Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Bryst epitel og endotelcellespheroider som en potentiel funktionel in vitro-model til brystkræftforskning

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

Krydstale mellem bryst epitelceller og endotelceller vigtigere bidrager til brystkræft progression, tumorvækst, og metastaser. I denne undersøgelse, spheroids er blevet lavet af brystkræftceller sammen med vaskulære og / eller lymfe endotelceller og demonstrere deres anvendelighed som en in vitro-system til brystkræft forskning.

Abstract

Brystkræft er den hyppigste årsag til dødelighed hos kvinder. Væksten af brystkræftceller og deres efterfølgende metastaser er en nøglefaktor for dens progression. Selv om de mekanismer, der er involveret i at fremme brystkræft vækst er blevet intensivt undersøgt ved hjælp af monokulturer af brystkræftceller såsom MCF-7 celler, bidraget fra andre celletyper, såsom vaskulære og lymfe endotelceller, der er tæt involveret i tumorvækst, er ikke blevet undersøgt i dybden. Celle-celle interaktion spiller en central rolle i tumor vækst og progression. Neoangiogenese, eller udvikling af fartøjer, er afgørende for tumorvækst, mens lymfesystemet fungerer som en portal for kræftcellemigration og efterfølgende metastaser. Nylige undersøgelser giver bevis for, at vaskulære og lymfe endotelceller kan påvirke kræftcellevæksten betydeligt. Disse observationer indebærer et behov for at udvikle in vitro-modeller, der mere realistisk afspejler brystkræft vækstprocesser in vivo. Desuden kræver restriktioner inden for dyreforsøg, at der udvikles ex vivo-modeller for bedre at belyse de involverede mekanismer.

Denne artikel beskriver udviklingen af brystkræft spheroids består af både brystkræftceller (østrogen receptor-positive MCF-7 celler) og vaskulære og / eller lymfe endotelceller. Protokollen beskriver en detaljeret trin-for-trin tilgang til at skabe dual-celle spheroids ved hjælp af to forskellige tilgange, hængende drop (guld standard og billige) og 96-godt U-bund plader (dyrt). Der gives dybdegående instruktioner til, hvordan man forsigtigt afhenter de dannede spheroider for at overvåge væksten ved mikroskopisk dimensionering og vurdering af levedygtighed ved hjælp af døde og levende cellefarvninger. Desuden er procedurer til at fastsætte spheroids til sektionsafræning og farvning med vækstspecifikke antistoffer for at differentiere vækstmønstre i spheroider afgrænses. Derudover gives detaljer til fremstilling af spheroider med transfected celler og metoder til at udtrække RNA til molekylær analyse. Afslutningsvis giver denne artikel dybdegående instruktioner til forberedelse af multicellede spheroider til brystkræftforskning.

Introduction

Brugen af dyr til forsøg har begrænsninger. Dyreforsøg kan ikke nøjagtigt efterligne sygdomsprogression hos mennesker, og dyr og mennesker har ikke identiske reaktioner på patogener. Derudover er restriktioner i dyreforsøg på grund af bekymringer for dyrelidelser og etiske problemer1,2 i stigende grad begrænse forskningsprogrammerne. In vitro der er udviklet systemer i vid udstrækning for at omgå brugen af dyr; desuden har brugen af menneskelige celler gjort in vitro modeller, der er mere relevante for den patofysiologiske og terapeutiske undersøgelse. Konventionelle monolayer (2D) cellekulturer er meget udbredt, fordi de efterligner humane væv til en vis grad. 2D-monokulturer efterligner imidlertid ikke menneskelige organer, og 2D-monokulturer er ikke i stand til at simulere det komplekse mikromiljø af de oprindelige organer og efterligne in vivo situation3,4,5,6. Derudover, i monolayer celle kulturer, lægemiddelbehandlinger let kunne ødelægge / skade alle cellerne. Det er vigtigt, at nogle af disse begrænsninger kan overvindes ved at skifte til tredimensionelle (3D) cellekulturer (multilags)7,8. Faktisk har 3D-kulturmodeller vist sig bedre at afspejle cellestrukturen, layoutet og funktionen af celler i primære væv. Disse 3D-kulturer kan dannes ved hjælp af en række cellelinjer, svarende til et funktionelt organ. Faktisk er der to modeller af 3D-kulturer. En model producerer spheroids af aggregerede celler, der danner klynger og reorganisere dem i kugler (stillads-fri modeller). Den anden giver organoider, som har en mere kompleks struktur og består af kombinationer af flere organspecifikke celler, der betragtes som en miniatureversion af organer9,10. På grund af dette repræsenterer 3D-kultursystemer en innovativ teknologi med mange biologiske og kliniske anvendelser. Spheroider og organoider har således talrige anvendelser for sygdomsmodellering og undersøgelser relateret til regenerativ medicin, lægemiddelscreening og toksikologiske undersøgelser6,11,12,13,14,15. Kræftfremkaldende spheroider, der stammer fra 3D-teknologi, genskabe morfologi og fænotype af relevante celletyper, efterligner in vivo tumor mikromiljø, og model cellekommunikation og signalering veje, der er operationelle under tumor udvikling16,17,18. Hertil kommer, at forbedre kræft biologi forståelse, tumor spheroids / organoider kan også bruges til at identificere en potentiel patient-specifik anti-cancer terapi (personlig) og vurdere dens effektivitet, toksicitet, og langsigtede virkninger19,20,21,22. Spheroids har åbnet fremtrædende muligheder for at undersøge patofysiologi, sygdom modellering og lægemiddelscreening på grund af deres evne til at bevare cellulære og tre-dimensionelle væv arkitektur, evnen til at efterligne in vivo og cellecelleinteraktionerne. Man skal dog også være opmærksom på begrænsningerne i dette system, såsom manglen på vaskulær/systemisk komponent, funktionel immun- eller nervesystem, og systemet repræsenterer en reduktionistisk tilgang sammenlignet med dyremodeller. I modsætning til dyremodeller giver 3D-strukturer faktisk kun en tilnærmelse af biologien i en menneskelig krop. Forståelse af begrænsningerne i 3D-metoden kan hjælpe forskere med at designe mere raffinerede og gyldige processer til fremstilling af spheroider, der bedre repræsenterer et organ i større skala23,24,25.

Kræft er den hyppigste dødsårsag på verdensplan, og brystkræft er den mest almindelige kræftform hos kvinder26,27,28. For at efterligne det komplekse mikromiljø af brystkræft, bør brystkræft spheroider dyrkes ved hjælp af celler, der spiller en fremtrædende rolle i brysttumorer, dvs epitelceller, endotelceller, fibroblaster, og / eller immunceller. Desuden, for en spheroid repræsenterer brystkræft, udtrykket af kvindelige hormon receptorer (østrogen / progesteron receptorer), evne til at bevare patientens tumor histologiske status, og evnen til at efterligne respons på terapi bør også overvejes. Undersøgelser har vist, at 3D co-kultur systemer har en cellulær organisation svarende til den primære væv in vivo, har evnen til at reagere i realtid til stimuli, og har funktionelle androgen receptorer29,30,31,32. Derfor kan en lignende tilgang være nyttig til at efterligne en brystsvulst in vitro. Formålet med den nuværende protokol er at etablere en ny metode til at generere brystkræft spheroids. Denne metode udnytter østrogen receptor-positive MCF-7 celler (en udødeliggjort menneskelige celle linje af epitelceller) og vaskulære endotelceller (HUVECs) eller lymfe endotelceller (HMVEC-DNeo) til at skabe en model, der efterligner eller nøje afspejler samspillet mellem disse celler i en tumor. Selvom MCF-7 (østrogen-lydhør) og endotelceller er blevet brugt til at udvikle spheroids i denne undersøgelse, andre celler såsom fibroblaster, som repræsenterer ~ 80% af bryst tumor masse, kunne også kombineres i fremtiden for bedre at repræsentere og efterligne brysttumor.

Der er flere metoder til at danne spheroids, såsom: 1) den hængende dråbemetode, der anvender tyngdekraften33,34; 2) den magnetiske levitationsmetode, der bruger magnetiske nanopartikler, der udsættes for en ekstern magnet35, og 3) spheroid mikroplademetoden, der udføres ved at så celler på lavtilbehørsplader36,37. På grundlag af de eksisterende metoder, som kun bruger én celletype, er den nuværende protokol blevet optimeret ved hjælp af epitel- og endotelceller for bedre at efterligne vækstbetingelserne for brystkræfttumorer i vivo38,39,40,41. Denne metode kan nemt opnås i laboratoriet til en lav pris og med minimale udstyrskrav. Baseret på laboratoriets behov/mål blev forskellige tilgange brugt til at danne spheroider og få relevant cellulært materiale fra disse spheroider. I denne sammenhæng, for DNA, RNA, eller protein analyse, 3D spheroids er produceret af co-culturing endotel og epitelceller med hængende dråbe metode. Men for funktionelle undersøgelser, for eksempel, for at overvåge cellevækst efter kort interferens (siRNA) transfection og / eller hormonbehandling, spheroids genereres ved hjælp af U-bund plader.

Formålet med denne tekniske protokol er at give en detaljeret trinvis beskrivelse af 1) danner brystkræft multicellulære-type spheroids, 2) forberede prøver til histologisk farvning, og 3) indsamling af celler til udvinding af RNA, DNA og proteiner. Både den billige hængende dråbemetode og de dyrere U-bundplader bruges til at danne spheroids. Her leveres en protokol til forberedelse (fastsættelse) spheroider til sektion og efterfølgende immunstaining med markører for at vurdere cellespredning, apoptose og fordeling af epitel- og endotelceller i en spheroid. Derudover viser denne protokol en komplet trinvis analyse af histologiske data ved hjælp af ImageJ-software. Fortolkningen af biologiske data varierer afhængigt af eksperimenttypen og de anvendte antistoffer. Afsnit af faste spheroider og efterfølgende farvning af sektionerne blev udført af et rutinemæssigt patologisk laboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur

BEMÆRK: Udfør cellehåndtering under sterile forhold.

  1. Human Umbilical Vene EndotelCeller (HUVECs) subkultur
    1. Frakke 75 cm2 kollagen med kollagen (5 μg/cm2) (rottehale) natten over (ON) ved stuetemperatur (RT) eller 2-3 timer ved 37 °C, skyl med vand, og lad kolben tørre.
    2. Grow HUVECs i vækstmedium (EBM-2, Endotel basal medium-2) suppleret med glutamin (1x = 2 mM), antibiotisk-antimykotisk opløsning (AA; 100 μg/ml streptomycin, 100 μg/ml penicillin og 0,025 μg/ml amphotericin B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/ml hydrocortison, 10 ng/ml human Epidermal Growth Factor, 3 ng/ml human basic Fibroblast Growth Factor, 10 μg/mL heparin) og 10 % FCS (Føtal calf serum) under standardvævskulturforhold (37 °C, 5 % CO2). Skift mediet hver anden dag, indtil cellerne når 70%-80% sammenløb.
    3. Vask sub-sammenløbet kulturer med 5 mL AF HBSS (uden Ca2 + og Mg2 +) og tilsæt 3 mL trypsin (0,25% fortyndet i HBSS (uden Ca2 + og Mg2 +)).
      BEMÆRK: HBSS kan også erstattes med PBS.
    4. Inkuber cellerne ved 37 °C i 2 min (mikroskopisk kontrollere, om cellerne er løsrevet og afrundet) og stoppe løsrivning reaktion ved at tilføje 6 mL af 10% FCS medium (DMEM-F12 eller EBM-2, 10% FCS).
    5. Centrifuge celleaffjedringen ved 250 x g i 5 min ved RT og kassér supernatanten.
    6. Ophæng cellerne i vækstmedium og frø i 75 cm2 kolber eller kulturretter.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, menneskelige bryst adenocarcinom celler) subkultur
    1. Vokse human brystkræft cellelinjer i 75 cm2 kolber i vækstmed medium (DMEM/F12 medium suppleret med en kommerciel glutamin (1x), antibiotika-antimykotisk opløsning (AA; 100 μg/mL af streptomycin, 100 μg/mL penicillin og 0,025 μg/mL af amphotericin B), og 10% FCS under standard væv kultur betingelser (37 °C, 5% CO2). Skift medium hver 2-3 dage.
    2. Delkonfluentcellekulturerne (70-80 % sammenløb) vaskes med 5 mL HBSS (udenCa. 2+ og Mg2+)og tilsættes 3 mL trypsin (0,5 % fortyndet i HBSS (uden Ca2+ og Mg2+) ved 37 °C i 5 min (mikroskopisk kontrollere, at cellerne er løsrevet).
      BEMÆRK: HBSS kan også erstattes med PBS.
    3. Tilsæt 8 mL 10% FCS medium for at stoppe afmonteringsreaktionen, centrifuge ved 250 x g i 5 min ved RT og kassér supernatanten.
    4. Afbryn pellet i vækstmedium og plade i 75 cm2 kolber eller kulturretter.

2. Spheroid dannelse

  1. Plade 5 x 105 celler/mL (HUVECs og MCF-7) i en 3,5 cm rund skål og kultur i 48 timer.
  2. Behandl eller transfect de belagt celler i 24 timer eller efter ønske.
  3. Valgfrit trin udført i 96-brønd U-bundplade: Vask cellerne med 1 mL HBSS(Ca. 2+ og Mg2+) og plette HUVECs ved hjælp af et blåt farvestof (0,5 μg/mL) og MCF-7 celler ved hjælp af et grønt farvestof (0,5 μM) fortyndet i det respektive vækstmedium og placeres i en 37 °C og 5% CO2 inkubator i 30-40 min.
  4. Vask cellerne med 1 mL HBSS (uden Ca2+ og Mg2+),tilsæt 1 mL enzymatisk løsrivelsesreagens (0,25% trypsin til HUVEC og 0,5% trypsin til MCF-7) til hver rund skål ved hjælp af en P1000 pipette, og inkuber derefter i 2-5 minutter, indtil cellerne er løsrevet.
  5. Saml hver celletype separat i et 5 mL rundbundet polystyrenrør, og tilsæt 1 mL 10% FCS-medium ved hjælp af en P1000-pipette for at stoppe den enzymatiske reaktion. Centrifuge celle suspensioner ved 250 x g i 5 min.
  6. Forsigtigt aspirere supernatant og suspendere cellerne i 1 mL af steroid-fri medium (EBM-2, glutamin , antibiotika-antimykotisk, 0,4% FCS sf (trækul-strippet)).
    BEMÆRK: Steroid-fri medium kan erstattes med normal vækst medium.
  7. Brug 100 μL af hver celleaffjedring fortyndet med 10 mL fortyndings II (se materialetabel)til at bestemme det samlede celletal og beregne mængden af behandlingsmedium (EBM-2, glutamin, antibiotika-antimykotisk, 0,4% FCS sf, køretøj/behandling), der er nødvendig for at opnå en celleopsepension på 5 x 103 celler/mL eller 3,4 x 105 celler/mL pr. celletype.
    1. Antal celler
      1. Tænd for maskinen og skyl ved at trykke på knapperne Funktion og Start (opsætning S3) med FortyndING II-opløsning i et celletællerglas.
      2. Brug opsætningen S4, og tryk på Start for at måle det tomme med frisk FortyndING II-opløsning.
      3. Scintillationsglastet ændres med 100 μL celleaffjedring i 10 mL Fortynding II-opløsning, og prøverne måles: set-up S4 og tryk på Start.
      4. Bemærk antallet af celler pr. minut på den digitale skærm.
        BEMÆRK: Celletælling kan også udføres ved hjælp af andre manuelle eller automatiske systemer: Hæmocytometergitterlinjer, lysspredningscelletællingsteknologi, elektrisk impedans, billedbaserede systemer ved hjælp af cellefarvning, f.eks. trypanblå.
    2. 96-brønd U-bund plader
      1. Forbered 5 mL af hver celle suspension (5 x 103 celler / mL) og bland dem for at få et endeligt volumen på 10 mL i forholdet 1:1.
      2. Brug en manuel gentaget pipette til at pipette 100 μL af celleaffjedringen ud i hver brønd af de 96-brønde U-bundplader.
      3. Placer pladen i en inkubator under standard vævskulturforhold og kontroller for spheroids dannelse efter 48 timer.
      4. Valgfrit trin: Tag billeder af spheroids (40x) ved hjælp af et fluorescens stereomikroskop.
        BEMÆRK: Denne metode genererer 96 spheroids (en spheroid / brønd) efter 48 h (område 1-2 pixel2), og det bruges normalt til vækstundersøgelser.
    3. Hængende dråbe
      1. Bland celleaffjedringerne (3,4 x 105 celler/mL) i et 1:1-forhold for at få et endeligt volumen på 2 mL.
      2. Brug en P20 pipette til at så celleblandingen i form af 15 μL dråber på det omvendte låg på en 10 cm petriskål.
      3. Vend låget med dråberne og tilsæt 5 mL basismedie (EBM-2) i bunden af skålen for at undgå fordampning af dråberne.
        BEMÆRK: Denne metode genererer en spheroid / drop efter 48 timer. Sørg for, at dråberne er tilstrækkeligt adskilt fra hinanden, så de ikke smelter sammen, mens låget skiftes. Brug mere end en 10 cm Petriskål, hvis det er nødvendigt.

3. Spheroid vækst undersøgelse

  1. Plade 100 μL HUVECs og MCF-7 celleblanding (5 x 102 celler/brønd) i 96-brøndE U-bundplader og læg dem i inkubatoren.
  2. 48 timer efter plating, kontrollere for spheroids dannelse med en omvendt mikroskop (Bright felt). Tag billeder (mindst seks billeder pr. behandling, 40x) ved 96 timers kultur.
  3. Åbn billederne ved hjælp af en billedbehandlingssoftware, og behandl billedet til 300 pixel /tommer, og gem billedet som en tiff-fil.
  4. Download ImageJ-softwaren, og åbn den. Klik på indstillingen Filer , og gå til Åbn.
  5. Konverter de områder af interesse til mættede sorte områder på en ensartet måde at have et binært billede (sort og hvid). Til dette skal du vælge indstillingen Billede, vælge Skriv | 8-bit. Billedet er sort og hvidt.
  6. Brug værktøjet Til frihåndsmarkering til at tegne kanten af spheroiderne.
  7. Hvis du vil beregne interesseområdet og adskille objektet eller forgrundspixelerne fra baggrundspixelerne, skal du bruge tærskelfunktionen: Vælg indstillingen Billede, vælg Juster og klik på Threshold.
  8. Nu åbnes pop op-vinduet Threshold. Den øverste linje angiver minimumgrænseværdien: Angiv værdien til nul. Den nederste linje angiver den maksimale tærskelværdi: Flyt søjlen, indtil renteområdet bliver helt rødt.
    BEMÆRK: Hvis farven ikke er rød, skal du vælge Rød i vinduet Tærskel.
  9. Gå til Analyser | Angiv målinger , og vælg Område og Afspærring.
  10. Hvis du vil måle interesseområdet, skal du vælge indstillingen Analyser og bruge værktøjet Analyser partikler. I vinduet Analyser partikler skal du angive størrelsen til at måle (0,00003-Infinity eller 3-Infinity, afhængigt af størrelsen på spheroiderne), skal du vælge Opsummer og vis resultater. Klik derefter på OK.
  11. Resultaterne vises i et diagram. Kopier målingerne til et regneark for at analysere dataene.
    BEMÆRK: Området beregnes som antallet af samlede pixel. Brug det samlede område til beregning.

4. Spheroid immunohistochemistry undersøgelse

  1. Prøveforberedelse
    1. Plade celleblandingen af HUVECs og MCF-7 (5 x 103 celler/brønd) i 96-brønd U-bund plader i HUVEC vækstmedium i 96 timer.
    2. Der opsamles ca. 50 spheroider i et 1,5 mL rør med en skåret spids af en P200 μL pipette. lad dem slå sig ned til bunden af røret ved tyngdekraften, og kassér derefter supernatanten.
    3. Fastgør spheroiderne med 500 μL på 4% PFA i 1 time, RT.
    4. Kog 2% Nobel Agar opløsning i PBS usinga hot plate med en magnetisk omrører i 3-5 min for at opløse agarose pulver helt og køle ned til omkring 60 °C.
    5. Fjern PFA med en P1000 pipette, vask spheroiderne med 500 μL PBS, og lad dem sedimentere. Kassér supernatanten.
    6. Rør forsigtigt 600 μL agaroseopløsning i 1,5 mL-røret med spheroider og læg straks røret i en centrifuge med en vandret rotor ved 177 x g i 2 min.
    7. Tilsæt en kort streng i midten af agaroseopløsningen for nemt at fjerne stikket fra røret.
    8. Størk agarosestikket på is eller ved 4 °C. Der tilsættes 500 μL PBS i 1,5 mL-røret for at undgå udtørring af pelleten.
      BEMÆRK: Prøverne er klar til efterfølgende dehydrering, paraffin indlejring, afsnit, overførsel på mikroskop dias, og IHC farvning (udført af Sophistolab).
  2. Billedopsamling og -behandling
    1. Erhverve billeder af spheroid sektioner ved hjælp af et stereomikroskop.
    2. Gem tre billeder til hvert eksempel som .jpg filer.
    3. Åbn ImageJ-softwaren. Åbn JPEG-billedet, klik på Filer, og klik derefter på Åbn.
    4. Vælg Farve- og farvedekonvolution i indstillingen Billede.
    5. Vælg H DAB-vektorer i vinduet Farvedekonvolution 1.7, og de tre billeder vises.
      BEMÆRK: De tre billeder er: Farve 1 repræsenterer kun Hematoxylin farvning (blå / lilla), og Color 2 repræsenterer kun DAB farvning (brun). Farve 3 er ikke nødvendig for billedanalysen med to farvninger.
    6. Vælg vinduet Farve 1, og angiv tærskel: Gå til | Juster og klik på tærskel. Vinduet Tærskel åbnes.
    7. Lad minimumstærskelværdien være angivet til nul, og juster den maksimale tærskelværdi for at fjerne baggrundssignalet uden at påvirke det sande signal. Klik på Anvend.
      1. Arealmåling
        1. Klik på Analyser, vælg Angiv måling. Vælg Område, Middelgrå værdiog Min og Maks grå værdi, og klik på OK for at bekræfte.
        2. Mål størrelsen på kernen ved hjælp af indstillingen Analyser , og vælg derefter Mål .
          BEMÆRK: Vinduet Resultater giver navnet på billedet (Etiket), størrelsen på billedet (Område), den gennemsnitlige pixelintensitet for IHC-billedet (Middelværdi) og de mindste og maksimale grå værdier (Min, Maks. ). Brug middelværdien til beregning.
        3. Gentag trin 4.2.6-4.7.1.2 for vinduet Farve 2 (og Farve 3, hvis der er dobbelt farvning).
      2. Cellekvantificering
        1. Klik på Proces, vælg indstillingen Binær, og vælg Vandskel for at adskille celler.
        2. Gå til Analyser og klik på Analyser partikler. I pop op-vinduet Analyser partikler skal du indstille cellernes størrelse for at udelukke uspecifikke partikler. Klik derefter på rullelisten på rullelisten Vis , og vælg Dispositioner. Klik derefter på OK.
        3. Gentag trin 4.2.6-4.2.7 og cellekvantificeringstrin (punkt 4.2.7.2) for vinduet Farve 2 (og Farve 3, hvis der er dobbelt farvning).
          BEMÆRK: Nu vises tre vinduer: 1) Oversigtsresultater (antal optalte celler, samlet areal, gennemsnitlig størrelse, % af areal og gennemsnit), 2) Resultater (respektive for de celler, der tælles) og 3) Tegningsvindue (afbildet billede af de celler, der tælles).

5. Levende /død farvning i Spheroids

  1. Forbered 4 mM lageropløsninger af Calcein AM i DMSO (pletter levende celler grønne) og 2 mM Ethidium homodimer i DMSO (pletter døde celler røde) i 1,5 mL rør.
  2. Den mængde opløsning, der er nødvendig for at tilsætte 10 μL/brønd af en blanding af Calcein AM og Ethidium homodimer fortyndet 1:50 i EBM-2.
  3. Tilsæt farvningsblandingen til spheroiderne og læg pladen i inkubatoren under standard vævskulturforhold i 30-60 min.
  4. Hent billeder (40x) ved hjælp af fluorescens stereomikroskopet.

6. Spheroids protein- og RNA-isolering

  1. Forbered celleaffjedring ved 3,4 x 105 celler/mL pr. celletype, bland dem i et forhold på 1:1, og frø celleblandingen ved hjælp af en P20-pipette i form af 15 μL-dråber på låget på en 10 cm Petriskål. Vend låget og læg det i inkubatoren under standard vævskulturforhold i 96 timer.
  2. Brug 5-6 mL PBS til at opsamle spheroider i et 15 mL rundbundet polystyrenrør ved hjælp af 5 mL sterile polystyrenpipetter.
    BEMÆRK: Det er også muligt at bruge 15 ML koniske rør.
  3. Centrifugere spheroids suspension ved 250 x g i 5 min, og derefter forsigtigt aspirere supernatant.
  4. Tilsæt 500 μL trypsin (100%) og pipette op og ned ved hjælp af en P1000 pipette til 30 s for at opdele spheroids, opnå en celle suspension.
  5. Neutralisere trypsin med 10% FCS medium, centrifuge rørene ved 250 x g i 5 min, og aspirere supernatant.
  6. Ifølge producentens protokol (specifikt kit til DNA-fri RNA-isolering) skal du bruge 300 μL RNA lysis buffer til at lyse cellepillen.
    BEMÆRK: Lysis buffer kan også tilføjes direkte til de intakte spheroids (ingen trypsin trin kræves) for at udtrække RNA. Tilsæt 300 μL af lysisbufferen til de pelleterede spheroider, læg rør i is og triturerer 10 gange ved hjælp af en P200 pipette. Derefter isolere RNA som ovenfor. Spheroid dissociation kan være nødvendig, hvis RNA opsving er lav på grund af matrix interferens.
  7. Alternativt kan du bruge 70 μL af Lysis buffer til proteinisolation. Homogenisere for 2-4 s ved sonikering og bestemme proteinkoncentrationen i henhold til producentens protokol ved hjælp af en BCA Assay Kit.
    BEMÆRK: For proteinisolation kan pelletede spheroider lyses direkte i lysisbuffer efterfulgt af sonikering. Brug 25 μg af det samlede protein til at udføre vestlig blot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spheroids model ved hjælp af epitel og endotel co-kulturer er forpligtet til nøje at efterligne in vivo betingelser for brysttumorer for in vitro eksperimenter. Ordningen i figur 1 skildrer protokollen om at danne spheroider med brystkræft epitelceller og vaskulære eller lymfe endotelceller (Figur 1). Hver celletype sås separat i en rund skål på 3,5 cm og behandles med vækststimulatorer/hæmmere eller transfected med oligoukleotider ved hjælp af Lipofectamin. Sammenløbet monolag af epitel- eller endotelceller høstes efter trypsinisering, vaskes og blandes ved et 1:1-forhold. Cellerne er efterfølgende belagt i 96-brønd U-bund plader (Figur 1A) eller på det omvendte låg af en 10 cm diameter rund kultur skål for at lette hængende dråbe kultur (Figur 1B). Kort efter såning fremstår cellerne som flade, tætte ark celler i bunden af hver brønd eller dråbe, og efterfølgende samles de med tiden (24-48 timer), hvilket danner intakte spheroider ved 48 timer. For at undgå skader på de løst dannede celleaggregater må pladerne ikke forstyrres i mindst 24 timer.

I U-bund plader, såning af MCF-7 celler, men ikke endotelceller eller lymfeceller, resulterede i spheroid dannelse efter 48 h (Figur 2A,B, henholdsvis). Desuden resulterede såning af MCF-7 plus endotelceller eller lymfeceller ved et 1:1-forhold også i spheroid dannelse (Figur 2C, D, henholdsvis). For at validere spheroider som en model til at studere tumorvækst blev tidsafhængige ændringer i spheroidstørrelse som reaktion på vækststimulerende opløsning målt /kvantificeret og sammenlignet med de ubehandlede kontroller (Figur 2). Fotomikrografer i figur 2E viser tidsafhængig (24-120 h) sekventiel vækst af en repræsentativ MCF-7 spheroid. Linjegrafen i figur 2F skildrer ændringen i området MCF-7 spheroids over tid, når de behandles med eller uden en vækststimulator. Spheroid størrelse steg fra ~ 100 μm til ~ 200 μm over 5 dage; desuden blev der observeret en øget vækstrate hos spheroider, der blev behandlet med vækststimulatoren (figur 2F). Fordi langvarig behandling (168 h) resulterede i reduceret MCF-7 levedygtighed, potentielt på grund af hypoxiske tilstande i midten af spheroids (Figur 3), 3D struktur vækst blev undersøgt indtil 96 timer. Spheroider dannet med MCF-7 celler og HUVECs viser et lavere antal døde celler på 168 h i forhold til spheroids dannet med MCF-7 alene.

I de første eksperimenter blev kun en lille vækst i spheroids størrelse observeret efter 4 dages kultur. Det var en hypotese, at dette kunne skyldes det høje antal celler sået til at danne spheroids. I U-bund kultur plader, væksten af spheroids kunne have været begrænset af den konkave form af brønden. Da væksten var afhængig af det oprindelige antal celler, der var sået, blev forskellige cellenumre brugt til at danne spheroider til at teste og etablere forhold, der ville være optimale til at overvåge spheroidvækst. Som vist i figur 4tyder resultaterne på, at for spheroidvækstundersøgelser var såning af 500 celler / brønd til at danne spheroids pålidelig og reproducerbar til overvågning af spheroids vækst i 4-6 dage som reaktion på vækstmodulerende faktorer. Spheroider, der var mest egnede til histologiske eller immun-histologiske observationer blev opnået på dag 4, efter såning af 5 x 103 celler / brønd. Den samme indledende koncentration blev anvendt til celleprotein eller RNA-ekstraktioner. Forøgelse af den oprindelige cellekoncentration med mere end 7,5 x 103 celler/brønd forbedrede ikke spheroiddannelsen, og cellerne samledes ikke korrekt og antog uregelmæssige strukturer (Figur 4).

For at evaluere cellesammensætning, spredning og apoptosestatus blev histologiske dele af spheroider dannet med brystkræftceller plus endotelceller undersøgt ved hjælp af H &E og Ki67 (fortynding 1:300) og Cleaved Caspase-3 (fortynding 1:500) antistoffer. Processen til endelig prøveforberedelse kræver omhu/opmærksomhed og præcision. Figur 5A skildrer arbejdsgangen for indsamling og inkorporering af spheroider i agarose til afsnit. Fotomikrografer i figur 5B-C påviser forskellen i MCF-7 spheroid dannelse i nærvær ( Figur5B) og fravær (figur 5C) af Lipofectamin (0,17% endelig koncentration), et almindeligt anvendt transfection middel. Mikroskopiske billeder af histologiske profiler i lysfelt viser en cirkulær, kompakt struktur af en homogen blanding af to celletyper (Figur 5D-G). Spheroidernes struktur og deres cellers form viste ingen abnormiteter efter transfektion med kontrololiigoukleotider i nærværelse af Lipofectamin (figur 5D). Desuden blev celler, der udtrykte den proliferative markør, Ki67, fordelt homogent i spheroiderne; der blev dog også observeret en ring af proliferative celler på overfladen af spheroiderne (Figur 5E). Cleaved Caspase-3 farvning viste apoptotiske celler efter 4 dages kultur (Figur 5F). Histologiske sektioner er nyttige til at evaluere fordelingen af epitel- og endotelceller i spheroider ved hjælp af specifikke markører. Ved hjælp af CD31 som en specifik markør for endotelceller er det muligt at bestemme deres fordeling inden for 3D-strukturen. Da alle cellerne er plettet med Hæmatoxylin (blå farvning af cellens kerne), kan beregningen af CD31-udtrykket give det område af spheroiderne, der indeholder endotelceller efter behandling eller transfektion (protokolafsnit 4.2.7.1.). Desuden er det ved at udføre en dobbelt farvningsanalyse muligt at have endnu mere information, for eksempel som vist i figur 5G, CD31 pletter endotelceller (røde) og Ki67 pletter proliferative celler (brun). Efter protokollen afsnit 4.2.7.2, Figur 5G afslørede, at 55% er epitelceller, 45% er endotelceller, og 25% af cellerne breder sig.

Strukturen af spheroids kan også studeres ved hjælp af immunofluorescence analyse efter mærkning af celler med levende farvestoffer. Sammenflydende 2D-kulturer af HUVEC og MCF-7 celler blev separat farves med blå (HUVEC) og grønne (MCF-7) farvestoffer. Efterfølgende blev de farvede celler indsamlet og blandet ved et 1:1-forhold og sået i brønde til spheroid dannelse. Billeder af fluorescerende celler, der blev farvet, blev taget umiddelbart efter såning (figur 6A) og efter 3 dages kultur (figur 6B). Med det formål at vurdere procentdelen af levende og døde celler blev 4-dages gamle spheroider farves med calcein-AM (grøn) og med ethidium homodimer (rød) (Figur 6C). Spheroider dannet med MCF-7 og HUVECs kunne ikke med held fryses / bevares ved hjælp af standardprotokollerne for frysende celler (vækstmedium suppleret med 10% DMSO og 10% FCS) til frysning af celler. I frosne og optøede spheroider var der tydelige brud på celleaggregater og øget tab af celle levedygtighed. Det repræsentative billede i figur 6D viser en frisk optøet spheroid farvet til døde og levende celler. Det viser, at spheroider er meget følsomme over for fryseforholdene.

Efter 5 dages kultur under forsøgssygdomme var lysis på omkring 100 spheroider nødvendig for at indsamle nok protein (~ 3 μg/mL) eller RNA (~60 ng/μL) til analyse. Figur 7 repræsenterer en arbejdsgang fra spheroids samling (genereret med hængende dråber metode) til celle lysis for protein ekstraktion til at udføre vestlige blotting eller RNA isolation for fremtidige Microarray assays eller analyse af RT-PCR. Isolering af RNA / DNA fra en heterogen cellepopulation i en spheroid til mikroarray analyse kan bringe nogle nyttige oplysninger. For at identificere centrale cellespecifikke mekanismer eller cellecelleinteraktioner kan spheroidcellerne dog adskilles efter enzymatisk (trypsin eller accutase) dissociation ved hjælp af FACS-analyse og RNA fra specifikke celler, der anvendes til mikroarrayanalyse. Desuden kan antibiotikaresistente cellelinjer (f.eks. ved hjælp af EGFP- og/eller puromycinresistenscellelinjer) anvendes i spheroider til at adressere rollen som en bestemt celletype af cellecelleinteraktion. Derudover kan genhæmningsværktøjer bruges til at konstruere cellerne til at løse specifikke problemer med interaktion mellem celler og celler.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for spheroids dannelse. MCF-7 og HUVEC- eller LEC-celler i 2D-kulturer dyrkes separat og indsamles efter forskellige ønskede behandlinger. Spheroids genereres efterfølgende ved direkte blanding af celler i (A) 96-brønd U-bundplader, som fremmer dannelsen af 3D-struktur ved celle-til-celle sammenlægning, eller ved hjælp af (B) hængende dråbekultur, der understøtter spheroids dannelse via tyngdekraften. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Spheroid dannelse og udvikling over tid. Billeder skildrer dannelsen af en spheroid af MCF-7 celler (Panel A), manglen på spheroid dannelse af endotel- eller lymfeceller (HUVECs; (Panel B)) belagt med samme densitet og spheroid dannelse af MCF-7 celler plus HUVECs eller LECs blandet på en 1:1 ratio (Panels C,D). Også afbildet er væksten i størrelsen af en spheroid over tid (24 timer, 48 h, 72 h, 96 h og 120 h). Denne spheroid blev dannet af en blanding af MCF-7 plus HUVECs i et 1:1-forhold og seedet ved en massefylde på 500 celler / brønd af en 96-brønd U-bundplade (Panel E) (skalalinje = 200 μm, 40x). Linjegraf (Panel F) viser den tidsafhængige vækst i kontrol (CTR) versus vækststimulet (Behandling) spheroider. Spheroids områder blev målt og sammenlignet mellem ubehandlede og behandlede spheroider. Resultaterne repræsenterer ± SEM, *** p < 0,001 sammenlignet med den respektive kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Spheroids langsigtet kultur og levedygtighed. Fotomikrograf viser celle levedygtighed i spheroider dannet med MCF-7 celler alene ved 96 h (Panel A) og 168 h (Panel C), mens paneler B og D skildrer celle levedygtighed i spheroids lavet med MCF-7 plus HUVECs (1:1 ratio) ved 96 h (Panel B) og 168 h ( PanelD) (skala bar = 100 μm). Celler blev farves med Calcein (røde, døde celler) og Ethidium homodimer (grønne, levende celler). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Celle såningstæthed og tidsafhængig vækstprofil af MCF-7 plus HUVEC spheroid. HUVECs og MCF-7 celler blandet på en 1:1 ratio blev seedet ved stigende tætheder (102-104 celler / brønd), og væksten af spheroids blev overvåget over 24-96 h. Mikroskopiske lysfeltbilleder blev taget (skalastang = 200 μm, 40x) for at vurdere spheroidvækst over tid. Celler ved en densitet på 500 celler / godt forudsat optimal størrelse til at studere spheroid vækst. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Spheroid indlejring til indsnit og histologisk farvning. Panel A: Cartoon, der skildrer arbejdsgangen for indsamling og inkorporering af HUVECs/MCF-7 spheroider i agarose. Efter paraffin indlejring af spheroids i en agarose stik og eskapsler af paraffin blokke, prøverne blev brugt til standard histologiske farvning. Panel B og C viser repræsentant MCF-7 plus HUVEC spheroider behandlet uden og med Lipofectamin 2000, henholdsvis (skala bar = 200 μm, 40x). Paneler D-G viser repræsentative billeder af spheroid sektioner farves med specifikke markører. Panel D viser spheroids farves med hæmatoxylin-eosin at vurdere spheroid struktur (skala bar = 100 μm). Farvning i panel E skildrer mangfoldige celler positivt plettet med Ki67. Panel F viser apoptotiske celler i en spheroid positivt plettet med Cleaved Caspase-3 (skala bar = 50 μm). Panel G skildrer spheroid sektioner med dobbelt farvning: CD31 (endotelceller markør) og Ki67 (proliferative markør) (skala bar = 100 μm). Afsnittet af spheroider og farvning blev udført af Sophistolab (info@sophistolab.ch). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Fluorescensbilleder af MCF-7/HUVEC spheroider, der viser cellefordeling og levedygtighed. Panel A og B skildrer repræsentative spheroids med HUVECs farves med en blå farvestof og MCF-7 celler farves med et grønt farvestof. Lokaliseringen af HUVEC og MCF-7 i spheroiden varierer umiddelbart efter såning (A) og efter spheroiddannelse (B) (skalastang = 250 μm). Panel C-D viser spheroider farves med Calcein / Ethidium Homodimer at identificere levende (grønne) og døde celler (rød) i 3D-strukturer i normal kultur tilstand (C) og efter frysning (D) (Skala bar = 100 μm). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Skematisk repræsentation af spheroidsamling til biokemisk analyse. Tegneserie, der viser ordningen for at høste spheroids, adskille eller frigive celler, og suspendere dem i lysis opløsning til proteinanalyse eller RNA-ekstraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med 2D-cellekulturer er revolutionerende 3D-spheroidkulturteknologi et bedre og mere kraftfuldt værktøj til at rekonstruere et organs mikromiljø, cellecelleinteraktioner og lægemiddelrespons in vitro. Dette er den første protokol, der beskriver dannelsen af spheroider fra flercellede (epitel- og endotelcellelinjer) til brystkræftforskning. Denne protokol sikrer spheroidal 3D-vækst af spheroider i op til 5 dage, og spheroids kan undersøges efter paraffin indlejring, sektion og histologisk farvning. Interessant nok udtrykker de cellulære elementer i spheroiden stadig receptorer, der fremmer cellevækst og er lydhøre over for proliferative og apoptotiske stimuli. Den beskrevne protokol genererer tilstrækkeligt biologisk materiale til protein- eller RNA/DNA-analyse. Ovenstående samkultursystem, der let kan opnås under laboratorieforhold og til lave omkostninger, kan være en fordel for fremtidige anvendelser, især inden for brystkræftbehandling og til test af lægemiddelfølsomhed. Derudover kan denne protokol anvendes på forskellige epitel- og endotelcelletyper.

Det er yderst vanskeligt at efterligne in vitro et komplekst væv, der findes in vivo. Dette skyldes, at in vivovæv består af mange interagerende komponenter, herunder nerver, blodkar, mesenchyme og immunceller30,42. Formålet med denne protokol er at overvinde nogle af disse begrænsninger ved hjælp af en 3D co-kultur system med to forskellige celletyper til at nærme sig den faktiske tumor tilstand. Her er spheroids blevet dannet med epiteltumorer i kombination med endotelceller eller lymfeceller for at efterligne in vivo-situationen så meget som muligt, herunder cellecelleinteraktioner, modtagelighed for apoptotiske faktorer frigivet i de intercellulære rum af døende celler og hypoxiske tilstande i midten af spheroiderne. Denne protokol er blevet optimeret til test af cellulære reaktioner på vækstfaktorer, signalfaktorer og hormoner, som hurtigt aktiverer signaleringskaskader og målretter gentransskription og stimulerer proteinudtryk og transport30,31. I spheroider, men ikke in vivo, kan svar fra tumorceller på stimuli vurderes hurtigt og ofte.

I denne undersøgelse synes endotelceller i spheroiderne ikke at danne kapillærlignende strukturer. Da endotelceller har vist sig at danne kapillærer, når de er belagt med lav densitet og monolag ved høj densitet, er det muligt, at en sænkning af FORHOLDET MELLEM MCF-7 og endotelceller kan resultere i kapillærdannelse i spheroiderne. Alternativt kan tilsætning af specifikke matrixproteiner eller matrigel fremme kapillærdannelse. Manglen på kapillær-lignende struktur i spheroiden ikke udvande fordelen ved MCF-7 plus endotelceller versus MCF-7 celler i sig selv, da de faktorer, der frigives af MCF-7 celler kunne fremme endotelcellespredning og vice versa; sådanne interaktioner vil forblive uopdaget i MCF-7 kun spheroids.

Flere undersøgelser har vist, at 5 x 103 celler/brønd var den rette koncentration til frøceller til at danne spheroids43,44,45,46,47; Men i 96-brønd U-bund plader begrænsede dette antal celler den koordinerede vækst af spheroider under eksperimentelle forhold. Derfor er det i hver ny undersøgelse for hver ny celletype vigtigt at overvåge væksten af 3D-systemet efter lægemiddelbehandling for at bestemme virkningen af behandlingen på spheroid størrelse.

Begrænsningen af den nuværende protokol er, at kulturen af tidligere dannede spheroider ikke kan fortsættes efter frysning og optøning ved den klassiske DMSO-metode. Faktisk, når optøet, de fleste af cellerne var døde. Vitrifikation kan vise sig at være et alternativ til at holde cellerne i live48.

Omhyggelig opmærksomhed på tekniske detaljer er nødvendig for at undgå fejl og producere og opretholde velformede spheroids. En udfordring er prøvepræparatet til immunstainning (punkt 4.1). For at lette overførslen ved at pipetter spheroiderne ind i 1,5 mL-røret er det vigtigt at bruge et P200 tip skåret med en saks, så hullets område er større end selve spheroiderne. Ellers kan overførslen ødelægge kuglerne. En anden udfordring er, hvordan man aspirere mediet efter spheroids har slået sig ned til bunden af et reagensglas. I denne henseende er det bedre at bruge en P1000 pipette i stedet for en vakuumpumpe for at undgå aspiration af spheroids. Et vigtigt og delikat skridt i forberedelsen af spheroiderne til sektion er at tilføje agarose til de pelleted spheroids. Spheroiderne, når de er suspenderet i agarose, skal pelleted hurtigt til bunden af mikrofugerøret ved hjælp af vandret centrifugering ved stuetemperatur og før agarose polymeriseres.

Samlet set giver de tocellede spheroide lavet af MCF-7 og endotelceller et levedygtigt alternativ til at undersøge cellecelleinteraktioner og mekanismer, der driver væksten af enten kræftceller eller endotelceller i en tumor. Spheroids kunne tjene som en model til at vurdere effekten af terapeutiske midler rettet mod tumor eller kræft vækst. Vigtigere, denne to-cellede model kunne yderligere improviseres til at omfatte andre celletyper relevante i tumorvækst. I denne sammenhæng, fibroblaster, der udgør 80% af brystsvulst masse kan indgå til at danne en MCF-7, endotelceller, og fibroblast spheroid. Desuden kan genhæmning og genetisk manipulerede celler bruges til at løse rollen som cellecelleinteraktion, hormonreceptorer (østrogen / progesteron), vækstfaktorer og signalveje på tumor / kræftvækst samt til at teste effekten af nye anti-cancer molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League bevilling KFS-4125-02-2017 til RKD og National Institute of Health tilskud DK079307 til EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
  3. Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
  4. Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
  5. Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
  6. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  7. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  8. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
  9. Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
  10. Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
  11. Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (1), 151-165 (2020).
  12. Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
  13. Little, M. H. Organoids: a special issue. Development. 144 (6), Cambridge, England. 935-937 (2017).
  14. Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
  15. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  16. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  17. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  18. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  19. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  20. Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
  21. Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
  22. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
  23. Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W. Towards manufacturing of human organoids. Biotechnology Advances. 39, 107460 (2020).
  24. Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
  25. Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
  26. Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
  27. DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A. Breast cancer statistics, 2013. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 64 (1), 52-62 (2014).
  28. Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
  29. Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
  30. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  31. Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
  32. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
  34. Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  35. Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
  36. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  37. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  38. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
  39. Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C. Progress in melanoma modelling in vitro. Experimental Dermatology. 27 (5), 578-586 (2018).
  40. Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
  41. Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
  42. Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
  43. Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
  44. Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
  45. Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
  46. Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
  47. Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
  48. Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).

Tags

Kræftforskning Udgave 173 brystkræft tumor spheroider neovascularization lymfekar tumorvækst endotelceller epitelceller cellespredning
Bryst epitel og endotelcellespheroider som en potentiel funktionel <em>in vitro-model</em> til brystkræftforskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azzarito, G., Szutkowska, M. E.,… More

Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter