Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Abstract

Borstkanker is de belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen. De groei van borstkankercellen en hun daaropvolgende metastase is een belangrijke factor voor de progressie ervan. Hoewel de mechanismen die betrokken zijn bij het bevorderen van de groei van borstkanker intensief zijn bestudeerd met behulp van monoculturen van borstkankercellen zoals MCF-7-cellen, is de bijdrage van andere celtypen, zoals vasculaire en lymfatische endotheelcellen die nauw betrokken zijn bij tumorgroei, niet diepgaand onderzocht. Cel-cel interactie speelt een sleutelrol in tumorgroei en progressie. Neoangiogenese, of de ontwikkeling van bloedvaten, is essentieel voor tumorgroei, terwijl het lymfestelsel dient als een portaal voor migratie van kankercellen en daaropvolgende metastase. Recente studies leveren bewijs dat vasculaire en lymfatische endotheelcellen de groei van kankercellen aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Deze observaties impliceren een behoefte aan het ontwikkelen van in vitro modellen die de groeiprocessen van borstkanker in vivorealistischer zouden weergeven. Bovendien vereisen beperkingen in dieronderzoek de ontwikkeling van ex vivo modellen om de betrokken mechanismen beter te verduidelijken.

Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van borstkanker sferoïden samengesteld uit zowel borstkankercellen (oestrogeen receptor-positieve MCF-7 cellen) en vasculaire en /of lymfatische endotheelcellen. Het protocol beschrijft een gedetailleerde stapsgewijze aanpak bij het maken van dual-cell sferoïden met behulp van twee verschillende benaderingen, hangende druppel (gouden standaard en goedkoop) en 96-goed U-bodemplaten (duur). Er worden diepgaande instructies gegeven voor het subtiel oppakken van de gevormde sferoïden om de groei te volgen door microscopische dimensionering en het beoordelen van de levensvatbaarheid met behulp van dode en levende celkleuring. Bovendien worden procedures om de sferoïden te fixeren voor sectie en kleuring met groeispecifieke antilichamen om groeipatronen in sferoïden te differentiëren, afgebakend. Daarnaast worden details verstrekt voor het bereiden van sferoïden met getransfecteerde cellen en methoden om RNA te extraheren voor moleculaire analyse. Kortom, dit artikel biedt diepgaande instructies voor het voorbereiden van meercellige sferoïden voor borstkankeronderzoek.

Introduction

Het gebruik van dieren voor experimenten heeft beperkingen. Dierstudies kunnen ziekteprogressie bij mensen niet nauwkeurig nabootsen en dieren en mensen hebben geen identieke reacties op pathogenen. Bovendien, beperkingen in dierproeven als gevolg van bezorgdheid over dierenleed en ethische problemen1,2 onderzoeksprogramma's steeds meer beperken. In vitro er zijn op grote schaal systemen ontwikkeld om het gebruik van dieren te omzeilen; bovendien heeft het gebruik van menselijke cellen in vitro modellen die relevanter zijn voor het pathofysiologisch en therapeutisch onderzoek. Conventionele monolayer (2D) celculturen worden veel gebruikt omdat ze menselijke weefsels tot op zekere hoogte nabootsen. 2D-monoculturen slagen er echter niet in om menselijke organen na te bootsen en 2D-monoculturen zijn niet in staat om de complexe micro-omgeving van de oorspronkelijke organen te simuleren en de in vivo situatie3,4,5,6. Bovendien kunnen medicamenteuze behandelingen in monolaagcelculturen gemakkelijk alle cellen vernietigen / beschadigen. Belangrijk is dat sommige van deze beperkingen kunnen worden overwonnen door over te schakelen naar meerlaagse driedimensionale (3D) celculturen7,8. In feite is aangetoond dat 3D-kweekmodellen de cellulaire structuur, lay-out en functie van cellen in primaire weefsels beter weerspiegelen. Deze 3D-culturen kunnen worden gevormd met behulp van een verscheidenheid aan cellijnen, vergelijkbaar met een functioneel orgaan. Er zijn inderdaad twee modellen van 3D-culturen. Eén model produceert sferoïden van geaggregeerde cellen die clusters vormen en deze reorganiseren in bollen (steigervrije modellen). De tweede levert organoïden op, die een complexere structuur hebben en bestaan uit combinaties van meerdere orgaanspecifieke cellen, die worden beschouwd als een miniatuurversie van organen9,10. Hierdoor vertegenwoordigen 3D-kweeksystemen een innovatieve technologie met veel biologische en klinische toepassingen. Zo hebben sferoïden en organoïden tal van toepassingen voor ziektemodellering en studies met betrekking tot regeneratieve geneeskunde, geneesmiddelenscreening en toxicologische studies6,11,12,13,14,15. Kankerverwekkende sferoïden, afgeleid van 3D-technologie, recreëren de morfologie en het fenotype van relevante celtypen, bootsen de in vivo tumor micro-omgeving, en model cel communicatie en signalering routes die operationeel zijn tijdens de ontwikkeling van de tumor16,17,18. Bovendien, om het begrip van kankerbiologie te verbeteren, kunnen tumorsferoïden / organoïden ook worden gebruikt om een potentiële patiëntspecifieke antikankertherapie (gepersonaliseerd) te identificeren en de werkzaamheid, toxiciteit en langetermijneffecten ervan te beoordelen19,20,21,22. Sferoïden hebben prominente mogelijkheden geopend om pathofysiologie, ziektemodellering en medicijnscreening te onderzoeken vanwege hun vermogen om cellulaire en driedimensionale weefselarchitectuur te behouden, het vermogen om de in vivo situatie, en de cel-cel interacties. Men moet zich echter ook bewust zijn van de beperkingen van dit systeem, zoals het ontbreken van vasculaire / systemische component, functioneel immuunsysteem of zenuwstelsel, en het systeem vertegenwoordigt een reductionistische benadering in vergelijking met diermodellen. In tegenstelling tot diermodellen bieden 3D-structuren slechts een benadering van de biologie in een menselijk lichaam. Inzicht in de beperkingen van de 3D-methode kan onderzoekers helpen om meer verfijnde en geldige processen te ontwerpen voor het produceren van sferoïden die een orgaan op grotere schaal beter vertegenwoordigen23,24,25.

Kanker is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en borstkanker is de meest voorkomende kanker bij vrouwen van26,27,28jaar. Om de complexe micro-omgeving van borstkanker na te bootsen, moeten borstkankersferoïden worden gekweekt met behulp van cellen die een prominente rol spelen in borsttumoren, d.w.z. epitheelcellen, endotheelcellen, fibroblasten en / of immuuncellen. Bovendien moet voor een sferoïde die borstkanker vertegenwoordigt, ook de expressie van vrouwelijke hormoonreceptoren (oestrogeen / progesteronreceptoren), het vermogen om de histologische status van de tumor van de patiënt te behouden en het vermogen om de respons op therapie na te bootsen, worden overwogen. Studies hebben aangetoond dat 3D-co-kweeksystemen een cellulaire organisatie hebben die vergelijkbaar is met die van het primaire weefsel in vivo,de mogelijkheid hebben om in realtime te reageren op stimuli en functionele androgeenreceptorenhebben 29,30,31,32. Daarom kan een vergelijkbare aanpak nuttig zijn om een borsttumor in vitro na te bootsen. Het doel van het huidige protocol is om een nieuwe methode vast te stellen voor het genereren van sferoïden voor borstkanker. Deze methode maakt gebruik van oestrogeenreceptorpositieve MCF-7-cellen (een vereeuwigde menselijke cellijn van epitheelcellen) en vasculaire endotheelcellen (HUVECs) of lymfatische endotheelcellen (HMVEC-DNeo) om een model te creëren dat de interacties tussen deze cellen in een tumor nabootst of nauw weerspiegelt. Hoewel MCF-7 (oestrogeen-responsieve) en endotheelcellen in de huidige studie zijn gebruikt om sferoïden te ontwikkelen, kunnen andere cellen zoals fibroblasten die ~ 80% van de borsttumormassa vertegenwoordigen, in de toekomst ook worden gecombineerd om borsttumor beter weer te geven en na te bootsen.

Er zijn verschillende methoden om sferoïden te vormen, zoals: 1) de hangende druppelmethode die de zwaartekracht gebruikt33,34; 2) de magnetische levitatiemethode die magnetische nanodeeltjes gebruikt die zijn blootgesteld aan een externe magneet35,en 3) de sferoïde microplaatmethode die wordt uitgevoerd door zaaicellen op platen met een lage bevestiging36,37. Op basis van de bestaande methoden, die slechts één celtype gebruiken, is het huidige protocol geoptimaliseerd met behulp van epitheel- en endotheelcellen om de groeiomstandigheden van borstkankertumoren in vivobeter na te bootsen38,39,40,41. Deze methode kan eenvoudig worden bereikt in het laboratorium tegen lage kosten en met minimale apparatuurvereisten. Op basis van de behoefte / doelen van het lab werden verschillende benaderingen gebruikt om sferoïden te vormen en relevant cellulair materiaal uit deze sferoïden te halen. In deze context, voor DNA-, RNA- of eiwitanalyse, worden de 3D-sferoïden geproduceerd door co-cultivering van endotheel- en epitheelcellen met de hanging drop-methode. Voor functionele studies, bijvoorbeeld om de celgroei na korte interfererende (siRNA) transfectie en / of hormoonbehandeling te volgen, worden de sferoïden gegenereerd met behulp van U-bodemplaten.

Het doel van dit technische protocol is om een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving te geven voor 1) het vormen van borstkanker meercellige sferoïden, 2) het voorbereiden van monsters voor histologische kleuring en 3) het verzamelen van cellen voor extractie van RNA, DNA en eiwitten. Zowel de goedkope hangdruppelmethode als de duurdere U-bodemplaten worden gebruikt om sferoïden te vormen. Hier wordt een protocol verstrekt voor het voorbereiden (fixeren) van sferoïden voor sectie en daaropvolgende immunostaining met markers om celproliferatie, apoptose en distributie van epitheel- en endotheelcellen binnen een sferoïde te beoordelen. Bovendien toont dit protocol een volledige stapsgewijze analyse van histologische gegevens met behulp van ImageJ-software. De interpretatie van biologische gegevens varieert afhankelijk van het type experiment en de gebruikte antilichamen. Sectie van vaste sferoïden en daaropvolgende kleuring van de secties werd uitgevoerd door een routine pathologielaboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celkweek

OPMERKING: Voer celbehandeling uit onder steriele omstandigheden.

  1. Humane Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) subcultuur
    1. Bestrijk 75 cm2 kolven met collageen (5 μg/cm2) (rattenstaart) 's nachts (AAN) bij kamertemperatuur (RT) of 2-3 uur bij 37 °C, spoel af met water en laat de kolf drogen.
    2. Kweek HUVECs in groeimedium (EBM-2, Endotheel Basaal Medium-2) aangevuld met glutamine (1x = 2 mM), antibiotisch-antimycotische oplossing (AA; 100 μg/ml streptomycine, 100 μg/ml penicilline en 0,025 μg/ml amfotericine B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/ml hydrocortison, 10 ng/ml humane epidermale groeifactor, 3 ng/ml humane basische fibroblastgroeifactor, 10 μg/ml heparine) en 10% FCS (Foetaal Kalfsserum) onder standaard weefselkweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2). Verander het medium om de 2 dagen totdat de cellen 70% -80% confluentie bereiken.
    3. Was de subconfluente culturen met 5 ml HBSS (zonder Ca2+ en Mg2+) en voeg 3 ml trypsine toe (0,25% verdund in HBSS (zonder Ca2+ en Mg2+)).
      OPMERKING: HBSS kan ook worden vervangen door PBS.
    4. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 2 minuten (microscopisch controleren of de cellen zijn losgemaakt en naar boven afgerond) en stop de ontkoppelingsreactie door 6 ml 10% FCS-medium (DMEM-F12 of EBM-2, 10% FCS) toe te voegen.
    5. Centrifugeer de celsuspensie bij 250 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
    6. Suspensie van de cellen in groeimedium en zaad in 75 cm2 kolven of kweekschalen.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, menselijke borst adenocarcinoom cellen) subcultuur
    1. Kweek menselijke borstkankercellijnen in 75 cm2 kolven in groeimedium (DMEM/F12 medium aangevuld met een commerciële glutamine (1x), antibiotisch-antimycotische oplossing (AA; 100 μg/ml streptomycine, 100 μg/ml penicilline en 0,025 μg/ml amfotericine B) en 10% FCS onder standaard weefselkweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2). Vervang het medium om de 2-3 dagen.
    2. Was de subconfluente celculturen (70%-80% confluentie) met 5 ml HBSS (zonder Ca2+ en Mg2+) en voeg 3 ml trypsine (0,5% verdund in HBSS (zonder Ca2+ en Mg2+) toe bij 37 °C gedurende 5 minuten (microscopisch controleren of de cellen zijn losgemaakt).
      OPMERKING: HBSS kan ook worden vervangen door PBS.
    3. Voeg 8 ml 10% FCS-medium toe om de losmaakreactie te stoppen, centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
    4. Suspensie van de pellet in groeimedium en plaat in 75 cm2 kolven of kweekschalen.

2. Sferoïde vorming

  1. Plaat 5 x 105 cellen/ml (HUVECs en MCF-7) in een ronde schaal van 3,5 cm en kweek gedurende 48 uur.
  2. Behandel of transfecteer de vergulde cellen gedurende 24 uur of naar wens.
  3. Optionele stap uitgevoerd in 96-well U-bottom plaat: Was de cellen met 1 ml HBSS (Ca2+ en Mg2+) en kleur HUVECs met een blauwe kleurstof (0,5 μg/ml) en MCF-7 cellen met een groene kleurstof (0,5 μM) verdund in het betreffende groeimedium en plaats in een incubator van 37 °C en 5% CO2 gedurende 30-40 minuten.
  4. Was de cellen met 1 ml HBSS (zonder Ca2+ en Mg2+),voeg 1 ml enzymatisch loslatingsreagens (0,25% trypsine voor HUVEC en 0,5% trypsine voor MCF-7) toe aan elke ronde schaal met behulp van een P1000-pipet en incubeer vervolgens gedurende 2-5 minuten totdat de cellen zijn losgemaakt.
  5. Verzamel elk celtype afzonderlijk in een polystyreenbuis met ronde bodem van 5 ml en voeg 1 ml 10% FCS-medium toe met behulp van een P1000-pipet om de enzymatische reactie te stoppen. Centrifugeer de celsuspensies bij 250 x g gedurende 5 minuten.
  6. Adem het supernatant voorzichtig op en suspensie de cellen in 1 ml steroïdevrij medium (EBM-2, glutamine , antibioticum-antimycotisch, 0,4% FCS sf (houtskool-gestript)).
    OPMERKING: Steroïde-vrij medium kan worden vervangen door normaal groeimedium.
  7. Gebruik 100 μL van elke celsuspensie verdund met 10 ml verdunningsmiddel II (zie materialentabel)om het totale celnummer te bepalen en de hoeveelheid behandelingsmedium (EBM-2, glutamine, antibioticum-antimycotisch, 0,4% FCS sf, voertuig / behandeling) te berekenen die nodig is om een celsuspensie van 5 x 103 cellen / ml of 3,4 x 105 cellen / ml per celtype te verkrijgen.
    1. Aantal cellen
      1. Schakel het apparaat in en spoel door op de knoppen Functie en Start te drukken (stel S3 in), met Verdunningsmiddel II-oplossing in een injectieflacon met celteller.
      2. Gebruik de set-up S4 en druk op Start om de blanco te meten met een nieuwe Diluent II-oplossing.
      3. Vervang de scintillatieflacon met 100 μL celsuspensie in 10 ml verdunningsmiddel II-oplossing en meet de monsters: stel S4 in en druk op Start.
      4. Noteer het aantal cellen per ml op het digitale display.
        OPMERKING: Celtelling kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere handmatige of automatische systemen: hemocytometerrasterlijnen, technologie voor het tellen van lichtverstrooiingscellen, elektrische impedantie, op beeldvorming gebaseerde systemen met behulp van celkleuring, bijvoorbeeld trypanblauw.
    2. 96-well U-bodemplaten
      1. Bereid 5 ml van elke celsuspensie (5 x10 3 cellen / ml) en meng ze om een eindvolume van 10 ml te krijgen in de verhouding van 1: 1.
      2. Gebruik een handmatig herhalende pipet om 100 μL van de celsuspensie in elke put van de 96-well U-bottom platen te pipetten.
      3. Plaats de plaat in een incubator onder standaard weefselkweekomstandigheden en controleer na 48 uur op sferoïdenvorming.
      4. Optionele stap: Maak foto's van de sferoïden (40x) met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop.
        OPMERKING: Deze methode genereert 96 sferoïden (één sferoïde / put) na 48 uur (gebied 1-2 pixel2) en wordt meestal gebruikt voor groeistudies.
    3. Hangende druppel
      1. Meng de celsuspensies (3,4 x10 5 cellen / ml) in een verhouding van 1: 1 om een eindvolume van 2 ml te krijgen.
      2. Gebruik een P20-pipet om het celmengsel in de vorm van druppels van 15 μL op het omgekeerde deksel van een petrischaaltje van 10 cm te zaaien.
      3. Keer het deksel om met de druppels en voeg 5 ml basismedium (EBM-2) toe aan de onderkant van de schaal om verdamping van de druppels te voorkomen.
        OPMERKING: Deze methode genereert één sferoïde / druppel na 48 uur. Zorg ervoor dat de druppels voldoende uit elkaar staan, zodat ze niet samensmelten tijdens het verwisselen van het deksel. Gebruik indien nodig meer dan één petrischaaltje van 10 cm.

3. Sferoïde groeistudie

  1. Plaat 100 μL HUVECs en MCF-7 celmengsel (5 x 102 cellen/put) in 96-well U-bottom platen en plaats ze in de incubator.
  2. Controleer 48 uur na het plateren op sferoïdenvorming met een omgekeerde microscoop (Helder veld). Maak foto's (minimaal zes foto's per behandeling, 40x) bij 96 uur cultuur.
  3. Open de foto's met behulp van een beeldverwerkingssoftware en verwerk de afbeelding tot 300 pixel / inch en sla de afbeelding op als een TIFF-bestand.
  4. Download de ImageJ-software en open deze. Klik op de optie Bestand en ga naar Openen.
  5. Converteer de interessegebieden op een uniforme manier naar verzadigde zwarte gebieden om een binair beeld (zwart-wit) te hebben. Selecteer hiervoor de optie Afbeelding, kies Type | 8-bits. Nu is het beeld zwart-wit.
  6. Gebruik het selectiegereedschap uit de vrije hand om de rand van de sferoïden te tekenen.
  7. Om het interessegebied te berekenen en het object of de voorgrondpixels van de achtergrondpixels te scheiden, gebruikt u de drempelfunctie: Selecteer de optie Afbeelding, kies Aanpassen en klik op Drempel.
  8. Nu wordt een pop-upvenster Drempel geopend. De bovenste balk geeft de minimale drempelwaarde aan: stel de waarde in op nul. De onderste balk geeft de maximale drempelwaarde aan: verplaats de balk totdat het interessegebied volledig rood wordt.
    OPMERKING: Als de kleur niet rood is, selecteert u Rood in het venster Drempel.
  9. Ga naar | analyseren Stel metingen in en selecteer Gebied en omtrek.
  10. Als u het interessegebied wilt meten, selecteert u de optie Analyseren en gebruikt u het gereedschap Deeltjes analyseren. Stel in het venster Deeltjes analyseren de grootte in die u wilt meten (0,00003-Oneindig of 3-Oneindig, afhankelijk van de grootte van de sferoïden), selecteer Resultaten samenvatten en weergeven. Klik vervolgens op OK.
  11. De resultaten worden weergegeven in een grafiek. Kopieer de metingen naar een spreadsheet om de gegevens te analyseren.
    OPMERKING: Het gebied wordt berekend als het aantal totale pixels; gebruik de totale oppervlakte voor berekening.

4. Sferoïde immunohistochemie studie

  1. Monstervoorbereiding
    1. Verguld het celmengsel van HUVECs en MCF-7 (5 x 103 cellen/put) in 96-well U-bottom platen in HUVEC groeimedium gedurende 96 uur.
    2. Verzamel ongeveer 50 sferoïden in een buis van 1,5 ml met een gesneden punt van een P200 μL pipet; laat ze zich door de zwaartekracht naar de bodem van de buis nestelen en gooi het supernatant vervolgens weg.
    3. Bevestig de sferoïden met 500 μL van 4% PFA gedurende 1 uur, RT.
    4. Kook 2% Nobel Agar-oplossing in PBS met behulp van een hete plaat met een magnetische roerder gedurende 3-5 minuten om het agarosepoeder volledig op te lossen en af te koelen tot ongeveer 60 °C.
    5. Verwijder de PFA met een P1000-pipet, was de sferoïden met 500 μL PBS en laat ze bezinken. Gooi het supernatant weg.
    6. Pipetteer voorzichtig 600 μL agarose-oplossing in de buis van 1,5 ml met sferoïden en plaats de buis onmiddellijk in een centrifuge met een horizontale rotor op 177 x g gedurende 2 minuten.
    7. Voeg een kort touwtje toe in het midden van de agarose-oplossing om de plug gemakkelijk uit de buis te verwijderen.
    8. Stolt agaroseplug op ijs of bij 4 °C. Voeg 500 μL PBS toe aan de buis van 1,5 ml om uitdroging van de pellet te voorkomen.
      OPMERKING: De monsters zijn klaar voor daaropvolgende uitdroging, paraffine-inbedding, sectie, overdracht op de microscoopglaasjes en IHC-kleuring (uitgevoerd door Sophistolab).
  2. Beeldverwerving en -verwerking
    1. Verkrijg afbeeldingen van sferoïde secties met behulp van een stereomicroscoop.
    2. Sla drie afbeeldingen voor elk voorbeeld op als .jpg bestanden.
    3. Open de ImageJ-software. Open de JPEG-afbeelding, klik op Bestand en vervolgens op Openen.
    4. Selecteer Kleur en kleuropvolging in de optie Afbeelding.
    5. Selecteer H DAB-vectoren in het venster Color Deconvolution 1.7 en de drie afbeeldingen worden weergegeven.
      OPMERKING: De drie afbeeldingen zijn: Kleur 1 vertegenwoordigt alleen de Hematoxyline-kleuring (blauw / paars) en Kleur 2 vertegenwoordigt alleen de DAB-kleuring (bruin). Kleur 3 is niet nodig voor de beeldanalyse met twee vlekken.
    6. Selecteer het venster Kleur 1 en stel de drempel in: ga naar Afbeelding | Aanpassen en klik op Drempel. Het venster Drempel wordt weergegeven.
    7. Laat de minimale drempelwaarde op nul staan en pas de maximale drempelwaarde aan om het achtergrondsignaal te verwijderen zonder het werkelijke signaal te beïnvloeden. Klik op Toepassen.
      1. Oppervlaktemeting
        1. Klik op Analyseren, kies Meting instellen. Selecteer Gebied, Gemiddelde grijswaardeen Min en Max grijswaarde en klik op OK om te bevestigen.
        2. Meet de grootte van de kern met de optie Analyseren en selecteer vervolgens Meten.
          OPMERKING: Het venster Resultaten bevat de naam van de afbeelding (label), de grootte van de afbeelding (gebied), de gemiddelde pixelintensiteit van de IHC-afbeelding (gemiddelde) en de minimale en maximale grijswaarden (Min, Max). Gebruik de gemiddelde waarde voor berekening.
        3. Herhaal stap 4.2.6-4.7.1.2 voor het venster Kleur 2 (en Kleur 3 als er dubbele vlekken zijn).
      2. Celkwantificering
        1. Klik op Proces, kies de optie Binair en selecteer Waterscheiding om cellen te scheiden.
        2. Ga naar Analyseren en klik op Deeltjes analyseren. Stel in het pop-upvenster Deeltjes analyseren de grootte van de cellen in om niet-specifieke deeltjes uit te sluiten. Klik vervolgens op de optie Weergeven op de vervolgkeuzelijst en selecteer Contouren. Klik vervolgens op OK.
        3. Herhaal stap 4.2.6-4.2.7 en celkwantificeringsstappen (punt 4.2.7.2) voor het venster Kleur 2 (en Kleur 3 als er dubbele kleuring is).
          OPMERKING: Nu verschijnen er drie vensters: 1) Overzichtsresultaten (aantal getelde cellen, totale oppervlakte, gemiddelde grootte, % van het gebied en het gemiddelde), 2) Resultaten (respectievelijk de cellen die worden geteld) en 3) Tekenvenster (afgebeelde afbeelding van de cellen die worden geteld).

5. Levende /dode kleuring in Spheroids

  1. Bereid 4 mM stamoplossingen van Calcein AM in DMSO (kleurt levende cellen groen) en 2 mM Ethidium homodimeer in DMSO (kleurt dode cellen rood) in buizen van 1,5 ml.
  2. Bereken de hoeveelheid oplossing die nodig is om 10 μL/put van een mengsel van Calcein AM en Ethidium homodimeer verdund 1:50 in EBM-2 toe te voegen.
  3. Voeg het kleuringsmengsel toe aan de sferoïden en plaats de plaat gedurende 30-60 minuten in de incubator onder standaard weefselkweekomstandigheden.
  4. Verkrijg foto's (40x) met behulp van de fluorescentie stereomicroscoop.

6. Sferoïde eiwit- en RNA-isolatie

  1. Bereid celsuspensies met 3,4 x10 5 cellen / ml per celtype, meng ze in een verhouding van 1: 1 en zaai het celmengsel met behulp van een P20-pipet in de vorm van 15 μL druppels op het deksel van een petrischaaltje van 10 cm. Keer het deksel om en plaats het gedurende 96 uur in de couveuse onder standaard weefselkweekomstandigheden.
  2. Gebruik 5-6 ml PBS om sferoïden te verzamelen in een polystyreenbuis met ronde bodem van 15 ml met behulp van steriele polystyreenpipetten van 5 ml.
    OPMERKING: Het is ook mogelijk om conische buizen van 15 ml te gebruiken.
  3. Centrifugeer de sferoïdensuspensie gedurende 5 minuten bij 250 x g en zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op.
  4. Voeg 500 μL trypsine (100%) toe en pipetteer op en neer met een P1000-pipet gedurende 30 s om sferoïden uit te splitsen en een celsuspensie te bereiken.
  5. Neutraliseer trypsine met 10% FCS-medium, centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 250 x g en zuig het supernatant op.
  6. Gebruik volgens het protocol van de fabrikant (specifieke kit voor DNA-vrije RNA-isolatie) 300 μL RNA-lysisbuffer om de celkorrel te lyseren.
    OPMERKING: Lysisbuffer kan ook direct worden toegevoegd aan de intacte sferoïden (geen trypsinestap vereist) om RNA te extraheren. Voeg 300 μL van de lysisbuffer toe aan de gepelletiseerde sferoïden, plaats buizen in ijs en trituraer 10 keer met een P200-pipet. Isoleer vervolgens RNA zoals hierboven. Sferoïde dissociatie kan nodig zijn als het RNA-herstel laag is als gevolg van matrixinterferentie.
  7. U kunt ook 70 μL van de Lysis-buffer gebruiken voor eiwitisolatie. Homogeniseren gedurende 2-4 s door ultrasoonapparaat en bepaal de eiwitconcentratie volgens het protocol van de fabrikant met behulp van een BCA Assay Kit.
    OPMERKING: Voor eiwitisolatie kunnen gepelleteerde sferoïden direct in lysisbuffer worden gelyseerd, gevolgd door ultrasoonapparaat. Gebruik 25 μg totaal eiwit om western blot uit te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het sferoïdenmodel met behulp van epitheliale en endotheelcoculturen is nodig om in vivo omstandigheden van borsttumoren nauwkeurig na te bootsen voor in vitro experimenten. Het schema in figuur 1 toont het protocol om sferoïden te vormen met epitheelcellen van borstkanker en vasculaire of lymfatische endotheelcellen(figuur 1). Elk celtype wordt afzonderlijk gezaaid in een ronde schaal van 3,5 cm en behandeld met groeistimulatoren/-remmers of getransfecteerd met oligonucleotiden met behulp van Lipofectamine. De confluente monolagen van epitheel- of endotheelcellen worden geoogst na trypsinisatie, gewassen en gemengd in een verhouding van 1: 1. De cellen worden vervolgens verguld in 96-well U-bottom platen (figuur 1A) of op het omgekeerde deksel van een ronde kweekschaal met een diameter van 10 cm om het ophangen van druppelcultuur te vergemakkelijken (figuur 1B). Kort na het zaaien verschijnen de cellen als platte, dichte vellen cellen aan de onderkant van elke put of druppel, en vervolgens aggregeren ze met de tijd (24-48 uur), waardoor intacte sferoïden worden gevormd bij 48 uur. Om schade aan de los gevormde celaggregaten te voorkomen, mogen de platen gedurende ten minste 24 uur niet worden verstoord.

In U-bodemplaten resulteerde het zaaien van MCF-7-cellen, maar niet endotheelcellen of lymfecellen, in sferoïde vorming na 48 uur (respectievelijkfiguur 2A, B). Bovendien resulteerde het zaaien van MCF-7 plus endotheelcellen of lymfecellen in een verhouding van 1: 1 ook in sferoïdevorming (respectievelijkfiguur 2C,D). Om sferoïden te valideren als een model om tumorgroei te bestuderen, werden tijdsafhankelijke veranderingen in sferoïdegrootte als reactie op groeistimulerende oplossing gemeten / gekwantificeerd en vergeleken met de onbehandelde controles (figuur 2). Fotomicrografen in figuur 2E tonen tijdsafhankelijke (24-120 h) sequentiële groei van een representatieve MCF-7 sferoïde. De lijngrafiek in figuur 2F toont de verandering in het gebied van MCF-7-sferoïden in de loop van de tijd bij behandeling met of zonder groeistimulator. De sferoïde grootte nam toe van ~ 100 μm tot ~ 200 μm gedurende 5 dagen; bovendien werd een verhoogde groeisnelheid waargenomen bij sferoïden die met de groeistimulator werden behandeld (figuur 2F). Omdat langdurige behandeling (168 h) resulteerde in verminderde MCF-7 levensvatbaarheid, mogelijk als gevolg van hypoxische omstandigheden in het midden van de sferoïden(figuur 3),werd de groei van de 3D-structuur bestudeerd tot 96 h. Sferoïden gevormd met MCF-7-cellen en HUVECs vertonen een lager aantal dode cellen bij 168 h in vergelijking met sferoïden gevormd met MCF-7 alleen.

In de eerste experimenten werd slechts een kleine groei in de grootte van sferoïden waargenomen na 4 dagen cultuur. Er werd verondersteld dat dit te wijten zou kunnen zijn aan het hoge aantal cellen dat is gezaaid om sferoïden te vormen. In de U-bottom kweekplaten kan de groei van sferoïden beperkt zijn door de concave vorm van de put. Omdat de groei afhankelijk was van het initiële aantal gezaaide cellen, werden verschillende celnummers gebruikt om sferoïden te vormen om omstandigheden te testen en vast te stellen die optimaal zouden zijn om de sferoïdegroei te volgen. Zoals te zien is in figuur 4,suggereren de bevindingen dat voor sferoïde groeistudies het zaaien van 500 cellen / put om sferoïden te vormen betrouwbaar en reproduceerbaar was voor het monitoren van de groei van sferoïden gedurende 4-6 dagen in reactie op groeimodulatiefactoren. Sferoïden die het meest geschikt waren voor histologische of immuun-histologische waarnemingen werden verkregen op dag 4, na zaaien van 5 x 103 cellen/put. Dezelfde beginconcentratie werd gebruikt voor celeiwit- of RNA-extracties. Het verhogen van de initiële celconcentratie met meer dan 7,5 x10 3 cellen/put verbeterde de vorming van sferoïden niet, en de cellen aggregeerden niet goed en veronderstelden onregelmatige structuren(figuur 4).

Om de celsamenstelling, proliferatie en apoptosestatus te evalueren, werden histologische secties van sferoïden gevormd met borstkankercellen plus endotheelcellen onderzocht met behulp van H & E en Ki67 (verdunning 1:300) en Cleaved Caspase-3 (verdunning 1:500) antilichamen. Het proces voor de uiteindelijke monstervoorbereiding vereist zorg/aandacht en precisie. Figuur 5A toont de workflow voor het verzamelen en opnemen van sferoïden in agarose voor secties. Fotomicrografieën in figuur 5B-C tonen het verschil in MCF-7 sferoïde vorming in de aanwezigheid ( Figuur5B) en afwezigheid (Figuur 5C) van Lipofectamine (0,17% eindconcentratie), een veelgebruikt transfectiemiddel. Bright-field microscopische afbeeldingen van histologische secties tonen een cirkelvormige, compacte structuur van een homogeen mengsel van twee celtypen (Figuur 5D-G). De structuur van de sferoïden en de vorm van hun cellen vertoonden geen afwijkingen na transfectie met controle-oligonucleotiden in aanwezigheid van Lipofectamine (figuur 5D). Bovendien waren cellen die de proliferatieve marker, Ki67, tot expressie brachten, homogeen verdeeld in de sferoïden; er werd echter ook een ring van proliferatieve cellen waargenomen op het oppervlak van de sferoïden (figuur 5E). Gekloofde Caspase-3 kleuring toonde apoptotische cellen na 4 dagen kweek(figuur 5F). Histologische secties zijn nuttig om de verdeling van epitheliale en endotheelcellen in sferoïden te evalueren met behulp van specifieke markers. Met behulp van CD31 als een specifieke marker voor endotheelcellen, is het mogelijk om hun verdeling binnen de 3D-structuur te bepalen. Aangezien alle cellen gekleurd zijn met Hematoxyline (blauwe kleuring van de kern van de cel), zou de berekening van CD31-expressie het gebied van de sferoïden kunnen bieden die endotheelcellen bevatten na behandeling of transfectie (protocolsectie 4.2.7.1.). Bovendien is het mogelijk om door het uitvoeren van een dubbele kleuringstest nog meer informatie te hebben, bijvoorbeeld zoals weergegeven in figuur 5G, CD31-vlekken endotheelcellen (rood) en Ki67-vlekken proliferatieve cellen (bruin). Volgens protocol sectie 4.2.7.2, figuur 5G onthulde dat 55% epitheelcellen zijn, 45% endotheelcellen en 25% van de cellen prolifereert.

De structuur van sferoïden kan ook worden bestudeerd met behulp van immunofluorescentieanalyse na de etikettering van cellen met levende kleurstoffen. Confluente 2D-culturen van HUVEC- en MCF-7-cellen werden afzonderlijk gekleurd met blauwe (HUVEC) en groene (MCF-7) kleurstoffen. Vervolgens werden de gekleurde cellen verzameld en gemengd in een verhouding van 1: 1 en gezaaid in putten voor sferoïdevorming. Foto's van gekleurde fluorescerende cellen werden onmiddellijk na hetzaaien (figuur 6A)en na 3 dagen kweek genomen(figuur 6B). Om het percentage levende en dode cellen te beoordelen, werden 4 dagen oude sferoïden gekleurd met calceïne-AM (groen) en met ethidium homodimeer (rood) (figuur 6C). Sferoïden gevormd met MCF-7 en HUVECs konden niet met succes worden ingevroren / bewaard met behulp van de standaardprotocollen voor vriescellen (groeimedium aangevuld met 10% DMSO en 10% FCS) voor vriescellen. In bevroren en ontdooide sferoïden waren scheuring van celaggregaten en verhoogd verlies van levensvatbaarheid van de cel duidelijk. De representatieve afbeelding in figuur 6D toont een vers ontdooide sferoïde gekleurd voor dode en levende cellen. Het laat zien dat sferoïden erg gevoelig zijn voor de vriesomstandigheden.

Na 5 dagen kweek in experimentele omstandigheden was lysis van ongeveer 100 sferoïden nodig om voldoende eiwit (~3 μg/ml) of RNA (~60 ng/μL) te verzamelen voor analyse. Figuur 7 toont een workflow van het verzamelen van sferoïden (gegenereerd met de hanging drops-methode) tot cellysis voor eiwitextractie om western blotting of RNA-isolatie uit te voeren voor toekomstige Microarray-assays of analyse door RT-PCR. Isolatie van RNA/DNA uit een heterogene celpopulatie in een sferoïde voor microarray-analyse kan nuttige informatie opleveren. Om echter belangrijke celspecifieke mechanismen of cel-celinteracties te identificeren, kunnen de sferoïde cellen worden gescheiden na enzymatische (trypsine of accutase) dissociatie, met behulp van FACS-analyse en RNA van specifieke cellen die worden gebruikt voor microarray-analyse. Bovendien kunnen antibioticaresistente cellijnen (bijvoorbeeld door gebruik te maken van EGFP en/of puromycineresistentiecellijnen) in sferoïden worden gebruikt om de rol van een specifiek celtype van cel-celinteractie aan te pakken. Bovendien kunnen gen-uitschakelingstools worden gebruikt om de cellen te engineeren om specifieke cel-celinteractieproblemen aan te pakken.

Figure 1
Figuur 1: Workflow van sferoïdenvorming. MCF-7- en HUVEC- of LEC-cellen in 2D-culturen worden apart gekweekt en verzameld na verschillende gewenste behandelingen. Sferoïden worden vervolgens gegenereerd door directe vermenging van cellen in (A) 96-well U-bottom platen, die de vorming van 3D-structuur bevorderen door cel-naar-cel aggregatie, of door gebruik te maken van (B) hangende druppelcultuur die de vorming van sferoïden ondersteunt via zwaartekracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vorming en ontwikkeling van sferoïden in de loop van de tijd. Afbeeldingen tonen de vorming van een sferoïde door MCF-7-cellen (Paneel A), het ontbreken van sferoïde vorming door endotheel- of lymfecellen (HUVECs; (Paneel B)) verguld met dezelfde dichtheid, en sferoïde vorming door MCF-7 cellen plus HUVECs of LEC's gemengd in een 1:1 verhouding (Panelen C, D). Ook afgebeeld is de groei in grootte van een sferoïde in de tijd (24 h, 48 h, 72 h, 96 h en 120 h). Deze sferoïde werd gevormd uit een mengsel van MCF-7 plus HUVECs in een verhouding van 1:1 en gezaaid met een dichtheid van 500 cellen / put van een 96-well U-bottom plaat (Panel E), (schaalbalk = 200 μm, 40x). Lijngrafiek (Paneel F) toont de tijdsafhankelijke groei van controle (CTR) versus groei-gestimuleerde (Behandeling) sferoïden. De gebieden van sferoïden werden gemeten en vergeleken tussen onbehandelde en behandelde sferoïden. De resultaten vertegenwoordigen ± SEM, *** p < 0,001 in vergelijking met de respectieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Sferoïden op lange termijn cultuur en levensvatbaarheid. Fotomicrografie toont de levensvatbaarheid van cellen in sferoïden gevormd met MCF-7-cellen alleen bij 96 h (Paneel A) en 168 h (Paneel C), terwijl panelen B en D de levensvatbaarheid van cellen weergeven in sferoïden gemaakt met MCF-7 plus HUVECs (1: 1 verhouding) bij 96 h (Paneel B) en 168 h ( PaneelD) (schaalbalk = 100 μm). Cellen werden gekleurd met Calceïne (rode, dode cellen) en Ethidium homodimeer (groene, levende cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Celzaaidichtheid en tijdsafhankelijk groeiprofiel van MCF-7 plus HUVEC-sferoïde. HUVECs en MCF-7 cellen gemengd in een 1:1 verhouding werden gezaaid bij toenemende dichtheden (102-104 cellen/put), en de groei van sferoïden werd gemonitord over 24-96 uur. Microscopische bright-field beelden werden gemaakt (schaalbalk = 200 μm, 40x) om de sferoïde groei in de loop van de tijd te beoordelen. Cellen met een dichtheid van 500 cellen/put zorgden voor een optimale grootte om sferoïde groei te bestuderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Sferoïde inbedding voor sectioning en histologische kleuring. Paneel A: Cartoon die de workflow weergeeft voor het verzamelen en opnemen van HUVECs/MCF-7 sferoïden in agarose. Na paraffine-inbedding van de sferoïden in een agaroseprop en sectie van paraffineblokken, werden de monsters gebruikt voor standaard histologische kleuring. Panelen B en C tonen representatieve MCF-7 plus HUVEC-sferoïden behandeld zonder en met Lipofectamine 2000, respectievelijk (schaalbalk = 200 μm, 40x). Panelen D-G tonen representatieve afbeeldingen van sferoïde secties gekleurd met specifieke markers. Paneel D toont sferoïden gekleurd met hematoxyline-eosine om de sferoïde structuur te beoordelen (schaalbalk = 100 μm). Kleuring in paneel E toont prolifererende cellen die positief gekleurd zijn met Ki67. Paneel F toont apoptotische cellen in een sferoïde die positief gekleurd zijn met gekloofde Caspase-3 (schaalbalk = 50 μm). Paneel G toont sferoïde secties met dubbele kleuring: CD31 (endotheelcellen marker) en Ki67 (proliferatieve marker) (schaalbalk = 100 μm). De sectie van sferoïden en kleuring werden uitgevoerd door Sophistolab (info@sophistolab.ch). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Fluorescentiebeelden van MCF-7/HUVEC-sferoïden die celverdeling en levensvatbaarheid laten zien. Panelen A en B tonen representatieve sferoïden met HUVECs gekleurd met een blauwe kleurstof en MCF-7-cellen gekleurd met een groene kleurstof. De lokalisatie van HUVEC en MCF-7 binnen de sferoïde varieert onmiddellijk na het zaaien (A) en na sferoïdevorming (B) (schaalbalk = 250 μm). Panelen C-D tonen sferoïden gekleurd met Calcein /Ethidium Homodimer om levende (groene) en dode cellen (rood) in de 3D-structuren in normale kweekomstandigheden (C) en na bevriezing (D) (Schaalbalk = 100 μm) te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Schematische weergave van de sferoïdenverzameling voor biochemische analyse. Cartoon toont het schema om sferoïden te oogsten, cellen te scheiden of vrij te geven en ze op te schorten in lysis-oplossing voor eiwitanalyse of RNA-extractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vergelijking met 2D-celculturen is revolutionaire 3D-sferoïde cultuurtechnologie een beter en krachtiger hulpmiddel om de micro-omgeving van een orgaan, cel-celinteracties en medicijnresponsen in vitrote reconstrueren. Dit is het eerste protocol dat de vorming van sferoïden uit meercellige (epitheliale en endotheel) cellijnen beschrijft voor borstkankeronderzoek. Dit protocol zorgt voor sferoïdale 3D-groei van sferoïden gedurende maximaal 5 dagen, en sferoïden kunnen worden onderzocht na paraffine-inbedding, sectioning en histologische kleuring. Interessant is dat de cellulaire elementen in de sferoïde nog steeds receptoren tot expressie brengen die de celgroei bevorderen en reageren op proliferatieve en apoptotische stimuli. Het beschreven protocol genereert voldoende biologisch materiaal voor eiwit- of RNA/DNA-analyse. Het bovenstaande co-kweeksysteem, dat gemakkelijk kan worden bereikt in laboratoriumomstandigheden en tegen lage kosten, kan een voordeel zijn voor toekomstige toepassingen, met name in borstkankertherapie en voor het testen van de gevoeligheid van geneesmiddelen. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op verschillende epitheliale en endotheelceltypen.

Het is uiterst moeilijk om in vitro een complex weefsel na te bootsen dat in vivobestaat . Dit komt omdat in vivo weefsels bestaan uit veel op elkaar inwerkende componenten, waaronder zenuwen, bloedvaten, mesenchym en immuuncellen30,42. Het doel van dit protocol is om enkele van deze beperkingen te overwinnen door een 3D-co-kweeksysteem met twee verschillende celtypen te gebruiken om de werkelijke tumortoestand te benaderen. Hier zijn sferoïden gevormd met epitheliale tumorcellen in combinatie met endotheelcellen of lymfecellen om de in vivo situatie zoveel mogelijk na te bootsen, inclusief cel-celinteracties, gevoeligheid voor apoptotische factoren die vrijkomen in de intercellulaire ruimtes door stervende cellen en hypoxische omstandigheden in het centrum van de sferoïden. Dit protocol is geoptimaliseerd voor het testen van cellulaire reacties op groeifactoren, signaleringsfactoren en hormonen, die snel signaalcascades en doelgentranscriptie activeren en eiwitexpressie en transport stimuleren30,31. In sferoïden, maar niet in vivo,kunnen reacties van tumorcellen op stimuli snel en vaak worden beoordeeld.

In de huidige studie lijken endotheelcellen in de sferoïden geen capillairachtige structuren te vormen. Aangezien is aangetoond dat endotheelcellen haarvaten vormen wanneer ze met een lage dichtheid worden verguld en monolagen met een hoge dichtheid, is het mogelijk dat het verlagen van de verhouding TUSSEN MCF-7 en endotheelcellen kan resulteren in capillaire vorming in de sferoïden. Als alternatief kan de toevoeging van specifieke matrixeiwitten of matrigel de capillaire vorming bevorderen. Het ontbreken van capillairachtige structuur in de sferoïde verdunt het voordeel van MCF-7 plus endotheelcellen ten opzichte van MCF-7-cellen op zich niet, omdat de factoren die vrijkomen door MCF-7-cellen de proliferatie van endotheelcellen kunnen bevorderen en vice versa; dergelijke interacties zouden onopgemerkt blijven in MCF-7 alleen sferoïden.

Verschillende studies hebben aangetoond dat 5 x 103 cellen/put de juiste concentratie was om zaadcellen te zaaien om sferoïden43,44,45,46,47te vormen; in 96-well U-bottom platen beperkte dit aantal cellen echter de gecoördineerde groei van sferoïden in experimentele omstandigheden. Daarom is het in elke nieuwe studie, voor elk nieuw celtype, belangrijk om de groei van het 3D-systeem na medicamenteuze behandeling te volgen, om de effecten van de behandeling op de sferoïde grootte te bepalen.

De beperking van het huidige protocol is dat de kweek van eerder gevormde sferoïden na bevriezing en ontdooiing niet kan worden voortgezet volgens de klassieke DMSO-methode. In feite waren de meeste cellen dood toen ze ontdooid waren. Vitrificatie kan een alternatief blijken te zijn voor het in leven houden van de cellen48.

Zorgvuldige aandacht voor technische details is noodzakelijk om fouten te voorkomen en goed gevormde sferoïden te produceren en te onderhouden. Een uitdaging is de monstervoorbereiding voor immunostaining (rubriek 4.1). Om de overdracht te vergemakkelijken door de sferoïden in de buis van 1,5 ml te pipetteren, is het belangrijk om een P200-tip te gebruiken die met een schaar is gesneden, zodat het gebied van het gat groter is dan de sferoïden zelf. Anders zou de overdracht de bollen kunnen vernietigen. Een andere uitdaging is hoe het medium te aspirateren nadat de sferoïden zich op de bodem van een reageerbuis hebben gevestigd. In dit opzicht is het beter om een P1000-pipet te gebruiken in plaats van een vacuümpomp om de aspiratie van sferoïden te voorkomen. Een belangrijke en delicate stap bij het voorbereiden van de sferoïden voor sectie is het toevoegen van de agarose aan de gepelletiseerde sferoïden. De sferoïden, eenmaal gesuspendeerd in agarose, moeten snel naar de bodem van de microfugebuis worden gepelletiseerd met behulp van horizontale centrifugatie bij kamertemperatuur en voordat de agarose polymeriseert.

Over het algemeen biedt de tweecellige sferoïde gemaakt van MCF-7 en endotheelcellen een levensvatbaar alternatief om cel-celinteracties en mechanismen te onderzoeken die de groei van kankercellen of endotheelcellen in een tumor stimuleren. De sferoïden kunnen dienen als een model om de werkzaamheid te beoordelen van therapeutische middelen gericht op tumor- of kankergroei. Belangrijk is dat dit tweecellige model verder kan worden geïmproviseerd om andere celtypen op te nemen die relevant zijn voor tumorgroei. In deze context kunnen fibroblasten die 80% van de borsttumormassa vormen, worden opgenomen om een MCF-7, endotheelcellen en fibroblastsferoïde te vormen. Bovendien kunnen gen-uitschakeling en genetisch gemanipuleerde cellen worden gebruikt om de rol van cel-celinteractie, hormoonreceptoren (oestrogeen / progesteron), groeifactoren en signaalroutes op tumor / kankergroei aan te pakken en om de werkzaamheid van nieuwe antikankermoleculen te testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 aan RKD en National Institute of Health grant DK079307 aan EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 173 borstkanker tumor sferoïden neovascularisatie lymfevaten tumorgroei endotheelcellen epitheelcellen celproliferatie
Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel <em>in vitro</em> model voor borstkankeronderzoek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azzarito, G., Szutkowska, M. E.,… More

Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter