Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Användning av expansionsmikroskopi för att fysiskt förstora hela Drosophila-embryon för superupplösningsavbildning

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/64662
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Arkansas

Summary

Här presenteras ett protokoll för implementering av expansionsmikroskopi i tidiga Drosophila-embryon för att uppnå superupplöst avbildning med hjälp av ett konventionellt laserskannande konfokalmikroskop.

Abstract

Arbetshästen inom utvecklingsbiologi är det konfokala mikroskopet, som gör det möjligt för forskare att bestämma den tredimensionella lokaliseringen av märkta molekyler i komplexa biologiska prover. Medan traditionella konfokalmikroskop gör det möjligt att upplösa två intilliggande fluorescerande punktkällor som ligger några hundra nanometer från varandra, kräver observation av de finare detaljerna i subcellulär biologi förmågan att lösa upp signaler i storleksordningen tiotals nanometer. Många hårdvarubaserade metoder för superupplösningsmikroskopi har utvecklats för att göra det möjligt för forskare att kringgå sådana upplösningsgränser, även om dessa metoder kräver specialiserade mikroskop som inte är tillgängliga för alla forskare. En alternativ metod för att öka upplösningsförmågan är att isotropiskt förstora själva provet genom en process som kallas expansionsmikroskopi (ExM), som först beskrevs av Boyden-gruppen 2015. ExM är inte en typ av mikroskopi i sig utan är snarare en metod för att svälla ett prov samtidigt som den relativa rumsliga organisationen av dess ingående molekyler bevaras. Det expanderade provet kan sedan observeras med en effektivt ökad upplösning med hjälp av ett traditionellt konfokalmikroskop. Här beskriver vi ett protokoll för implementering av ExM i helmonterade Drosophila-embryon , som används för att undersöka lokaliseringen av Par-3, myosin II och mitokondrier i ytepitelcellerna. Detta protokoll ger en ungefär fyrfaldig ökning av provstorleken, vilket gör det möjligt att upptäcka subcellulära detaljer som inte är synliga med konventionell konfokalmikroskopi. Som bevis på principen används en anti-GFP-antikropp för att särskilja distinkta pooler av myosin-GFP mellan intilliggande cellkortiker, och fluorescerande märkt streptavidin används för att detektera endogena biotinylerade molekyler för att avslöja de fina detaljerna i den mitokondriella nätverksarkitekturen. Detta protokoll använder vanliga antikroppar och reagenser för fluorescensmärkning, och det bör vara kompatibelt med många befintliga immunofluorescensprotokoll.

Introduction

Inom cell- och utvecklingsbiologi är seende att tro, och förmågan att exakt bestämma lokaliseringsmönster för proteiner är grundläggande för många typer av experiment. Konfokalmikroskopi med laserskanning är standardverktyget för avbildning av fluorescerande märkta proteiner i tre dimensioner i intakta prover. Konventionella konfokalmikroskop är oförmögna att särskilja (upplösa) intilliggande fluorescerande signaler som är separerade med mindre än hälften av våglängden för det ljus de avger1. Med andra ord måste två punktkällor separeras med minst 200-300 nm i lateral riktning (500-700 nm i axiell riktning) för att upplösa dem som två distinkta signaler. Denna tekniska barriär är känd som diffraktionsgränsen, och den är ett grundläggande hinder för studier av komplexa subcellulära strukturer (t.ex. aktomyosincytoskelett- eller mitokondrienätverk) med rumsliga egenskaper under diffraktionsgränsen. Därför är tekniker för att öka upplösningsförmågan hos konventionella konfokalmikroskop av allmänt intresse för det biologiska samhället.

För att kringgå diffraktionsgränsen har ett antal olika superupplösningsmikroskopitekniker utvecklats som möjliggör upplösning i storleksordningen tiotals nanometer eller mindre 1,2,3, vilket avslöjar en värld av biologisk komplexitet som tidigare bara var tillgänglig via elektronmikroskopi. Trots de uppenbara fördelarna med dessa hårdvarubaserade metoder har superupplösningsmikroskop ofta specifika krav på provmärkning och långa insamlingstider, vilket begränsar deras flexibilitet, eller så kan de helt enkelt vara för dyra för vissa laboratorier att komma åt. Ett alternativ till mikroskopbaserad superupplösning är expansionsmikroskopi (ExM), som inte är en typ av mikroskopi i sig utan snarare en metod för att svälla ett prov samtidigt som den relativa rumsliga organisationen av dess ingåendemolekyler bevaras. De isotropiskt expanderade proverna kan sedan observeras med en effektivt ökad upplösning med hjälp av ett traditionellt fluorescenskonfokalmikroskop. ExM beskrevs första gången av Boyden-gruppen 20155, och grundtekniken har sedan dess anpassats för användning i en mängd olika experiment 6,7,8. ExM har också anpassats för användning i helmonterade embryon, särskilt hos Drosophila 9,10,11, C. elegans12 och zebrafisk 13, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg för utvecklingsbiologer.

ExM är baserad på två olika hydrogelkemier: 1) svällbara polyelektrolythydrogeler, som ökar kraftigt i storlek när de blötläggs i vatten14, och 2) polyakrylamidhydrogeler, som har extremt litet polymeravstånd för att möjliggöra isotrop provexpansion15. Även om det finns många publicerade ExM-protokoll, delar de i allmänhet följande steg: provfixering, märkning, aktivering, gelning, matsmältning och expansion4. Fixeringsvillkoren och fluorescensmärkningsstrategierna kommer naturligtvis att variera beroende på experimentets och systemets behov, och i vissa protokoll sker märkning efter expansion. Målmolekylerna i provet måste primas (aktiveras) för bindning till hydrogelen, vilket kan uppnås med hjälp av olika kemier4. Under gelningsstegen mättas provet med monomerer av den framtida hydrogelen (natriumakrylat, akrylamid och tvärbindaren bisacrylamid), och hydrogelen bildas sedan genom polymerisation av fria radikaler katalyserad av en initiator, såsom ammoniumpersulfat (APS), och en accelerator, såsom tetrametylendiamin (TEMED)4. Efter gelning smälts provet enzymatiskt för att homogenisera provets motståndskraft mot svullnad och säkerställa den isotropa expansionen av hydrogelen4. Slutligen placeras den upplösta hydrogelen i vatten, vilket gör att den expanderar till ungefär fyra gånger sin ursprungliga linjära storlek4.

Figure 1
Figur 1: Översikt över expansionsmikroskopi i Drosophila-embryon . ExM är ett flerstegsprotokoll som tar minst 4 dagar att slutföra. Embryoinsamling, fixering och devitellinisering tar 1 dag eller mer beroende på om embryon från flera samlingar slås samman. Immunofluorescensmärkningen tar 1 dag eller 2 dagar beroende på om embryona inkuberas över natten med de primära antikropparna. Embryoaktivering, gelning, matsmältning och expansion kan utföras på en enda dag. Gelerna kan monteras och avbildas omedelbart efter expansionen, även om det av praktiska skäl ofta är önskvärt att börja avbilda nästa dag. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Detta protokoll beskriver hur man utför ExM på helmonterade Drosophila-embryon i tidigt till mellanstadium16 för att visualisera subcellulära proteinlokaliseringsmönster med superupplösning (figur 1). Denna metod använder metylakrylsyra N-hydroxisuccinimidylester (MA-NHS) kemi för att aktivera och förankra proteinmolekyler till hydrogelen17, och det är en modifiering av ett tidigare publicerat ExM-protokoll för användning i sena stadier av Drosophila-embryon och vävnader11. Detta protokoll använder polydimetylsiloxan (PDMS) brunnar för att forma hydrogelerna och underlätta lösningsutbyte under aktivering och gelning. En alternativ metod som inte kräver att PDMS-brunnar skapas innebär att man sänker ner embryon som är fästa på täckglas i droppar av monomerlösning som sitter på en bit laboratorieförseglingsfilm22. Dessutom beskriver detta protokoll en metod för att manuellt avlägsna det ogenomträngliga vitellinmembranet som omger Drosophila-embryon , vilket är en förutsättning för immunofluorescensfärgning. Det är viktigt att notera att denna metod för handpeeling av embryon endast kan användas för att välja ut Drosophila-embryon i rätt stadiestadium före provmärkning, vilket avsevärt ökar sannolikheten för att få utökade prover av rätt stadium och orientering och därmed gör datainsamlingen nedströms mycket effektivare.

Protocol

Detta protokoll följer University of Arkansas (UARK) riktlinjer för forskning på ryggradslösa djur, såsom Drosophila melanogaster, och godkändes av UARK Institutional Biosafety Committee (protokoll #20001).

1. Fixering och devitellinisering av Drosophila-embryon

OBS: Steg 1 beskriver en procedur (handpeeling) för manuell borttagning av vitellinmembranet, ett genomskinligt ogenomträngligt membran som omger embryot. Det är viktigt att notera att handpeeling gör det möjligt att välja ut embryon i rätt stadieindelning i början av ExM-protokollet, vilket avsevärt ökar sannolikheten för att få embryon i en användbar orientering i slutet av ExM-protokollet. Detta ExM-protokoll är dock helt kompatibelt med bulkembryoinsamling och standardprocedurer för metanolbaserat avlägsnande av vitellinmembranet, i vilket fall man kan hoppa direkt till steg 2 (immunofluorescensmärkning).

  1. Förbered eller köp ett antal fina glasnålar. De faktiska måtten på nålspetsen är inte kritiska, men se till att nålarna är styva och vassa nog att tränga igenom vitellinmembranen på fixerade embryon. Gör nålar av kapillärrör av glas (1 mm ytterdiameter, 0,75 mm innerdiameter) med hjälp av en mikropipettavdragare, som man skulle förbereda nålar för mikroinjektioner av embryon18; Alternativt kan du köpa färdigdragna nålar.
  2. Samla embryon med hjälp av standardtekniker för Drosophila19 genom att placera >100 vuxna Drosophila i en ventilerad plastmugg förseglad med en fruktjuice-/agarplatta20. Använd tidsinställda uppsamlingsfönster för att berika embryon i rätt stadium16. Till exempel, för att berika för gastrulationsstadiet (steg 6) och konvergent-förlängningsstadiet (steg 7), byt fruktjuicetallriken, samla embryona i 2 timmar vid 25 °C, ta sedan bort plattan och åldra den i ytterligare 2 timmar vid 25 °C för att få embryon som är ~2-4 timmar gamla.
  3. För att ta bort den äggskalsliknande korionen från embryona, täck ytan på fruktjuiceplattorna med 50 % blekmedel (tabell 1), släpp embryona från agarns yta genom att röra om dem med en liten pensel och vänta 3 minuter tills korionen har lösts upp.
  4. Överför de dekorionerade embryona med hjälp av en pensel till en 30 ml scintillationsflaska innehållande 4 ml heptan (organisk toppfas) och 4 ml fixeringsbuffert (vattenhaltig bottenfas; (se tabell 1). Späd formaldehyden färskt från en nyberedd eller nyligen öppnad stam och blanda med 10x PBS och avjoniserat vatten omedelbart innan du tillsätter embryona.
    OBS: Bered formaldehyden från paraformaldehydkraft eller 16 % EM-klass formaldehyd i glasampuller. Lager av koncentrerad formaldehyd (t.ex. 37 % formaldehyd) kan användas, även om resultaten kan vara mindre konsekventa.
  5. Embryona kommer att ackumuleras i gränssnittet mellan den organiska fasen och vattenfasen. Lägg till så många embryon som kommer att bilda ett enda lager vid gränssnittet. Om för många embryon läggs till en injektionsflaska kommer de inte att fixeras lika bra.
  6. Använd stark tejp, immobilisera scintillationsflaskorna på sidorna på en bordsshaker och skaka dem i 20 minuter vid 220 rpm. För optimal fixering, upprätthåll en kraftig emulsion mellan de organiska och vattenhaltiga faserna under hela fixeringen.
  7. Under fixeringstiden bereds något av följande för vart och ett av proverna.
    1. Ta en 6 cm petriskål i plast fylld till hälften med 3 % agar och gör en rektangel på ~5 cm x 3 cm i agarn med ett rakblad eller skalpell. Fruktjuice-/agartallrikar kan också användas för detta ändamål.
    2. Använd en liten labbspatel och ta bort agarplattan. Vänd upp och ner på petriskålens botten och ställ den på bänken. Placera agarplattan ovanpå den inverterade skålen (Figur 2A).
    3. Ta locket på petriskålen och se till att den är torr. Bär handskar och placera en bit dubbelhäftande tejp inuti locket (tejpbiten ska vara något större än agarplattan; Figur 2B).
  8. Ta ut injektionsflaskorna ur shakern, ställ dem upprätt på bänken och låt de organiska faserna och vattenfaserna separeras. Korrekt fixerade embryon kommer att finnas kvar i gränssnittet mellan de två faserna.
  9. Överför de fixerade embryona till agarplattan med hjälp av en Pasteurpipett av glas försedd med en latexlampa. För att förhindra att embryona fastnar på insidan av pipetten, försök att hålla embryona inom pipettens smala hals och överför embryona i flera små omgångar snarare än alla på en gång. När alla embryon är på agarplattan, ta bort det mesta av kvarvarande heptan runt embryona med hjälp av en P200-pipett. Utför detta steg så snabbt som möjligt (<3 min) för att undvika att de fixerade embryona torkar ut, vilket kan påverka morfologin negativt.
  10. Från en höjd av ~2 cm, släpp locket med den dubbelhäftande tejpen på agarplattan för att fästa embryona på tejpen (Figur 2C). Ta försiktigt bort locket från agarplattan, placera den upp och ner på bänken och tillsätt sedan tillräckligt med PBS-Tween (tabell 1) för att täcka embryona i locket.
  11. Använd ett stereodissekerande mikroskop med cirka 100x förstoring med indirekt belysning, identifiera korrekt stadieindelade embryon med hjälp av morfologiska markörer. För embryon i stadium 6, använd markörer som en synlig cefalisk fåra och invaginerad mesoderm; För embryon i stadium 7, använd markörer som ett förlängt groddband; För embryon i stadium 11, använd markörer som en helt utsträckt grodd och synlig segmentering längs huvud-till-svans-axeln16.
    1. För att samla in de önskade embryona, stick först vitellinmembranet (ett genomskinligt ovalt membran runt embryot) nära den främre eller bakre änden av embryot med en fin glasnål; Membranet kommer att tömmas lite när trycket släpper. Använd sedan en fin pincett eller en metallsond och tryck försiktigt embryot i andra änden genom hålet. Vitellinmembranet kommer att förbli fäst vid den dubbelhäftande tejpen. Låt oönskade embryon sitta kvar på tejpen.
  12. Samla regelbundet in de flytande devitelliniserade embryona med en Pasteurpipett av glas och flytta dem till ett 1,5 ml mikrofugerör.
  13. Utför nu något av följande steg.
    1. Fortsätt direkt till immunfluorescensmärkningsstegen. De devitelliniserade embryona kan gå direkt in i blockerande lösning (steg 2.2). Låt inte embryona ligga kvar i PBS-Tween eller blockerande lösning (tabell 1) längre än 16 timmar innan du går vidare till nästa steg.
    2. Flytta embryona till metanol för förvaring. Ta bort så mycket PBS-interpolering som möjligt och tillsätt sedan 1 ml metanol. När embryona har satt sig, ta bort så mycket metanol som möjligt och tillsätt 1 ml färsk metanol. Förvara embryona vid −20 °C på obestämd tid. Lagring av metanol gör det också möjligt att samla embryon från flera samlingar.

2. Märkning av immunofluorescens

OBS: Bortsett från antikroppsinkubationsstegen är exakta vätskemängder och tider inte avgörande i detta avsnitt. För att utföra en sköljning eller tvätt, låt embryona sätta sig till botten av röret, ta bort så mycket vätska som möjligt utan att suga upp embryon och tillsätt sedan ~1 ml ny vätska; använd en Pasteurpipett i glas utrustad med en latexlampa för optimal klarhet och kontroll. För sköljningssteget vaggas inte embryona, utan får bara sätta sig; För tvättsteget vaggas embryona på en nutator under den angivna tiden och får sedan sätta sig.

  1. Om embryona inte förvarades i metanol, gå vidare till steg 2.2. Om embryona förvarades i metanol, skölj två gånger med PBS-Tween och tvätta sedan i 20 minuter två gånger med PBS-Tween.
  2. Tvätta embryona i 30-60 minuter i 1 ml blockerande lösning.
  3. Inkubera embryona med primära antikroppar utspädda i antikroppslösning (tabell 1) i 2 timmar i rumstemperatur eller helst över natten vid 4 °C. Utför detta steg i så liten volym som möjligt (50-300 μL) för att bevara de primära antikropparna; Att gunga på en mutter är inte absolut nödvändigt.
    1. Öka mängden primär antikropp som används i ett typiskt immunofluorescensexperiment med minst 50 % för ExM. Använd följande primära antikroppskoncentrationer: 1:200 för anti-Par-3 marsvin polyklonal21 och 1:100 för anti-GFP kaninpolyklonal.
  4. Ta bort den primära antikroppslösningen (spara vid 4 °C om så önskas), skölj två gånger med PBS-Tween och tvätta sedan i 15 minuter fyra gånger med PBS-Tween.
  5. Inkubera embryona med fluorescerande sekundära antikroppar i en slutlig volym på 300 μL (utspädd i antikroppslösning) i 1 timme vid rumstemperatur på en nutator. Fluorescerande märkt streptavidin kan tillsättas under detta steg. Från och med detta steg bör du skydda embryona från överdriven och långvarig ljusexponering när det är möjligt, till exempel genom att täcka rören med ett ogenomskinligt lock eller förvara proverna i en låda.
    1. Använd följande koncentrationer: 1:500 för anti-kanin IgG get polyklonal smält till Alexa Fluor 488; 1:500 för anti-marsvin IgG get polyklonal smält till Alexa Fluor 568; och 1:1000 för streptavidin-Alexa Fluor 488.
  6. Avlägsna och kassera den sekundära antikroppslösningen. Skölj embryona två gånger med PBS-Tween och tvätta i 15 minuter fyra gånger med PBS-Tween.
  7. Vid denna tidpunkt kan embryona förvaras vid 4 °C i mörker men behandla proverna så snabbt som möjligt (<24 timmar).

3. Förberedelse av PDMS-brunnar

OBS: PDMS-brunnarna kan göras upp till 2 veckor i förväg.

  1. Ställ in en inkubator eller kokplatta på 55 °C och ställ in en centrifug som kan snurra koniska rör på 15 °C.
  2. För att bereda PDMS-lösningen (tabell 1), placera ett 50 ml koniskt rör i en sekundär behållare på en våg och tillsätt 10 g silikonelastomerbas till röret med hjälp av en spruta. Tillsätt sedan 1 g silikonelastomerhärdare och vänd röret flera gånger för att blanda.
  3. Skapa ett balansrör genom att tillsätta en lämplig mängd vatten till ett andra 50 ml koniskt rör. Centrifugera PDMS-lösningen vid 500 x g i 3 minuter vid 15 °C och häll den sedan i en 10 cm petriskål till ett djup av ~1 mm. Ta vid behov bort bubblor genom att blåsa försiktigt på lösningen med en luftslang. Låt PDMS-lösningen stelna över natten vid 55 °C.
  4. När PDMS-plattan har stelnat, med hjälp av en skalpell, gör kvadratiska ytor som är något mindre än en 22 mm x 22 mm täckglas. Inuti varje ruta, skåra och ta bort en ~8 mm bred fyrkantsbrunn.
  5. Överför varje fyrkantig PDMS-brunn på en 22 mm x 22 mm täckglas och fäst den ordentligt (Figur 2D). Att förbereda sex eller fler täckglas bör ge ett stort antal expanderade embryon att avbilda.

4. Fästa embryona på täckglasen

  1. Applicera tillräckligt med 0,1 % poly-L-lysin för att täcka täckglasytan inuti varje brunn (~50 μL) och placera dem i en 55 °C inkubator för att lufttorka. Upprepa detta steg för att öka vidhäftningsförmågan.
  2. Skölj embryona kort en gång i 1x PBS för att ta bort interpoleringtvättmedlet och överför sedan >10 embryon till var och en av de poly-L-lysinbelagda brunnarna.
  3. Låt embryona sjunka till botten av brunnarna. Ta bort överflödig vätska från de vidhäftade embryona med hjälp av en Pasteurpipett. Gå omedelbart vidare till nästa steg.

5. Aktivering och gelning

OBS: Aktivering avser tillsats av MA-NHS till embryona, vilket kommer att modifiera provproteinerna och antikropparna så att de kan binda till hydrogelen. Gelning avser generering av en hydrogel i och runt embryona i varje brunn. Under gelningen genomsyras embryona med en monomerlösning och behandlas sedan med en gelningslösning för att bilda hydrogelen.

  1. Aktivera embryona i 1 timme vid rumstemperatur genom att fylla brunnarna med aktiveringslösning (1 mM MA-NHS nyutspädd i 1 x PBS; (se tabell 1). Byt denna lösning ungefär var 10:e minut under loppet av 1 timme.
  2. Skölj embryona med 1x PBS tre gånger. Inkubera embryona i monomerlösning (tabell 1) i 45 minuter vid 4 °C.
  3. Medan embryona sitter i monomerlösningen, bered gelningslösningen (tabell 1). Beredning av ~2 ml geleringslösning räcker för att täcka PDMS-brunnarna från en hel 10 cm petriskål. Var noga med att lägga till APS sist, eftersom det kommer att initiera polymerisation och påbörja gelningen.
    1. Späd den katalytiska oxidanten färskt från pulvret (t.ex. 1 % TEMPO w/v i vatten). Blanda 1 960 μl monomerlösning med 30 μl 10 % TEMED och 10 μL 1 % TEMPO.
    2. För att undvika polymerisering av hela satsen geleringslösning på en gång, arbeta i små satser. Dela upp gelningslösningen (utan APS) i 125 μL alikvoter mellan de åtta rören i en PCR-remsa.
    3. Avlägsna monomerlösningen från de tre PDMS-brunnarna med hjälp av vakuum och var noga med att inte störa embryona. Tillsätt 5 μL APS till ett av PCR-rören som innehåller geleringslösning för att initiera polymerisationen. Fördela snabbt polymerisationsgeleringslösningen mellan brunnarna (~40 μL per brunn). Upprepa detta tills alla brunnar och embryon är täckta.
  4. Låt proverna gela i 1,5-2,5 timmar vid 37 °C. Rör om hydrogelerna då och då för att övervaka polymerisationen. Stelnade hydrogeler kommer inte att vicka. Tjockare hydrogeler tar längre tid att slutföra polymerisationen och stelna.

6. Matsmältning och expansion

OBS: Tjockare och större geler tar längre tid att expandera, och mitten av gelerna kan ta flera timmar att expandera helt; Detta kan påskyndas genom att trimma kanterna på gelen. När gelerna expanderar kommer deras brytningsindex att bli nästan identiskt med vattnets, och de blir mycket svåra att se.

  1. När gelningen är klar, dra av PDMS-brunnarna från täckglaset samtidigt som du försöker att inte störa hydrogelerna. Skär bort överflödigt hydrogelmaterial, om så önskas.
  2. Överför hydrogelerna (som fortfarande sitter fast på täckglasen) individuellt till brunnarna på en platta med sex hål (Figur 2E). Observera att hydrogelerna kan expandera något under matsmältningen.
  3. Täck gelerna helt med rötningsbuffert (tabell 1) i 1 timme vid 37 °C. I allmänhet räcker det med 30 ml rötningsbuffert för att täcka gelerna i en 6-hålsplatta.
  4. Efter matsmältningen, överför varje hydrogel individuellt till en 6 cm petriskål genom att skjuta av dem från täckglaset. Det kan vara nödvändigt att använda ett andra täckglas för att få bort gelen. Fyll varje petriskål med avjoniserat vatten för att expandera gelen. Byt vatten tre till fyra gånger under loppet av 1-2 timmar tills gelerna är helt expanderade (förvänta dig en ungefärlig fyrfaldig ökning av bredden).

7. Montering och avbildning

OBS: Expanderade hydrogeler består nästan helt av vatten, vilket gör dem nästan genomskinliga och extremt ömtåliga. Gelerna kan manipuleras med hjälp av långa täckglas för att flytta runt dem och plocka upp dem. Montera och avbilda endast ett eller två färgfilter åt gången, eftersom färgfilter gradvis släpper ut vatten och börjar glida runt täckglaset.

  1. Använd en Pasteurpipett och ta bort så mycket överflödigt vatten som möjligt från petriskålen för att minimera att gelerna rör sig när de hanteras.
  2. Manövrera varje expanderad gel, med embryona på undersidan, på ett stort täckglas (t.ex. 24 mm x 40 mm) för avbildning.
  3. Montera varje täckglas med gel över objektivet på ett inverterat laserskannande konfokalmikroskop. Lokalisera korrekt iscensatta och orienterade prover med hjälp av epifluorescens- eller ljusfältsmikroskopilägena på mikroskopet med låg förstoring (5x eller 10x) eller medelförstoring (20x) luftobjektiv.
  4. Om du vill ta en bild med hög upplösning byter du till ett olje- eller vattennedsänkningsobjektiv med hög förstoring (60x, 63x eller 100x). Embryonas yta måste ligga inom objektivets fokuseringsområde (<300 μm från täckglaset för ett 63x objektiv) för att kunna avbildas.
  5. Samla in data från prover med hjälp av laserskanningskonfokalläget på mikroskopet. Se till att samla in omättade bilder med bra dynamiskt omfång och använd ett lämpligt antal pixlar per bild för att fånga maximal möjlig information om provet23.

Figure 2
Figur 2: Manuell devitellinisering och arbete med hydrogeler . A) Skärning av en agarplatta från en agar/fruktjuiceplatta. (B) Placera dubbelhäftande tejp inuti locket på en 6 cm petriskål. (C) Vidhäftning av embryon på det tejpade locket. (D) En PDMS-platta med en fyrkantig brunn fäst vid ett 22 mm x 22 mm täckglas. (E) Täckglas med en PDMS-brunn inuti en 6-hålsplatta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representative Results

För att karakterisera den allmänna effekten av ExM i helmonterade Drosophila-embryon mättes embryolängden längs huvud-till-svans-axeln hos oexpanderade kontrollembryon jämfört med expanderade embryon (Figur 3A-C). De oexpanderade kontrollembryona utsattes för samma fixeringsbetingelser och immunofluorescensmärkningssteg som de expanderade embryona, förutom att de monterades med hjälp av ett stelnat monteringsmedium före avbildning. De enskilda oexpanderade embryona sträckte sig över ungefär hälften av ett synfält när man använde ett 10x-objektiv (Figur 3A). Däremot sträckte sig de expanderade embryona över ungefär två hela synfält när man använde samma 10x-objektiv (figur 3B). För att bedöma hur expansionsgraden varierade både inom och mellan experimenten utfördes samma ExM-protokoll vid tre separata tillfällen, och embryolängden mättes i tre olika geler inom varje enskilt experiment. Den genomsnittliga längden från huvud till svans för de oexpanderade kontrollembryona var 398,8 μm (standardavvikelse [SD] = 22,93 μm; n = 74; Figur 3C). För experiment 1, experiment 2 och experiment 3 var de genomsnittliga embryolängderna 1 596 μm (SD = 159,9 μm; n = 57), 1 868 μm (SD = 150,5 μm; n = 51) respektive 1 954 μm (SD = 120,3 μm; n = 44), vilket representerar expansionsfaktorer på 4,0 gånger, 4,7 gånger respektive 4,9 gånger (figur 3C). Den intraexperimentella variationen mellan gelerna var mycket mindre märkbar än den interexperimentella variationen, som var cirka 20 % (Figur 3C). För att bedöma effekterna av ExM på cell- och embryomorfologi användes en antikropp mot adherens junction-komponenten Par-3 (Bazooka)21 för att märka de apikala cellmembranen, och vi avbildade de utvecklande munsegmenten hos stadium 11 Drosophila-embryon – ett stadium med en komplex segmenterad struktur (Figur 3D-F). I kontrollprovet hade cellerna i maxillärsegmentet en genomsnittlig bredd på 4,76 μm (SD = 1,053 μm, n = 25; Figur 3D,F). I de expanderade proverna som avbildades med samma 40x objektiv och zoomfaktor (1x) hade cellerna i maxillärsegmentet en genomsnittlig bredd på 19,10 μm (SD = 3,966 μm, n = 18; Figur 3E,F), som representerar en 4,0-faldig expansion. Därför, i överensstämmelse med tidigare rapporter11, kunde vi expandera hela Drosophila-embryon ungefär fyrfaldigt i linjära dimensioner med hjälp av ExM utan att proverna rivs sönder eller uppenbara förvrängningar i cell- eller vävnadsmorfologin.

Figure 3
Figur 3: Fyrfaldig expansion av Drosophila-embryon. (A) Oexpanderade och (B) expanderade Drosophila-embryon avbildade med ett 10x objektiv (0,3 NA) vid 1x zoom. Enskilda synfält (FOV) indikeras med streckade linjer. Embryona uttryckte en GFP-märkt version av myosinets lätta kedja och färgades med en anti-GFP-antikropp. C) Kvantifiering av embryolängd (längs huvud-till-svans-axeln) i tre hydrogeler per försök och från tre separata ExM-försök jämfört med oexpanderade kontroller. (D,E) Maxillära segment från (D) oexpanderade och (E) expanderade stadium 11 Drosophila-embryon avbildade med ett 40x objektiv (1,3 NA) vid 1x zoom. Cellkonturerna (adherens junctions) detekterades med en anti Par-3/Bazooka-antikropp (vit). (F) Kvantifiering av cellbredden (lång axel) från ekvivalenta grupper av celler från (D) och (E). Lådagrammen i (C) och (F) visar intervallen för den 25:e, 50:e och 75:e percentilen. Morrhåren anger minimi- och maximivärdena. "+"-symbolerna anger medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För att visa att ExM kan användas för att lösa subcellulära detaljer under den typiska diffraktionsgränsen, avbildades aktomyosincytoskelettet i oexpanderad kontroll jämfört med expanderade embryon som genomgår konvergent förlängning (stadium 7). Vävnadsremodelleringen av gastrulation och konvergent förlängning styrs till stor del av förändringar i lokaliseringen av motorproteinet myosin II24. Men i det tätt packade kolonnepitelet hos den tidiga Drosophila-ektodermen är det svårt att observera många fina detaljer i myosin II-lokaliseringsmönstret, även när det avbildas med 158x förstoring (63x objektiv med en 2,5x optisk zoom) – en typisk maximal upplösningsförmåga för ett laserskannande konfokalmikroskop. Till exempel, eftersom myosin II är ett kortikalt protein (beläget direkt under plasmamembranet), kunde pooler av myosin II25 belägna på vardera sidan av cell-cellkontakter inte lösas i stadium 7-embryon, och de uppträdde som en enda linje där närliggande celler möttes (Figur 4A). I expanderade embryon i stadium 7 kunde däremot parallella linjer av myosin II observeras vid cell-cell-korsningar, vilket representerar kortikala proteinpooler i intilliggande celler (Figur 4B). Avståndet mellan parallella myosin II-linjer i expanderade prover var 892,7 nm (SD = 0,171 nm, n = 12); när det divideras med fyra ger detta ett förutspått avstånd på ~220 nm mellan myosinlinjerna i intilliggande celler i oexpanderade embryon, vilket faktiskt är strax under diffraktionsgränsen för en signal detekterad med Alexa 488 (toppemission på ~520 nm/2 = 260 nm).

Dessutom testade vi också om ExM kunde användas för att lösa upp den mitokondriella nätverksarkitekturen i tätt packade celler av gastrulerande Drosophila-embryon (stadium 6). Mitokondriell funktion är nära kopplad till nätverksstruktur (dvs. sammansmälta kontra fragmenterade organeller), men detaljerna i mitokondriell nätverksorganisation är svåra att visualisera med konventionell konfokalmikroskopi i celltyper som inte är platta och/eller tunna. Mitokondrier är naturligt rika på biotinylerade molekyler, och därför kan mitokondrier märkas i det tidiga Drosophila-embryot med hjälp av fluorescerande märkt streptavidin26. I de oexpanderade embryona i stadium 6 märkta med streptavidin-Alexa 488 uppträdde signalen som cytoplasmatiska puncta som ofta var överlappande och svåra att upplösa (Figur 4C). I de expanderade embryona i stadium 6 var däremot många fler fina detaljer i det mitokondriella nätverket synliga och puncta var lättare att lösa (Figur 4D)26,27. Dessa resultat indikerar att ExM kan användas för att studera mitokondriell nätverksorganisation i celltyper som traditionellt inte lämpar sig för mitokondriell analys.

Figure 4
Figur 4: Detaljer om aktomyosincytoskelett och mitokondrier avslöjade genom expansionsmikroskopi. (A,B) Myosin II-lokalisering i neuroektodermceller (germband) avbildade med ett 63x objektiv (1,4 NA) vid 2,5x zoom i steg 7 (A) oexpanderade och (B) expanderade embryon. Myosin II detekterades i embryon som uttryckte en transgen GFP-märkt version av myosin II regulatorisk ljuskedja (sqh-GFP), som detekterades med en anti-GFP-antikropp (röd). Distinkta pooler av kortikal myosin som finns i intilliggande celler kan lösas upp i det expanderade embryot (vita pilar). (C,D) Mitokondriella nätverk i neuroektodermceller avbildade med ett 63× objektiv (1,4 NA) vid 2,5x zoom i stadium 6 oexpanderade (C) och expanderade (D) embryon. Mitokondrierna detekterades med streptavidin-Alexa 488 (grönt) och cellkonturerna detekterades med en anti-Par-3/Bazooka-antikropp (magenta). Experimenten utfördes med ett laserskannande konfokalmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Lösningsrecept. Sammansättning av de lösningar som används i detta protokoll i den ordning de uppträder. Alla aktier är likvida om inget annat anges. Kemikalierna återsuspenderades eller späddes ut i autoklaverat filtrerat vatten om inget annat anges. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Manuell devitellinisering
De flesta Drosophila-embryofixeringsprotokoll innebär att vitellinmembranet avlägsnas genom att fasta embryon skakas i en emulsion av metanol och heptan, vilket gör att membranen spricker av via osmotisk ruptur26. Medan metanolbaserad devitellinisering (metanolpoppning) är effektiv och lämplig för många applikationer, erbjuder manuell devitellinisering (handpeeling) några betydande fördelar. För det första gör handpeeling det möjligt för en att välja exakt iscensatta embryon att devitellinisera och samla in, vilket kraftigt ökar sannolikheten för att få expanderade embryon i en användbar orientering i slutet av experimentet. Denna anrikning är avgörande när man studerar specifika aspekter av snabba utvecklingsprocesser (t.ex. mesoderminvagination eller konvergent förlängning), för vilka embryon i lämpligt stadiestadium endast kan utgöra några få procent av alla embryon, även inom ett snävt tidsbestämt insamlingsfönster. Naturligtvis, för många applikationer, kommer den mer traditionella bulkmetanolpoppningen av embryon från ett tidsbestämt insamlingsfönster att vara tillräckligt, och handpeeling kanske inte är värt den extra ansträngningen. För det andra påverkas bindningen av vissa primära antikroppar och färgämnen negativt av tidigare exponering av provet för metanol. Av denna anledning kan handpeeling ge betydande ökningar av immunfluorescenssignalkvaliteten jämfört med metanolpoppade prover, vilket gör det till en användbar allmän teknik för utvecklingsbiologer av Drosophila .

Högupplösande konfokalmikroskopi i expanderade helmonterade Drosophila-embryon
Även om det konceptuellt sett är samma sak att utföra högupplöst konfokalmikroskopi på expanderade prover som på oexpanderade prover, introducerar ExM vissa tekniska hinder. Framför allt blir embryoorienteringen, som är slumpmässig, ännu viktigare när provstorleken ökar, eftersom mål med hög förstoring och hög NA-halt endast kan fokusera ljus från provregioner som ligger mycket nära täckglaset27. Därför går det oftast bara att fokusera på de celler på eller nära embryots yta som hamnade intill täckglaset när gelen bildades. Det bästa sättet att säkerställa att det finns prover med rätt orientering i slutet är att starta ExM-protokollet med en tätt stegvis samling av fasta embryon (t.ex. genom att använda handpeeling) och att så många embryon i varje brunn (>10). För att visualisera celler djupt inne i embryots inre kan det vara nödvändigt att använda mer specialiserade avbildningsuppställningar, såsom light-sheet-mikroskopi28. Dessutom finner vi att bildkvaliteten kan förbättras genom att öppna det konfokala nålhålet till en storlek större än en luftig enhet. Naturligtvis kommer en ökad nålhålsstorlek att ske på bekostnad av minskad maximal upplösning, men i praktiken kan även små ökningar av nålhålsstorleken avsevärt öka signalintensiteten (data visas inte). Framtida studier bör systematiskt ta itu med nålhålsstorlek och effektiv upplösning i ExM-prover.

Variationer på grundläggande ExM
Protokollet som beskrivs här är ett relativt enkelt exempel på ExM som bör fungera för många applikationer och vara lätt att implementera i de flesta utvecklingsbiologiska laboratorier. Det finns dock många variationer på det grundläggande konceptet ExM 4,5,7 som kan användas för att öka signalintensiteten, uppnå ännu fler expansionsgrader och detektera nukleinsyramolekyler såväl som proteiner. I detta protokoll inkuberas embryona med antikroppar före gelning och expansion. Alternativt kan proverna behandlas med antikroppar efter att de expanderats 6,30, vilket kan öka signalintensiteten på grund av ökad epitoptillgänglighet och minskad förlust av bundna antikroppar under expansionsstegen. Dessutom kan specifika tvärbindningsmolekyler användas för att fästa RNA-molekyler på hydrogelen för att möjliggöra detektion av RNA i expanderade geler med hjälp av hybridiseringskedjereaktionsmetoden30. Slutligen kan proverna utsättas för flera expansionsrundor, som i iterativ expansionsmikroskopi (iExM)31, pan-ExM32 och expansion avslöjande (ExR)31, för att uppnå ännu högre grader av ökad upplösning.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dr. Jennifer Zallen för att hon har tillhandahållit marsvinets primära anti-Par-3-antikropp. Detta arbete stöddes av generös finansiering (1R15GM143729-01 och 1P20GM139768-01 5743) från National Institute of General Medical Science (NIGMS), en av medlemmarna i National Institutes of Health (NIH), samt Arkansas Biosciences Institute (ABI), som delvis finansierade inköpet av vårt konfokalmikroskop.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acrylamide Milipore Sigma 1490-100ML
ammonium persulfate VWR BDH9214-500G
anti-GFP rabbit polyclonal antibody Torrey Pines BioLabs TP-401
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11075
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
bisacrylamide Research Products International A11275
bovine serum albumin (30% solution) Millipore Sigma A7284
conical tubes, 50 mL fisherscientific  21008-940
coverlip glass, square 22 mm VWR 48366-227
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm VWR 48393-230
glass capillaries for pulling needles World Precision Instruments TW100F-4
glass microinjection needles (pre-pulled) World Precision Instruments TIP10LT
guanidine HCl VWR 101970-606
heptane VWR EM-HX0078-1
latex pipet bulbs VWR 82024-554
methanol VWR BDH1135-4LP
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester VWR 730300-1G
microfuge tube, 1.5 mL VWR 20170-038
multi-well plate, 6-well Genesee 25-100
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) Electron Microscopy Sciences 509804487 (Fisher)
Pasteur pipet (2 mL, short tip) VWR 14673-010
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) VWR 102092-312
Petri plates Genesee 32-107
phosphate-buffered saline (10x solution) VWR 97063-660
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) VWR P8920-1ooML
Proteinase K Thermo Fisher Scientific E00491
scintillation vials (30 mL) VWR 66022-128
sodium acrylate VWR 101181-226
sodium azide (powder) Millipore Sigma 71289 make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific S32354
TAE (50x) VWR 97063-692
tape (double-sided, 1 inch wide) Scotch  3M 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed
TEMED Thermo Fisher Scientific PI17919
TEMPO VWR EM8.14681.0005 catalytic oxidant
Tween-20 VWR 97063-872 extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water
Zeiss LSM 900 Zeiss Laser scanning microscope used without AiryScan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8206-8210 (2000).
  2. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  3. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  5. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  6. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Chang, J. -B. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  9. Cahoon, C. K., et al. Superresolution expansion microscopy reveals the three-dimensional organization of the Drosophila synaptonemal complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (33), 6857-6866 (2017).
  10. Mosca, T. J., Luginbuhl, D. J., Wang, I. E., Luo, L. Presynaptic LRP4 promotes synapse number and function of excitatory CNS neurons. eLife. 6, e27347 (2017).
  11. Jiang, N., et al. Superresolution imaging of Drosophila tissues using expansion microscopy. Molecular Biology of the Cell. 29 (12), 1413-1421 (2018).
  12. Yu, C. -C. J., et al. Expansion microscopy of C. elegans. eLife. 9, e46249 (2020).
  13. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  14. Tanaka, T., et al. Phase transitions in ionic gels. Physical Review Letters. 45 (20), 1636-1639 (1980).
  15. Hausen, P., Dreyer, C. The use of polyacrylamide as an embedding medium for immunohistochemical studies of embryonic tissues. Stain Technology. 56 (5), 287-293 (1981).
  16. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Germany. (2013).
  17. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  18. Miller, D. F. B., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-367 (2002).
  19. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protocols. 2007, (2007).
  20. Cold Spring Harbor Protocols. Drosophila apple juice-agar plates. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  21. de Matos Simões, S., et al. Rho-kinase directs bazooka/Par-3 planar polarity during drosophila axis elongation. Developmental Cell. 19 (3), 377-388 (2010).
  22. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  23. Paddock, S. W., Fellers, T. J., Davidson, M. W. Specimen Preparation and Imaging. Nikon MicroscopyU. , Available from: http://www.microscopyu.com/techniques/confocal/specimen-preparation-and-imaging (2022).
  24. Paré, A. C., Zallen, J. A. Cellular, molecular, and biophysical control of epithelial cell intercalation. Current Topics in Developmental Biology. 136, 167-193 (2020).
  25. Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
  26. Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
  27. Chowdhary, S., Madan, S., Tomer, D., Mavrakis, M., Rikhy, R. Mitochondrial morphology and activity regulate furrow ingression and contractile ring dynamics in Drosophila cellularization. Molecular Biology of the Cell. 31 (21), 2331-2347 (2020).
  28. Stelzer, E. H. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nature Reviews Methods Primers. 1, 73 (2021).
  29. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  30. Wen, G., et al. A Universal labeling strategy for nucleic acids in expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 143 (34), 13782-13789 (2021).
  31. M'Saad, O., Bewersdorf, J. Light microscopy of proteins in their ultrastructural context. Nature Communications. 11 (1), 3850 (2020).
  32. Sarkar, D. Expansion revealing: Decrowding proteins to unmask invisible brain nanostructures. bioRxiv. , (2020).

Tags

Developmental Biology Actomyosin konvergent extension utvecklingsbiologi Drosophila embryologi expansionsmikroskopi gastrulation mitokondrier myosin II Par-3 superupplösningsmikroskopi
Användning av expansionsmikroskopi för att fysiskt förstora hela <em>Drosophila-embryon för superupplösningsavbildning</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parveen, S., Jones, N. W.,… More

Parveen, S., Jones, N. W., Millerschultz, I., Paré, A. C. Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging. J. Vis. Exp. (194), e64662, doi:10.3791/64662 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter