Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/64662
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Arkansas

Summary

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

Abstract

סוס העבודה של הביולוגיה ההתפתחותית הוא המיקרוסקופ הקונפוקלי, המאפשר לחוקרים לקבוע את הלוקליזציה התלת-ממדית של מולקולות מתויגות בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות. בעוד שמיקרוסקופים קונפוקליים מסורתיים מאפשרים לזהות שני מקורות נקודתיים פלואורסצנטיים סמוכים הממוקמים במרחק של כמה מאות ננומטרים זה מזה, התבוננות בפרטים הקטנים יותר של הביולוגיה התת-תאית דורשת יכולת לפענח אותות בסדר גודל של עשרות ננומטרים. שיטות מבוססות חומרה רבות למיקרוסקופיה ברזולוציית על פותחו כדי לאפשר לחוקרים לעקוף מגבלות רזולוציה כאלה, אם כי שיטות אלה דורשות מיקרוסקופים מיוחדים שאינם זמינים לכל החוקרים. שיטה חלופית להגדלת כוח הפענוח היא הגדלה איזוטרופית של הדגימה עצמה באמצעות תהליך המכונה מיקרוסקופ הרחבה (ExM), אשר תואר לראשונה על ידי קבוצת בוידן בשנת 2015. ExM אינו סוג של מיקרוסקופ כשלעצמו אלא שיטה לניפוח דגימה תוך שמירה על הארגון המרחבי היחסי של המולקולות המרכיבות אותה. לאחר מכן ניתן לצפות בדגימה המורחבת ברזולוציה מוגברת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מסורתי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ליישום ExM בעוברי דרוזופילה שלמים, המשמש לבחינת לוקליזציה של Par-3, מיוזין II ומיטוכונדריה בתוך תאי אפיתל פני השטח. פרוטוקול זה מניב גידול של בערך פי ארבעה בגודל הדגימה, ומאפשר זיהוי של פרטים תת-תאיים שאינם נראים במיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונלי. כהוכחה עקרונית, נוגדן אנטי-GFP משמש להבחנה בין מאגרים נפרדים של מיוזין-GFP בין קליפות תאים סמוכות, וסטרפטאבידין המסומן פלואורסצנטית משמש לזיהוי מולקולות ביוטיניליות אנדוגניות כדי לחשוף את הפרטים הקטנים של ארכיטקטורת הרשת המיטוכונדריאלית. פרוטוקול זה משתמש בנוגדנים וריאגנטים נפוצים לסימון פלואורסצנטי, והוא צריך להיות תואם לפרוטוקולים חיסוניים קיימים רבים.

Introduction

בביולוגיה תאית והתפתחותית, ראייה היא אמונה, והיכולת לקבוע במדויק את דפוסי הלוקליזציה של חלבונים היא בסיסית לסוגים רבים של ניסויים. מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר הוא הכלי הסטנדרטי להדמיית חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בשלושה ממדים בתוך דגימות שלמות. מיקרוסקופים קונפוקליים קונבנציונליים אינם מסוגלים להבחין (לפתור) אותות פלואורסצנטיים סמוכים המופרדים על ידי פחות ממחצית אורך הגל של האור שהם פולטים1. במילים אחרות, שני מקורות נקודתיים חייבים להיות מופרדים על ידי לפחות 200-300 ננומטר בכיוון הצידי (500-700 ננומטר בכיוון הצירי) כדי לפתור אותם כשני אותות נפרדים. מחסום טכני זה ידוע כגבול העקיפה, והוא מהווה מכשול בסיסי למחקרים של מבנים תת-תאיים מורכבים (למשל, שלד שלד אקטומיוזין או רשתות מיטוכונדריאליות) עם תכונות מרחביות מתחת לגבול העקיפה. לכן, טכניקות להגדלת כוח הפתרון של מיקרוסקופים קונפוקליים קונבנציונליים הם בעלי עניין כללי לקהילה הביולוגית.

כדי לעקוף את מגבלת העקיפה, פותחו מספר טכנולוגיות שונות של מיקרוסקופיה ברזולוציית על המאפשרות רזולוציה בסדר גודל של עשרות ננומטרים או פחות 1,2,3, וחושפות עולם של מורכבות ביולוגית שהיה נגיש בעבר רק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. למרות היתרונות הברורים של שיטות מבוססות חומרה אלה, למיקרוסקופים ברזולוציית על יש לעתים קרובות דרישות ספציפיות לסימון דגימות וזמני רכישה ארוכים, המגבילים את גמישותם, או שהם פשוט יקרים מדי עבור מעבדות מסוימות לגשת אליהם. חלופה לסופר-רזולוציה מבוססת מיקרוסקופ היא מיקרוסקופ התפשטות (ExM), שאינו סוג של מיקרוסקופ כשלעצמו אלא שיטה לניפוח דגימה תוך שמירה על הארגון המרחבי היחסי של המולקולות המרכיבות אותה4. לאחר מכן ניתן לצפות בדגימות המורחבות איזוטרופית ברזולוציה מוגברת ביעילות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי מסורתי. ExM תוארה לראשונה על ידי קבוצת בוידן בשנת 20155, והטכניקה הבסיסית הותאמה מאז לשימוש במגוון ניסויים 6,7,8. ExM הותאם גם לשימוש בעוברים שלמים, בעיקר בדרוזופילה 9,10,11, C. elegans12 ודגי זברה 13, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה עבור ביולוגים התפתחותיים.

ExM מבוסס על שני כימי הידרוג'ל שונים: 1) הידרוג'ל פוליאלקטרוליטים מתנפחים, אשר גדלים מאוד כאשר הם מושרים במים14, ו -2) הידרוג'ל פוליאקרילאמיד, שיש להם מרווח פולימרי קטן מאוד כדי לאפשר הרחבת דגימה איזוטרופית15. למרות שישנם פרוטוקולי ExM רבים שפורסמו, הם בדרך כלל חולקים את השלבים הבאים: קיבוע דגימה, תיוג, הפעלה, ג'לציה, עיכול והרחבה4. תנאי הקיבוע ואסטרטגיות התיוג הפלואורסצנטי ישתנו כמובן בהתאם לצרכי הניסוי והמערכת, ובחלק מהפרוטוקולים התיוג מתרחש לאחר הרחבה. מולקולות המטרה בדגימה חייבות להיות מוכנות (מופעלות) להיקשרות להידרוג'ל, דבר שניתן להשיג באמצעות כימיות שונות4. במהלך שלבי הג'לציה, הדגימה רוויה במונומרים של ההידרוג'ל העתידי (נתרן אקרילט, אקרילאמיד וביסקרלאמיד קרוס-לינקר ), וההידרוג'ל נוצר לאחר מכן על ידי פילמור רדיקלים חופשיים המזורז על ידי יוזם, כגון אמוניום פרסולפט (APS), ומאיץ, כגון טטרמתילאנדיאמין (TEMED)4. לאחר הג'לציה, הדגימה מתעכלת אנזימטית כדי ליצור הומוגניזציה של עמידות הדגימה לנפיחות ולהבטיח את ההתרחבות האיזוטרופית של ההידרוג'ל4. לבסוף, הידרוג'ל מעוכל ממוקם במים, מה שגורם לו להתרחב בערך פי ארבעה בגודל ליניארי המקורי שלה4.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של מיקרוסקופ התפשטות בעוברי דרוזופילה . ExM הוא פרוטוקול רב-שלבי שהשלמתו נמשכת לפחות 4 ימים. איסוף, קיבוע ודייטליניזציה של עוברים נמשכים יום אחד או יותר, תלוי אם עוברים מאוספים מרובים מאוגמים. תיוג immunofluorescence לוקח 1 יום או 2 ימים, תלוי אם העוברים מודגרים לילה עם הנוגדנים הראשוניים. הפעלת עוברים, גלציה, עיכול והרחבה יכולים להתבצע ביום אחד. הג'לים יכולים להיות מורכבים והדמיה מיד לאחר הרחבה, אם כי מסיבות מעשיות רצוי לעתים קרובות להתחיל הדמיה למחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ExM בעוברי דרוזופילה 16 בשלב מוקדם עד בינוני כדי להמחיש תבניות לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים ברזולוציית על (איור 1). שיטה זו משתמשת בכימיה של חומצה מתילאקרילית N-hydroxysuccinimidyl ester (MA-NHS) כדי להפעיל ולעגן מולקולות חלבון להידרוג'ל17, והיא שינוי של פרוטוקול ExM שפורסם בעבר לשימוש בעוברים ורקמות דרוזופילה בשלב מאוחר11. פרוטוקול זה משתמש בבארות פולידימתילסילוקסאן (PDMS) כדי לעצב את ההידרוג'לים ולהקל על החלפת תמיסות במהלך ההפעלה והג'לציה. שיטה חלופית שאינה דורשת יצירת בארות PDMS כוללת הורדת עוברים המחוברים לכיסויים לטיפות של תמיסת מונומר המונחת על פיסת סרט איטום מעבדה22. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של קרום ויטלין בלתי חדיר המקיף עוברי דרוזופילה , שהוא תנאי מוקדם לצביעת אימונופלואורסצנטיות. חשוב לציין, שיטה זו של קילוף ידני של עוברים יכולה לשמש לבחירת רק עוברי דרוזופילה בשלבים נכונים לפני תיוג הדגימה, מה שמגדיל מאוד את הסיכוי להגיע לדגימות מורחבות של השלב והכיוון הנכונים, ובכך הופך את איסוף הנתונים במורד הזרם להרבה יותר יעיל.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות אוניברסיטת ארקנסו (UARK) למחקר על בעלי חיים חסרי חוליות, כגון Drosophila melanogaster, ואושר על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של UARK (פרוטוקול #20001).

1. קיבוע עובר דרוזופילה ו devitellinization

הערה: שלב 1 מתאר הליך (קילוף ידיים) להסרה ידנית של קרום ויטלין, קרום שקוף ובלתי חדיר המקיף את העובר. חשוב לציין, קילוף ידני מאפשר בחירה של עוברים בשלבים נכונים בתחילת פרוטוקול ExM, ובכך משפר מאוד את הסיכוי לקבל עוברים בכיוון שמיש בסוף פרוטוקול ExM. עם זאת, פרוטוקול ExM זה תואם לחלוטין לאיסוף עוברים בתפזורת ולהליכים סטנדרטיים להסרה מבוססת מתנול של קרום ויטלין, ובמקרה זה ניתן לדלג ישירות לשלב 2 (תיוג immunofluorescence).

  1. הכינו או רכשו מספר מחטי זכוכית עדינות. הממדים בפועל של קצה המחט אינם קריטיים, אך מבטיחים שהמחטים יהיו קשיחות וחדות מספיק כדי לחדור את קרומי הוויטלינים של עוברים קבועים. לייצר מחטים מצינורות נימי זכוכית (קוטר חיצוני של 1 מ"מ, קוטר פנימי של 0.75 מ"מ) באמצעות מושך מיקרופיפט, כפי שמכינים מחטים למיקרו-הזרקות של עוברים18; לחלופין, רכשו מחטים שנמשכו מראש.
  2. יש לאסוף עוברים בטכניקות דרוזופילה סטנדרטיות19 על ידי הנחת >100 דרוזופילה בוגרת בכוס פלסטיק מאווררת אטומה בצלחת מיץ פירות/אגר20. השתמש בחלונות איסוף מתוזמנים כדי להעשיר עוברים בשלב16 הנכון. לדוגמה, כדי להעשיר עבור שלבי הגסטרולציה (שלב 6) וההרחבה המתכנסת (שלב 7), שנו את צלחת מיץ הפירות, אספו את העוברים במשך שעתיים ב -25 מעלות צלזיוס, ואז הסירו את הצלחת, ויישנו אותה למשך שעתיים נוספות ב -25 מעלות צלזיוס כדי לקבל עוברים בני ~ 2-4 שעות.
  3. כדי להסיר את הכוריון דמוי קליפת הביצה מהעוברים, כסו את פני השטח של צלחות מיץ הפירות באקונומיקה של 50% (טבלה 1), שחררו את העוברים מפני השטח של האגר על ידי התסיסתם בעזרת מברשת צבע קטנה, והמתינו 3 דקות עד שהכוריון יתמוסס.
  4. מעבירים את העוברים הדכוריוניים באמצעות מברשת צבע לבקבוקון נצנוץ של 30 מ"ל המכיל 4 מ"ל הפטן (פאזה עליונה אורגנית) ו-4 מ"ל של חיץ קיבוע (פאזה תחתונה מימית; טבלה 1). לדלל טרי את הפורמלדהיד ממלאי טרי שהוכן או נפתח לאחרונה, ולערבב עם 10x PBS ומים נטולי יונים, מיד לפני הוספת העוברים.
    הערה: הכינו את הפורמלדהיד מכוח פרפורמלדהיד או 16% פורמלדהיד באיכות EM באמפולות זכוכית. ניתן להשתמש במלאי של פורמלדהיד מרוכז (למשל, 37% פורמלדהיד), אם כי התוצאות עשויות להיות פחות עקביות.
  5. העוברים יצטברו בממשק שבין הפאזה האורגנית לשלב המימי. הוסיפו כמה שיותר עוברים שייצרו שכבה אחת בממשק. אם מוסיפים יותר מדי עוברים לבקבוקון, גם הם לא יתקנו.
  6. בעזרת נייר דבק חזק, יש לשתק את בקבוקוני הנצנוץ שעל צידיהם על שייקר שולחני, ולהסעיר אותם במשך 20 דקות ב-220 סל"ד. לקיבוע אופטימלי, שמרו על תחליב נמרץ בין השלב האורגני לשלב המימי במהלך הקיבוע כולו.
  7. במהלך זמן הקיבוע, הכינו אחת מהפעולות הבאות עבור כל אחת מהדגימות.
    1. קח בסיס צלחת פטרי 6 ס"מ פלסטיק מלא באמצע הדרך עם 3% אגר ולהשיג ~ 5 ס"מ x 3 ס"מ מלבן באגר עם סכין גילוח או אזמל. ניתן להשתמש גם במיץ פירות / צלחות אגר למטרה זו.
    2. בעזרת מרית מעבדה קטנה, מסירים את לוח האגר. הופכים את בסיס צלחת הפטרי, ומניחים אותה על הספסל. הניחו את לוח האגר על גבי הכלי ההפוך (איור 2A).
    3. קח את המכסה של צלחת פטרי וודא שהוא יבש. לובשים כפפות, מניחים חתיכת סרט דו-צדדי בתוך המכסה (חתיכת הסרט צריכה להיות מעט גדולה יותר מלוח האגר; איור 2B).
  8. הוציאו את הבקבוקונים מהשייקר, הניחו אותם זקופים על הספסל ואפשרו לפאזות האורגניות והמימיות להיפרד. עוברים קבועים כראוי יישארו בממשק בין שני השלבים.
  9. מעבירים את העוברים הקבועים על לוח אגר באמצעות פיפט פסטר זכוכית המצויד בנורת לטקס. כדי למנוע מהעוברים להיצמד לחלק הפנימי של הפיפט, נסו לשמור את העוברים בתוך הצוואר הצר של הפיפט, והעבירו את העוברים במספר אצוות קטנות ולא בבת אחת. לאחר שכל העוברים נמצאים על לוח האגר, הסר את רוב שאריות הפטן מסביב לעוברים באמצעות פיפטור P200. בצע שלב זה מהר ככל האפשר (<3 דקות) כדי למנוע ייבוש העוברים הקבועים, אשר יכול להשפיע לרעה על המורפולוגיה.
  10. מגובה של ~2 ס"מ, שחררו את המכסה עם הסרט הדו-צדדי על לוח האגר כדי להדביק את העוברים לסרט (איור 2C). הסירו בעדינות את המכסה מלוח האגר, הניחו אותו הפוך על הספסל ולאחר מכן הוסיפו מספיק PBS-Tween (טבלה 1) כדי לכסות את העוברים במכסה.
  11. באמצעות מיקרוסקופ מנתח סטריאו בהגדלה של בערך פי 100 עם תאורה עקיפה, לזהות עוברים מבוימים כראוי באמצעות סמנים מורפולוגיים. עבור עוברים בשלב 6, השתמש בסמנים כמו תלם צפאלי גלוי ומזודרם פולש; עבור עוברים בשלב 7, השתמש בסמנים כמו רצועת חיידקים מורחבת; עבור עוברים בשלב 11, השתמשו בסמנים כמו נבט מורחב במלואו וסגמנטציה נראית לעין לאורך ציר הראש עד הזנב16.
    1. כדי לאסוף את העוברים הרצויים, ראשית לדקור את קרום ויטלין (קרום אליפסה שקופה סביב העובר) ליד הקצה הקדמי או האחורי של העובר עם מחט זכוכית עדינה; הממברנה תתנפח מעט ככל שהלחץ ישתחרר. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים עדינים או בדיקה מתכתית, לדחוף בעדינות את העובר בצד השני דרך החור; קרום ויטלין יישאר דבוק לסרט הדו-צדדי. השאירו עוברים לא רצויים דבוקים לקלטת.
  12. מעת לעת לאסוף את העוברים devitellinized צף עם פיפט פסטר זכוכית, ולהעביר אותם צינור microfuge 1.5 מ"ל.
  13. בשלב זה, בצע אחד מהשלבים הבאים.
    1. המשך ישירות לשלבי הסימון של immunofluorescence. העוברים שעברו devitellinized יכולים להיכנס ישירות לתמיסת חסימה (שלב 2.2). אל תאפשר לעוברים להישאר בתמיסת PBS-Tween או בתמיסת חסימה (טבלה 1) למשך יותר מ-16 שעות לפני שתמשיך לשלב הבא.
    2. העבירו את העוברים למתנול לאחסון. הסר כמה שיותר PBS-Tween ולאחר מכן הוסף 1 מ"ל מתנול. לאחר שהעוברים התיישבו, הסירו כמה שיותר מתנול, והוסיפו 1 מ"ל מתנול טרי. אחסנו את העוברים בטמפרטורה של -20°C ללא הגבלת זמן. אחסון מתנול מאפשר גם איגום עוברים מאוספים מרובים.

2. תיוג immunofluorescence

הערה: מלבד שלבי הדגירה של הנוגדנים, כמויות וזמנים מדויקים של נוזלים אינם קריטיים בסעיף זה. כדי לבצע שטיפה או שטיפה, לאפשר לעוברים להתיישב לתחתית הצינור, להסיר נוזלים רבים ככל האפשר מבלי למצוץ עוברים, ולאחר מכן להוסיף ~ 1 מ"ל של נוזל חדש; השתמשו בצינור פסטר מזכוכית המצויד בנורת לטקס לקבלת בהירות ושליטה מיטביות. עבור שלב השטיפה, העוברים אינם נדנדים, רק מותר להתיישב; עבור שלב השטיפה, העוברים נדנדים על nutator במשך כמות הזמן המצוינת ולאחר מכן מותר להתיישב.

  1. אם העוברים לא אוחסנו במתנול, המשך לשלב 2.2. אם העוברים אוחסנו במתנול, יש לשטוף פעמיים עם PBS-Tween, ולאחר מכן לשטוף במשך 20 דקות פעמיים עם PBS-Tween.
  2. לשטוף את העוברים במשך 30-60 דקות ב 1 מ"ל של פתרון חוסם.
  3. לדגור על העוברים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת נוגדנים (טבלה 1) במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או עדיף לילה ב 4 מעלות צלזיוס. בצע שלב זה בנפח קטן ככל האפשר (50-300 μL) כדי לשמר את הנוגדנים הראשוניים; נדנוד על נוטטור אינו נדרש בהחלט.
    1. הגדל את כמות הנוגדן הראשוני המשמש בניסוי אימונופלואורסצנטי טיפוסי בלפחות 50% עבור ExM. השתמש בריכוזי הנוגדנים העיקריים הבאים: 1:200 עבור רב-שפן21 נגד Par-3 ו-1:100 עבור רב-שבטי ארנב אנטי-GFP.
  4. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית (שמור ב -4 ° C אם תרצה), שטוף פעמיים עם PBS-Tween, ולאחר מכן לשטוף במשך 15 דקות ארבע פעמים עם PBS-Tween.
  5. לדגור על העוברים עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים בנפח סופי של 300 μL (מדולל בתמיסת נוגדנים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על נוטטור. ניתן להוסיף סטרפטאבידין עם תווית פלואורסצנטית במהלך שלב זה. משלב זה ואילך, הגנו על העוברים מפני חשיפה מוגזמת וממושכת לאור במידת האפשר, למשל על ידי כיסוי הצינורות במכסה קופסה אטום או שמירת הדגימות במגירה.
    1. השתמש בריכוזים הבאים: 1:500 עבור נוגד ארנב IgG עז polyclonal מאוחה Alexa Fluor 488; 1:500 לשרקן נגד שרקנים IgG עז רב-שבטי מאוחה לאלכסה פלור 568; ו-1:1000 עבור סטרפטווידין-אלקסה פלואור 488.
  6. הסר והשלך את תמיסת הנוגדנים המשנית. שטפו את העוברים פעמיים עם PBS-Tween, ושטפו במשך 15 דקות ארבע פעמים עם PBS-Tween.
  7. בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך אך לעבד את הדגימות במהירות האפשרית (<24 שעות).

3. הכנת בארות PDMS

הערה: ניתן להכין את בארות PDMS עד שבועיים מראש.

  1. הגדר אינקובטור או צלחת חמה ל 55 ° C, ולהגדיר צנטריפוגה שיכולה לסובב צינורות חרוטיים ל 15 ° C.
  2. כדי להכין את תמיסת PDMS (טבלה 1), הניחו צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל במיכל משני על מאזניים, והוסיפו 10 גרם בסיס אלסטומר סיליקון לצינור באמצעות מזרק. לאחר מכן, להוסיף 1 גרם של חומר ריפוי אלסטומר סיליקון, ולהפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב.
  3. צור צינור איזון על ידי הוספת כמות מתאימה של מים לצינור חרוטי שני של 50 מ"ל. צנטריפוגה את תמיסת PDMS ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 15 ° C, ולאחר מכן לשפוך אותו לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ לעומק של ~ 1 מ"מ. במידת הצורך, להסיר בועות על ידי נשיפה עדינה על הפתרון עם צינור אוויר. אפשר לתמיסת PDMS להתמצק בן לילה בטמפרטורה של 55°C.
  4. לאחר מיצוק לוח PDMS, באמצעות אזמל, הניחו לעצמכם אזורים מרובעים קטנים מעט יותר ממשטח כיסוי בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ. בתוך כל ריבוע, הבקיע והסר היטב ריבוע ברוחב ~8 מ"מ.
  5. העבירו היטב כל PDMS מרובע על מכסה בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ, והדביקו אותו היטב (איור 2D). הכנת שישה כיסויים או יותר אמורה להניב מספר לא מבוטל של עוברים מורחבים לתמונה.

4. הדבקת העוברים לכיסויים

  1. יש למרוח מספיק 0.1% פולי-L-ליזין כדי לכסות את משטח הכיסוי בתוך כל באר (~ 50 μL), ומניחים אותם באינקובטור של 55 מעלות צלזיוס לייבוש באוויר. חזור על שלב זה כדי להגביר את ההדבקה.
  2. שטפו בקצרה את העוברים פעם ב-1x PBS כדי להסיר את חומר הניקוי Tween, ולאחר מכן העבירו >10 עוברים לכל אחת מהבארות מצופות הפולי-L-ליזין.
  3. אפשרו לעוברים לשקוע לתחתית הבארות. מוציאים את עודפי הנוזלים מהעוברים הדבוקים באמצעות פיפט פסטר. המשך מיד לשלב הבא.

5. הפעלה וג'לציה

הערה: הפעלה מתייחסת לתוספת של MA-NHS לעוברים, אשר ישנה את חלבוני הדגימה והנוגדנים כך שיוכלו להיקשר להידרוג'ל. ג'לציה מתייחסת ליצירת הידרוג'ל בתוך ומסביב לעוברים בכל באר. במהלך הג'לציה, העוברים חדורים בתמיסת מונומר ולאחר מכן מטופלים בתמיסת ג'לציה ליצירת ההידרוג'ל.

  1. הפעל את העוברים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על ידי מילוי הבארות בתמיסת הפעלה (1 mM MA-NHS מדולל טרי ב- 1x PBS; טבלה 1). שנה פתרון זה בערך כל 10 דקות במהלך 1 שעה.
  2. שטפו את העוברים עם PBS 1x שלוש פעמים. יש לדגור על העוברים בתמיסת מונומר (טבלה 1) למשך 45 דקות בטמפרטורה של 4°C.
  3. בזמן שהעוברים יושבים בתמיסת מונומר, הכינו את תמיסת הגלציה (טבלה 1). הכנת ~ 2 מ"ל של תמיסת ג'לציה מספיקה כדי לכסות את בארות PDMS מצלחת פטרי שלמה של 10 ס"מ. הקפד להוסיף את APS האחרון, כפי שהוא יתחיל פילמור ולהתחיל את gelation.
    1. לדלל את המחמצן הקטליטי טרי מאבקה (למשל, 1% TEMPO w/v במים). שלב 1,960 μL של תמיסת מונומר עם 30 μL של 10% TEMED ו 10 μL של 1% TEMPO.
    2. כדי למנוע פילמור של כל אצווה של פתרון gelation בבת אחת, לעבוד בקבוצות קטנות. לפצל את תמיסת הג'לציה (ללא APS) ל 125 μL aliquots בין שמונת הצינורות של רצועת PCR.
    3. הסר את תמיסת המונומר משלוש בארות PDMS באמצעות ואקום תוך זהירות שלא להפריע לעוברים. הוסף 5 μL של APS לאחד מצינורות ה- PCR המכילים תמיסת ג'לציה כדי להתחיל פילמור. להפיץ במהירות את תמיסת הג'לציה המתפלמרת בין הבארות (~ 40 μL לכל באר). חזור על פעולה זו עד שכל הבארות והעוברים מכוסים.
  4. תן את הדגימות ג'ל במשך 1.5-2.5 שעות ב 37 ° C. תססו את ההידרוג'לים מדי פעם כדי לפקח על הפילמור. הידרוג'לים מוצקים לא יתנוועעו. הידרוג'לים עבים יותר ייקח זמן רב יותר להשלים פילמור ולהתמצק.

6. עיכול והרחבה

הערה: לג'לים עבים וגדולים יותר ייקח זמן רב יותר להתרחב, ומרכז הג'לים עשוי לקחת מספר שעות כדי להתרחב לחלוטין; זה יכול להיות מואץ על ידי חיתוך הקצוות של הג'ל. ככל שהג'לים מתרחבים, מקדם השבירה שלהם יהיה כמעט זהה לזה של מים, ויהיה קשה מאוד לראות אותם.

  1. לאחר השלמת הג'לציה, קלפו את בארות ה-PDMS מהכיסוי תוך ניסיון לא להפריע להידרוג'לים. חותכים חומר הידרוג'ל עודף, אם רוצים.
  2. העבירו את ההידרוג'לים (שעדיין מחוברים לכיסויים) בנפרד לתוך בארות של צלחת בת שש בארות (איור 2E). שים לב כי הידרוג'לים עשויים להתרחב מעט במהלך העיכול.
  3. כסו את הג'לים לחלוטין במאגר העיכול (טבלה 1) למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C. באופן כללי, 30 מ"ל של חיץ העיכול מספיק כדי לכסות את הג'לים בצלחת 6 באר.
  4. לאחר העיכול, מעבירים כל הידרוג'ל בנפרד לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ על ידי החלקתם מהכיסוי. ייתכן שיהיה צורך להשתמש בכיסוי שני כדי לעקור את הג'ל. מלאו כל צלחת פטרי במים נטולי יונים, כדי להרחיב את הג'ל. החליפו את המים שלוש עד ארבע פעמים במהלך 1-2 שעות עד שהג'לים מורחבים במלואם (צפו לעלייה משוערת פי ארבעה ברוחב).

7. הרכבה והדמיה

הערה: הידרוג'לים מורחבים מורכבים כמעט אך ורק ממים, מה שהופך אותם לכמעט שקופים ושבריריים ביותר. ניתן לתפעל את הג'לים באמצעות כיסויים ארוכים כדי להזיז אותם ולהרים אותם. הרכיבו ודמיינו רק ג'ל אחד או שניים בכל פעם, מכיוון שג'לים ישחררו מים בהדרגה ויתחילו להחליק סביב הכיסוי.

  1. בעזרת פיפט פסטר, הסירו כמה שיותר מים עודפים מצלחת הפטרי כדי למזער את הג'לים הנעים ממקום למקום בעת הטיפול.
  2. תמרנו כל ג'ל מורחב, עם העוברים על המשטח התחתון, על גבי כיסוי גדול (למשל, 24 מ"מ x 40 מ"מ) להדמיה.
  3. יש להרכיב כל כיסוי בג'ל מעל המטרה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לסריקת לייזר. אתר דגימות מבוימות ומכוונות כראוי באמצעות מצבי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או שדה בהיר במיקרוסקופ עם מטרות אוויר בהגדלה נמוכה (5x או 10x) או בינונית (20x).
  4. כדי לצלם ברזולוציה גבוהה, עבור למטרה של הגדלה גבוהה (60x, 63x או 100x) של טבילת שמן או מים. פני השטח של העוברים חייבים להיות בטווח המיקוד של המטרה (<300 מיקרומטר מהכיסוי עבור מטרה של 63x) על מנת שניתן יהיה לצלם אותם.
  5. איסוף נתונים מדגימות באמצעות מצב קונפוקלי של סריקת לייזר במיקרוסקופ. הקפידו לאסוף תמונות לא רוויות עם טווח דינמי טוב, והשתמשו במספר מתאים של פיקסלים לתמונה כדי ללכוד את המידע המרבי האפשרי על הדגימה23.

Figure 2
איור 2: סטייה ידנית ועבודה עם הידרוג'לים . (A) חיתוך לוח אגר מצלחת אגר/מיץ פירות. (B) הנחת סרט דו-צדדי בתוך מכסה של צלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ. (ג) הדבקת עוברים למכסה המודבק. (D) לוח PDMS עם ריבוע מודבק היטב לכיסוי בגודל 22 מ"מ x 22 מ"מ. (E) כיסוי עם PDMS היטב בתוך צלחת 6 בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Representative Results

כדי לאפיין את היעילות הכללית של ExM בעוברי דרוזופילה שלמים, אורך העובר לאורך ציר הראש-זנב נמדד בעוברי ביקורת לא מורחבים לעומת עוברים מורחבים (איור 3A-C). עוברי הבקרה הבלתי מורחבים היו נתונים לאותם תנאי קיבוע ושלבי תיוג אימונופלואורסנציה כמו העוברים המורחבים, אלא שהם הותקנו באמצעות אמצעי הרכבה מוצק לפני ההדמיה. העוברים הבודדים שלא התרחבו השתרעו על פני כמחצית משדה הראייה כאשר השתמשו במטרה של פי 10 (איור 3A). לעומת זאת, העוברים המורחבים השתרעו על פני כשני שדות ראייה מלאים כאשר השתמשו באותה מטרה של פי 10 (איור 3B). כדי להעריך כיצד מידת ההתפשטות השתנתה בתוך ובין ניסויים, אותו פרוטוקול ExM בוצע בשלוש הזדמנויות שונות, ואורך העובר נמדד בשלושה ג'לים שונים בתוך כל ניסוי בנפרד. אורך הראש עד הזנב הממוצע של עוברי הביקורת הבלתי מורחבים היה 398.8 מיקרומטר (סטיית תקן [SD] = 22.93 מיקרומטר; n = 74; איור 3C). עבור ניסוי 1, ניסוי 2 וניסוי 3, אורכי העובר הממוצעים היו 1,596 מיקרומטר (SD = 159.9 מיקרומטר; n = 57), 1,868 מיקרומטר (SD = 150.5 מיקרומטר; n = 51), ו- 1,954 מיקרומטר (SD = 120.3 מיקרומטר; n = 44), בהתאמה, המייצגים גורמי התפשטות של פי 4.0, פי 4.7 ופי 4.9, בהתאמה (איור 3C). השונות התוך-ניסויית בין הג'לים הייתה הרבה פחות מורגשת מאשר השונות הבין-ניסויית, שהייתה בערך 20% (איור 3C). כדי להעריך את ההשפעות של ExM על המורפולוגיה של התאים והעוברים, נעשה שימוש בנוגדן כנגד רכיב צומת הדבקים Par-3 (Bazooka)21 כדי לסמן את קרומי התאים האפיקאליים, ודימנו את מקטעי הפה המתפתחים של עוברי דרוזופילה בשלב 11 – שלב עם מבנה מקוטע מורכב (איור 3D-F). במדגם הבקרה, התאים במקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 4.76 מיקרומטר (SD = 1.053 מיקרומטר, n = 25; איור 3D,F). בדגימות המורחבות שצולמו באמצעות אותו גורם מטרה וזום של 40x (1x), התאים במקטע המקסילרי היו ברוחב ממוצע של 19.10 מיקרומטר (SD = 3.966 מיקרומטר, n = 18; איור 3E,F), המייצג התרחבות של פי 4.0. לכן, בהתאם לדיווחים קודמים11, הצלחנו להרחיב עוברי דרוזופילה שלמים בערך פי ארבעה בממדים ליניאריים באמצעות ExM ללא קריעת דגימה או עיוותים ברורים במורפולוגיה התאית או הרקמה.

Figure 3
איור 3: התרחבות פי ארבעה של עוברי דרוזופילה. (A) עוברי דרוזופילה לא מורחבים ו-(B) מורחבים שצולמו באמצעות מטרה של 10x (0.3 NA) בזום 1x. שדות תצוגה בודדים (FOV) מסומנים בקווים מקווקוים. העוברים ביטאו גרסה מתויגת GFP של שרשרת אור מיוזין והיו מוכתמים בנוגדן אנטי GFP. (C) כימות אורך העובר (לאורך ציר הראש-זנב) בשלושה הידרוג'לים בכל ניסוי ומשלושה ניסויי ExM נפרדים בהשוואה לבקרות לא מורחבות. (ד,ה) מקטעים מקסילריים מ-(D) עוברים לא מורחבים ו-(E) שלב 11 מורחב של דרוזופילה שצולמו באמצעות מטרה של 40x (1.3 NA) בזום 1x. קווי המתאר של התא (צמתים נצמדים) זוהו עם נוגדן אנטי Par-3/Bazooka (לבן). (F) כימות רוחב התא (ציר ארוך) מקבוצות מקבילות של תאים מ-(D) ו-(E). תרשימי התיבות ב-(C) ו-(F) מציגים את טווחי האחוזונים ה-25, ה-50 וה-75; השפם מציין את ערכי המינימום והמקסימום; הסמלים "+" מציינים את הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי להדגים שניתן להשתמש ב-ExM כדי לפתור פרטים תת-תאיים מתחת לגבול העקיפה האופייני, שלד הציטו-טקטומיוסין צולם בבקרה לא מורחבת לעומת עוברים מורחבים שעברו הרחבה מתכנסת (שלב 7). אירועי עיצוב מחדש של רקמות של גסטרולציה והרחבה מתכנסת נשלטים במידה רבה על ידי שינויים בלוקליזציה של החלבון המוטורי מיוזין II24. עם זאת, באפיתל העמודים הצפוף של אקטודרם דרוזופילה המוקדם, קשה להבחין בפרטים עדינים רבים של תבנית הלוקליזציה של מיוזין II, אפילו כאשר הם מצולמים בהגדלה של 158x (63x אובייקטיבי עם זום אופטי של 2.5x) – עוצמת פתרון מקסימלית טיפוסית עבור מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. לדוגמה, מאחר שמיוזין II הוא חלבון בקליפת המוח (הממוקם ישירות מתחת לקרום הפלזמה), מאגרים של מיוזין II25 הממוקמים משני צדי המגעים של תאי התא לא היו פתירים בעוברים בשלב 7, והם הופיעו כקו יחיד שבו תאים שכנים נפגשו (איור 4A). לעומת זאת, בעוברים מורחבים בשלב 7 ניתן היה לראות קווים מקבילים של מיוזין II בצמתים בין תאים, המייצגים מאגרי חלבונים בקליפת המוח בתאים סמוכים (איור 4B). המרחק בין קווי מיוזין II מקבילים בדגימות מורחבות היה 892.7 ננומטר (SD = 0.171 ננומטר, n = 12); כאשר מחלקים זאת בארבעה, זה מניב מרחק חזוי של ~220 ננומטר בין קווי המיוזין בתאים סמוכים בעוברים לא מורחבים, שהוא אכן מעט מתחת לגבול העקיפה עבור אות שזוהה עם Alexa 488 (פליטת שיא של ~520 ננומטר / 2 = 260 ננומטר).

בנוסף, בדקנו גם אם ניתן להשתמש ב-ExM כדי לפתור את ארכיטקטורת הרשת המיטוכונדריאלית בתאים צפופים של עוברי דרוזופילה גסטרולטים (שלב 6). תפקוד המיטוכונדריה קשור קשר הדוק למבנה הרשת (כלומר, אברונים מאוחים לעומת אברונים מקוטעים), אך קשה לדמיין את פרטי ארגון הרשת המיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי בסוגי תאים שאינם שטוחים ו/או דקים. מיטוכונדריה עשירים באופן טבעי במולקולות ביוטינילציה, ולכן ניתן לתייג מיטוכונדריה בעובר דרוזופילה מוקדם באמצעות סטרפטאבידין26 המסומן באופן פלואורסצנטי. בעוברים בשלב 6 הלא מורחבים שסומנו עם סטרפטווידין-אלקסה 488, האות הופיע כפונקטה ציטופלזמית שלעתים קרובות הייתה חופפת וקשה לפתור אותה (איור 4C). לעומת זאת, בעוברים המורחבים בשלב 6, פרטים עדינים רבים יותר של הרשת המיטוכונדריאלית נראו לעין ופונקטה היו ניתנים לפתרון בקלות רבה יותר (איור 4D)26,27. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש ב- ExM לחקר ארגון הרשת המיטוכונדריאלית בסוגי תאים שאינם מתאימים באופן מסורתי לניתוח מיטוכונדריאלי.

Figure 4
איור 4: פרטים על שלד ציטו-כונדריה של אקטומיוזין ומיטוכונדריה שנחשפו במיקרוסקופ הרחבה. (A,B) לוקליזציה של מיוזין II בתאי נוירואקטודרם (germband) שצולמו עם מטרה של 63x (1.4 NA) בזום של 2.5x בשלב 7 (A) עוברים לא מורחבים ו-(B) מורחבים. מיוזין II זוהה בעוברים המבטאים גרסה טרנסגנית עם תג GFP של שרשרת האור הרגולטורית מיוזין II (SQH-GFP), אשר זוהתה עם נוגדן אנטי-GFP (אדום). מאגרים נפרדים של מיוזין קורטיקלי הממוקם בתאים סמוכים יכולים להיפתר בעובר המורחב (חיצים לבנים). (ג,ד) רשתות מיטוכונדריאליות בתאי נוירואקטודרם שצולמו עם מטרה של 63× (1.4 NA) בזום של 2.5x בשלב 6 עוברים לא מורחבים (C) ומורחבים (D). המיטוכונדריה זוהו עם סטרפטווידין-אלקסה 488 (ירוק), וקווי המתאר של התאים זוהו עם נוגדן אנטי-Par-3/בזוקה (מגנטה). הניסויים בוצעו במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מתכוני תמיסות. הרכב עבור הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה לפי סדר הופעתם. כל המניות נזילות אלא אם כן צוין אחרת. הכימיקלים הושעו מחדש או דוללו במים מסוננים אוטוקלאביים, אלא אם כן צוין אחרת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

סטייה ידנית
רוב פרוטוקולי קיבוע העוברים של דרוזופילה כוללים הסרת קרום ויטלין על ידי ניעור עוברים קבועים בתחליב של מתנול והפטאן, מה שגורם לקרומים להתפוצץ באמצעות קרע אוסמוטי26. בעוד devitellinization מבוסס מתנול (מתנול popping) הוא יעיל ומתאים עבור יישומים רבים, devitellinization ידני (פילינג ידני) מציע כמה יתרונות משמעותיים. ראשית, קילוף ידני מאפשר לבחור עוברים בשלבים מדויקים לסטייה ואיסוף, מה שמגדיל מאוד את הסיכוי להשיג עוברים מורחבים בכיוון שמיש בסוף הניסוי. העשרה זו היא קריטית כאשר לומדים היבטים ספציפיים של תהליכים התפתחותיים מהירים (למשל, חדירה מזודרם או הרחבה מתכנסת), שעבורם עוברים בשלבים מתאימים עשויים לייצג רק אחוזים בודדים מכלל העוברים, אפילו בתוך חלון איסוף מתוזמן היטב. כמובן, עבור יישומים רבים, מתנול בתפזורת מסורתית יותר קופץ של עוברים מחלון איסוף מתוזמן יהיה מספיק, קילוף ידני לא יכול להיות שווה את המאמץ הנוסף. שנית, קשירה של נוגדנים וצבעים ראשוניים מסוימים מושפעת לרעה מחשיפה קודמת של הדגימה למתנול. מסיבה זו, קילוף ידני יכול להניב עלייה משמעותית באיכות האות האימונופלואורסצנטי בהשוואה לדגימות עם מתנול, מה שהופך אותו לטכניקה כללית שימושית עבור ביולוגים התפתחותיים של דרוזופילה .

מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה בעוברי דרוזופילה מורחבים בהרכבה שלמה
בעוד ביצוע מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה על דגימות מורחבות זהה מבחינה רעיונית לדגימות לא מורחבות, ExM מציג כמה מכשולים טכניים. יש לציין כי כיוון העובר, שהוא אקראי, הופך חשוב עוד יותר ככל שגודל המדגם גדל, מכיוון שמטרות בעלות הגדלה גבוהה ו-NA גבוהות מסוגלות למקד אור רק מאזורי דגימה הקרובים מאוד לכיסוי27. לכן, בדרך כלל ניתן להתמקד רק בתאים על או בסמוך לפני השטח של העובר שבסופו של דבר היה צמוד לכיסוי כאשר הג'ל נוצר. הדרך הטובה ביותר להבטיח שיש דגימות בכיוון הנכון בסוף היא להתחיל את פרוטוקול ExM עם אוסף מבוים היטב של עוברים קבועים (למשל, באמצעות קילוף ידני) ולזרוע עוברים רבים בכל באר (>10). כדי להמחיש תאים עמוק בתוך העובר, ייתכן שיהיה צורך להשתמש במערכי הדמיה מיוחדים יותר, כגון מיקרוסקופ גיליון אור28. בנוסף, אנו מוצאים כי ניתן לשפר את איכות התמונה על ידי פתיחת חור הסיכה הקונפוקלי לגודל גדול מיחידה אוורירית אחת. כמובן, הגדלת גודל חור הסיכה תבוא במחיר של ירידה ברזולוציה המקסימלית, אך בפועל, אפילו עליות קטנות בגודל חור הסיכה יכולות להגביר משמעותית את עוצמת האות (נתונים שאינם מוצגים). מחקרים עתידיים צריכים להתייחס באופן שיטתי לגודל חור הסיכה ולרזולוציה היעילה בדגימות ExM.

וריאציות על ExM בסיסי
הפרוטוקול המתואר כאן הוא דוגמה פשוטה יחסית של ExM שאמור לעבוד עבור יישומים רבים ולהיות קל ליישום ברוב מעבדות הביולוגיה ההתפתחותית. עם זאת, ישנן וריאציות רבות על הרעיון הבסיסי של ExM 4,5,7 שניתן להשתמש בהן כדי להגביר את עוצמת האות, להשיג דרגות התרחבות נוספות ולזהות מולקולות חומצות גרעין כמו גם חלבונים. בפרוטוקול זה, העוברים מודגרים עם נוגדנים לפני הג'לציה וההרחבה. לחלופין, ניתן לטפל בדגימות באמצעות נוגדנים לאחר הרחבתן 6,30, מה שיכול להגביר את עוצמת האות עקב נגישות מוגברת לאפיטופים וירידה באובדן נוגדנים קשורים במהלך שלבי ההתפשטות. בנוסף, ניתן להשתמש במולקולות קרוסלינקר ספציפיות כדי להצמיד מולקולות RNA להידרוג'ל כדי לאפשר זיהוי של RNA בג'לים מורחבים באמצעות שיטת תגובת שרשרת הכלאה30. לבסוף, הדגימות יכולות להיות נתונות לסבבי הרחבה מרובים, כמו במיקרוסקופ הרחבה איטרטיבי (iExM)31, pan-ExM32 וחשיפת הרחבה (ExR)31, כדי להשיג דרגות גבוהות עוד יותר של רזולוציה מוגברת.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר ג'ניפר זאלן על מתן הנוגדן הראשוני נגד Par-3 של השרקן. עבודה זו נתמכה על ידי מימון נדיב (1R15GM143729-01 ו- 1P20GM139768-01 5743) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים (NIGMS), אחד מחברי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), כמו גם המכון הביולוגי של ארקנסו (ABI), שסיפק מימון חלקי לרכישת המיקרוסקופ הקונפוקלי שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acrylamide Milipore Sigma 1490-100ML
ammonium persulfate VWR BDH9214-500G
anti-GFP rabbit polyclonal antibody Torrey Pines BioLabs TP-401
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11075
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
bisacrylamide Research Products International A11275
bovine serum albumin (30% solution) Millipore Sigma A7284
conical tubes, 50 mL fisherscientific  21008-940
coverlip glass, square 22 mm VWR 48366-227
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm VWR 48393-230
glass capillaries for pulling needles World Precision Instruments TW100F-4
glass microinjection needles (pre-pulled) World Precision Instruments TIP10LT
guanidine HCl VWR 101970-606
heptane VWR EM-HX0078-1
latex pipet bulbs VWR 82024-554
methanol VWR BDH1135-4LP
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester VWR 730300-1G
microfuge tube, 1.5 mL VWR 20170-038
multi-well plate, 6-well Genesee 25-100
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) Electron Microscopy Sciences 509804487 (Fisher)
Pasteur pipet (2 mL, short tip) VWR 14673-010
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) VWR 102092-312
Petri plates Genesee 32-107
phosphate-buffered saline (10x solution) VWR 97063-660
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) VWR P8920-1ooML
Proteinase K Thermo Fisher Scientific E00491
scintillation vials (30 mL) VWR 66022-128
sodium acrylate VWR 101181-226
sodium azide (powder) Millipore Sigma 71289 make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific S32354
TAE (50x) VWR 97063-692
tape (double-sided, 1 inch wide) Scotch  3M 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed
TEMED Thermo Fisher Scientific PI17919
TEMPO VWR EM8.14681.0005 catalytic oxidant
Tween-20 VWR 97063-872 extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water
Zeiss LSM 900 Zeiss Laser scanning microscope used without AiryScan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  2. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  3. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  5. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  6. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Chang, J. -B. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  9. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  10. Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons. eLife. 6, e27347 (2017).
  11. Jiang, N., et al. Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy. Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).
  12. Yu, C. -C. J., et al. Expansion microscopy of C. elegans. eLife. 9, e46249 (2020).
  13. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  14. Tanaka, T., et al. Phase transitions in ionic gels. Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).
  15. Hausen, P., Dreyer, C. The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues. Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).
  16. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).
  17. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  18. Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).
  19. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protocols. 2007, (2007).
  20. Cold Spring Harbor Protocols. Drosophila apple juice-agar plates. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  21. de Matos Simões, S., et al. Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation. Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).
  22. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  23. Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging (2022).
  24. Paré, A. C., Zallen, J. A. Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation. Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).
  25. Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
  26. Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
  27. Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization. Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).
  28. Stelzer, E. H. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).
  29. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  30. Wen, G., et al. A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).
  31. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
  32. Sarkar, D. Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures. bioRxiv. , (2020).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 194 אקטומיוזין הרחבה מתכנסת ביולוגיה התפתחותית דרוזופילה אמבריולוגיה מיקרוסקופ הרחבה גסטרולציה מיטוכונדריה מיוזין II Par-3 מיקרוסקופ ברזולוציית על
שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי <em>דרוזופילה</em> שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parveen, S., Jones, N. W.,… More

Parveen, S., Jones, N. W., Millerschultz, I., Paré, A. C. Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging. J. Vis. Exp. (194), e64662, doi:10.3791/64662 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter