Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Bröst epitelial och endotelcellssfäroider som en potentiell funktionell in vitro-modell för bröstcancerforskning

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

Crosstalk mellan bröst epitelial celler och endotel celler bidrar viktigt till bröstcancer progression, tumör tillväxt och metastasering. I denna studie har sfäroider tillverkats av bröstcancerceller tillsammans med kärl- och/eller lymfatiska endotelceller och visat deras tillämplighet som in vitro-system för bröstcancerforskning.

Abstract

Bröstcancer är den främsta dödsorsaken hos kvinnor. Tillväxten av bröstcancerceller och deras efterföljande metastasering är en nyckelfaktor för dess progression. Även om mekanismerna som är involverade i att främja bröstcancer tillväxt har studerats intensivt med hjälp av monokulturer av bröstcancerceller såsom MCF-7 celler, har bidraget från andra celltyper, såsom vaskulär och lymfatiska endotelceller som är intimt involverade i tumörtillväxt, inte undersökts på djupet. Cell-cell interaktion spelar en nyckelroll i tumör tillväxt och progression. Neoangiogenes, eller utveckling av fartyg, är avgörande för tumör tillväxt, medan lymfsystemet fungerar som en portal för cancer cell migration och efterföljande metastasering. Nyligen genomförda studier ger bevis för att vaskulär och lymfatiska endotelceller kan påverka cancercellstillväxten avsevärt. Dessa observationer innebär ett behov av att utveckla in vitro-modeller som mer realistiskt skulle återspegla bröstcancertillväxtprocesser in vivo. Dessutom kräver begränsningar i djurforskningen att man utarbetar ex vivo-modeller för att bättre klargöra de berörda mekanismerna.

Denna artikel beskriver utvecklingen av bröstcancer sfäroider består av både bröstcancerceller (östrogen receptor-positiva MCF-7 celler) och vaskulär och/eller lymfatiska endotel celler. Protokollet beskriver en detaljerad steg-för-steg-metod för att skapa tvåcelliga sfäroider med två olika metoder, hängande droppe (guldstandard och billig) och 96-brunns U-bottenplattor (dyra). Djupgående instruktioner ges för hur man försiktigt plockar upp de formade sfäroiderna för att övervaka tillväxten genom mikroskopisk storlek och bedömning av livskraften med hjälp av döda och levande cellfärgning. Dessutom avgränsas förfaranden för att fixa sfäroiderna för sektionering och färgning med tillväxtspecifika antikroppar för att skilja tillväxtmönster i sfäroider. Dessutom ges detaljer för att förbereda sfäroider med transfectedceller och metoder för att extrahera RNA för molekylär analys. Sammanfattningsvis ger denna artikel djupgående instruktioner för att förbereda flercelliga sfäroider för bröstcancerforskning.

Introduction

Användningen av djur för experiment har begränsningar. Djurstudier kan inte exakt efterlikna sjukdomsprogression hos människor, och djur och människor har inte identiska svar på patogener. Dessutom kan begränsningar av djurförsök på grund av oro för djurs lidande och etiska problem1,2 allt mer begränsade forskningsprogram. In vitro System har utvecklats i stor utsträckning för att kringgå användningen av djur. Dessutom har användningen av mänskliga celler gjort att in vitro modeller som är mer relevanta för den patofysiologiska och terapeutiska undersökningen. Konventionella monolayer (2D) cellkulturer används ofta eftersom de efterliknar mänskliga vävnader i viss utsträckning. 2D-monokulturer kan dock inte efterlikna mänskliga organ, och 2D-monokulturer kan inte simulera den komplexa mikromiljön hos de ursprungliga organen och efterlikna in vivo situation3,4,5,6. Dessutom, i monolayer cell kulturer, läkemedelsbehandlingar kan lätt förstöra / skada alla celler. Viktigt är att vissa av dessa begränsningar kan övervinnas genom att byta till flerskikts tredimensionella (3D) cellkulturer7,8. Faktum är att 3D-kulturmodeller har visat sig bättre återspegla cellstrukturen, layouten och funktionen hos celler i primära vävnader. Dessa 3D-kulturer kan bildas med hjälp av en mängd olika cellinjer, som liknar ett funktionellt organ. Det finns faktiskt två modeller av 3D-kulturer. En modell producerar sfäroider av aggregerade celler som bildar kluster och omorganiserar dem till sfärer (byggnadsställningsfria modeller). Den andra ger organoider, som har en mer komplex struktur och består av kombinationer av flera organspecifika celler, som betraktas som en miniatyrversion av organ9,10. På grund av detta representerar 3D-odlingssystem en innovativ teknik med många biologiska och kliniska tillämpningar. Således har sfäroider och organoider många tillämpningar för sjukdomsmodellering och studier relaterade till regenerativ medicin, läkemedelsscreening och toxikologiska studier6,11,12,13,14,15. Cancerframkallande sfäroider, härledda från 3D-teknik, återskapar morfologi och fenotyp av relevanta celltyper, efterliknar in vivo tumörmikromiljön och modellcellkommunikation och signalvägar som är i drift under tumörutveckling16,17,18. För att förbättra förståelsen för cancerbiologi kan tumörsfäroider/organoider också användas för att identifiera en potentiell patientspecifik cancerbehandling (personlig) och bedöma dess effekt, toxicitet och långsiktiga effekter19,20,21,22. Sfäroider har öppnat framträdande möjligheter att undersöka patofysiologi, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening på grund av deras förmåga att bevara cellulär och tredimensionell vävnadsarkitektur, förmågan att efterlikna in vivo situationen och cell-cellinteraktionerna. Men man måste också vara medveten om begränsningarna i detta system, såsom bristen på vaskulär/ systemisk komponent, funktionellt immun- eller nervsystemet, och systemet representerar ett reduktionistiskt tillvägagångssätt jämfört med djurmodeller. I motsats till djurmodeller ger 3D-strukturer endast en approximation av biologin i en mänsklig kropp. Att förstå begränsningarna i 3D-metoden kan hjälpa forskare att utforma mer raffinerade och giltiga processer för att producera sfäroider som bättre representerar ett organ i större skala23,24,25.

Cancer är den främsta dödsorsaken i världen, och bröstcancer är den vanligaste cancerformen hos kvinnor26,27,28. För att efterlikna den komplexa mikromiljön av bröstcancer bör bröstcancer sfäroider odlas med celler som spelar en framträdande roll i brösttumörer, dvs. epitelceller, endotelceller, fibroblaster och/eller immunceller. Dessutom, för en sfäroid som representerar bröstcancer, bör uttrycket av kvinnliga hormonreceptorer (östrogen/ progesteronreceptorer), förmåga att bevara patientens tumör histologisk status och förmåga att efterlikna svar på terapi också övervägas. Studier har visat att 3D-samkultursystem har en cellulär organisation som liknar den primära vävnaden in vivo, har förmågan att reagera i realtid på stimuli och har funktionella androgenreceptorer29,30,31,32. Därför kan ett liknande tillvägagångssätt vara användbart för att efterlikna en brösttumör in vitro. Syftet med det nuvarande protokollet är att etablera en ny metod för att generera bröstcancersfäroider. Denna metod använder östrogen receptorpositiva MCF-7 celler (en odödliggjord mänsklig cellinje av epitelceller) och vaskulär endotelceller (HUVECs) eller lymfatiska endotelceller (HMVEC-DNeo) för att skapa en modell som efterliknar eller nära återspeglar interaktionerna mellan dessa celler i en tumör. Även om MCF-7 (östrogen-lyhörda) och endotelceller har använts för att utveckla sfäroider i den nuvarande studien, kan andra celler som fibroblaster som representerar ~ 80% av brösttumörmassan också kombineras i framtiden för att bättre representera och efterlikna brösttumör.

Det finns flera metoder för att bilda sfäroider, till exempel: 1) den hängande droppmetoden som användergravitationen 33,34; 2) den magnetiska levitationsmetoden som använder magnetiska nanopartiklar som utsätts för en extern magnet35och 3) den sfäroida mikroplatta som utförs av såddceller på lågtillsatta plattor36,37. På grundval av de befintliga metoderna, som endast använder en celltyp, har det nuvarande protokollet optimerats med epitel- och endotelceller för att bättre efterlikna tillväxtförhållandena för bröstcancertumörer i vivo38,39,40,41. Denna metod kan enkelt uppnås i laboratoriet till en låg kostnad och med minimala utrustningskrav. Baserat på labbets behov/mål användes olika metoder för att bilda sfäroider och få relevant cellulärt material från dessa sfäroider. I detta sammanhang, för DNA, RNA eller proteinanalys, produceras 3D-sfäroiderna genom samodling av endotel- och epitelceller med hängande droppmetod. Men för funktionella studier, till exempel, för att övervaka celltillväxt efter kort störande (siRNA) transfektion och/eller hormonbehandling, sfäroiderna genereras med hjälp av U-bottenplattor.

Syftet med detta tekniska protokoll är att tillhandahålla en detaljerad steg-för-steg beskrivning för 1) bilda bröstcancer multicellulär-typ sfäroider, 2) förbereda prover för histologiska färgning, och 3) samling av celler för extraktion av RNA, DNA och proteiner. Både den billiga hängande droppmetoden och de dyrare U-bottenplattorna används för att bilda sfäroider. Här tillhandahålls ett protokoll för att förbereda (fixa) sfäroider för sektionering och efterföljande immunstaining med markörer för att bedöma cellproliferation, apoptos och distribution av epitelial och endotelceller inom en sfäroid. Dessutom visar detta protokoll en fullständig steg-för-steg-analys av histologiska data med hjälp av ImageJ-programvara. Tolkningen av biologiska data varierar beroende på vilken typ av experiment och vilka antikroppar som används. Sektionering av fasta sfäroider och efterföljande färgning av sektionerna utfördes av ett rutinmässigt patologilabb (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellkultur

OBS: Utför cellhantering under sterila förhållanden.

  1. Subkultur av human umbilisk ven (HUVECs)
    1. Täck 75 cm2 flaskor med kollagen (5 μg/cm2) (råttsvans) över natten (ON) vid rumstemperatur (RT) eller 2-3 h vid 37 °C, skölj med vatten och låt kolven torka.
    2. Odla HUVECs i tillväxtmedium (EBM-2, Endotel basal medel-2) kompletterad med glutamin (1x = 2 mM), antibiotisk-antimykotisk lösning (AA; 100 μg/mL streptomycin, 100 μg/ml penicillin och 0,025 μg/mL ammacin B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL hydrocortisone, 1 μg/mL hydrocortisone, 1 μg/mL ammahjärn B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL hydrocortisone, 1 μg/mL hydrokortison, 1 μg/mL hydrokortison, 1 μg/mL hydrokorraton, 1 μg/mL hydrokorraton, 1 μg/mL amma 10 μg/ml heparin) och 10% FCS (Fetal Calf Serum) under normala vävnadsodlingsförhållanden (37 °C, 5% CO2). Byt medium varannan dag tills cellerna når 70-80% sammanflöde.
    3. Tvätta de underkonfluentkulturerna med 5 ml HBSS (utan Ca2+ och Mg2+) och tillsätt 3 ml trypsin (0, 25% utspädd i HBSS (utan Ca2+ och Mg2+)).
      OBS: HBSS kan också ersättas med PBS.
    4. Inkubera cellerna vid 37 °C i 2 minuter (kontrollera mikroskopiskt om cellerna är lossnade och avrundade uppåt) och stoppa lösgörningsreaktionen genom att tillsätta 6 ml 10% FCS-medium (DMEM-F12 eller EBM-2, 10% FCS).
    5. Centrifugera cellfjädringen vid 250 x g i 5 min vid RT och kassera supernatanten.
    6. Suspendera cellerna i tillväxtmedium och frö i 75 cm2 flaskor eller odlingsrätter.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, mänskliga bröst adenocarcinom celler) subkultur
    1. Odla humana bröstcancer cellinjer i 75 cm2 flaskor i tillväxtmedium (DMEM/F12 medium kompletterat med en kommersiell glutamin (1x), antibiotisk-antimykotisk lösning (AA; 100 μg/mL streptomycin, 100 μg/ml penicillin och 0,025 μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadsodlingsförhållanden ( 0, 025 μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadsodlingsförhållanden ( 0, 025 μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadsodlingsförhållanden ( 0, 025 μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadskulturförhållanden ( 0, 025 μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadsodlingsförhållanden ( 0, 025 μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadsodlingsförhållanden ( 0, 025 μg/ml akomcin B) och 10% FCS under normala vävnadsodlingsförhållanden ( 0, 025 μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadsodlingsförhållanden ( 0,025μg/ml ahotericin B) och 10% FCS under normala vävnadskulturförhållanden ( 0, 0 Byt medium var 2-3 dag.
    2. Tvätta subkonfluentcellkulturerna (70-80% sammanflöde) med 5 ml HBSS (utan Ca2+ och Mg2+) och tillsätt 3 ml trypsin (0,5% utspädd i HBSS (utan Ca2+ och Mg2+) vid 37 °C i 5 min (kontrollera mikroskopiskt att cellerna är lossnade).
      OBS: HBSS kan också ersättas med PBS.
    3. Tillsätt 8 ml 10% FCS-medium för att stoppa lossningsreaktionen, centrifugera vid 250 x g i 5 min vid RT och kassera supernatanten.
    4. Häng pelleten i tillväxtmedium och tallrik i 75 cm2 flaskor eller odlingsfat.

2. Sfäroidbildning

  1. Platta 5 x 105 celler/ml (HUVECs och MCF-7) i en 3,5 cm rund skål och kultur i 48 timmar.
  2. Behandla eller transfektera de pläterade cellerna i 24 timmar eller efter önskemål.
  3. Valfritt steg som utförs i 96-brunns U-bottenplatta: Tvätta cellerna med 1 ml HBSS (Ca2+ och Mg2+) och fläck HUVECs med ett blått färgämne (0,5 μg/ ml) och MCF-7 celler med ett grönt färgämne (0,5 μM) utspädd i respektive tillväxtmedium och placera i en 37 °C och 5% CO2 inkubator i 30-4 min.
  4. Tvätta cellerna med 1 ml HBSS (utan Ca2+ och Mg2+), tillsätt 1 ml enzymatiskt löstagageageage (0,25% trypsin för HUVEC och 0,5% trypsin för MCF-7) till varje rund skål med en P1000-pipett och inkubera sedan i 2-5 min tills cellerna är lossnade.
  5. Samla varje celltyp separat i ett 5 ml polystyrenrör med rund botten och tillsätt 1 ml 10% FCS-medium med en P1000-pipett för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Centrifugera cellfjädringarna vid 250 x g i 5 min.
  6. Aspirera försiktigt supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml steroidfritt medium (EBM-2, glutamin, antibiotikum-antimykotiskt, 0,4% FCS sf (kol-strippad)).
    OBS: Steroidfritt medium kan ersättas med normalt tillväxtmedium.
  7. Använd 100 μL av varje celluppskov utspädd med 10 ml Diluent II (se Materialtabell)för att bestämma det totala cellantalet och beräkna mängden behandlingsmedium (EBM-2, glutamin, antibiotika-antimykotiskt, 0,4% FCS sf, fordon/behandling) som behövs för att få en cellavstängning på 5 x 103 celler/ml eller 3,4 x 10celler/ ml per celltyp.
    1. Antal celler
      1. Slå på maskinen och spola genom att trycka på funktions- och startknapparna (inställning S3), med Diluent II-lösning i en cellräknare.
      2. Använd konfigurera S4 och tryck på Start för att mäta tomrummet med en ny Diluent II-lösning.
      3. Ändra scintillationsflaskan med 100 μL cellfjädring i 10 ml Diluent II-lösning och mät proverna: ställ in S4 och tryck på Start.
      4. Notera antalet celler per ml på den digitala displayen.
        OBS: Cellräkning kan också utföras med andra manuella eller automatiska system: Hemocytometernätlinjer, ljusspridningscellräkningsteknik, elektrisk impedans, bildbaserade system med cellfärgning, t.ex. trypan blå.
    2. 96-väl U-bottenplattor
      1. Förbered 5 ml av varje cellfjädring (5 x 103 celler/ml) och blanda dem för att få en slutlig volym på 10 ml i förhållandet 1:1.
      2. Använd en manuell upprepande pipett för att pipett ut 100 μL av cellupphängningen i varje brunn på 96-brunnens U-bottenplattor.
      3. Placera plattan i en inkubator under normala vävnadsodlingsförhållanden och kontrollera om sfäroider bildas efter 48 h.
      4. Valfritt steg: Ta bilder av sfäroiderna (40x) med hjälp av ett fluorescensstereomikroskop.
        OBS: Denna metod genererar 96 sfäroider (en sfäroid/brunn) efter 48 h (område 1-2 pixel2), och den används vanligtvis för tillväxtstudier.
    3. Hängande droppe
      1. Blanda cellavstängningarna (3,4 x 105 celler/ml) i ett 1:1-förhållande för att få en slutlig volym på 2 ml.
      2. Använd en P20-pipett för att så cellblandningen i form av 15 μL droppar på det inverterade locket på en 10 cm Petriskål.
      3. Vänd locket med dropparna och tillsätt 5 ml basmedium (EBM-2) i botten av skålen för att undvika avdunstning av dropparna.
        OBS: Den här metoden genererar en sfäroid/droppe efter 48 h. Se till att dropparna är tillräckligt åtskilda från varandra, så att de inte smälter samman när locket byts ut. Använd mer än en 10 cm Petriskål om det behövs.

3. Spheroid tillväxtstudie

  1. Platta 100 μL HUVECs och MCF-7 cellblandning (5 x 102 celler/brunn) i 96-brunns U-bottenplattor och placera dem i inkubatorn.
  2. 48 h efter plätering, kontrollera om sfäroider bildas med ett inverterat mikroskop (Ljust fält). Ta bilder (minst sex bilder per behandling, 40x) vid 96 h kultur.
  3. Öppna bilderna med hjälp av en bildbehandlingsprogramvara och bearbeta bilden till 300 pixel/tum och spara bilden som en tiff-fil.
  4. Ladda ner ImageJ-programvaran och öppna den. Klicka på alternativet Arkiv och gå till Öppna.
  5. Konvertera de områden som är av intresse till mättade svarta områden på ett enhetligt sätt för att ha en binär bild (svartvitt). För detta väljer du alternativet Bild, väljer Du Skriv | 8-bitars. Bilden är svartvit.
  6. Använd Freehands markeringsverktyg för att rita sfäroidernas kant.
  7. Om du vill beräkna intresseområdet och separera objektet eller förgrundspixlarna från bakgrundspixlarna använder du tröskelvärdesfunktionen: Välj alternativet Bild, välj Justera och klicka på Tröskelvärde.
  8. Nu öppnas ett popup-fönster för tröskelvärde. Den översta stapeln anger det lägsta tröskelvärdet: ange värdet till noll. Den nedre stapeln anger det maximala tröskelvärdet: flytta stapeln tills intresseområdet blir helt rött.
    OBS: Om färgen inte är röd väljer du Röd i fönstret Tröskelvärde.
  9. Gå till Analysera | Ange mått och välj Område och Omkrets.
  10. Om du vill mäta intresseområdet väljer du alternativet Analysera och använder verktyget Analysera partiklar. I fönstret Analysera partiklar anger du Storlek som mått (0,00003-Infinity eller 3-Infinity, beroende på sfäroidernas storlek), väljer Sammanfatta och Visa resultat. Klicka sedan på OK.
  11. Resultaten visas i ett diagram. Kopiera mätningarna till ett kalkylblad för att analysera data.
    Området beräknas som antalet totala pixlar. använd totalarealen för beräkning.

4. Spheroid immunohistochemistry studie

  1. Provberedning
    1. Plätera cellblandningen av HUVECs och MCF-7 (5 x 103 celler/brunn) i 96-väl U-bottenplattor i HUVEC tillväxtmedium för 96 h.
    2. Samla cirka 50 sfäroider i ett 1,5 ml rör med en skärspets av en P200 μL-pipett; låt dem sätta sig till botten av röret genom gravitation och kassera sedan supernatanten.
    3. Fixera sfäroiderna med 500 μL 4% PFA i 1 h, RT.
    4. Koka 2% Nobel Agar-lösning i PBS med en kokplatta med magnetomrörare i 3-5 min för att lösa upp agarospulvret helt och svalna till cirka 60 °C.
    5. Ta bort PFA med en P1000-pipett, tvätta sfäroiderna med 500 μL PBS och låt dem sedimentera. Kasta supernatanten.
    6. Rör försiktigt 600 μL agaroselösning i 1,5 ml-röret med sfäroider och placera röret omedelbart i en centrifug med en horisontell rotor vid 177 x g i 2 min.
    7. Tillsätt en kort sträng i mitten av agaroslösningen för att enkelt ta bort kontakten från röret.
    8. Stelna agarospluggen på is eller vid 4 °C. Tillsätt 500 μL PBS i 1,5 ml-röret för att undvika uttorkning av pelleten.
      OBS: Proverna är klara för efterföljande uttorkning, paraffininbäddning, sektionering, överföring till mikroskopbilderna och IHC-färgning (utförs av Sophistolab).
  2. Bildförvärv och bildbehandling
    1. Skaffa bilder av sfäroidsektioner med hjälp av ett stereomikroscope.
    2. Spara tre bilder för varje exempel när .jpg filer.
    3. Öppna ImageJ-programvaran. Öppna JPEG-bilden, klicka på Arkiv och sedan på Öppna.
    4. Välj Färg- och färgdekonvolution i bildalternativet.
    5. Välj H DAB-vektorer i fönstret Färgdekonvolution 1.7 så visas de tre bilderna.
      OBS: De tre bilderna är: Färg 1 representerar endast Hematoxylinfärgningen (blå/ lila), och färg 2 representerar endast DAB-färgningen (brun). Färg 3 behövs inte för bildanalysen med två färgningar.
    6. Välj fönstret Färg 1 och ange tröskelvärde: gå till Bild | Justera och klicka på Tröskelvärde. Fönstret Tröskelvärde visas.
    7. Lämna minimitröskelvärdet inställt på noll och justera det maximala tröskelvärdet för att ta bort bakgrundssignalen utan att påverka den sanna signalen. Klicka på Använd.
      1. Mätning av område
        1. Klicka på Analysera, välj Ställ in mätning. Välj Område, Medelvärde grå värdeoch Min och Max grå värde och klicka på OK för att bekräfta.
        2. Mät kärnans storlek med alternativet Analysera och välj sedan Mät.
          I resultatfönstret anges bildens namn (Etikett), bildens storlek (område), den genomsnittliga pixelintensiteten för IHC-bilden (Medelvärde) och de lägsta och högsta grå värdena (Min, Max). Använd medelvärdet för beräkning.
        3. Upprepa steg 4.2.6-4.7.1.2 för fönstret Färg 2 (och färg 3 om det finns dubbel färgning).
      2. Cellkvantifiering
        1. Klicka på Process, välj alternativet Binär och välj Vattendelare för att separera celler.
        2. Gå till Analysera och klicka på Analysera partiklar. I popup-fönstret Analysera partiklar ställer du in cellernas storlek så att ospecificerade partiklar utesluts. Klicka sedan på listrutan i alternativet Visa och välj Dispositioner. Klicka sedan på OK.
        3. Upprepa steg 4.2.6-4.2.7 och cellkvantifieringssteg (avsnitt 4.2.7.2) för fönstret Färg 2 (och färg 3 om det finns dubbel färgning).
          OBS: Nu visas tre fönster: 1) Sammanfattande resultat (antal antal celler räknade, total yta, genomsnittlig storlek, % av yta och medelvärde), 2) Resultat (respektive till de celler som räknas) och 3) Ritfönster (avbildad bild av de celler som räknas).

5. Levande/ död färgning i Spheroids

  1. Förbered 4 mM lagerlösningar av Calcein AM i DMSO (fläckar levande celler gröna) och 2 mM Ethidium homodimer i DMSO (fläckar döda celler röda) i 1,5 mL rör.
  2. Beräkna den mängd lösning som krävs för att tillsätta 10 μL/brunn av en blandning av Calcein AM och Ethidium homodimer utspädd 1:50 i EBM-2.
  3. Tillsätt färgblandningen till sfäroiderna och placera plattan i inkubatorn under standardvävnadskulturförhållanden i 30-60 min.
  4. Skaffa bilder (40x) med stereomikroskopet Fluorescence.

6. Spheroids protein- och RNA-isolering

  1. Förbered cellupphängningar vid 3,4 x 105 celler/ml per celltyp, blanda dem i ett förhållande av 1:1 och så cellblandningen med en P20-pipett i form av 15 μL droppar på locket på en 10 cm Petriskål. Vänd locket och placera det i inkubatorn under standardvävnadskulturförhållanden i 96 h.
  2. Använd 5-6 ml PBS för att samla sfäroider i ett 15 ml polystyrenrör med 5 ml sterila polystyrenpipetter.
    OBS: Det är också möjligt att använda 15 ml koniska rör.
  3. Centrifugera sfäroidernas suspension vid 250 x g i 5 minuter och aspirera sedan försiktigt på supernatanten.
  4. Tillsätt 500 μL trypsin (100%) och pipettera upp och ner med en P1000 pipetter i 30 s för att disaggregera sfäroider, vilket ger en cellfjädring.
  5. Neutralisera trypsin med 10% FCS medium, centrifugera rören vid 250 x g i 5 min och aspirera supernatanten.
  6. Enligt tillverkarens protokoll (specifikt kit för DNA-fri RNA-isolering), använd 300 μL RNA-lysbuffert för att lysa cellpelleten.
    OBS: Lysis buffert kan också läggas direkt till intakta sfäroider (inget trypsinsteg krävs) för att extrahera RNA. Tillsätt 300 μL av lysbufferten till de pelleterade sfäroiderna, placera rören i is och triturera 10 gånger med en P200-pipett. Isolera därefter RNA enligt ovan. Sfäroid dissociation kan behövas om RNA återhämtning är låg på grund av matris störningar.
  7. Alternativt kan du använda 70 μL av Lysis-bufferten för proteinisolering. Homogenisera för 2-4 s genom ultraljudsbehandling och bestäm proteinkoncentrationen enligt tillverkarens protokoll med hjälp av en BCA Assay Kit.
    OBS: För protein isolering, pelleted sfäroider kan lyseras direkt i lys buffert följt av ultraljudsbehandling. Använd 25 μg totalt protein för att utföra western blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sfäroider modell med epitelial och endotel och endotel co-kulturer krävs att nära efterlikna in vivo villkor för bröst tumörer för in vitro experiment. Schemat i figur 1 visar protokollet för att bilda sfäroider med epitelceller för bröstcancer och kärl- eller lymfatiska endotelceller (figur 1). Varje celltyp sås separat i en 3,5 cm rund skål och behandlas med tillväxtstimulatorer/hämmare eller transfekteras med oligonukleotider med lipofectamin. De sammanflöde monoskikten av epitel- eller endotelceller skördas efter trypsinisering, tvättas och blandas i ett 1: 1-förhållande. Cellerna pläteras därefter i 96-brunns U-bottenplattor(figur 1A) eller på det inverterade locket på en rund odlingsskål med 10 cm diameter för att underlätta hängande droppkultur (figur 1B). Strax efter sådd visas cellerna som platta, täta cellark längst ner i varje brunn eller droppe, och därefter aggregeras de med tiden (24-48 h), vilket bildar intakta sfäroider vid 48 h. För att förhindra skador på de löst formade cellaggregaten får plattorna inte störas i minst 24 timmar.

I U-bottenplattor resulterade sådd av MCF-7 celler, men inte endotelceller eller lymfatiska celler, i sfäroidbildning efter 48 h (figur 2A, B,respektive). Dessutom resulterade sådd av MCF-7 plus endotelceller eller lymfceller vid ett 1: 1-förhållande också i sfäroidbildning(figur 2C, D). För att validera sfäroider som modell för att studera tumörtillväxt mättes/kvantifierades tidsberoende förändringar i sfäroid storlek som svar på tillväxtstimulerande lösning och jämfördes med de obehandlade kontrollerna (figur 2). Fotomikrografer i figur 2E visar tidsberoende (24-120 h) sekventiell tillväxt av en representativ MCF-7 sfäroid. Linjediagrammet i figur 2F visar förändringen i området mcf-7 sfäroider över tid när de behandlas med eller utan tillväxtstimulator. Sfäroidstorleken ökade från ~ 100 μm till ~ 200 μm under 5 dagar; Dessutom observerades en ökad tillväxttakt hos sfäroider som behandlats med tillväxtstimulatorn (figur 2F). Eftersom långtidsbehandling (168 h) resulterade i minskad MCF-7 livskraft, potentiellt på grund av hypoxiska tillstånd i mitten av sfäroiderna (figur 3), studerades 3D struktur tillväxt till 96 h. Spheroids bildas med MCF-7 celler och HUVECs visar ett lägre antal döda celler vid 168 h jämfört med sfäroider bildas med MCF-7 ensam.

I de första experimenten observerades endast en liten tillväxt i sfäroidernas storlek efter 4 dagars kultur. Det var en hypotes att detta kan bero på det höga antalet celler som såddes för att bilda sfäroider. I U-botten kulturplattorna kunde tillväxten av sfäroider ha begränsats av brunnens konkava form. Eftersom tillväxten var beroende av det ursprungliga antalet celler som såddes, användes olika celltal för att bilda sfäroider för att testa och fastställa förhållanden som skulle vara optimala för att övervaka sfäroid tillväxt. Som visas i figur 4tyder resultaten på att för sfäroid tillväxtstudier var sådd av 500 celler/brunn för att bilda sfäroider tillförlitlig och reproducerbar för övervakning av sfäroidernas tillväxt i 4-6 dagar som svar på tillväxtmodulerande faktorer. Spheroids som var mest lämpliga för histologiska eller immun-histologiska observationer erhölls på dag 4, efter sådd av 5 x 103 celler/brunn. Samma initiala koncentration användes för cellprotein eller RNA extrakt. Att öka den ursprungliga cellkoncentrationen med mer än 7,5 x 103 celler/brunn förbättrade inte sfäroidbildningen, och cellerna aggregerade inte ordentligt och antog oregelbundna strukturer(figur 4).

För att utvärdera cell sammansättning, spridning och apoptos status, histologiska delar av sfäroider bildas med bröstcancer celler plus endotel celler undersöktes med H&E och Ki67 (utspädning 1:300) och Cleaved Caspase-3 (utspädning 1:500) antikroppar. Processen för slutlig provberedning kräver omsorg/uppmärksamhet och precision. Figur 5A visar arbetsflödet för insamling och införlivande av sfäroider i agaros för sektionering. Fotomikrografer i figur 5B-C visar skillnaden i MCF-7 sfäroidbildning i närvaro(figur 5B) och frånvaro (figur 5C) av lipofectamin (0,17% slutlig koncentration), ett vanligt transfekteringsmedel. Ljusa fält mikroskopiska bilder av histologiska sektioner visar en cirkulär, kompakt struktur av en homogen blandning av två celltyper (figur 5D-G). Sfäroidernas struktur och formen på deras celler visade inga avvikelser efter transfektion med kontroll oligonucleotides i närvaro av Lipofectamine (figur 5D). Dessutom distribuerades celler som uttrycker den proliferative markören, Ki67, homogent i sfäroiderna; Emellertid observerades en ring av proliferative celler också på ytan av sfäroiderna (figur 5E). Cleaved Caspase-3 färgning visade apoptotiska celler efter 4 dagars kultur (figur 5F). Histologiska avsnitt är användbara för att utvärdera fördelningen av epitelial och endotel celler i sfäroider med hjälp av specifika markörer. Med CD31 som en specifik markör för endotelceller är det möjligt att bestämma deras fördelning inom 3D-strukturen. Eftersom alla celler är färgade med Hematoxylin (blå färgning av cellens kärna), kan beräkningen av CD31-uttrycket ge området av sfäroiderna som innehåller endotelceller efter behandling eller transfektion (protokoll avsnitt 4.2.7.1.). Dessutom, genom att utföra en dubbel färgning analys, är det möjligt att ha ännu mer information, till exempel, som visas i figur 5G, CD31 fläckar endotelceller (röda) och Ki67 fläckar proliferativa celler (brun). Enligt protokollet avsnitt 4.2.7.2, figur 5G visade att 55% är epitelial celler, 45% är endotel celler och 25% av cellerna förökar sig.

Strukturen hos sfäroider kan också studeras med hjälp av immunofluorescensanalys efter märkning av celler med levande färgämnen. Confluent 2D kulturer av HUVEC och MCF-7 celler var separat färgade med blå (HUVEC) och gröna (MCF-7) färgämnen. Därefter samlades de färgade cellerna och blandades vid ett 1: 1-förhållande och såddes i brunnar för sfäroidbildning. Bilder av fluorescerande celler färgade togs omedelbart efter sådd(figur 6A) och efter 3 dagars kultur (figur 6B). I syfte att bedöma andelen levande och döda celler färgades 4-dagars gamla sfäroider med kalcein-AM (grön) och med etidium homodimer (röd) (figur 6C). Spheroids bildas med MCF-7 och HUVECs kunde inte framgångsrikt frysas/bevaras med hjälp av standardprotokollen för frysning av celler (tillväxtmedium kompletterat med 10% DMSO och 10% FCS) för frysning av celler. I frysta och tinade sfäroider var rupturing av cellaggregat och ökad förlust av cell livskraft uppenbart. Den representativa bilden i figur 6D visar en nyupptinad sfäroid fläckad för döda och levande celler. Det visar att sfäroider är mycket känsliga för frysförhållandena.

Efter 5 dagars kultur under experimentella förhållanden var lys av cirka 100 sfäroider nödvändigt för att samla tillräckligt med protein (~ 3 μg/mL) eller RNA (~ 60 ng/μL) för analys. Figur 7 representerar ett arbetsflöde från sfäroider samling (genereras med hängande droppar metoden) till celllys för protein extraktion för att utföra västra blotting eller RNA isolering för framtida Microarray analyser eller analys av RT-PCR. Isolering av RNA/DNA från en heterogen cellpopulation i en sfäroid för mikroarrayanalys kan ge viss användbar information. För att identifiera viktiga cellspecifika mekanismer eller cell-cellinteraktioner kan dock de sfäroida cellerna separeras efter enzymatisk (trypsin eller accutase) dissociation, med hjälp av FACS-analys och RNA från specifika celler som används för mikroarrayanalys. Dessutom kan antibiotikaresistenta cellinjer (t.ex. genom användning av EGFP och/eller puromycinresistens cellinjer) användas i sfäroider för att ta itu med rollen för en viss celltyp av cell-cellinteraktion. Dessutom kan gendämpningsverktyg användas för att konstruera cellerna för att ta itu med specifika cell-cellinteraktionsproblem.

Figure 1
Bild 1: Arbetsflöde för sfäroidbildning. MCF-7 och HUVEC eller LEC celler i 2D kulturer odlas separat och samlas in efter olika önskade behandlingar. Spheroids genereras därefter genom direkt blandning av celler i (A) 96-brunns U-bottenplattor, som främjar bildandet av 3D-struktur genom cell-till-cell-aggregering, eller genom att använda (B) hängande droppkultur som stöder sfäroidbildning via gravitationskraft. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Sfäroidbildning och utveckling över tid. Bilder visar bildandet av en sfäroid av MCF-7 celler(panel A), bristen på sfäroidbildning av endotel- eller lymfatiska celler (HUVECs; (Panel B)) pläterad med samma densitet och sfäroidbildning av MCF-7-celler plus HUVECs eller LECs blandade i ett 1:1-förhållande(panel C,D). Också avbildad är tillväxten i storlek av en sfäroid över tiden (24 h, 48 h, 72 h, 96 h och 120 h). Denna sfäroid bildades av en blandning av MCF-7 plus HUVECs i ett 1:1 förhållande och såddes med en densitet av 500 celler/brunn av en 96-väl U-bottenplatta (Panel E), (skala bar = 200 μm, 40x). Linjediagram (panel F) visar den tidsberoende tillväxten av kontroll (CTR) jämfört med tillväxtstimulerade (behandling) sfäroider. Spheroids områden mättes och jämfördes mellan obehandlade och behandlade sfäroider. Resultaten representerar ± SEM, *** p < 0,001 jämfört med respektive kontroll. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Sfäroider långsiktig kultur och livskraft. Fotomikrograf visar cellviabilitet i sfäroider som bildas med MCF-7-celler enbart vid 96 h (panel A) och 168 h (panel C), medan panel B och D visar cellviabilitet i sfäroider gjorda med MCF-7 plus HUVECs (1:1-förhållande) vid 96 h (panel B) och 168 h ( panelD) (skalstång = 100 μm). Cellerna färgades med Calcein (röda, döda celler) och Ethidium homodimer (gröna, levande celler). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Cellsåddtäthet och tidsberoende tillväxtprofil för MCF-7 plus HUVEC-sfäroid. HUVECs och MCF-7 celler blandas vid ett 1: 1 förhållande såddes vid ökande densiteter (102-104 celler/brunn), och tillväxten av sfäroider övervakades över 24-96 h. Mikroskopiska ljusfält bilder togs (skala bar = 200 μm, 40x) för att bedöma sfäroid tillväxt över tid. Celler med en densitet av 500 celler/väl gav optimal storlek för att studera sfäroid tillväxt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Sfäroid inbäddning för sektionering och histologisk färgning. Efter paraffin inbäddning av sfäroider i en agarose plugg och avsnitt av paraffin block, proverna användes för standard histologiska färgning. Panelerna B och C visar representativa MCF-7 plus HUVEC-sfäroider behandlade utan och med Lipofectamine 2000 (skalstång = 200 μm, 40x). Paneler D-G visar representativa bilder av sfäroidsektioner färgade med specifika markörer. Panel D visar sfäroider färgade med hematoxylin-eosin för att bedöma sfäroid struktur (skalstång = 100 μm). Färgning i panel E visar prolifererande celler positivt färgade med Ki67. Panel F visar apoptotiska celler i en sfäroid positivt färgade med Cleaved Caspase-3 (skalstång = 50 μm). Panel G avbildar sfäroidsektioner med dubbel färgning: CD31 (endotelcellsmarkör) och Ki67 (proliferativ markör) (skalstång = 100 μm). Sektionering av sfäroider och färgning utfördes av Sophistolab (info@sophistolab.ch). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Fluorescensbilder av MCF-7/HUVEC-sfäroider som visar cellfördelning och livskraft. Panelerna A och B visar representativa sfäroider med HUVECs färgade med ett blått färgämne och MCF-7 celler färgade med ett grönt färgämne. Lokaliseringen av HUVEC och MCF-7 inom sfäroiden varierar omedelbart efter sådd (A) och efter sfäroidbildning (B) (skalstång = 250 μm). Panelerna C-D visar sfäroider färgade med Calcein/Ethidium Homodimer för att identifiera levande (gröna) och döda celler (röda) i 3D-strukturerna i normalt odlingsförhållande (C) och efter frysning (D) (Skalstång = 100 μm). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Schematisk representation av sfäroid samling för biokemisk analys. Tecknad film som visar systemet för att skörda sfäroider, separera eller frigöra celler, och suspendera dem i lyslösning för proteinanalys eller RNA-extraktion. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jämfört med 2D-cellkulturer är revolutionerande 3D-sfäroidkulturteknik ett bättre och kraftfullare verktyg för att rekonstruera ett organs mikromiljö, cellcellsinteraktioner och läkemedelssvar in vitro. Detta är det första protokollet som beskriver bildandet av sfäroider från multicellulära (epiteliella och endotel) cellinjer för bröstcancerforskning. Detta protokoll säkerställer sfäroidal 3D tillväxt av sfäroider i upp till 5 dagar, och sfäroider kan undersökas efter paraffin inbäddning, avsnitting och histologiska färgning. Intressant nog uttrycker de cellulära elementen inom sfäroiden fortfarande receptorer som främjar celltillväxt och är lyhörda för proliferativa och aptoptotiska stimuli. Det beskrivna protokollet genererar tillräckligt biologiskt material för protein- eller RNA/DNA-analys. Ovanstående samkultursystem, som lätt kan uppnås under laboratorieförhållanden och till låg kostnad, kan vara en fördel för framtida tillämpningar, särskilt inom bröstcancerbehandling och för läkemedelskänslighetstestning. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på olika epitel- och endotelcellstyper.

Det är extremt svårt att efterlikna in vitro en komplex vävnad som finns in vivo. Detta beror på att in vivo vävnader består av många interagerande komponenter, inklusive nerver, blodkärl, mesenkym och immunceller30,42. Syftet med detta protokoll är att övervinna några av dessa begränsningar genom att använda ett 3D-samkultursystem med två olika celltyper för att närma sig det faktiska tumörtillståndet. Här har sfäroider bildats med epitelial tumör celler i kombination med endotel celler eller lymfatiska celler att efterlikna in vivo situationen så mycket som möjligt, inklusive cell-cell interaktioner, mottaglighet för apoptotiska faktorer som släpps ut i de intercellulära utrymmena av döende celler och hypoxic villkor i mitten av sfäroiderna. Detta protokoll har optimerats för testning av cellulära svar på tillväxtfaktorer, signalfaktorer och hormoner, som snabbt aktiverar signalkaskader och målgen transkription och stimulerar proteinuttryck och transport30,31. I sfäroider, men inte in vivo, kan reaktioner från tumörceller på stimuli bedömas snabbt och ofta.

I den aktuella studien verkar endotelceller i sfäroiderna inte bilda kapillärliknande strukturer. Eftersom endotelceller har visat sig bilda kapillärer när de pläteras vid låg densitet och monoskikt vid hög densitet, är det möjligt att sänka FÖRHÅLLANDET MELLAN MCF-7 och endotelceller kan leda till kapillärbildning inom sfäroiderna. Alternativt kan tillsats av specifika matrisproteiner eller matrigel främja kapillärbildning. Bristen på kapillärliknande struktur i sfäroiden späder inte ut fördelen med MCF-7 plus endotelceller jämfört med MCF-7-celler i sig, eftersom de faktorer som frigörs av MCF-7-celler kan främja endotelcellsproliferation och vice versa; sådana interaktioner skulle förbli oupptäckta i MCF-7 endast sfäroider.

Flera studier har visat att 5 x 103 celler/brunn var lämplig koncentration för att så celler bildar sfäroider43,44,45,46,47; I 96-brunn U-bottom plattor, detta antal celler begränsa den samordnade tillväxten av sfäroider i experimentella förhållanden. Därför är det i varje ny studie, för varje ny celltyp, viktigt att övervaka tillväxten av 3D-systemet efter läkemedelsbehandling, för att bestämma effekterna av behandlingen på sfäroidstorlek.

Begränsningen av det nuvarande protokollet är att kulturen hos tidigare bildade sfäroider inte kan fortsätta efter frysning och upptining med den klassiska DMSO-metoden. Faktum är att när de tinades var de flesta cellerna döda. Vitrifikation kan visa sig vara ett alternativ till att hålla cellerna vid liv48.

Noggrann uppmärksamhet på tekniska detaljer är nödvändig för att undvika fel och producera och underhålla välformade sfäroider. En utmaning är provberedningen för immunstainering (avsnitt 4.1). För att underlätta överföringen genom pipettering av sfäroiderna till 1,5 ml-röret är det viktigt att använda en P200-spetsskärning med sax så att hålets område är större än själva sfäroiderna. Annars kan överföringen förstöra sfärerna. En annan utmaning är hur man aspirerar mediet efter att sfäroiderna har satt sig till botten av ett provrör. I detta avseende är det bättre att använda en P1000-pipett istället för en vakuumpump för att undvika strävan efter sfäroider. Ett viktigt och känsligt steg i beredningen av sfäroiderna för sektionering är att lägga till agaros till de pelleterade sfäroiderna. Sfäroiderna, när de är upphängda i agaros, måste pelleteras snabbt till botten av mikrofugeröret med horisontell centrifugering vid rumstemperatur och innan agarosen polymeriseras.

Sammantaget ger tvåcells sfäroiden gjord av MCF-7 och endotelceller ett livskraftigt alternativ för att undersöka cell-cellinteraktioner och mekanismer som driver tillväxten av antingen cancerceller eller endotelceller i en tumör. Sfäroiderna kan fungera som en modell för att bedöma effekten av terapeutiska medel som riktar sig mot tumör- eller cancertillväxt. Viktigt, denna två-cells modell kan ytterligare improviseras för att inkludera andra celltyper som är relevanta i tumör tillväxt. I detta sammanhang kan fibroblaster som utgör 80% av brösttumör massa inkluderas för att bilda en MCF-7, endotelceller och fibroblast sfäroid. Dessutom kan gendämpning och genetiskt konstruerade celler användas för att ta itu med rollen som cellcellsinteraktion, hormonreceptorer (östrogen / progesteron), tillväxtfaktorer och signalvägar på tumör / cancertillväxt samt för att testa effekten av nya anti-cancermolekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 till RKD och National Institute of Health grant DK079307 till EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).

Tags

Cancerforskning nummer 173 bröstcancer tumör sfäroider neovaskulärisering lymfkärl tumörtillväxt endotelceller epitelceller cellproliferation
Bröst epitelial och endotelcellssfäroider som en potentiell funktionell <em>in vitro-modell</em> för bröstcancerforskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azzarito, G., Szutkowska, M. E.,… More

Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter