırıngayı% 4 PFA ile doldurun ve kimyasal davlumbazda tutun. Kaputun altına boş bir Petri kabı hazırlayın.
- Fareyi %3 İzofluran / oksijen ile 1.0 L / dak akış hızında uyuşturun ve yürürlükteki hayvan refahı kurallarına göre servikal çıkık ile feda edin.
- Kurbandan sonra, kürkü göğsün üzerinden çıkarın ve kalbe tam erişime sahip olmak için göğsü açın.
- Kalbi izole edin, daha önce 50 mL Tirode Çözeltisi ile doldurulmuş Petri kabına batırın. Kalbin açığa çıkması için aort kemerinin hemen yakınında aortu kesmek için cerrahi makas kullanın.
- Kalbi stereoskopik bir mikroskop altında aktarın ve kanülasyonu dikkatlice gerçekleştirin. Doku hasarını önlemek için kanülü aortun çok derinlerine (en fazla 2 mm) sokmayın.
- Kalbi kanüle sabitlemek için küçük bir kelepçe ve bir dikiş (boyut 5/0) kullanın.
- Damarlardan kanı çıkarmak için kalbi 30 mL Tirode çözeltisi ile 10 mL / dak sabit bir basınçla perfüze edin.
- Kanülü şırıngadan ayırın ve kalbi Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin. Kanülde hava kabarcıkları olmamasına dikkat edin; aksi takdirde, hava kabarcıklarını düzgün bir şekilde çıkarın.
- Soğuk %4 PFA ile doldurulmuş 20 mL şırıngayı kanüle takın ve kalbi aynı sabit basınçta perfüze edin.
- Kalbi gece boyunca 4 °C'de (O / N) 10 mL% 4 PFA'da inkübe edin. Doku bozulmasını önlemek için, 2.6-2.13 adımlarını mümkün olan en kısa sürede uygulayın.
3. Kalp temizleme
- Ertesi gün, kalbi 15 dakika boyunca 4 ° C'de 3 kez 0.01 M PBS'de yıkayın.
NOT: Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca 4 ° C'de PBS +% 0.01 sodyum azid (NaN3) içinde saklanabilir. - Kalbi 3 gün boyunca 4 ° C'de sallamada (15 rpm) 30 mL Hidrojel çözeltisinde inkübe edin.
- Bir kurutucu, bir vakum pompası ve kurutucuyu hem pompaya hem de azot boru hattına bağlayan bir tüp sistemi kullanarak numuneyi oda sıcaklığında gazdan arındırın.
- Numuneyi kurutucuya yerleştirin ve kapağı üzerinde tutarak şişeyi açın.
- Kurutucuyu kapatın ve azot boru hattını açarak oksijeni tüpten çıkarın.
- Oksijeni kurutucudan 10 dakika boyunca çıkarmak için vakum pompasını açın.
- Pompayı kapatın ve azot boru hattını açmak için kurutucunun düğmesini kullanın. Basınç atmosferik basınca eşit olduğunda, kurutucuyu dikkatlice açın ve şişeyi hızla kapatın.
- Kalbi gazdan arındırılmış Hidrojel çözeltisinde 37 °C'de 3 saat dinlendirin.
- Hidrojel düzgün bir şekilde polimerize edildiğinde ve tamamen jelatinimsi göründüğünde, kalbi dikkatlice çıkarın ve numune tutucuya yerleştirin.
- Numune tutucuyu kalple birlikte temizleme odalarından birine yerleştirin ve temizleme çözeltisinin sızmasını önlemek için düzgün bir şekilde kapatın.
- Temizleme çözeltisinin devridaimini başlatmak için temizleme çözeltisi kabının yerleştirildiği su banyosunu ve peristaltik pompayı açın.
- Arıtma prosedürünü hızlandırmak için kaptaki temizleme solüsyonunu haftada bir kez değiştirin.
4. Hücresel membran boyama
- Kalp tamamen berraklaştıktan sonra, numune tutucudan çıkarın ve 24 saat boyunca 50 mL ısıtılmış PBS'de yıkayın. 24 saat boyunca 50 mL PBS + Triton-X'in% 1'inde (PBS-T 1x) tekrar yıkayın.
- Numuneyi 0.01 mg / mL Buğday Gergini Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633'ü 3 mL PBS-T 1x'te 7 gün boyunca oda sıcaklığında sallayarak (50 rpm) inkübe edin.
- 7 günlük inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 50 mL PBS-T 1x'te 24 saat çalkalayarak yıkayın.
- Numuneyi 15 dakika boyunca% 4 PFA'da inkübe edin ve ardından PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
NOT: Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca 4 ° C'de PBS +% 0.01 NaN3'te saklanabilir. - Kalbi, her biri 8 saat boyunca 0.01 M PBS'de (% 20 ve% 47 TDE / PBS) artan konsantrasyonlarda 2,2′-Tiyodiethanol (TDE), gerekli kırılma indisini sağlamak için 0.01 M PBS'de% 68 TDE'nin son konsantrasyonuna kadar inkübe edin (RI = 1.46). Bu, görüntüleri elde etmek için kullanılan RI eşleştirme ortamıdır (RI-medium) 16.
5. Kalbe montaj ve satın alma
NOT: Optik sistemin tüm bileşenleri Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak listelenmiştir.
- Dış küvetin yaklaşık% 80'ini (kuvars, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) RI-medium ile yavaşça doldurun.
NOT: Burada, 1,46 RI'yı garanti eden farklı uçucu olmayan çözümler kullanmak mümkündür. - İç küveti (kuvars, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) aynı RI-medium ile yavaşça doldurun.
- Numuneyi iç küvetin içine batırın. Yukarıda açıklanan numune inkübasyonları, numunenin tutulmadan RI-ortamı içinde sabit kalmasını sağlar.
- İnce cımbız kullanarak numuneyi yavaşça küvetin dibine doğru hareket ettirin ve tarama sırasında doku boyunca uyarma ışığı yolunu en aza indirmek için kalbi uzunlamasına ekseni küvetin ana eksenine paralel olarak düzenleyin.
- Özel fişi iç küvetin üzerine iki vidayla yavaşça sabitleyin.
- Mıknatısları kullanarak numuneyi mikroskop aşamasına monte edin.
- İç küvetin dış küvete batırılması için dikey numune aşamasını manuel olarak çevirin.
- Uyarma ışık kaynağını (638 nm dalga boyu) açın ve düşük bir güç (3 mW sırasına göre) ayarlayın.
- Dokunun iç düzlemini aydınlatmak için motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi hareket ettirin.
- Görüntüleme yazılımını (HCImageLive) açın ve tüm kurulumu kontrol eden özel yazılım tarafından kameranın alma tetikleyicisini çalıştırmak için fotoğraf makinesinin Harici (ışık tabakası) modunda Tetikleyicisini ayarlayın.
- Tarama Ayarları panelinde Otomatik Kaydet'i etkinleştirin ve görüntülerin kaydedilmesi gereken çıktı klasörünü ayarlayın.
- Numuneyi kamera sensörünün FoV'sinin merkezine taşımak için doğrusal çevirmenlerle XY düzlemindeki numune konumunu manuel olarak ayarlayın.
- Tomografik rekonstrüksiyon için kalp sınırlarını tanımlamak üzere doğrusal motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca hareket ettirin.
- Lazer gücünü, görüntüleme oturumu için hazır olacak şekilde ~20 mW'a yükseltin.
- Tomografik alımı başlatın, görüntüleme yazılımının Sıra Panelindeki Başlat düğmesine tıklayın ve aynı zamanda motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca 6 μm/s sabit hızda hareket ettirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geliştirilen pasif temizleme kurulumu, yaklaşık 3 ay içinde temizlenmiş bir yetişkin fare kalbi (10 mm x 6 mm x 6 mm mertebesinde bir boyutta) elde etmeyi sağlar. Kurulumun tüm bileşenleri Şekil 1'de gösterildiği gibi monte edilmiştir. Her bir temizleme odası arasındaki ihmal edilebilir sıcaklık gradyanı (3 ° C mertebesinde), sıcaklığın tüm odalarda uygun bir aralıkta tutulmasını sağlar.
Şekil 1: Pasif temizleme kurulumunun şeması. Temizleme çözeltisi (filtrelendikten sonra), peristaltik pompa yardımıyla numune odalarında art arda dolaşır. Çözelti kabının 50 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda bakımı, çözelti sıcaklığının odalar içinde 37-45 °C arasında olmasını sağlar. Biorender.com ile oluşturulan görüntü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2, tüm kalbin temizlenme sürecinin sonucunu göstermektedir. Costantini ve ark.16 tarafından daha önce bildirildiği gibi, CLARITY metodolojisinin TDE ile RI-medium olarak kombinasyonu, numunenin son hacmini önemli ölçüde değiştirmez veya numunenin anizotropik deformasyonuna yol açmaz.
Şekil 2: Bir kalbin CLARITY protokolünden önce (solda) ve sonra (sağda) temsili görüntüsü. Kalpler tamamen şeffaf ve biraz büyük olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kalp temizlendikten sonra, tüm organın sitomimari rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek için hücresel zarlar Alexa Fluor 633 konjuge WGA ile boyandı. Özel yapım floresan ışık tabakası mikroskobu (Şekil 3), tüm FoV boyunca 3D mikron ölçekli çözünürlük sağlayabildi.
Resim 3: MesoSPIM. Özel yapım floresan ışık tabakası mikroskobunun CAD gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Algılama optiklerinin sayısal açıklığı (NA = 0.1) göz önüne alındığında, sistemin radyal (XY) Nokta Yayılma Fonksiyonu (PSF) 4-5 μm mertebesinde tahmin edilebilir. Öte yandan, uyarma optikleri, FoV'nin kenarında 175 μm'ye kadar ayrılan minimum bele yaklaşık 6 μm (Tam genişlikte yarım maksimum, FWHM) sahip bir ışık tabakası üretir (Şekil 4A-C). Kamera yuvarlanan deklanşörün lazer ışınının eksenel taraması ile senkronizasyonu, emisyon sinyalinin yalnızca ışık tabakasının beli ile uyarılan örnek kısmında toplanmasını sağladı ve tüm FoV boyunca yaklaşık 6.7 μm'lik ortalama bir FWHM ile sonuçlandı (Şekil 4B-D).
Şekil 4: Işık tabakası üretimi ve karakterizasyonu . (A) 638 nm'lik bir lazer kaynağı ile üretilen bir uyarma ışık tabakası, Görüş Alanının (FoV) merkezine odaklanır ve 3,25 μm piksel boyutu ve 10 ms'lik bir Pozlama Süresi ile elde edilir. Işık yoğunluğu normalleştirilir ve bir renk haritası ile raporlanır. Işık yoğunluğu profilinin Tam Genişlik Yarım Maksimum (FWHM), FoV boyunca 15 farklı konumda değerlendirilir. Sonuçlar C ile gösterilir. (B) 1,92 Hz'de çalışan fotoğraf makinesi panjuru ile ayarlanabilir lens tarafından tahrik edilen ışık demeti konumu arasındaki senkronizasyon tarafından oluşturulan uyarma ışık tabakasının görüntüsü. Işık yoğunluğu profilinin FWHM'si FoV boyunca değerlendirilir ve sonuçlar D ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mikroskobun Z-PSF'si de floresan nanosferin tomografik rekonstrüksiyonu ile tahmin edilmiştir (Şekil 5). 6.4 μm'lik bir FWHM, önceki değerlendirme ile iyi bir uyum içinde, uyum ile tahmin edilebilir.
Şekil 5: Z ekseninde Nokta Yayılma Fonksiyonu. Optik sistemin Nokta Yayılma İşlevi (PSF), 3,25 μm piksel boyutuna × 3,25 μm × 2,0 μm piksel boyutuna sahip floresan mikron altı ölçekli nanosferlerin (638 nm dalga boyuna sahip bir ışık tabakası ile uyarılır) görüntülenmesiyle tahmin edilir. PSF profili, μ = 18.6 μm ve σ = 2.7 μm olan bir Gauss fonksiyonu ile donatılmıştır. PSF'nin fit tarafından tahmin edilen FWHM'si 6.4 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Dokunun yüksek şeffaflığı sayesinde, eksenel olarak taranan ışık tabakasının 638 nm uyarma dalga boyunda önemli bir bozulma olmadan tüm kalbi aydınlatmak mümkün olmuştur. Floresan sinyali, 500 ms pozlama süresinde ve 1.92 Hz'lik bir kare hızında çalışan sCMOS sensörü tarafından toplandı. önceki nicelemeye dayanarak, tomografik alım, 6 μm / s'lik bir Z-tarama hızı kullanılarak gerçekleştirildi ve 1.92 Hz'lik bir kare hızı varsayarak, her 3.12 μm'de bir kare elde edildi ve Z-PSF sistemini yaklaşık iki kez aşırı örnekledi. Sol ventrikül odasının iki temsili çerçevesi (koronal ve enine düzlemlerde) Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu sonuç, sistemin tek hücre zarlarını tüm organda yeterli bir Sinyal/Gürültü oranıyla üç boyutlu olarak çözme potansiyelini doğrulamaktadır (Şekil 6).
Resim 6: Fare kalp dokusu rekonstrüksiyonu. Berraklaştırılmış kalp, Alexa Fluor 633'e konjuge edilmiş WGA ile boyandı ve 638 nm dalga boyuna sahip bir lazer kaynağı tarafından uyarıldı. (A) Koronal ve (B) enine temsili bölümler. (C-D) Doku dönüşümü, yüksek doku şeffaflığı sağlayarak duvar derinliğindeki küçük yapıların çözülmesine izin verir. Optik sistem, mikrometrik yapıları çözmek için yeterli bir eksenel çözünürlük gösterir (panel. D). (E) 3D düşük çözünürlüklü kalp oluşturma. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, bütün bir fare kalbini yüksek çözünürlükte temizlemek, lekelemek ve görüntülemek için başarılı bir yaklaşım tanıtıldı. İlk olarak, bir doku dönüşüm protokolü (CLARITY) optimize edildi ve uygulandı, kalp dokusuna uygulanması için biraz modifiye edildi. Gerçekten de, bütün bir kalbin 3B'sinde etkili bir rekonstrüksiyon elde etmek için, ışık saçılması fenomenini önlemek esastır. CLARITY metodolojisi, oldukça şeffaf ve sağlam bir kalp elde etmemizi sağlar, ancak pasif olarak gerçekleştirildiğinde (yaklaşık 5 ay) uzun kuluçka süreleri gerektirir. Beyne gelince, kalp dokusu bir elektrik alanından yararlanan aktif bir temizleme için uygun değildir. Düşük voltajlarda bile, elektrik alanı hasarlara ve doku kırılmalarına neden olur. Burada, yaklaşık 3 ay içinde tamamen temizlenmiş bir kalp elde etmek için pasif bir temizleme yaklaşımı optimize edildi. Kalbi proksimal aort yoluyla izole ettikten ve kanüle ettikten sonra, CLARITY metodolojisi protokolün 3. bölümünde açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Prosedürü hızlandırmak için, ev yapımı bir pasif temizleme kurulumu düzenlendi (Şekil 1), bu da doku temizlemenin zamanlamasını yaklaşık% 40 oranında azalttı. Kurulum, temizleme çözeltisi için bir kap, bir su banyosu, bir peristaltik pompa, farklı numune tutucular içeren birkaç oda, her oda için kapsül filtreler ve çözeltinin devridaimi için bir boru sisteminden oluşur. Pompa, çözeltiyi kaptan, numunelerin temizlenmek üzere tutulduğu odaların her biri boyunca art arda çıkarır ve dolaştırır. Odalara girmeden önce, çözelti, temizleme sırasında dokulardan uzaklaştırılan lipitleri yakalamak için bir kapsül filtreden akar. Temizleme çözeltisi için en uygun sıcaklık, 37-45 °C arasında, çözelti kabını 50 °C'de bir su banyosunda tutarak devridaim sırasında odalar içinde tutulur. İşlem sırasında kaptaki temizleme çözeltisinin haftada bir kez değiştirilmesi önerilir. Kullanılan tüm bileşenler Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak listelenmiştir. Burada sunulan optimize edilmiş çözüm, standart pasif temizleme tekniğine göre önemli ölçüde daha kısa bir sürede pasif olarak temizlenmiş bir fare kalbi elde etmemizi sağlar, böylece organa zarar vermeden gerekli deneysel süreyi azaltır. Boyama yaklaşımı ayrıca bir floresan lektin (WGA - Alexa Fluor 633) kullanılarak hücresel membranların ve endotelin homojen etiketlenmesi için optimize edilmiştir.
Kalp sitomimarisi, ışık tabakasını numune boyunca eksenel olarak süpüren özel bir mezoSPIM geliştirilerek yeniden yapılandırılmıştır (https://mesospim.org). Özel yapım floresan ışık tabakası mikroskobu (Şekil 3), mikrometrik çözünürlükte mezoskopik bir FoV'un (milimetre sırasına göre) görüntülerini hızla elde edebildi. Bu şekilde, tek kardiyomiyositler çözülebilir ve tüm organın 3D rekonstrüksiyonuna eşlenebilir. Mikroskop, temizlenmiş numuneyi, galvanometrik bir ayna kullanarak 638 nm'de bir lazer ışını tarayarak dinamik olarak üretilen bir ışık tabakası ile aydınlatır. Bir sCMOS kamera, algılama kolunu 2x büyütme şemasında karakterize eder ve bu da tüm FoV'yi tek bir taramada elde etmesini sağlar. Floresan sinyali, hedeften sonra uzun geçirgen bir filtre yerleştirilerek seçildi. Kamera deklanşör modunda çalışacak şekilde ayarlandı: herhangi bir zamanda, aktif kamera piksellerinin çizgileri (yani, görüntüye maruz kalan), elektriksel olarak ayarlanabilir bir lens tarafından gerçekleştirilen ışık tabakasının odak bandının düzlem içi kaymasıyla senkronize edilir. Bu yaklaşım, odaklanmış ışık tabakasının yalnızca en ince kısmındaki görüntüleri elde ederek tüm FoV'deki optik bölümleme kapasitesini en üst düzeye çıkardı. Bu çözüm, edinimin ışık tabakasının tüm odak derinliği aralığını içerdiği ve FoV'un büyük bölümünde en yüksek optik kesitleme çözünürlüğünü önleyen geleneksel konfigürasyonlardan farklıdır. Entegre bir numune aşaması küvetleri destekler, böylece konumlandırmayı optimize eder ve görüntüleme işlemi sırasında numunenin eksenel hareketini sağlar. Bu şekilde, tomografik rekonstrüksiyonlar, ardışık iç bölümler elde edilerek mümkündür. Elde edilen görüntüler mezoskopik bir FoV ve mikrometrik bir çözünürlüğe sahipken, tüm fare kalbi için gereken elde etme süresi ~ 15 dakikadır. Kamera yuvarlanan deklanşör ile FoV'u süpüren uyarma ışık demeti arasındaki senkronizasyon, tüm görüntü düzleminin yüksek uzamsal çözünürlükle elde edilmesini sağlar (Şekil 4). Bu, numunenin radyal yer değiştirmesi ve çok bitişik yığın tabanlı görüntülemeye gerek kalmadan tek bir tomografik kazanımda numunenin doğrudan yeniden yapılandırılmasını sağlar. Özellikle, mikroskop, tek bir görüntüleme oturumunda, neredeyse izotropik bir voksel boyutu ve tüm organ boyunca tek hücreleri potansiyel olarak çözmek için yeterli bir sinyal-arka plan oranı ile yaklaşık 10 mm x 6 mm x 6 mm) tüm organın tamamının yeniden yapılandırılmasına izin verdi.
Önerilen protokolün, iyi sonuçlar elde etmek için dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken bazı kritik adımlar sunması dikkat çekicidir. Özellikle, kalbin proksimal aorttan kanülasyonu oldukça zor olabilir, ancak organı düzgün bir şekilde yıkamak ve sabitlemek için önemli bir adımdır. Judd ve ark.17, bu adımın etkili bir şekilde nasıl gerçekleştirileceğini göstermiştir. Ayrıca, CLARITY protokolünün ihtiyaç duyduğu gaz giderme prosedürü de oldukça karmaşıktır, ancak doku korunması için gereklidir; Bu adım düzgün bir şekilde gerçekleştirilmezse, temizleme çözeltisinde inkübasyon sırasında doku hasar ve çürüme ile karşılaşabilir.
Ayrıca, sunulan deneysel iş akışı küçük floresan problar için uygun olmasına rağmen, immünohistokimyanın kullanımı, antikorların daha yüksek moleküler ağırlığı nedeniyle boyalamada her zaman iyi bir verimlilik sağlamaz. Her immün boyama protokolü uygun optimizasyon gerektirir ve antikor penetrasyonunu iyileştirmek için farklı yaklaşımlar tasarlanmıştır, örneğin, doku genişlemesi18 ve / veya pH ve iyonik mukavemet19'daki değişiklikler.
MesoSPIM kurulumu ayrıca iki ana sınırlama sunar: i) numune boyunca ışık tabakasının korunması doku şeffaflığına büyük ölçüde bağlıdır ve ii) kamera sensörünün boyutu FoV'yi sınırlar. Tüm kalbin içinde mükemmel bir kırılma indisi eşleşmesini garanti etmek çok zordur ve kırılma indisindeki küçük değişiklikler ışık saçılmasına neden olarak görüntü kalitesinin bozulmasına neden olabilir. Bu bakımdan, çift taraflı bir aydınlatma şeması tanıtılabilir. İki uyarma kolu, aydınlatmayı numunenin bir tarafından diğerine değiştirerek maksimum odaklanmış aydınlatmaya sahip iki ayrı ve hizalanmış dinamik ışık tabakası oluşturabilir. Ayrıca, FoV, düşük alan distorsiyonuna sahip yüksek sayısal diyaframlı telesentrik lenslerle birlikte çok büyük sensörlere sahip yeni nesil yüksek çözünürlüklü arkadan aydınlatmalı sCMOS kullanılarak geliştirilebilir. Bu uygulama, aynı optik kesit kapasitesini koruyarak daha büyük organları veya genişletilmiş dokuları yeniden yapılandırmamıza ve böylece santimetre boyutunda temizlenmiş numunelerin mikron ölçeğinde 3D görüntülerini üretmemize izin verecektir.
Sunulan protokol, numune hazırlama için hala uzun bir zaman ve tüm organın güvenilir bir sitomimari rekonstrüksiyonunu elde etmek için yüksek düzeyde şeffaflık gerektirse de, yaklaşımın temel önemi, temizleme protokolünün iyileştirilmesi ve mikrometrik çözünürlükte tek bir taramada mezoskopik rekonstrüksiyon yapabilme kabiliyetinde yatmaktadır. Gelecekte, bu ilerlemeler, farklı biyolojik yapıları entegre eden tüm organ rekonstrüksiyonunu sağlamak için çoklu boyama protokolü ile birleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
İfşa edilecek bir şey yok.
Acknowledgments
Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından 952166 No'lu hibe anlaşması (REPAIR), FISR programı kapsamında MUR, proje FISR2019_00320 ve Regione Toscana, Bando Ricerca Salute 2018, PERCARE projesi kapsamında fon almıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
