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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in vitro potentiel pour la recherche sur le cancer du sein

Published: July 12, 2021 doi: 10.3791/62940
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1, 1,3
1Department of Reproductive Endocrinology, Wagistrasse 14, University of Zurich and University Hospital Zurich, 2Department of Dermatology, Wagistrasse 18, University of Zurich and University Hospital Zurich, 3Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh

Summary

La diaphonie entre les cellules épithéliales mammaires et les cellules endothéliales contribue de manière importante à la progression du cancer du sein, à la croissance tumorale et aux métastases. Dans cette étude, les sphéroïdes ont été fabriqués à partir de cellules cancéreuses du sein avec des cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques et démontrent leur applicabilité en tant que système in vitro pour la recherche sur le cancer du sein.

Abstract

Le cancer du sein est la principale cause de mortalité chez les femmes. La croissance des cellules cancéreuses du sein et leurs métastases subséquentes sont un facteur clé de sa progression. Bien que les mécanismes impliqués dans la promotion de la croissance du cancer du sein aient été étudiés de manière intensive à l’aide de monocultures de cellules cancéreuses du sein telles que les cellules MCF-7, la contribution d’autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques qui sont intimement impliquées dans la croissance tumorale, n’a pas été étudiée en profondeur. L’interaction cellule-cellule joue un rôle clé dans la croissance et la progression tumorales. La néoangiogenèse, ou le développement des vaisseaux, est essentielle à la croissance tumorale, tandis que le système lymphatique sert de portail pour la migration des cellules cancéreuses et les métastases ultérieures. Des études récentes fournissent des preuves que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques peuvent influencer de manière significative la croissance des cellules cancéreuses. Ces observations impliquent la nécessité de développer des modèles in vitro qui refléteraient de manière plus réaliste les processus de croissance du cancer du sein in vivo. De plus, les restrictions dans la recherche animale nécessitent le développement de modèles ex vivo pour mieux élucider les mécanismes impliqués.

Cet article décrit le développement de sphéroïdes du cancer du sein composés à la fois de cellules cancéreuses du sein (cellules MCF-7 positives aux récepteurs d’œstrogènes) et de cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques. Le protocole décrit une approche détaillée étape par étape dans la création de sphéroïdes à deux cellules en utilisant deux approches différentes, la goutte suspendue (étalon-or et bon marché) et les plaques à fond en U à 96 puits (coûteuses). Des instructions détaillées sont fournies sur la façon de ramasser délicatement les sphéroïdes formés pour surveiller la croissance par dimensionnement microscopique et évaluer la viabilité à l’aide de la coloration des cellules mortes et vivantes. De plus, les procédures pour fixer les sphéroïdes pour la section et la coloration avec des anticorps spécifiques à la croissance afin de différencier les modèles de croissance chez les sphéroïdes sont délimitées. En outre, des détails pour la préparation des sphéroïdes avec des cellules transfectées et des méthodes d’extraction de l’ARN pour l’analyse moléculaire sont fournis. En conclusion, cet article fournit des instructions détaillées pour la préparation des sphéroïdes multicellulaires pour la recherche sur le cancer du sein.

Introduction

L’utilisation d’animaux pour des expériences a des limites. Les études animales ne peuvent pas imiter avec précision la progression de la maladie chez les humains, et les animaux et les humains n’ont pas de réponses identiques aux agents pathogènes. En outre, des restrictions dans l’expérimentation animale en raison de préoccupations concernant la souffrance animale et des problèmes éthiques1,2 limiter de plus en plus les programmes de recherche. In vitro des systèmes ont été largement mis au point pour contourner l’utilisation des animaux; de plus, l’utilisation de cellules humaines a fait in vitro modèles plus pertinents pour l’investigation physiopathologique et thérapeutique. Les cultures cellulaires monocouches conventionnelles (2D) sont largement utilisées car elles imitent les tissus humains dans une certaine mesure. Cependant, les monocultures 2D ne parviennent pas à imiter les organes humains, et les monocultures 2D sont incapables de simuler le microenvironnement complexe des organes d’origine et d’imiter le in vivo situation3,4,5,6. De plus, dans les cultures cellulaires monocouches, les traitements médicamenteux pourraient facilement détruire / endommager toutes les cellules. Il est important de noter que certaines de ces limitations peuvent être surmontées en passant à des cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) multicouches7,8. En fait, il a été démontré que les modèles de culture 3D reflètent mieux la structure cellulaire, la disposition et la fonction des cellules dans les tissus primaires. Ces cultures 3D peuvent être formées en utilisant une variété de lignées cellulaires, semblables à un organe fonctionnel. En effet, il existe deux modèles de cultures 3D. Un modèle produit des sphéroïdes de cellules agrégées qui forment des amas et les réorganisent en sphères (modèles sans échafaudage). Le second donne des organoïdes, qui ont une structure plus complexe et consistent en des combinaisons de plusieurs cellules spécifiques à un organe, qui sont considérées comme une version miniature des organes.9,10. Pour cette raison, les systèmes de culture 3D représentent une technologie innovante avec de nombreuses applications biologiques et cliniques. Ainsi, les sphéroïdes et les organoïdes ont de nombreuses applications pour la modélisation des maladies et les études liées à la médecine régénérative, au dépistage des médicaments et aux études toxicologiques.6,11,12,13,14,15. Les sphéroïdes cancérigènes, dérivés de la technologie 3D, recréent la morphologie et le phénotype des types de cellules pertinents, imitent le in vivo microenvironnement tumoral et modèles de communications cellulaires et de voies de signalisation qui sont opérationnelles pendant le développement de la tumeur16,17,18. En outre, pour améliorer la compréhension de la biologie du cancer, les sphéroïdes / organoïdes tumoraux peuvent également être utilisés pour identifier un traitement anticancéreux potentiel spécifique au patient (personnalisé) et évaluer son efficacité, sa toxicité et ses effets à long terme.19,20,21,22. Les sphéroïdes ont ouvert d’importantes possibilités d’étudier la physiopathologie, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en raison de leur capacité à préserver l’architecture cellulaire et tridimensionnelle des tissus, la capacité d’imiter le in vivo et les interactions cellule-cellule. Cependant, il faut également être conscient des limites de ce système, telles que l’absence de composant vasculaire / systémique, système immunitaire ou nerveux fonctionnel, et le système représente une approche réductionniste par rapport aux modèles animaux. En effet, contrairement aux modèles animaux, les structures 3D ne fournissent qu’une approximation de la biologie au sein d’un corps humain. Comprendre les limites de la méthode 3D peut aider les chercheurs à concevoir des processus plus raffinés et valides pour produire des sphéroïdes qui représentent mieux un organe à plus grande échelle23,24,25.

Le cancer est la principale cause de décès dans le monde, et le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes26,27,28. Pour imiter le microenvironnement complexe du cancer du sein, les sphéroïdes du cancer du sein doivent être cultivés à l’aide de cellules qui jouent un rôle de premier plan dans les tumeurs du sein, c’est-à-dire les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les fibroblastes et / ou les cellules immunitaires. De plus, pour un sphéroïde représentant le cancer du sein, l’expression des récepteurs hormonaux féminins (récepteurs œstrogènes/progestérone), la capacité de conserver l’état histologique de la tumeur de la patiente et la capacité d’imiter la réponse au traitement doivent également être prises en compte. Des études ont montré que les systèmes de co-culture 3D ont une organisation cellulaire similaire à celle du tissu primaire in vivo,ont la capacité de réagir en temps réel aux stimuli, et ont des récepteurs androgènes fonctionnels29,30,31,32. Par conséquent, une approche similaire pourrait être utile pour imiter une tumeur du sein in vitro. Le but du protocole actuel est d’établir une nouvelle méthode de génération de sphéroïdes du cancer du sein. Cette méthode utilise des cellules MCF-7 à récepteurs d’œstrogènes positifs (une lignée cellulaire humaine immortalisée de cellules épithéliales) et des cellules endothéliales vasculaires (HUVEC) ou des cellules endothéliales lymphatiques (HMVEC-DNeo) pour créer un modèle qui imite ou reflète étroitement les interactions entre ces cellules au sein d’une tumeur. Bien que les cellules MCF-7 (sensibles aux œstrogènes) et endothéliales aient été utilisées pour développer des sphéroïdes dans la présente étude, d’autres cellules telles que les fibroblastes qui représentent environ 80% de la masse tumorale du sein pourraient également être combinées à l’avenir pour mieux représenter et imiter la tumeur mammaire.

Il existe plusieurs méthodes pour former des sphéroïdes, telles que: 1) la méthode des gouttelettes suspendues qui utilise la gravité33,34; 2) la méthode de lévitation magnétique qui utilise des nanoparticules magnétiques exposées à un aimant externe 35 , et3)la méthode de microplaque sphéroïde qui est réalisée en ensemençant des cellules sur des plaques à faible fixation36,37. Sur la base des méthodes existantes, qui n’utilisent qu’un seul type de cellule, le présent protocole a été optimisé en utilisant des cellules épithéliales et endothéliales pour mieux imiter les conditions de croissance des tumeurs du cancer du sein in vivo38,39,40,41. Cette méthode peut être facilement réalisée en laboratoire à faible coût et avec un minimum d’équipement. Sur la base des besoins / objectifs du laboratoire, différentes approches ont été utilisées pour former des sphéroïdes et obtenir du matériel cellulaire pertinent à partir de ces sphéroïdes. Dans ce contexte, pour l’analyse de l’ADN, de l’ARN ou des protéines, les sphéroïdes 3D sont produits en co-cultivant des cellules endothéliales et épithéliales avec la méthode de la goutte suspendue. Cependant, pour les études fonctionnelles, par exemple, pour surveiller la croissance cellulaire après une transfection interférente courte (siRNA) et / ou un traitement hormonal, les sphéroïdes sont générés à l’aide de plaques à fond en U.

Le but de ce protocole technique est de fournir une description détaillée étape par étape pour 1) la formation de sphéroïdes multicellulaires du cancer du sein, 2) la préparation d’échantillons pour la coloration histologique et 3) la collecte de cellules pour l’extraction de l’ARN, de l’ADN et des protéines. La méthode de chute suspendue peu coûteuse et les plaques à fond en U plus chères sont utilisées pour former des sphéroïdes. Ici, un protocole pour préparer (fixer) les sphéroïdes pour la section et l’immunocoloration ultérieure avec des marqueurs pour évaluer la prolifération cellulaire, l’apoptose et la distribution des cellules épithéliales et endothéliales dans un sphéroïde est fourni. De plus, ce protocole montre une analyse complète étape par étape des données histologiques à l’aide du logiciel ImageJ. L’interprétation des données biologiques varie en fonction du type d’expérience et des anticorps utilisés. La section des sphéroïdes fixes et la coloration ultérieure des sections ont été effectuées par un laboratoire de pathologie de routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

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Protocol

1. Culture cellulaire

REMARQUE: Effectuer la manipulation des cellules dans des conditions stériles.

  1. Sous-culture des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)
    1. Enduire 75 cm2 flacons de collagène (5 μg/cm2) (queue de rat) pendant la nuit (ON) à température ambiante (RT) ou 2-3 h à 37 °C, rincer à l’eau et laisser sécher la fiole.
    2. Cultiver des HUVEC en milieu de croissance (EBM-2, Milieu basal endothélial-2) complétés par de la glutamine (1x = 2 mM), une solution antibiotique-antimycotique (AA; 100 μg/mL de streptomycine, 100 μg/mL de pénicilline et 0,025 μg/mL d’amphotéricine B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL d’hydrocortisone, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain, 3 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes de base humains, 10 μg/mL d’héparine) et 10 % de FCS (sérum de veau fœtal) dans des conditions de culture tissulaire standard (37 °C, 5 % de CO2). Changez le milieu tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 70% à 80%.
    3. Laver les cultures sous-confluentes avec 5 mL de HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)et ajouter 3 mL de trypsine (0,25% dilué dans HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)).
      REMARQUE: HBSS peut également être remplacé par PBS.
    4. Incuber les cellules à 37 °C pendant 2 min (vérifier au microscope si les cellules sont détachées et arrondies vers le haut) et arrêter la réaction de détachement en ajoutant 6 mL de milieu FCS à 10 % (DMEM-F12 ou EBM-2, 10 % FCS).
    5. Centrifuger la suspension de la cellule à 250 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant.
    6. Suspendez les cellules dans un milieu de croissance et ensemencez dans des flacons de 75 cm2 ou des plats de culture.
  2. Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, cellules d’adénocarcinome du sein humain) sous-culture
    1. Cultiver des lignées cellulaires de cancer du sein humain dans des flacons de 75 cm2 en milieu de croissance (milieu DMEM/F12 complété par une glutamine commerciale (1x), une solution antibiotique-antimycotique (AA; 100 μg/mL de streptomycine, 100 μg/mL de pénicilline et 0,025 μg/mL d’amphotéricine B), et 10 % de FCS dans des conditions de culture tissulaire standard (37 °C, 5 % de CO2). Changez le milieu tous les 2-3 jours.
    2. Laver les cultures cellulaires sous-fluides (confluence à 70%-80%) avec 5 mL de HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)et ajouter 3 mL de trypsine (0,5% diluée dans HBSS (sans Ca2+ et Mg2+)à 37 °C pendant 5 min (vérifier au microscope que les cellules sont détachées).
      REMARQUE: HBSS peut également être remplacé par PBS.
    3. Ajouter 8 mL de milieu FCS à 10 % pour arrêter la réaction de détachement, centrifuger à 250 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant.
    4. Suspendre le granulé dans un milieu de croissance et une assiette dans des flacons de 75 cm2 ou des plats de culture.

2. Formation de sphéroïdes

  1. Plaque 5 x 105 cellules/mL (HUVEC et MCF-7) dans un plat rond de 3,5 cm et culture pendant 48 h.
  2. Traiter ou transfecter les cellules plaquées pendant 24 h ou comme vous le souhaitez.
  3. Étape optionnelle effectuée dans une plaque à fond en U à 96 puits : Laver les cellules avec 1 mL de HBSS (Ca2+ et Mg2+)et colorer les HUVEC à l’aide d’un colorant bleu (0,5 μg/mL) et des cellules MCF-7 à l’aide d’un colorant vert (0,5 μM) dilué dans le milieu de croissance respectif et placer dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 à 40 min.
  4. Lavez les cellules avec 1 mL de HBSS (sans Ca2+ et Mg2+),ajoutez 1 mL de réactif de détachement enzymatique (0,25% de trypsine pour HUVEC et 0,5% de trypsine pour MCF-7) à chaque plat rond à l’aide d’une pipette P1000, puis incubez pendant 2 à 5 minutes jusqu’à ce que les cellules soient détachées.
  5. Recueillir chaque type de cellule séparément dans un tube de polystyrène à fond rond de 5 mL et ajouter 1 mL de milieu FCS à 10 % à l’aide d’une pipette P1000 pour arrêter la réaction enzymatique. Centrifuger les suspensions cellulaires à 250 x g pendant 5 min.
  6. Aspirer soigneusement le surnageant et suspendre les cellules dans 1 mL de milieu sans stéroïdes (EBM-2, glutamine, antibiotique-antimycotique, 0,4% FCS sf (dépouillé de charbon de bois)).
    REMARQUE: Le milieu sans stéroïdes peut être remplacé par un milieu de croissance normal.
  7. Utiliser 100 μL de chaque suspension cellulaire diluée avec 10 mL de diluant II (voir Tableau des matériaux)pour déterminer le nombre total de cellules et calculer la quantité de milieu de traitement (EBM-2, glutamine, antibiotique-antimycotique, 0,4 % FCS sf, véhicule/traitement) nécessaire pour obtenir une suspension cellulaire de 5 x 103 cellules/mL ou 3,4 x 105 cellules/mL par type de cellule.
    1. Nombre de cellules
      1. Allumez la machine et rincez en appuyant sur les boutons Fonction et Démarrer (configuration S3), avec la solution de diluant II dans un flacon de compteur de cellules.
      2. Utilisez set up S4 et appuyez sur Start pour mesurer l’ébauche avec une solution fraîche de Diluent II.
      3. Changer le flacon de scintillation avec 100 μL de suspension cellulaire dans 10 mL de solution de Diluant II et mesurer les échantillons: installez S4 et appuyezsur Démarrer .
      4. Notez le nombre de cellules par mL sur l’affichage numérique.
        REMARQUE: Le comptage cellulaire peut également être effectué à l’aide d’autres systèmes manuels ou automatiques: quadrillage de l’hémocytomètre, technologie de comptage des cellules à diffusion de lumière, impédance électrique, systèmes basés sur l’imagerie utilisant la coloration cellulaire, par exemple, bleu trypan.
    2. Plaques à fond en U de 96 puits
      1. Préparer 5 mL de chaque suspension cellulaire (5 x 103 cellules/mL) et les mélanger pour obtenir un volume final de 10 mL dans un rapport de 1:1.
      2. Utilisez une pipette à répétition manuelle pour pipeter 100 μL de la suspension de la cellule dans chaque puits des plaques de fond en U de 96 puits.
      3. Placez la plaque dans un incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard et vérifiez la formation de sphéroïdes après 48 h.
      4. Étape optionnelle : Prenez des photos des sphéroïdes (40x) à l’aide d’un stéréomicroscope à fluorescence.
        REMARQUE: Cette méthode génère 96 sphéroïdes (un sphéroïde / puits) après 48 h (zone 1-2 pixel2), et elle est généralement utilisée pour les études de croissance.
    3. Goutte suspendue
      1. Mélanger les suspensions cellulaires (3,4 x 105 cellules/mL) dans un rapport de 1:1 pour obtenir un volume final de 2 mL.
      2. Utilisez une pipette P20 pour ensemencer le mélange cellulaire sous forme de gouttes de 15 μL sur le couvercle inversé d’une boîte de Petri de 10 cm.
      3. Inverser le couvercle avec les gouttes et ajouter 5 mL de milieu de base (EBM-2) au fond du plat pour éviter l’évaporation des gouttes.
        REMARQUE: Cette méthode génère un sphéroïde / goutte après 48 h. Assurez-vous que les gouttes sont suffisamment éloignées les unes des autres, afin qu’elles ne fusionnent pas lors du changement de couvercle. Utilisez plus d’une boîte de Petri de 10 cm si nécessaire.

3. Étude de croissance des sphéroïdes

  1. Plaque 100 μL de HUVEC et mélange de cellules MCF-7 (5 x 102 cellules/puits) dans des plaques à fond en U de 96 puits et placez-les dans l’incubateur.
  2. 48 h après le placage, vérifiez la formation de sphéroïdes avec un microscope inversé (champ lumineux). Prenez des photos (au moins six photos par traitement, 40x) à 96 h de culture.
  3. Ouvrez les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’image et traitez l’image à 300 pixels / pouce et enregistrez l’image sous forme de fichier tiff.
  4. Téléchargez le logiciel ImageJ et ouvrez-le. Cliquez sur l’option Fichier et accédez à Ouvrir.
  5. Convertissez les zones d’intérêt en zones noires saturées de manière uniforme pour avoir une image binaire (noir et blanc). Pour cela, sélectionnez l’option Image, choisissez Type | 8 bits. Maintenant, l’image est en noir et blanc.
  6. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour dessiner la bordure des sphéroïdes.
  7. Pour calculer la zone d’intérêt et séparer l’objet ou les pixels de premier plan des pixels d’arrière-plan, utilisez la fonction de seuil: Sélectionnez l’option Image, choisissez Ajuster et cliquez sur Seuil.
  8. Maintenant, une fenêtre contextuelle Seuil s’ouvrira. La barre supérieure indique la valeur de seuil minimale : définissez la valeur à zéro. La barre inférieure indique la valeur de seuil maximale : déplacez la barre jusqu’à ce que la zone d’intérêt devienne complètement rouge.
    REMARQUE : Si la couleur n’est pas rouge, sélectionnez Rouge dans la fenêtre Seuil.
  9. Aller à Analyser | Définissez Mesures et sélectionnez Zone et périmètre.
  10. Pour mesurer la zone d’intérêt, sélectionnez l’option Analyser et utilisez l’outil Analyser les particules. Dans la fenêtre Analyser les particules, définissez la taille à mesurer (0,00003-infini ou 3-infini, selon la taille des sphéroïdes), sélectionnez Résumer et afficher les résultats. Ensuite, cliquez sur OK.
  11. Les résultats apparaîtront dans un graphique. Copiez les mesures dans une feuille de calcul pour analyser les données.
    REMARQUE: La zone est calculée comme le nombre total de pixels; utilisez la zone totale pour le calcul.

4. Étude d’immunohistochimie sphéroïde

  1. Préparation des échantillons
    1. Plaquer le mélange cellulaire de HUVEC et de MCF-7 (5 x 103 cellules/puits) dans des plaques à fond en U de 96 puits dans un milieu de croissance HUVEC pendant 96 h.
    2. Recueillir environ 50 sphéroïdes dans un tube de 1,5 mL avec une pointe coupée d’une pipette P200 μL; laissez-les se déposer au fond du tube par gravité, puis jetez le surnageant.
    3. Fixez les sphéroïdes avec 500 μL de PFA à 4% pendant 1 h, RT.
    4. Faire bouillir la solution de gélose Nobel à 2% dans du PBS à l’aide d’une plaque chauffante avec un agitateur magnétique pendant 3-5 min pour dissoudre complètement la poudre d’agarose et refroidir à environ 60 ° C.
    5. Retirez le PFA avec une pipette P1000, lavez les sphéroïdes avec 500 μL de PBS et laissez-les sédimenter. Jetez le surnageant.
    6. Pipeter soigneusement 600 μL de solution d’agarose dans le tube de 1,5 mL avec des sphéroïdes et placer le tube immédiatement dans une centrifugeuse avec un rotor horizontal à 177 x g pendant 2 min.
    7. Ajoutez une ficelle courte au milieu de la solution d’agarose pour retirer facilement le bouchon du tube.
    8. Solidifier le bouchon d’agarose sur de la glace ou à 4 °C. Ajouter 500 μL de PBS dans le tube de 1,5 mL pour éviter le dessèchement de la pastille.
      REMARQUE: Les échantillons sont prêts pour la déshydratation ultérieure, l’incorporation de paraffine, le sectionnement, le transfert sur les lames du microscope et la coloration IHC (effectuée par Sophistolab).
  2. Acquisition et traitement d’images
    1. Acquérir des images de sections sphéroïdes à l’aide d’un stéréomicroscope.
    2. Enregistrez trois images pour chaque exemple en tant que fichiers .jpg.
    3. Ouvrez le logiciel ImageJ. Ouvrez l’image JPEG, cliquez sur Fichier puis sur Ouvrir.
    4. Sélectionnez Déconvolution des couleurs et des couleurs dans l’option Image.
    5. Sélectionnez vecteurs DAB H dans la fenêtre Déconvolution des couleurs 1.7 et les trois images s’affichent.
      REMARQUE: Les trois images sont: La couleur 1 représente uniquement la coloration à l’hématoxyline (bleu / violet) et la couleur 2 représente uniquement la coloration DAB (brun). La couleur 3 n’est pas nécessaire pour l’analyse d’image avec deux colorations.
    6. Sélectionnez la fenêtre Couleur 1 et définissez le seuil : accédez à Image | Ajustez et cliquez sur Seuil. La fenêtre Seuil s’affiche.
    7. Laissez la valeur de seuil minimale définie à zéro et ajustez la valeur de seuil maximale pour supprimer le signal d’arrière-plan sans influencer le signal réel. Cliquez sur Appliquer.
      1. Mesure de surface
        1. Cliquez sur Analyser, choisissez Définir la mesure. Sélectionnez Zone, Valeur grise moyenneet Valeur grise min et maximale et cliquez sur OK pour confirmer.
        2. Mesurez la taille du noyau à l’aide de l’option Analyser, puis sélectionnez Mesurer.
          REMARQUE : La fenêtre Résultats donne le nom de l’image (étiquette), la taille de l’image (zone), l’intensité moyenne en pixels de l’image IHC (moyenne) et les valeurs de gris minimales et maximales (Min, Max). Utilisez la valeur moyenne pour le calcul.
        3. Répétez les étapes 4.2.6 à 4.7.1.2 pour la fenêtre Couleur 2 (et Couleur 3 s’il y a double coloration).
      2. Quantification cellulaire
        1. Cliquez sur Processus, choisissez l’option Binaire et sélectionnez Watershed pour séparer les cellules.
        2. Allez dans Analyser et cliquez sur Analyser les particules. Dans la fenêtre contextuelle Analyser les particules, définissez la taille des cellules pour exclure les particules non spécifiques. Ensuite, dans l’option Afficher, cliquez sur la liste déroulante et sélectionnez Contours. Ensuite, cliquez sur OK.
        3. Répétez les étapes 4.2.6 à 4.2.7 et les étapes de quantification des cellules (section 4.2.7.2) pour la fenêtre Couleur 2 (et Couleur 3 s’il y a double coloration).
          REMARQUE: Maintenant, trois fenêtres apparaîtront: 1) Résultats récapitulatifs (nombre de cellules comptées, surface totale, taille moyenne, % de la surface et moyenne), 2) Résultats (respectivement aux cellules comptées) et 3) Fenêtre de dessin (image représentée des cellules comptées).

5. Coloration vivante / morte dans les sphéroïdes

  1. Préparer 4 mM de solutions mères de Calcein AM dans le DMSO (taches vertes des cellules vivantes) et 2 mM d’homodimère d’Ethidium dans le DMSO (tache les cellules mortes en rouge) dans des tubes de 1,5 mL.
  2. Calculer la quantité de solution nécessaire pour ajouter 10 μL/puits d’un mélange de Calcein AM et d’homodimère d’Ethidium dilué à 1:50 dans EBM-2.
  3. Ajouter le mélange de coloration aux sphéroïdes et placer la plaque dans l’incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard pendant 30 à 60 min.
  4. Acquérir des images (40x) à l’aide du stéréomicroscope à fluorescence.

6. Isolement de la protéine et de l’ARN du sphéroïde

  1. Préparer des suspensions cellulaires à 3,4 x 105 cellules/mL par type de cellule, les mélanger dans un rapport de 1:1 et ensemencer le mélange cellulaire à l’aide d’une pipette P20 sous forme de gouttes de 15 μL sur le couvercle d’une boîte de Petri de 10 cm. Inverser le couvercle et le placer dans l’incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard pendant 96 h.
  2. Utilisez 5 à 6 mL de PBS pour recueillir les sphéroïdes dans un tube de polystyrène à fond rond de 15 mL à l’aide de pipettes stériles en polystyrène de 5 mL.
    REMARQUE: Il est également possible d’utiliser des tubes coniques de 15 mL.
  3. Centrifuger la suspension des sphéroïdes à 250 x g pendant 5 min, puis aspirer soigneusement le surnageant.
  4. Ajouter 500 μL de trypsine (100%) et pipeter de haut en bas à l’aide d’une pipette P1000 pendant 30 s pour désagréger les sphéroïdes, obtenant ainsi une suspension cellulaire.
  5. Neutraliser la trypsine avec un milieu FCS à 10%, centrifuger les tubes à 250 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
  6. Selon le protocole du fabricant (kit spécifique pour l’isolement de l’ARN sans ADN), utilisez 300 μL de tampon de lyse d’ARN pour lyser la pastille cellulaire.
    REMARQUE: Le tampon de lyse peut également être directement ajouté aux sphéroïdes intacts (aucune étape de trypsine requise) pour extraire l’ARN. Ajouter 300 μL du tampon de lyse aux sphéroïdes granulés, placer les tubes dans la glace et triturer 10 fois à l’aide d’une pipette P200. Par la suite, isolez l’ARN comme ci-dessus. La dissociation sphéroïde peut être nécessaire si la récupération de l’ARN est faible en raison d’interférences matricielles.
  7. Vous pouvez également utiliser 70 μL du tampon de lyse pour l’isolement des protéines. Homogénéiser pendant 2-4 s par sonication et déterminer la concentration en protéines selon le protocole du fabricant à l’aide d’un kit de dosage BCA.
    REMARQUE: Pour l’isolement des protéines, les sphéroïdes granulés peuvent être lysés directement dans un tampon de lyse suivi d’une sonication. Utilisez 25 μg de protéines totales pour effectuer le transfert western.

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Representative Results

Le modèle de sphéroïdes utilisant des co-cultures épithéliales et endothéliales est nécessaire pour imiter étroitement les conditions in vivo des tumeurs mammaires pour des expériences in vitro. Le schéma de la figure 1 illustre le protocole de formation de sphéroïdes avec des cellules épithéliales du cancer du sein et des cellules endothéliales vasculaires ou lymphatiques (Figure 1). Chaque type de cellule est ensemencé séparément dans un plat rond de 3,5 cm et traité avec des stimulateurs / inhibiteurs de croissance ou transfecté avec des oligonucléotides à l’aide de lipofectamine. Les monocouches confluentes des cellules épithéliales ou endothéliales sont récoltées après trypsinisation, lavées et mélangées dans un rapport de 1:1. Les cellules sont ensuite plaquées dans des plaques à fond en U de 96 puits(Figure 1A)ou sur le couvercle inversé d’un plat de culture rond de 10 cm de diamètre pour faciliter la culture de gouttes suspendues (Figure 1B). Peu de temps après l’ensemencement, les cellules apparaissent sous forme de feuilles plates et denses de cellules au fond de chaque puits ou goutte, et, par la suite, elles s’agrègent avec le temps (24-48 h), formant ainsi des sphéroïdes intacts à 48 h. Afin d’éviter tout dommage aux agrégats cellulaires lâchement formés, les plaques ne doivent pas être perturbées pendant au moins 24 heures.

Dans les plaques à fond en U, l’ensemencement des cellules MCF-7, mais pas des cellules endothéliales ou lymphatiques, a entraîné la formation de sphéroïdes après 48 h(Figure 2A,B,respectivement). De plus, l’ensemencement de MCF-7 plus des cellules endothéliales ou des cellules lymphatiques à un rapport de 1:1 a également entraîné la formation de sphéroïdes(Figure 2C,D,respectivement). Pour valider les sphéroïdes en tant que modèle pour étudier la croissance tumorale, des changements dépendant du temps dans la taille des sphéroïdes en réponse à une solution stimulant la croissance ont été mesurés / quantifiés et comparés aux témoins non traités (Figure 2). Les photomicrographies de la figure 2E montrent la croissance séquentielle dépendante du temps (24-120 h) d’un sphéroïde MCF-7 représentatif. Le graphique linéaire de la figure 2F illustre l’évolution de la zone des sphéroïdes MCF-7 au fil du temps lorsqu’ils sont traités avec ou sans stimulateur de croissance. La taille des sphéroïdes est passée de ~100 μm à ~200 μm sur 5 jours; de plus, un taux de croissance accru a été observé chez les sphéroïdes traités avec le stimulateur de croissance (Figure 2F). Parce que le traitement à long terme (168 h) a entraîné une réduction de la viabilité du MCF-7, potentiellement en raison de conditions hypoxiques au centre des sphéroïdes(Figure 3),la croissance de la structure 3D a été étudiée jusqu’à 96 h. Les sphéroïdes formés avec des cellules MCF-7 et des HUVEC montrent un nombre inférieur de cellules mortes à 168 h par rapport aux sphéroïdes formés avec MCF-7 seul.

Dans les premières expériences, seule une petite croissance de la taille des sphéroïdes a été observée après 4 jours de culture. On a émis l’hypothèse que cela pourrait être dû au nombre élevé de cellules ensemencées pour former des sphéroïdes. Dans les plaques de culture à fond U, la croissance des sphéroïdes aurait pu être limitée par la forme concave du puits. Étant donné que la croissance dépendait du nombre initial de cellules ensemencées, différents nombres de cellules ont été utilisés pour former des sphéroïdes afin de tester et d’établir les conditions qui seraient optimales pour surveiller la croissance des sphéroïdes. Comme le montre la figure 4,les résultats suggèrent que pour les études de croissance des sphéroïdes, l’ensemencement de 500 cellules / puits pour former des sphéroïdes était fiable et reproductible pour la surveillance de la croissance des sphéroïdes pendant 4 à 6 jours en réponse à des facteurs modulateurs de croissance. Les sphéroïdes les plus appropriés pour les observations histologiques ou immuno-histologiques ont été obtenus le jour 4, après ensemencement de 5 x 103 cellules / puits. Cette même concentration initiale a été utilisée pour les extractions de protéines cellulaires ou d’ARN. L’augmentation de la concentration cellulaire initiale de plus de 7,5 x 103 cellules/ puits n’a pas amélioré la formation de sphéroïdes, et les cellules ne se sont pas agrégées correctement et ont supposé des structures irrégulières(Figure 4).

Afin d’évaluer la composition cellulaire, la prolifération et l’état d’apoptose, des sections histologiques de sphéroïdes formés avec des cellules cancéreuses du sein et des cellules endothéliales ont été examinées à l’aide d’anticorps H&E et Ki67 (dilution 1:300) et De caspase-3 clivée (dilution 1:500). Le processus de préparation finale de l’échantillon nécessite soin/attention et précision. La figure 5A illustre le flux de travail pour la collecte et l’incorporation des sphéroïdes dans l’agarose pour la section. Les photomicrographies de la figure 5B-C démontrent la différence dans la formation de sphéroïdes MCF-7 en présence(figure 5B)et en absence(figure 5C)de lipofectamine (concentration finale de 0,17 %), un agent de transfection couramment utilisé. Les images microscopiques en champ lumineux de sections histologiques montrent une structure circulaire et compacte d’un mélange homogène de deux types de cellules(Figure 5D-G). La structure des sphéroïdes et la forme de leurs cellules n’ont montré aucune anomalie après transfection avec des oligonucléotides témoins en présence de lipofectamine (Figure 5D). De plus, les cellules exprimant le marqueur prolifératif, Ki67, ont été réparties de manière homogène dans les sphéroïdes; cependant, un anneau de cellules prolifératives a également été observé à la surface des sphéroïdes (Figure 5E). La coloration à la caspase-3 clivée a montré des cellules apoptotiques après 4 jours de culture (Figure 5F). Les sections histologiques sont utiles pour évaluer la distribution des cellules épithéliales et endothéliales dans les sphéroïdes à l’aide de marqueurs spécifiques. En utilisant CD31 comme marqueur spécifique pour les cellules endothéliales, il est possible de déterminer leur distribution dans la structure 3D. Étant donné que toutes les cellules sont colorées avec de l’hématoxyline (coloration bleue du noyau de la cellule), le calcul de l’expression de CD31 pourrait fournir la zone des sphéroïdes contenant des cellules endothéliales après traitement ou transfection (protocole section 4.2.7.1.). De plus, en effectuant un double test de coloration, il est possible d’avoir encore plus d’informations, par exemple, comme le montre la figure 5G,CD31 colore les cellules endothéliales (rouge) et Ki67 tache les cellules prolifératives (brunes). Selon la section 4.2.7.2 du protocole, la figure 5G a révélé que 55 % sont des cellules épithéliales, 45 % sont des cellules endothéliales et 25 % des cellules prolifèrent.

La structure des sphéroïdes peut également être étudiée à l’aide d’une analyse d’immunofluorescence après le marquage des cellules avec des colorants vivants. Les cultures 2D confluentes de cellules HUVEC et MCF-7 ont été colorées séparément avec des colorants bleus (HUVEC) et verts (MCF-7). Par la suite, les cellules colorées ont été collectées et mélangées à un rapport de 1: 1 et ensemencées dans des puits pour la formation de sphéroïdes. Des images de cellules fluorescentes colorées ont été prises immédiatement après l’ensemencement (Figure 6A) et après 3 jours de culture (Figure 6B). Dans le but d’évaluer le pourcentage de cellules vivantes et mortes, des sphéroïdes âgés de 4 jours ont été colorés avec de la calcéine-AM (vert) et de l’homodimère d’éthidium (rouge)(Figure 6C). Les sphéroïdes formés avec mcF-7 et HUVEC n’ont pas pu être congelés/conservés avec succès en utilisant les protocoles standard de congélation des cellules (milieu de croissance complété par 10% de DMSO et 10% de FCS) pour la congélation des cellules. Dans les sphéroïdes congelés et décongelés, la rupture des agrégats cellulaires et la perte accrue de viabilité cellulaire étaient évidentes. L’image représentative de la figure 6D montre un sphéroïde fraîchement décongelé coloré pour les cellules mortes et vivantes. Il montre que les sphéroïdes sont très sensibles aux conditions de congélation.

Après 5 jours de culture dans des conditions expérimentales, la lyse d’environ 100 sphéroïdes a été nécessaire pour recueillir suffisamment de protéines (~3 μg/mL) ou d’ARN (~60 ng/μL) pour l’analyse. La figure 7 représente un flux de travail allant de la collecte de sphéroïdes (générée avec la méthode des gouttes suspendues) à la lyse cellulaire pour l’extraction des protéines afin d’effectuer un transfert occidental ou un isolement de l’ARN pour de futurs tests de microréseaux ou une analyse par RT-PCR. L’isolement de l’ARN/ADN d’une population cellulaire hétérogène dans un sphéroïde pour l’analyse des microréseaux peut apporter des informations utiles. Cependant, pour identifier les mécanismes clés spécifiques à la cellule ou les interactions cellule-cellule, les cellules sphéroïdes peuvent être séparées après une dissociation enzymatique (trypsine ou accutase), en utilisant l’analyse FACS et l’ARN de cellules spécifiques utilisées pour l’analyse des microréseaux. De plus, des lignées cellulaires résistantes aux antibiotiques (p. ex., en utilisant des lignées cellulaires résistantes à l’EGFP et/ou à la puromycine) pourraient être utilisées dans les sphéroïdes pour traiter le rôle d’un type cellulaire spécifique d’interaction cellule-cellule. De plus, des outils de silençage génique peuvent être utilisés pour concevoir les cellules afin de résoudre des problèmes spécifiques d’interaction cellule-cellule.

Figure 1
Figure 1: Flux de travail de formation des sphéroïdes. Les cellules MCF-7 et HUVEC ou LEC dans les cultures 2D sont cultivées séparément et collectées après divers traitements souhaités. Les sphéroïdes sont ensuite générés par mélange direct de cellules dans des plaques de fond en U de 96 puits(A),qui favorisent la formation d’une structure 3D par agrégation de cellules à cellules, ou en utilisant(B)une culture de goutte suspendue qui soutient la formation de sphéroïdes par la force de gravité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Formation et développement des sphéroïdes au fil du temps. Les images montrent la formation d’un sphéroïde par les cellules MCF-7(panel A),l’absence de formation de sphéroïdes par les cellules endothéliales ou lymphatiques (HUVEC; (Panel B)) plaqué à la même densité, et formation de sphéroïdes par des cellules MCF-7 plus huVEC ou LEC mélangés à un rapport de 1:1 (Panneaux C,D). La croissance de la taille d’un sphéroïde au fil du temps (24 h, 48 h, 72 h, 96 h et 120 h) est également représentée. Ce sphéroïde a été formé à partir d’un mélange de MCF-7 plus HUVEC dans un rapport de 1:1 et ensemencé à une densité de 500 cellules/puits d’une plaque de fond en U de 96 puits(panneau E),(barre d’échelle = 200 μm, 40x). Le graphique linéaire(panel F)montre la croissance dépendante du temps des sphéroïdes témoins (CTR) par rapport aux sphéroïdes stimulés par la croissance (traitement). Les zones de Sphéroïde ont été mesurées et comparées entre les sphéroïdes non traités et traités. Les résultats représentent ± SEM, *** p < 0,001 par rapport au contrôle respectif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Culture et viabilité à long terme des sphéroïdes. La photomicrographie montre la viabilité cellulaire dans les sphéroïdes formés avec des cellules MCF-7 seules à 96 h(panneau A)et 168 h(panneau C),tandis que les panneaux B et D décrivent la viabilité cellulaire dans les sphéroïdes fabriqués avec MCF-7 plus HUVEC (rapport 1:1) à 96 h(panneau B)et 168 h(panneau D)(barre d’échelle = 100 μm). Les cellules ont été colorées avec de la calcéine (globules rouges, cellules mortes) et de l’homodimère d’éthidium (cellules vertes, vivantes). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Densité d’ensemencement cellulaire et profil de croissance dépendant du temps du MCF-7 plus sphéroïde HUVEC. Les HUVEC et les cellules MCF-7 mélangées à un rapport de 1:1 ont été ensemencées à des densités croissantes(10 2-10 4 cellules / puits), et la croissance des sphéroïdes a été surveillée pendant 24-96 h. Des images microscopiques en champ lumineux ont été prises (barre d’échelle = 200 μm, 40x) pour évaluer la croissance des sphéroïdes au fil du temps. Les cellules à une densité de 500 cellules/ puits ont fourni une taille optimale pour étudier la croissance des sphéroïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Incorporation de sphéroïdes pour le sectionnement et la coloration histologique. Panneau A: Dessin animé illustrant le flux de travail pour la collecte et l’incorporation de sphéroïdes HUVEC/MCF-7 dans l’agarose. Après l’incorporation de paraffine des sphéroïdes dans un bouchon d’agarose et la section de blocs de paraffine, les échantillons ont été utilisés pour la coloration histologique standard. Les panneaux B et C montrent des sphéroïdes MCF-7 plus HUVEC représentatifs traités sans et avec Lipofectamine 2000, respectivement (barre d’échelle = 200 μm, 40x). Les panneaux D-G montrent des images représentatives de sections sphéroïdes colorées avec des marqueurs spécifiques. Le panneau D montre des sphéroïdes colorés avec de l’hématoxyline-éosine pour évaluer la structure des sphéroïdes (barre d’échelle = 100 μm). La coloration dans le panneau E représente des cellules proliférantes colorées positivement avec Ki67. Le panneau F montre des cellules apoptotiques dans un sphéroïde coloré positivement avec la caspase-3 clivée (barre d’échelle = 50 μm). Le panneau G représente des sections sphéroïdes avec double coloration : CD31 (marqueur des cellules endothéliales) et Ki67 (marqueur prolifératif) (barre d’échelle = 100 μm). La section des sphéroïdes et la coloration ont été réalisées par Sophistolab (info@sophistolab.ch). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Images de fluorescence des sphéroïdes MCF-7/HUVEC montrant la distribution et la viabilité des cellules. Les panneaux A et B représentent des sphéroïdes représentatifs avec des HUVEC colorés avec un colorant bleu et des cellules MCF-7 colorées avec un colorant vert. La localisation de HUVEC et MCF-7 dans le sphéroïde varie immédiatement après l’ensemencement (A) et après la formation du sphéroïde (B) (barre d’échelle = 250 μm). Les panneaux C-D montrent des sphéroïdes colorés avec de l’homodimère calcéine/éthidium pour identifier les cellules vivantes (vertes) et mortes (rouges) dans les structures 3D dans des conditions de culture normales (C) et après congélation (D) (barre d’échelle = 100 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Représentation schématique de la collection de sphéroïdes pour l’analyse biochimique. Dessin animé montrant le schéma pour récolter des sphéroïdes, séparer ou libérer des cellules, et les suspendre dans une solution de lyse pour l’analyse des protéines ou l’extraction de l’ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Comparée aux cultures cellulaires 2D, la technologie révolutionnaire de culture sphéroïde 3D est un outil meilleur et plus puissant pour reconstruire le microenvironnement d’un organe, les interactions cellule-cellule et les réponses médicamenteuses in vitro. Il s’agit du premier protocole décrivant la formation de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires multicellulaires (épithéliales et endothéliales) pour la recherche sur le cancer du sein. Ce protocole assure la croissance 3D sphéroïdale des sphéroïdes jusqu’à 5 jours, et les sphéroïdes peuvent être examinés après l’incorporation de paraffine, le sectionnement et la coloration histologique. Fait intéressant, les éléments cellulaires dans le sphéroïde expriment encore des récepteurs qui favorisent la croissance cellulaire et sont sensibles aux stimuli prolifératifs et apoptotiques. Le protocole décrit génère suffisamment de matériel biologique pour l’analyse des protéines ou de l’ARN/ADN. Le système de co-culture ci-dessus, facilement réalisé dans des conditions de laboratoire et à faible coût, pourrait être un avantage pour les applications futures, en particulier dans le traitement du cancer du sein et pour les tests de sensibilité aux médicaments. De plus, ce protocole peut être appliqué à différents types de cellules épithéliales et endothéliales.

Il est extrêmement difficile d’imiter in vitro un tissu complexe qui existe in vivo. En effet, les tissus in vivo sont constitués de nombreux composants en interaction, notamment les nerfs, les vaisseaux sanguins, le mésenchyme et les cellules immunitaires30,42. Le but de ce protocole est de surmonter certaines de ces limitations en utilisant un système de co-culture 3D avec deux types de cellules différents pour approcher l’état tumoral réel. Ici, des sphéroïdes ont été formés avec des cellules tumorales épithéliales en combinaison avec des cellules endothéliales ou des cellules lymphatiques pour imiter autant que possible la situation in vivo, y compris les interactions cellule-cellule, la susceptibilité aux facteurs apoptotiques libérés dans les espaces intercellulaires par les cellules mourantes et les conditions hypoxiques au centre des sphéroïdes. Ce protocole a été optimisé pour tester les réponses cellulaires aux facteurs de croissance, aux facteurs de signalisation et aux hormones, qui activent rapidement les cascades de signalisation et ciblent la transcription des gènes et stimulent l’expression et le transport des protéines30,31. Dans les sphéroïdes, mais pas in vivo,les réponses des cellules tumorales aux stimuli peuvent être évaluées rapidement et fréquemment.

Dans la présente étude, les cellules endothéliales des sphéroïdes ne semblent pas former de structures capillaires. Étant donné qu’il a été démontré que les cellules endothéliales forment des capillaires lorsqu’elles sont plaquées à faible densité et des monocouches à haute densité, il est possible que l’abaissement du rapport MCF-7 / cellules endothéliales puisse entraîner la formation de capillaires dans les sphéroïdes. Alternativement, l’ajout de protéines matricielles spécifiques ou de matrigel peut favoriser la formation capillaire. L’absence de structure capillaire dans le sphéroïde ne dilue pas l’avantage des cellules endothéliales MCF-7 plus par rapport aux cellules MCF-7 en soi, car les facteurs libérés par les cellules MCF-7 pourraient favoriser la prolifération des cellules endothéliales et vice versa; de telles interactions resteraient non détectées dans les sphéroïdes MCF-7 seulement.

Plusieurs études ont montré que 5 x 103 cellules/puits était la concentration appropriée pour ensemencer les cellules pour former des sphéroïdes43,44,45,46,47; cependant, dans les plaques à fond en U de 96 puits, ce nombre de cellules limitait la croissance coordonnée des sphéroïdes dans des conditions expérimentales. Par conséquent, dans chaque nouvelle étude, pour chaque nouveau type de cellule, il est important de surveiller la croissance du système 3D après le traitement médicamenteux, afin de déterminer les effets du traitement sur la taille des sphéroïdes.

La limitation du protocole actuel est que la culture de sphéroïdes précédemment formés ne peut pas être poursuivie après congélation et décongélation par la méthode classique DMSO. En fait, lorsqu’elles ont été décongelées, la plupart des cellules étaient mortes. La vitrification peut s’avérer être une alternative au maintien des cellules en vie48.

Une attention particulière aux détails techniques est nécessaire pour éviter les erreurs et produire et maintenir des sphéroïdes bien formés. L’un des défis est la préparation de l’échantillon pour l’immunocoloration (rubrique 4.1). Pour faciliter le transfert en pipetant les sphéroïdes dans le tube de 1,5 mL, il est important d’utiliser une pointe P200 coupée avec des ciseaux de sorte que la surface du trou soit plus grande que les sphéroïdes eux-mêmes. Sinon, le transfert pourrait détruire les sphères. Un autre défi consiste à aspirer le milieu une fois que les sphéroïdes se sont déposés au fond d’un tube à essai. À cet égard, il est préférable d’utiliser une pipette P1000 au lieu d’une pompe à vide pour éviter l’aspiration de sphéroïdes. Une étape importante et délicate dans la préparation des sphéroïdes pour le sectionnement consiste à ajouter l’agarose aux sphéroïdes agglomérés. Les sphéroïdes, une fois en suspension dans l’agarose, doivent être granulés rapidement au fond du tube de microfuge en utilisant la centrifugation horizontale à température ambiante et avant que l’agarose ne polymérise.

Dans l’ensemble, le sphéroïde à deux cellules composé de CELLULES MCF-7 et endothéliales fournit une alternative viable pour étudier les interactions et les mécanismes cellule-cellule qui stimulent la croissance des cellules cancéreuses ou des cellules endothéliales au sein d’une tumeur. Les sphéroïdes pourraient servir de modèle pour évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques ciblant la croissance tumorale ou cancéreuse. Il est important de noter que ce modèle à deux cellules pourrait être encore improvisé pour inclure d’autres types de cellules pertinentes dans la croissance tumorale. Dans ce contexte, les fibroblastes qui constituent 80% de la masse tumorale du sein peuvent être inclus pour former un MCF-7, des cellules endothéliales et un sphéroïde fibroblastique. De plus, le silençage génique et les cellules génétiquement modifiées pourraient être utilisés pour aborder le rôle de l’interaction cellule-cellule, des récepteurs hormonaux (œstrogène / progestérone), des facteurs de croissance et des voies de signalisation sur la croissance tumorale / cancéreuse ainsi que pour tester l’efficacité de nouvelles molécules anticancéreuses.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par la Fondation pour la recherche sur le cancer / subvention de la Ligue suisse contre le cancer KFS-4125-02-2017 à RKD et la subvention de l’Institut national de la santé DK079307 à EKJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes Corning CLS430167
149MULTI0C1
35 x 10 mm Tissue Culture Dish Falcon 353001
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile Falcon 357543
Adobe Photoshop Version: 13.0.1 (64-bit)
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Calcein-AM Sigma-Aldrich 17783
CD31 (cluster of differentiation 31) Cell Marque 131M-95 monoclonal mouse ab clone JC70
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) Invitrogen C7025
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) DBS Mob189-05 monoclonal mouse ab, clone 5D3
CKX41 Inverted Microscope Olympus Life Science Olympus DP27 digital camera
Cleaved Caspase 3 Cell Signaling 9661L polyclonal rabbit ab
Collagen (rat tail) Roche 11 179 179 001
Coulter ISOTON II Diluent Beckman Coulter 844 80 11 Diluent II
Coulter Z1, Cell Counter Coulter Electronics, Luton, UK
Dehydrated Culture Media: Noble Agar BD Difco BD 214220
Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) Lonza CC-2516
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham Sigma-Aldrich D6434
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 Lonza 190860
Ethidium homodimer Sigma-Aldrich 46043
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher Scientific SH30070
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) Thermo Fisher Scientific SH3006803
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA Leica Microsystems
GlutaMAX Supplement (100x) Gibco 35050038
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175053
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
ImageJ National Institute of Health, USA Wayne Rasband
Version: 1.52a (64-bit)
Ki67 Cell Marque 275R-16 monoclonal rabbit ab, clone SP6
Leica fully motorized fluorescence stereo microscope Leica Microsystems M205 FA
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome 149MULTI0C1
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) Gibco S003K
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC
Nunclon Sphera 96U-well plate Thermo Fisher Scientific 174925
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010015
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Protein Lysis Buffer Cell Signaling, Danvers, USA 9803
Quick-RNA Miniprep Kit Zymo Research R1055
RNA Lysis Buffer Zymo Research R1060-1-100 Contents in Quick-RNA Miniprep Kit
Rotina 46R Centrifuge Hettich
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL Falcon 352003
Sonicator Bandelin electronics, Berlin, DE
Tecan Infinite series M200 microplate reader Tecan, Salzburg, AU
Tissue Culture Flasks 75 TPP 90076
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924

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Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in <em>vitro</em> potentiel pour la recherche sur le cancer du sein
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Azzarito, G., Szutkowska, M. E., Saltari, A., Jackson, E. K., Leeners, B., Rosselli, M., Dubey, R. K. Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research. J. Vis. Exp. (173), e62940, doi:10.3791/62940 (2021).

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