Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bruk av ekspansjonsmikroskopi for fysisk å forstørre helmonterte Drosophila-embryoer for superoppløsningsavbildning

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/64662
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Arkansas

Summary

Her presenteres en protokoll for implementering av ekspansjonsmikroskopi i tidlige Drosophila-embryoer for å oppnå superoppløsningsavbildning ved hjelp av et konvensjonelt laserskanning konfokalmikroskop.

Abstract

Arbeidshesten til utviklingsbiologi er det konfokale mikroskopet, som gjør det mulig for forskere å bestemme den tredimensjonale lokaliseringen av merkede molekyler i komplekse biologiske prøver. Mens tradisjonelle konfokale mikroskoper tillater en å løse to tilstøtende fluorescerende punktkilder som ligger noen hundre nanometer fra hverandre, krever observasjon av de finere detaljene i subcellulær biologi evnen til å løse signaler i størrelsesorden titalls nanometer. Tallrike maskinvarebaserte metoder for superoppløsningsmikroskopi er utviklet for å tillate forskere å omgå slike oppløsningsgrenser, selv om disse metodene krever spesialiserte mikroskoper som ikke er tilgjengelige for alle forskere. En alternativ metode for å øke oppløsningsevnen er å isotropisk forstørre prøven selv gjennom en prosess kjent som ekspansjonsmikroskopi (ExM), som først ble beskrevet av Boyden-gruppen i 2015. ExM er ikke en type mikroskopi i seg selv , men er snarere en metode for å svulme en prøve samtidig som den relative romlige organisasjonen av dets bestanddeler opprettholdes. Den utvidede prøven kan deretter observeres med en effektivt økt oppløsning ved hjelp av et tradisjonelt konfokalmikroskop. Her beskriver vi en protokoll for implementering av ExM i helmonterte Drosophila-embryoer , som brukes til å undersøke lokaliseringen av Par-3, myosin II og mitokondrier i overflateepitelcellene. Denne protokollen gir en omtrent fire ganger økning i prøvestørrelsen, noe som muliggjør deteksjon av subcellulære detaljer som ikke er synlige med konvensjonell konfokalmikroskopi. Som prinsippbevis brukes et anti-GFP-antistoff for å skille forskjellige bassenger av myosin-GFP mellom tilstøtende cellekortiker, og fluorescerende merket streptapavidin brukes til å oppdage endogene biotinylerte molekyler for å avsløre de fine detaljene i mitokondrienettverksarkitekturen. Denne protokollen bruker vanlige antistoffer og reagenser for fluorescensmerking, og den skal være kompatibel med mange eksisterende immunfluorescensprotokoller.

Introduction

I celle- og utviklingsbiologi er det å se å tro, og evnen til nøyaktig å bestemme lokaliseringsmønstrene til proteiner er grunnleggende for mange typer eksperimenter. Laserskanning konfokalmikroskopi er standardverktøyet for avbildning av fluorescerende merkede proteiner i tre dimensjoner i intakte prøver. Konvensjonelle konfokale mikroskoper er ikke i stand til å skille (løse) tilstøtende fluorescerende signaler som er skilt med mindre enn halvparten av bølgelengden til lyset de avgir:1. Med andre ord må to punktkilder skilles med minst 200-300 nm i sideretningen (500-700 nm i aksial retning) for å løse dem som to forskjellige signaler. Denne tekniske barrieren er kjent som diffraksjonsgrensen, og det er en grunnleggende hindring for studier av komplekse subcellulære strukturer (f.eks. Actomyosincytoskeletal eller mitokondrielle nettverk) med romlige egenskaper under diffraksjonsgrensen. Derfor er teknikker for å øke oppløsningskraften til konvensjonelle konfokale mikroskoper av generell interesse for det biologiske samfunnet.

For å omgå diffraksjonsgrensen er det utviklet en rekke forskjellige superoppløsningsmikroskopiteknologier som muliggjør oppløsning i størrelsesordentitalls nanometer eller mindre 1,2,3, og avslører en verden av biologisk kompleksitet som tidligere bare var tilgjengelig via elektronmikroskopi. Til tross for de åpenbare fordelene med disse maskinvarebaserte metodene, har superoppløsningsmikroskoper ofte spesifikke krav til prøvemerking og lange anskaffelsestider, noe som begrenser fleksibiliteten, eller de kan ganske enkelt være for dyre for noen laboratorier å få tilgang til. Et alternativ til mikroskopbasert superoppløsning er ekspansjonsmikroskopi (ExM), som ikke er en type mikroskopi i seg selv, men snarere er en metode for å svulme en prøve samtidig som den relative romlige organisasjonen av dets bestanddeler 4 opprettholdes. De isotropisk utvidede prøvene kan deretter observeres med en effektivt økt oppløsning ved hjelp av et tradisjonelt fluorescenskonfokalmikroskop. ExM ble først beskrevet av Boyden-gruppen i 20155, og grunnteknikken har siden blitt tilpasset for bruk i en rekke eksperimenter 6,7,8. ExM har også blitt tilpasset for bruk i helmonterte embryoer, spesielt i Drosophila 9,10,11, C. elegans12 og sebrafisk 13, noe som gjør det til et kraftig verktøy for utviklingsbiologer.

ExM er basert på to forskjellige hydrogelkjemikalier: 1) svulmende polyelektrolytthydrogeler, som øker kraftig i størrelse når de er gjennomvåt i vann14, og 2) polyakrylamidhydrogeler, som har ekstremt liten polymeravstand for å tillate isotropisk prøveutvidelse15. Selv om det er mange publiserte ExM-protokoller, deler de vanligvis følgende trinn: prøvefiksering, merking, aktivering, gelering, fordøyelse og utvidelse4. Fikseringsbetingelsene og fluorescensmerkingsstrategiene vil selvfølgelig variere basert på eksperimentets og systemets behov, og i noen protokoller skjer merking etter utvidelse. Målmolekylene i prøven må primes (aktiveres) for binding til hydrogelen, som kan oppnås ved bruk av forskjellige kjemikalier4. Under geleringstrinnene blir prøven mettet med monomerer av den fremtidige hydrogelen (natriumakrylat, akrylamid og tverrbindingsbisakrylamid), og hydrogelen dannes deretter ved friradikalpolymerisasjon katalysert av en initiator, slik som ammoniumpersulfat (APS) og en akselerator, slik som tetrametylendiamin (TEMED)4. Etter gelering fordøyes prøven enzymatisk for å homogenisere prøvemotstand mot hevelse og sikre isotrop ekspansjon av hydrogelen4. Til slutt plasseres den fordøyede hydrogelen i vann, noe som får den til å utvide seg til omtrent fire ganger sin opprinnelige lineære størrelse4.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over ekspansjonsmikroskopi i Drosophila-embryoer . ExM er en flertrinnsprotokoll som tar minst 4 dager å fullføre. Embryoinnsamling, fiksering og avvik tar 1 dag eller mer, avhengig av om embryoer fra flere samlinger er samlet. Immunfluorescensmerking tar 1 dag eller 2 dager, avhengig av om embryoene inkuberes over natten med de primære antistoffene. Embryoaktivering, gelering, fordøyelse og ekspansjon kan utføres på en enkelt dag. Gelene kan monteres og avbildes umiddelbart etter ekspansjon, men av praktiske årsaker er det ofte ønskelig å starte avbildningen dagen etter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Denne protokollen beskriver hvordan man utfører ExM på helmonterte Drosophila-embryoer 16 i tidlig til midtfase for å visualisere lokaliseringsmønstre for subcellulært protein ved superoppløsning (figur 1). Denne metoden bruker metylakrylsyre N-hydroksysuccinimidylester (MA-NHS) kjemi for å aktivere og forankre proteinmolekyler til hydrogelen17, og det er en modifikasjon av en tidligere publisert ExM-protokoll for bruk i sent stadium Drosophila embryoer og vev11. Denne protokollen bruker polydimetylsiloksan (PDMS) brønner for å støpe hydrogelene og lette løsningsutveksling under aktivering og gelering. En alternativ metode som ikke krever opprettelse av PDMS-brønner, innebærer å senke embryoer festet til deksler i dråper monomerløsning som sitter på et stykke laboratorieforseglingsfilm22. I tillegg beskriver denne protokollen en metode for manuelt å fjerne den ugjennomtrengelige vitellinemembranen som omgir Drosophila-embryoer , noe som er en forutsetning for immunfluorescensfarging. Det er viktig at denne metoden for håndpeeling av embryoer kan brukes til å velge bare riktig iscenesatte Drosophila-embryoer før prøvemerking, noe som øker sannsynligheten for å ende opp med utvidede prøver av riktig stadium og orientering og dermed gjør nedstrøms datainnsamling mye mer effektiv.

Protocol

Denne protokollen følger University of Arkansas (UARK) retningslinjer for forskning på virvelløse dyr, som Drosophila melanogaster, og ble godkjent av UARK Institutional Biosafety Committee (protokoll # 20001).

1. Drosophila embryofiksering og avvik

MERK: Trinn 1 beskriver en prosedyre (håndpeeling) for manuell fjerning av vitellinemembranen, en gjennomsiktig ugjennomtrengelig membran som omgir embryoet. Det er viktig at håndpeeling gjør det mulig å velge riktig iscenesatte embryoer ved starten av ExM-protokollen, og dermed øke sannsynligheten for å skaffe embryoer i en brukbar orientering på slutten av ExM-protokollen. Imidlertid er denne ExM-protokollen fullstendig kompatibel med bulkembryoinnsamling og standardprosedyrer for metanolbasert fjerning av vitellinemembranen, i så fall kan man hoppe direkte til trinn 2 (immunfluorescensmerking).

  1. Forbered eller kjøp et antall fine glassnåler. De faktiske dimensjonene på nålespissen er ikke kritiske, men sørg for at nålene er stive og skarpe nok til å gjennombore vitellinemembranene til faste embryoer. Lag nåler fra kapillærrør av glass (1 mm ytre diameter, 0,75 mm indre diameter) ved hjelp av en mikropipettrekker, da man ville forberede nåler for embryomikroinjeksjoner18; Alternativt kan du kjøpe ferdigtrukne nåler.
  2. Samle embryoer ved hjelp av standard Drosophila-teknikker19 ved å plassere >100 voksne Drosophila i en ventilert plastkopp forseglet med en fruktjuice / agarplate20. Bruk tidsbestemte innsamlingsvinduer for å berike embryoer av riktig stadium16. For eksempel, for å berike for gastrulasjonen (trinn 6) og konvergent-forlengelse (trinn 7) stadier, bytt fruktjuiceplaten, samle embryoene i 2 timer ved 25 ° C, fjern deretter platen og alder den i ytterligere 2 timer ved 25 ° C for å oppnå embryoer som er ~ 2-4 timer gamle.
  3. For å fjerne den eggeskalllignende korionen fra embryoene, dekk overflaten av fruktjuiceplatene med 50% blekemiddel (tabell 1), slipp embryoene fra overflaten av agar ved å røre dem med en liten pensel, og vent 3 minutter på at korionen skal oppløses.
  4. Overfør de dekorionerte embryoene med en pensel til et 30 ml scintillasjonshetteglass inneholdende 4 ml heptan (organisk toppfase) og 4 ml fikseringsbuffer (vandig bunnfase; Tabell 1). Fortynn formaldehydet fra en nylaget eller nylig åpnet kraft, og bland med 10x PBS og avionisert vann umiddelbart før du tilsetter embryoene.
    MERK: Forbered formaldehydet fra paraformaldehydkraft eller 16% EM-klasse formaldehyd i glassampuller. Lagre av konsentrert formaldehyd (f.eks. 37% formaldehyd) kan brukes, selv om resultatene kan være mindre konsistente.
  5. Embryoene vil akkumuleres ved grensesnittet mellom de organiske og vandige faser. Legg til så mange embryoer som vil danne et enkelt lag ved grensesnittet. Hvis for mange embryoer legges til et hetteglass, vil de ikke fikse også.
  6. Bruk sterk tape, immobiliser scintillasjonsglassene på sidene på en bordplateshaker, og berør dem i 20 minutter ved 220 o / min. For optimal fiksering, oppretthold en kraftig emulsjon mellom de organiske og vandige faser under hele fikseringen.
  7. I løpet av fikseringstiden, lag ett av følgende for hver av prøvene.
    1. Ta en plast 6 cm petriskålbase fylt halvveis med 3% agar og score et ~ 5 cm x 3 cm rektangel i agar med et barberblad eller skalpell. Fruktjuice/agarplater kan også brukes til dette formålet.
    2. Bruk en liten laboratoriespatel, fjern agarplaten. Inverter bunnen av petriskålen, og sett den på benken. Legg agarplaten på toppen av den omvendte tallerkenen (figur 2A).
    3. Ta lokket på petriskålen og sørg for at den er tørr. Bruk hansker, legg et stykke dobbeltsidig tape inne i lokket (tapestykket skal være litt større enn agarplaten; Figur 2B).
  8. Fjern hetteglassene fra shakeren, sett dem oppreist på benken, og la de organiske og vandige fasene skille seg. Riktig faste embryoer vil forbli i grensesnittet mellom de to fasene.
  9. Overfør de faste embryoene til agarplaten ved hjelp av en Pasteur-pipett i glass utstyrt med en latexpære. For å forhindre at embryoene fester seg til innsiden av pipeten, prøv å holde embryoene innenfor pipetens smale hals, og overfør embryoene i flere små batcher i stedet for alle samtidig. Når alle embryoene er på agarplaten, fjern det meste av gjenværende heptan fra rundt embryoene ved hjelp av en P200-pipettor. Utfør dette trinnet så raskt som mulig (<3 min) for å unngå å tørke ut de faste embryoene, noe som kan påvirke morfologien negativt.
  10. Fra en høyde på ~2 cm, slipp lokket med dobbeltsidig tape på agarplaten for å feste embryoene til båndet (figur 2C). Fjern forsiktig lokket fra agarplaten, legg det opp ned på benken, og tilsett deretter nok PBS-Tween (tabell 1) til å dekke embryoene i lokket.
  11. Ved hjelp av et stereodissekerende mikroskop ved omtrent 100x forstørrelse med indirekte belysning, identifiser riktig iscenesatte embryoer ved hjelp av morfologiske markører. For stadium 6 embryoer, bruk markører som en synlig cephalic fure og invaginated mesoderm; For stadium 7 embryoer, bruk markører som et utvidet germband; For stadium 11 embryoer, bruk markører som en fullt utvidet germband og synlig segmentering langs hode-til-hale akse16.
    1. For å samle de ønskede embryoene, stikk først vitellinemembranen (en gjennomsiktig oval membran rundt embryoet) nær den fremre eller bakre enden av embryoet med en fin glassnål; Membranen vil tømmes litt når trykket slipper ut. Deretter, ved hjelp av fin tang eller en metallsonde, skyv forsiktig embryoet i den andre enden gjennom hullet; Vitelline-membranen forblir festet til dobbeltsidig tape. La uønskede embryoer festes til båndet.
  12. Samle regelmessig de flytende devitelliniserte embryoene med en glass Pasteur-pipet, og flytt dem til et 1,5 ml mikrofugerør.
  13. På dette tidspunktet utfører du ett av følgende trinn.
    1. Fortsett direkte til trinnene for immunfluorescensmerking. De avvikende embryoene kan gå direkte inn i blokkeringsløsningen (trinn 2.2). Ikke la embryoene forbli i PBS-Tween eller blokkerende oppløsning (tabell 1) lenger enn 16 timer før du går videre til neste trinn.
    2. Flytt embryoene til metanol for lagring. Fjern så mye av PBS-Tween som mulig, og tilsett deretter 1 ml metanol. Når embryoene har avgjort, fjern så mye metanol som mulig, og tilsett 1 ml fersk metanol. Oppbevar embryoene ved -20 °C på ubestemt tid. Metanollagring gjør det også mulig å samle embryoer fra flere samlinger.

2. Merking av immunfluorescens

MERK: Bortsett fra antistoffinkubasjonstrinnene, er eksakte væskemengder og tider ikke kritiske i denne delen. For å utføre en skylling eller vask, la embryoene slå seg til bunnen av røret, fjern så mye væske som mulig uten å suge opp embryoer, og tilsett deretter ~ 1 ml ny væske; bruk en Pasteur-pipett i glass utstyrt med en latekspære for optimal klarhet og kontroll. For skylletrinnet blir embryoene ikke rocket, bare lov til å bosette seg; For vasketrinnet blir embryoene rocket på en nutator i den angitte tiden og får deretter lov til å bosette seg.

  1. Hvis embryoer ikke ble lagret i metanol, gå videre til trinn 2.2. Hvis embryoene ble lagret i metanol, skyll to ganger med PBS-Tween, og vask deretter i 20 minutter to ganger med PBS-Tween.
  2. Vask embryoene i 30-60 minutter i 1 ml blokkeringsløsning.
  3. Inkuber embryoene med primære antistoffer fortynnet i antistoffoppløsning (tabell 1) i 2 timer ved romtemperatur eller helst over natten ved 4 °C. Utfør dette trinnet i så lite volum som mulig (50-300 μL) for å bevare de primære antistoffene; Rocking på en mutterator er ikke strengt nødvendig.
    1. Øk mengden primært antistoff som brukes i et typisk immunfluorescenseksperiment med minst 50% for ExM. Bruk følgende primære antistoffkonsentrasjoner: 1:200 for anti-Par-3 marsvin polyklonal21 og 1:100 for anti-GFP kanin polyklonal.
  4. Fjern den primære antistoffoppløsningen (lagre ved 4 °C om ønskelig), skyll to ganger med PBS-Tween, og vask deretter i 15 minutter fire ganger med PBS-Tween.
  5. Inkuber embryoene med fluorescerende sekundære antistoffer i et endelig volum på 300 μL (fortynnet i antistoffoppløsning) i 1 time ved romtemperatur på en nutator. Fluorescerende merket streptavidin kan tilsettes i løpet av dette trinnet. Fra dette trinnet og fremover, beskytt embryoene mot overdreven og langvarig lyseksponering når det er mulig, for eksempel ved å dekke rørene med et ugjennomsiktig bokslokk eller holde prøvene i en skuff.
    1. Bruk følgende konsentrasjoner: 1:500 for anti-kanin IgG geit polyklonal smeltet til Alexa Fluor 488; 1:500 for anti-marsvin IgG geit polyklonal smeltet til Alexa Fluor 568; og 1:1000 for streptavidin-Alexa Fluor 488.
  6. Fjern og kast den sekundære antistoffoppløsningen. Skyll embryoene to ganger med PBS-Tween, og vask i 15 min fire ganger med PBS-Tween.
  7. På dette tidspunktet kan embryoene lagres ved 4 °C i mørket, men behandle prøvene så raskt som mulig (<24 timer).

3. Klargjøring av PDMS-brønner

MERK: PDMS-brønnene kan gjøres opptil 2 uker i forveien.

  1. Sett en kuvøse eller kokeplate til 55 °C, og sett en sentrifuge som kan spinne koniske rør til 15 °C.
  2. For å klargjøre PDMS-løsningen (tabell 1), plasser et 50 ml konisk rør i en sekundær beholder på en skala, og tilsett 10 g silikonelastomerbase til røret ved hjelp av en sprøyte. Deretter tilsettes 1 g silikonelastomerherdemiddel, og vender røret flere ganger for å blande.
  3. Lag et balanserør ved å tilsette en passende mengde vann til et andre 50 ml konisk rør. Sentrifuger PDMS-løsningen ved 500 x g i 3 minutter ved 15 °C, og hell den deretter i en 10 cm petriskål til en dybde på ~1 mm. Fjern om nødvendig bobler ved å blåse forsiktig på løsningen med en luftslange. La PDMS-oppløsningen stivne over natten ved 55 °C.
  4. Når PDMS-platen er størknet, ved hjelp av en skalpell, score firkantede områder som er litt mindre enn en 22 mm x 22 mm coverslip. Inne i hver rute, score og fjern en ~ 8 mm bred firkantbrønn.
  5. Overfør hver firkantede PDMS-brønn til en 22 mm x 22 mm deksel, og fest den godt (figur 2D). Å forberede seks eller flere coverslips bør gi et stort antall utvidede embryoer å avbilde.

4. Feste embryoene til dekslene

  1. Påfør nok 0,1% poly-L-lysin til å dekke dekkflaten inne i hver brønn (~ 50 μL), og plasser dem i en 55 ° C inkubator for å lufttørke. Gjenta dette trinnet for å øke klebeevnen.
  2. Skyll embryoene kort en gang i 1x PBS for å fjerne Tween-vaskemiddelet, og overfør deretter >10 embryoer til hver av de poly-L-lysinbelagte brønnene.
  3. La embryoene slå seg ned til bunnen av brønnene. Fjern overflødig væske fra de festede embryoene ved hjelp av en Pasteur-pipette. Fortsett umiddelbart til neste trinn.

5. Aktivering og gelering

MERK: Aktivering refererer til tilsetning av MA-NHS til embryoene, som vil modifisere prøveproteinene og antistoffene slik at de kan binde seg til hydrogelen. Gelering refererer til genereringen av en hydrogel i og rundt embryoene i hver brønn. Under gelering gjennomsyres embryoene med en monomerløsning og behandles deretter med en geleringsløsning for å danne hydrogelen.

  1. Aktiver embryoene i 1 time ved romtemperatur ved å fylle brønnene med aktiveringsløsning (1 mM MA-NHS nyfortynnet i 1x PBS; Tabell 1). Bytt denne løsningen omtrent hvert 10. minutt i løpet av 1 time.
  2. Skyll embryoene med 1x PBS tre ganger. Inkuber embryoene i monomeroppløsning (tabell 1) i 45 minutter ved 4 °C.
  3. Mens embryoene sitter i monomerløsningen, klargjør geleringsløsningen (tabell 1). Forberedelse av ~ 2 ml geleringsløsning er nok til å dekke PDMS-brønnene fra en hel 10 cm petriskål. Pass på å legge til APS sist, da det vil starte polymerisering og begynne geleringen.
    1. Fortynn den katalytiske oksidanten ferskt fra pulver (f.eks. 1 % TEMPO w/v i vann). Kombiner 1,960 μL monomerløsning med 30 μL 10% TEMED og 10 μL 1% TEMPO.
    2. For å unngå polymerisering av hele batchen av geleringsløsning samtidig, arbeid i små satser. Del geleringsløsningen (uten APS) i 125 μL alikoter mellom de åtte rørene i en PCR-stripe.
    3. Fjern monomerløsningen fra de tre PDMS-brønnene ved hjelp av vakuum mens du er forsiktig så du ikke forstyrrer embryoene. Tilsett 5 μL APS til et av PCR-rørene som inneholder geleringsoppløsning for å initiere polymerisering. Fordel polymerisasjonsgeleringsløsningen raskt mellom brønnene (~40 μL per brønn). Gjenta dette til alle brønnene og embryoene er dekket.
  4. La prøvene gelere i 1,5-2,5 timer ved 37 °C. Agiter hydrogelene så ofte for å overvåke polymerisasjonen. Størknede hydrogeler vil ikke vrikke. Tykkere hydrogeler vil ta lengre tid å fullføre polymerisering og størkne.

6. Fordøyelse og ekspansjon

MERK: Tykkere og større geler vil ta lengre tid å utvide, og midten av gelene kan ta flere timer å utvide helt. Dette kan økes ved å trimme kantene på gelen. Når gelene ekspanderer, vil brytningsindeksen deres bli nesten identisk med vannets, og de vil bli svært vanskelig å se.

  1. Etter at gelering er fullført, må du fjerne PDMS-brønnene fra dekselet mens du prøver å ikke forstyrre hydrogelene. Skjær bort overflødig hydrogelmateriale, om ønskelig.
  2. Overfør hydrogelene (fortsatt festet til dekslene) individuelt inn i brønnene på en seks-brønnplate (figur 2E). Legg merke til at hydrogelene kan ekspandere litt under fordøyelsen.
  3. Dekk gelene helt med fordøyelsesbuffer (tabell 1) i 1 time ved 37 °C. Generelt er 30 ml fordøyelsesbuffer tilstrekkelig til å dekke gelene i en 6-brønnsplate.
  4. Etter fordøyelsen, overfør hver hydrogel individuelt til en 6 cm petriskål ved å skyve dem av dekselet. Det kan være nødvendig å bruke et ekstra deksel for å løsne gelen. Fyll hver petriskål med avionisert vann for å utvide gelen. Bytt vannet tre til fire ganger i løpet av 1-2 timer til gelene er helt utvidet (forvent en omtrentlig fire ganger økning i bredden).

7. Montering og avbildning

MERK: Ekspanderte hydrogeler består nesten utelukkende av vann, noe som gjør dem nesten gjennomsiktige og ekstremt skjøre. Gelene kan manipuleres ved hjelp av lange deksler for å flytte dem rundt og plukke dem opp. Monter og avbilde bare en eller to geler om gangen, da geler gradvis vil frigjøre vann og begynne å glide rundt dekselet.

  1. Bruk en Pasteur-pipet, fjern så mye overflødig vann fra petriskålen som mulig for å minimere geleene som beveger seg rundt når de håndteres.
  2. Manøvrer hver ekspanderte gel, med embryoene på bunnflaten, på et stort deksel (f.eks. 24 mm x 40 mm) for avbildning.
  3. Monter hver coverslip med gel over målet med et invertert laserskanning konfokalmikroskop. Finn riktig iscenesatte og orienterte prøver ved hjelp av epifluorescens- eller brightfield-mikroskopimodusene på mikroskopet med luftmål med lav forstørrelse (5x eller 10x) eller middels forstørrelse (20x).
  4. Hvis du vil ta bilder med høy oppløsning, bytter du til et olje- eller nedsenkingsmål med høy forstørrelse (60x, 63x eller 100x). Overflaten av embryoene må være innenfor fokusområdet til målet (<300 μm fra dekselet for et 63x objektiv) for å bli avbildet.
  5. Samle inn data fra prøver ved hjelp av laserskanning konfokalmodus på mikroskopet. Sørg for å samle ikke-mettede bilder med godt dynamisk område, og bruk et passende antall piksler per bilde for å fange maksimalt mulig informasjon om prøven23.

Figure 2
Figur 2: Manuell avviktellinisering og arbeid med hydrogeler . (A) Kutte en agarplate fra en agar / fruktjuiceplate. (B) Plassering av dobbeltsidig tape inne i lokket på en 6 cm petriskål. (C) Feste embryoer til det teipede lokket. (D) En PDMS-plate med en firkantet brønn festet til et 22 mm x 22 mm deksel. (E) Coverslip med en PDMS godt inne i en 6-brønns plate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

For å karakterisere den generelle effekten av ExM i helmonterte Drosophila-embryoer, ble embryolengden langs hode-til-hale-aksen målt i ikke-ekspanderte kontrollembryoer versus utvidede embryoer (figur 3A-C). De ikke-ekspanderte kontrollembryoene ble utsatt for de samme fikseringsbetingelsene og immunfluorescensmerkingstrinnene som de utvidede embryoene, bortsett fra at de ble montert ved hjelp av et størknet monteringsmedium før avbildning. De enkelte uutvidede embryoene strakte seg over omtrent halvparten av synsfeltet ved bruk av et 10x-objektiv (figur 3A). Derimot strakte de utvidede embryoene seg over omtrent to fulle synsfelt når de brukte det samme 10x-målet (figur 3B). For å vurdere hvordan ekspansjonsgraden varierte både innenfor og mellom eksperimenter, ble den samme ExM-protokollen utført ved tre separate anledninger, og embryolengden ble målt i tre forskjellige geler i hvert enkelt eksperiment. Gjennomsnittlig hode-til-hale-lengde for de ikke-ekspanderte kontrollembryoene var 398,8 μm (standardavvik [SD] = 22,93 μm; n = 74; Figur 3C). For eksperiment 1, eksperiment 2 og eksperiment 3 var de gjennomsnittlige embryolengdene henholdsvis 1,596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1,868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) og 1,954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), som representerer ekspansjonsfaktorer på henholdsvis 4,0 ganger, 4,7 ganger og 4,9 ganger (figur 3C). Den intraeksperimentelle variasjonen mellom gelene var mye mindre merkbar enn den intereksperimentelle variasjonen, som var ca. 20% (figur 3C). For å vurdere effekten av ExM på celle- og embryomorfologi, ble et antistoff mot adherenskrysskomponenten Par-3 (Bazooka)21 brukt til å merke de apikale cellemembranene, og vi avbildet de utviklende munnsegmentene i stadium 11 Drosophila-embryoer - et stadium med en kompleks segmentert struktur (figur 3D-F). I kontrollprøven hadde cellene i maxillarsegmentet en gjennomsnittlig bredde på 4,76 μm (SD = 1,053 μm, n = 25; Figur 3D,F). I de utvidede prøvene avbildet med samme 40x-objektiv og zoomfaktor (1x) hadde cellene i maxillarsegmentet en gjennomsnittlig bredde på 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Figur 3E,F), som representerer en utvidelse på 4,0 ganger. Derfor, i samsvar med tidligere rapporter11, var vi i stand til å utvide helmonterte Drosophila-embryoer omtrent fire ganger i lineære dimensjoner ved bruk av ExM uten prøveriving eller åpenbare forvrengninger i cellulær eller vevsmorfologi.

Figure 3
Figur 3: Firedobling av Drosophila-embryoer. (A) Uutvidede og (B) utvidede Drosophila-embryoer avbildet ved hjelp av et 10x objektiv (0,3 NA) ved 1x zoom. Individuelle synsfelt (FOV) er indikert med stiplede linjer. Embryoene uttrykte en GFP-merket versjon av myosin lettkjede og ble farget med et anti-GFP antistoff. (C) Kvantifisering av embryolengde (langs hode-til-hale-aksen) i tre hydrogeler per eksperiment og fra tre separate ExM-eksperimenter sammenlignet med ikke-utvidede kontroller. (D,E) Maxillarsegmenter fra (D) uutvidede og (E) utvidede stadium 11 Drosophila-embryoer avbildet ved hjelp av et 40x objektivt (1,3 NA) ved 1x zoom. Cellekonturene (adherens junctions) ble påvist med et anti Par-3/Bazooka antistoff (hvitt). (F) Kvantifisering av cellebredden (lang akse) fra ekvivalente grupper av celler fra (D) og (E). Boksplottene i (C) og (F) viser persentilområdene 25., 50. og 75. whiskers angir minimums- og maksimumsverdiene; "+"-symbolene indikerer gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å demonstrere at ExM kan brukes til å løse subcellulære detaljer under den typiske diffraksjonsgrensen, ble actomyosincytoskjelettet avbildet i uutvidet kontroll versus utvidede embryoer som gjennomgikk konvergent forlengelse (trinn 7). Vevsremodelleringshendelsene av gastrulering og konvergent forlengelse styres i stor grad av endringer i lokaliseringen av motorproteinet myosin II24. I det tettpakkede søyleepitelet i den tidlige Drosophila-ektodermen er det imidlertid vanskelig å observere mange fine detaljer i myosin II-lokaliseringsmønsteret, selv når det avbildes ved 158x forstørrelse (63x objektiv med 2,5x optisk zoom) - en typisk maksimal oppløsningsevne for et laserskanning konfokalmikroskop. For eksempel, fordi myosin II er et kortikalt protein (lokalisert rett under plasmamembranen), var bassenger av myosin II25 plassert på hver side av cellekontakter ikke oppløselige i stadium 7-embryoer, og de dukket opp som en enkelt linje der naboceller møttes (figur 4A). I utvidede stadium 7-embryoer kunne derimot parallelle linjer med myosin II observeres ved celle-celle-veikryss, som representerte kortikale proteinpooler i tilstøtende celler (figur 4B). Avstanden mellom parallelle myosin II-linjer i utvidede prøver var 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); når delt på fire, gir dette en predikert avstand på ~ 220 nm mellom myosinlinjene i tilstøtende celler i uutvidede embryoer, som faktisk er like under diffraksjonsgrensen for et signal oppdaget med Alexa 488 (topputslipp på ~ 520 nm / 2 = 260 nm).

I tillegg testet vi også om ExM kunne brukes til å løse mitokondriell nettverksarkitektur i tettpakkede celler av gastrulaterende Drosophila-embryoer (trinn 6). Mitokondriell funksjon er nært knyttet til nettverksstruktur (dvs. smeltet vs. fragmenterte organeller), men detaljene i mitokondriell nettverksorganisasjon er vanskelig å visualisere ved bruk av konvensjonell konfokalmikroskopi i celletyper som ikke er flate og / eller tynne. Mitokondrier er naturlig rike på biotinylerte molekyler, og dermed kan mitokondrier merkes i det tidlige Drosophila-embryoet ved bruk av fluorescerende merket streptavidin26. I de uutvidede stadium 6-embryoene merket med streptavidin-Alexa 488 fremsto signalet som cytoplasmatisk puncta som ofte var overlappende og vanskelige å løse (figur 4C). I de utvidede stadium 6-embryoene var derimot mange flere fine detaljer i mitokondrienettverket synlige, og puncta var lettere løselige (figur 4D)26,27. Disse resultatene indikerer at ExM kan brukes til å studere mitokondriell nettverksorganisering i celletyper som ikke tradisjonelt er egnet for mitokondrieanalyse.

Figure 4
Figur 4: Detaljer om aktomyosincytoskjelett og mitokondrier påvist ved ekspansjonsmikroskopi. (A,B) Myosin II lokalisering i nevroektodermceller (germband) avbildet med en 63x objektiv (1,4 NA) ved 2,5x zoom i stadium 7 (A) uutvidet og (B) utvidede embryoer. Myosin II ble påvist i embryoene som uttrykk for en transgen GFP-merket versjon av myosin II regulatorisk lyskjede (sqh-GFP), som ble påvist med et anti-GFP-antistoff (rødt). Distinkte bassenger av kortikal myosin lokalisert i tilstøtende celler kan løses i det utvidede embryoet (hvite piler). (C,D) Mitokondrielle nettverk i nevroektodermceller avbildet med et 63× objektivt (1,4 NA) ved 2,5x zoom i stadium 6 uutvidede (C) og utvidede (D) embryoer. Mitokondriene ble påvist med streptavidin-Alexa 488 (grønn), og cellekonturene ble påvist med et anti-Par-3/Bazooka-antistoff (magenta). Forsøkene ble utført med et laserskanning konfokalmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Løsningsoppskrifter. Sammensetning for løsningene som brukes i denne protokollen i rekkefølge etter utseende. Alle aksjene er væsker med mindre annet er angitt. Kjemikaliene ble resuspendert eller fortynnet i autoklavert filtrert vann med mindre annet er angitt. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Manuell avvik
De fleste Drosophila-embryofikseringsprotokoller innebærer å fjerne vitellinmembranen ved å riste faste embryoer i en emulsjon av metanol og heptan, noe som får membranene til å briste av via osmotisk brudd26. Mens metanolbasert avviktellinisering (metanolpopping) er effektiv og egnet for mange applikasjoner, gir manuell avviktellinisering (håndpeeling) noen betydelige fordeler. For det første tillater håndpeeling en å velge nøyaktig iscenesatte embryoer å avvike og samle, noe som øker sannsynligheten for å oppnå utvidede embryoer i en brukbar orientering på slutten av forsøket. Denne anrikningen er kritisk når man studerer spesifikke aspekter av raske utviklingsprosesser (f.eks. Mesoderminvaginasjon eller konvergent forlengelse), for hvilke passende iscenesatte embryoer kan representere bare noen få prosent av alle embryoer, selv innenfor et tett tidsbestemt samlingsvindu. Selvfølgelig, for mange applikasjoner, vil den mer tradisjonelle bulkmetanolpopping av embryoer fra et tidsbestemt innsamlingsvindu være tilstrekkelig, og håndpeeling er kanskje ikke verdt den ekstra innsatsen. For det andre påvirkes bindingen av visse primære antistoffer og fargestoffer negativt av tidligere eksponering av prøven for metanol. Av denne grunn kan håndpeeling gi betydelige økninger i immunfluorescenssignalkvaliteten sammenlignet med metanolpoppprøver, noe som gjør det til en nyttig generell teknikk for Drosophila utviklingsbiologer.

Høyoppløselig konfokalmikroskopi i utvidede helmonterte Drosophila-embryoer
Mens utførelse av høyoppløselig konfokalmikroskopi på utvidede prøver er konseptuelt det samme som på uutvidede prøver, introduserer ExM noen tekniske hindringer. Spesielt blir embryoorientering, som er tilfeldig, enda viktigere når prøvestørrelsen øker, fordi høyforstørrelse, høy-NA-mål bare er i stand til å fokusere lys fra prøveområder som er svært nær dekselet27. Derfor er det vanligvis bare mulig å fokusere på cellene på eller nær overflaten av embryoet som endte opp ved siden av dekselet da gelen ble dannet. Den beste måten å sikre at det er prøver av riktig orientering på slutten, er å starte ExM-protokollen med en tett iscenesatt samling av faste embryoer (f.eks. ved å bruke håndpeeling) og å frø mange embryoer i hver brønn (>10). For å visualisere celler dypt inne i embryoet, kan det være nødvendig å benytte mer spesialiserte bildeoppsett, for eksempel lysarkmikroskopi28. I tillegg finner vi at bildekvaliteten kan forbedres ved å åpne det konfokale pinhole til en størrelse større enn en luftig enhet. Selvfølgelig vil en økt pinhole størrelse komme på bekostning av redusert maksimal oppløsning, men i praksis kan selv små økninger i pinhole størrelse øke signalintensiteten betydelig (data ikke vist). Fremtidige studier bør systematisk adressere pinhole størrelse og effektiv oppløsning i ExM-prøver.

Variasjoner over grunnleggende ExM
Protokollen beskrevet her er et relativt enkelt eksempel på ExM som skal fungere for mange applikasjoner og være enkel å implementere i de fleste utviklingsbiologiske laboratorier. Imidlertid er det mange variasjoner på det grunnleggende konseptet med ExM 4,5,7 som kan brukes til å øke signalintensiteten, oppnå enda flere ekspansjonsgrader og oppdage nukleinsyremolekyler så vel som proteiner. I denne protokollen inkuberes embryoene med antistoffer før gelering og ekspansjon. Alternativt kan prøvene behandles med antistoffer etter at de er utvidet 6,30, noe som kan øke signalintensiteten på grunn av økt epitoptilgjengelighet og redusert tap av bundne antistoffer under ekspansjonstrinnene. I tillegg kan spesifikke tverrbindingsmolekyler brukes til å feste RNA-molekyler til hydrogelen for å tillate deteksjon av RNA i ekspanderte geler ved bruk av hybridiseringskjedereaksjonsmetoden30. Til slutt kan prøvene bli utsatt for flere ekspansjonsrunder, som i iterativ ekspansjonsmikroskopi (iExM)31, pan-ExM32 og ekspansjonsavslørende (ExR)31, for å oppnå enda høyere grader av økt oppløsning.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Dr. Jennifer Zallen for å gi marsvin anti-Par-3 primære antistoff. Dette arbeidet ble støttet av sjenerøs finansiering (1R15GM143729-01 og 1P20GM139768-01 5743) fra National Institute of General Medical Science (NIGMS), et av medlemmene i National Institutes of Health (NIH), samt Arkansas Biosciences Institute (ABI), som ga delvis finansiering for kjøp av vårt konfokale mikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acrylamide Milipore Sigma 1490-100ML
ammonium persulfate VWR BDH9214-500G
anti-GFP rabbit polyclonal antibody Torrey Pines BioLabs TP-401
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11075
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
bisacrylamide Research Products International A11275
bovine serum albumin (30% solution) Millipore Sigma A7284
conical tubes, 50 mL fisherscientific  21008-940
coverlip glass, square 22 mm VWR 48366-227
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm VWR 48393-230
glass capillaries for pulling needles World Precision Instruments TW100F-4
glass microinjection needles (pre-pulled) World Precision Instruments TIP10LT
guanidine HCl VWR 101970-606
heptane VWR EM-HX0078-1
latex pipet bulbs VWR 82024-554
methanol VWR BDH1135-4LP
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester VWR 730300-1G
microfuge tube, 1.5 mL VWR 20170-038
multi-well plate, 6-well Genesee 25-100
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) Electron Microscopy Sciences 509804487 (Fisher)
Pasteur pipet (2 mL, short tip) VWR 14673-010
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) VWR 102092-312
Petri plates Genesee 32-107
phosphate-buffered saline (10x solution) VWR 97063-660
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) VWR P8920-1ooML
Proteinase K Thermo Fisher Scientific E00491
scintillation vials (30 mL) VWR 66022-128
sodium acrylate VWR 101181-226
sodium azide (powder) Millipore Sigma 71289 make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific S32354
TAE (50x) VWR 97063-692
tape (double-sided, 1 inch wide) Scotch  3M 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed
TEMED Thermo Fisher Scientific PI17919
TEMPO VWR EM8.14681.0005 catalytic oxidant
Tween-20 VWR 97063-872 extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water
Zeiss LSM 900 Zeiss Laser scanning microscope used without AiryScan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  2. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  3. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  5. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  6. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Chang, J. -B. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  9. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  10. Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons. eLife. 6, e27347 (2017).
  11. Jiang, N., et al. Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy. Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).
  12. Yu, C. -C. J., et al. Expansion microscopy of C. elegans. eLife. 9, e46249 (2020).
  13. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  14. Tanaka, T., et al. Phase transitions in ionic gels. Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).
  15. Hausen, P., Dreyer, C. The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues. Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).
  16. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).
  17. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  18. Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).
  19. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protocols. 2007, (2007).
  20. Cold Spring Harbor Protocols. Drosophila apple juice-agar plates. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  21. de Matos Simões, S., et al. Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation. Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).
  22. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  23. Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging (2022).
  24. Paré, A. C., Zallen, J. A. Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation. Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).
  25. Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
  26. Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
  27. Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization. Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).
  28. Stelzer, E. H. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).
  29. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  30. Wen, G., et al. A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).
  31. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
  32. Sarkar, D. Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures. bioRxiv. , (2020).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 194 Actomyosin konvergent forlengelse utviklingsbiologi Drosophila embryologi ekspansjonsmikroskopi gastrulasjon mitokondrier myosin II Par-3 superoppløsningsmikroskopi
Bruk av ekspansjonsmikroskopi for fysisk å forstørre helmonterte <em>Drosophila-embryoer</em> for superoppløsningsavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parveen, S., Jones, N. W.,… More

Parveen, S., Jones, N. W., Millerschultz, I., Paré, A. C. Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging. J. Vis. Exp. (194), e64662, doi:10.3791/64662 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter