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Developmental Biology

सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए पूरे-माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण को शारीरिक रूप से बढ़ाने के लिए विस्तार माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/64662
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Arkansas

Summary

यहां, पारंपरिक लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में विस्तार माइक्रोस्कोपी के कार्यान्वयन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

विकासात्मक जीव विज्ञान का वर्कहॉर्स कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप है, जो शोधकर्ताओं को जटिल जैविक नमूनों के भीतर टैग किए गए अणुओं के त्रि-आयामी स्थानीयकरण को निर्धारित करने की अनुमति देता है। जबकि पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप कुछ सौ नैनोमीटर की दूरी पर स्थित दो आसन्न फ्लोरोसेंट बिंदु स्रोतों को हल करने की अनुमति देते हैं, उपकोशिकीय जीव विज्ञान के बेहतर विवरणों को देखने के लिए दसियों नैनोमीटर के क्रम में संकेतों को हल करने की क्षमता की आवश्यकता होती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के लिए कई हार्डवेयर-आधारित तरीकों को शोधकर्ताओं को ऐसी रिज़ॉल्यूशन सीमाओं को दरकिनार करने की अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है, हालांकि इन विधियों के लिए विशेष माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है जो सभी शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं। समाधान शक्ति बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक तरीका विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) नामक एक प्रक्रिया के माध्यम से नमूने को आइसोट्रोपिक रूप से बढ़ाना है, जिसे पहली बार 2015 में बॉयडेन समूह द्वारा वर्णित किया गया था। ईएक्सएम प्रति माइक्रोस्कोपी का एक प्रकार नहीं है, बल्कि इसके घटक अणुओं के सापेक्ष स्थानिक संगठन को संरक्षित करते हुए एक नमूने को सूजन देने की एक विधि है। विस्तारित नमूना तब पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रभावी रूप से बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन पर देखा जा सकता है। यहां, हम पूरे-माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण में एक्सएम को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसका उपयोग सतह उपकला कोशिकाओं के भीतर पार -3, मायोसिन II और माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल नमूना आकार में लगभग चार गुना वृद्धि देता है, जिससे उपकोशिकीय विवरणों का पता लगाने की अनुमति मिलती है जो पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ दिखाई नहीं देते हैं। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी का उपयोग आसन्न सेल कॉर्टिकल्स के बीच मायोसिन-जीएफपी के अलग-अलग पूल को अलग करने के लिए किया जाता है, और फ्लोरोसेंटली लेबल स्ट्रेप्टाविडिन का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क आर्किटेक्चर के ठीक विवरण को प्रकट करने के लिए अंतर्जात बायोटिनीलेटेड अणुओं का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए सामान्य एंटीबॉडी और अभिकर्मकों का उपयोग करता है, और यह कई मौजूदा इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के साथ संगत होना चाहिए।

Introduction

सेल और विकासात्मक जीव विज्ञान में, देखना विश्वास है, और प्रोटीन के स्थानीयकरण पैटर्न को सटीक रूप से निर्धारित करने की क्षमता कई प्रकार के प्रयोगों के लिए मौलिक है। लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी बरकरार नमूनों के भीतर तीन आयामों में फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन इमेजिंग के लिए मानक उपकरण है। पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप आसन्न फ्लोरोसेंट संकेतों को अलग करने (हल करने) में असमर्थ हैं जो उनके द्वारा उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के आधे से भी कम से अलग होतेहैं। दूसरे शब्दों में, दो बिंदु स्रोतों को दो अलग-अलग संकेतों के रूप में हल करने के लिए पार्श्व दिशा (अक्षीय दिशा में 500-700 एनएम) में कम से कम 200-300 एनएम से अलग किया जाना चाहिए। इस तकनीकी बाधा को विवर्तन सीमा के रूप में जाना जाता है, और यह विवर्तन सीमा से नीचे स्थानिक विशेषताओं के साथ जटिल उपकोशिकीय संरचनाओं (जैसे, एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटल या माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क) के अध्ययन के लिए एक मौलिक बाधा है। इसलिए, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की समाधान शक्ति बढ़ाने की तकनीक जैविक समुदाय के लिए सामान्य रुचि है।

विवर्तन सीमा को दरकिनार करने के लिए, कई अलग-अलग सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं जो दसियों नैनोमीटर या उससे कम 1,2,3 के क्रम में रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती हैं, जिससे जैविक जटिलता की दुनिया का पता चलता है जो पहले केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सुलभ था। इन हार्डवेयर-आधारित विधियों के स्पष्ट लाभों के बावजूद, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप में अक्सर विशिष्ट नमूना लेबलिंग आवश्यकताएं और लंबे समय तक अधिग्रहण समय होता है, जिससे उनके लचीलेपन को सीमित किया जाता है, या वे कुछ प्रयोगशालाओं तक पहुंचने के लिए बहुत महंगे हो सकते हैं। माइक्रोस्कोप-आधारित सुपर-रिज़ॉल्यूशन का एक विकल्प विस्तार माइक्रोस्कोपी (एक्सएम) है, जो प्रति माइक्रोस्कोपी का एक प्रकार नहीं है, बल्कि इसकेघटक अणुओं के सापेक्ष स्थानिक संगठन को संरक्षित करते हुए एक नमूने को सूजन देने की एक विधि है। आइसोट्रोपिक रूप से विस्तारित नमूने तब पारंपरिक प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रभावी रूप से बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन पर देखे जा सकते हैं। एक्सएम को पहली बार 20155 में बॉयडेन समूह द्वारा वर्णित किया गया था, और मूल तकनीक को तब सेविभिन्न प्रयोगों 6,7,8 में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। एक्सएम को पूरे-माउंट भ्रूण में उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया गया है, विशेष रूप से ड्रोसोफिला 9,10,11, सी एलिगेंस12, और ज़ेब्राफिश 13 में, जिससे यह विकासात्मक जीवविज्ञानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है।

एक्सएम दो अलग-अलग हाइड्रोगेल केमिस्टरी पर आधारित है: 1) सूजन योग्य पॉलीइलेक्ट्रोलाइट हाइड्रोगेल, जो पानी में भिगोने पर आकार में बहुत बढ़ जाते हैं14, और 2) पॉलीक्रिलामाइड हाइड्रोगेल, जिसमें आइसोट्रोपिक नमूना विस्तारकी अनुमति देने के लिए बेहद कम बहुलक रिक्ति होती है। जबकि कई प्रकाशित एक्सएम प्रोटोकॉल हैं, वे आम तौर पर निम्नलिखित चरणों को साझा करते हैं: नमूना निर्धारण, लेबलिंग, सक्रियण, गेलेशन, पाचन और विस्तार4। निर्धारण की स्थिति और प्रतिदीप्ति लेबलिंग रणनीतियाँ निश्चित रूप से प्रयोग और प्रणाली की आवश्यकताओं के आधार पर भिन्न होंगी, और कुछ प्रोटोकॉल में, विस्तार के बाद लेबलिंग होती है। नमूने में लक्ष्य अणुओं को हाइड्रोगेल से बांधने के लिए प्राइमेड (सक्रिय) किया जाना चाहिए, जिसे विभिन्नरसायनज्ञों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। गेलेशन चरणों के दौरान, नमूना भविष्य के हाइड्रोगेल (सोडियम एक्रिलेट, एक्रिलामाइड, और क्रॉस-लिंकर बिसैक्रिलामाइड) के मोनोमर्स से संतृप्त होता है, और हाइड्रोगेल तब एक सर्जक द्वारा उत्प्रेरित फ्री-रेडिकल पोलीमराइजेशन द्वारा बनता है, जैसे अमोनियम परसल्फेट (एपीएस), और एक त्वरक, जैसे टेट्रामेथिलीनडायमाइन (टीईएमईडी)4। गेलेशन के बाद, सूजन के लिए नमूना प्रतिरोध को समरूप करने और हाइड्रोगेल4 के आइसोट्रोपिक विस्तार को सुनिश्चित करने के लिए नमूना को एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है। अंत में, पचा हुआ हाइड्रोगेल पानी में रखा जाता है, जिससे यह अपने मूल रैखिक आकार4 से लगभग चार गुना तक फैल जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला भ्रूण में विस्तार माइक्रोस्कोपी का अवलोकन। ExM एक बहु-चरण प्रोटोकॉल है जिसे पूरा करने में कम से कम 4 दिन लगते हैं। भ्रूण संग्रह, निर्धारण, और डेविटेलिनाइजेशन में 1 दिन या उससे अधिक समय लगता है, जो इस बात पर निर्भर करता है कि कई संग्रहों से भ्रूण पूल किए गए हैं या नहीं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग में 1 दिन या 2 दिन लगते हैं, जो इस बात पर निर्भर करता है कि भ्रूण को प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर इनक्यूबेट किया जाता है या नहीं। भ्रूण सक्रियण, गेलेशन, पाचन, और विस्तार एक ही दिन में किया जा सकता है। जैल को विस्तार के तुरंत बाद लगाया और चित्रित किया जा सकता है, हालांकि व्यावहारिक कारणों से अगले दिन इमेजिंग शुरू करना अक्सर वांछनीय होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यह प्रोटोकॉल बताता है कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन (चित्रा 1) पर उपकोशिकीय प्रोटीन स्थानीयकरण पैटर्न की कल्पना करने के लिए पूरे-माउंट प्रारंभिक से मध्य-चरण ड्रोसोफिला भ्रूण16 पर एक्सएम कैसे करें। यह विधि हाइड्रोगेल17 में प्रोटीन अणुओं को सक्रिय करने और लंगर डालने के लिए मिथाइलऐक्रेलिक एसिड एन-हाइड्रॉक्सीसुक्सिनिमिडिल एस्टर (एमए-एनएचएस) रसायन विज्ञान का उपयोग करती है, और यह अंतिम चरण के ड्रोसोफिला भ्रूण और ऊतकों में उपयोग के लिए पहले प्रकाशित एक्सएम प्रोटोकॉल का एक संशोधनहै। यह प्रोटोकॉल हाइड्रोगेल को ढालने और सक्रियण और गेलेशन के दौरान समाधान विनिमय की सुविधा के लिए पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) कुओं का उपयोग करता है। एक वैकल्पिक विधि जिसमें पीडीएमएस कुओं के निर्माण की आवश्यकता नहीं होती है, उसमें प्रयोगशाला सीलिंग फिल्म22 के एक टुकड़े पर बैठे मोनोमर समाधान की बूंदों में कवरलिप्स से जुड़े भ्रूण को कम करना शामिल है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला भ्रूण को घेरने वाली अभेद्य विटेलिन झिल्ली को मैन्युअल रूप से हटाने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के लिए एक शर्त है। महत्वपूर्ण रूप से, हाथ से छीलने वाले भ्रूण की इस विधि का उपयोग नमूना लेबलिंग से पहले केवल ठीक से मंचित ड्रोसोफिला भ्रूण का चयन करने के लिए किया जा सकता है, जो सही चरण और अभिविन्यास के विस्तारित नमूनों के साथ समाप्त होने की संभावना को बढ़ाता है और इस प्रकार, डाउनस्ट्रीम डेटा संग्रह को बहुत अधिक कुशल बनाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जैसे अकशेरुकी जानवरों पर शोध के लिए अर्कांसस विश्वविद्यालय (यूएआरके) के दिशानिर्देशों का पालन करता है, और यूएआरके संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (प्रोटोकॉल # 20001) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. ड्रोसोफिला भ्रूण निर्धारण और डेविटेलिनाइजेशन

नोट: चरण 1 भ्रूण को घेरने वाली एक पारदर्शी अभेद्य झिल्ली विटेलिन झिल्ली के मैनुअल हटाने के लिए एक प्रक्रिया (हाथ से छीलने) का वर्णन करता है। महत्वपूर्ण रूप से, हाथ छीलने से एक्सएम प्रोटोकॉल की शुरुआत में ठीक से मंचित भ्रूण के चयन की अनुमति मिलती है, इस प्रकार एक्सएम प्रोटोकॉल के अंत में उपयोग करने योग्य अभिविन्यास में भ्रूण प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है। हालांकि, यह एक्सएम प्रोटोकॉल विटेलिन झिल्ली के मेथनॉल-आधारित हटाने के लिए थोक भ्रूण संग्रह और मानक प्रक्रियाओं के साथ पूरी तरह से संगत है, इस मामले में कोई सीधे चरण 2 (इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग) को छोड़ सकता है।

  1. कई बारीक कांच की सुइयां तैयार करें या खरीदें। सुई की नोक के वास्तविक आयाम महत्वपूर्ण नहीं हैं, लेकिन सुनिश्चित करें कि सुई निश्चित भ्रूण के विटेलिन झिल्ली को छेदने के लिए पर्याप्त कठोर और तेज हैं। माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके ग्लास केशिका ट्यूबों (1 मिमी बाहरी व्यास, 0.75 मिमी आंतरिक व्यास) से सुई बनाएं, क्योंकि एक भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन18 के लिए सुई तैयार करेगा; वैकल्पिक रूप से, पहले से खींची गई सुइयों को खरीदें।
  2. मानक ड्रोसोफिला तकनीक19 का उपयोग करके फलों के रस / अगर प्लेट20 के साथ सील किए गए एक वेंट प्लास्टिक कप में >100 वयस्क ड्रोसोफिला रखकर भ्रूण एकत्र करें। उचित चरण16 के भ्रूण के लिए समृद्ध करने के लिए समयबद्ध संग्रह खिड़कियों का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, गैस्ट्रुलेशन (चरण 6) और अभिसरण-विस्तार (चरण 7) चरणों के लिए समृद्ध करने के लिए, फलों के रस की प्लेट को बदलें, भ्रूण को 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इकट्ठा करें, फिर प्लेट को हटा दें, और ~ 2-4 घंटे पुराने भ्रूण प्राप्त करने के लिए इसे 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए उम्र दें।
  3. भ्रूण से अंडे के छिलके जैसे कोरियन को हटाने के लिए, फलों के रस की प्लेटों की सतह को 50% ब्लीच (तालिका 1) के साथ कवर करें, भ्रूण को एक छोटे पेंटब्रश के साथ उत्तेजित करके आगर की सतह से छोड़ दें, और कोरियन के घुलने के लिए 3 मिनट प्रतीक्षा करें।
  4. पेंटब्रश का उपयोग करके डिकोरियोनेटेड भ्रूण को 30 एमएल सिंटिलेशन शीशी में स्थानांतरित करें जिसमें 4 एमएल हेप्टेन (कार्बनिक शीर्ष चरण) और 4 एमएल निर्धारण बफर (जलीय तल चरण) होता है; तालिका 1)। ताजा तैयार या हाल ही में खोले गए स्टॉक से फॉर्मलाडेहाइड को ताजा पतला करें, और भ्रूण को जोड़ने से तुरंत पहले 10x पीबीएस और विआयनीकृत पानी के साथ मिलाएं।
    नोट: ग्लास एम्प्यूल्स में पैराफॉर्मलडिहाइड पावर या 16% ईएम-ग्रेड फॉर्मलाडेहाइड से फॉर्मलाडेहाइड तैयार करें। केंद्रित फॉर्मलाडेहाइड (जैसे, 37% फॉर्मलाडेहाइड) के स्टॉक का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि परिणाम कम सुसंगत हो सकते हैं।
  5. भ्रूण कार्बनिक और जलीय चरणों के बीच इंटरफ़ेस पर जमा होंगे। इंटरफ़ेस पर एक एकल परत बनाने के रूप में कई भ्रूण जोड़ें। यदि एक शीशी में बहुत सारे भ्रूण जोड़े जाते हैं, तो वे ठीक नहीं होंगे।
  6. मजबूत टेप का उपयोग करके, टेबलटॉप शेकर पर उनके किनारों पर शानदार शीशियों को स्थिर करें, और उन्हें 220 आरपीएम पर 20 मिनट के लिए उत्तेजित करें। इष्टतम निर्धारण के लिए, पूरे निर्धारण के दौरान कार्बनिक और जलीय चरणों के बीच एक जोरदार इमल्शन बनाए रखें।
  7. निर्धारण समय के दौरान, प्रत्येक नमूने के लिए निम्नलिखित में से एक तैयार करें।
    1. 3% एगर के साथ आधे रास्ते में भरा एक प्लास्टिक 6 सेमी पेट्री डिश बेस लें और रेजर ब्लेड या स्केलपेल के साथ आगर में ~ 5 सेमी x 3 सेमी आयत स्कोर करें। इस उद्देश्य के लिए फलों के रस / अगर प्लेटों का भी उपयोग किया जा सकता है।
    2. एक छोटी प्रयोगशाला स्पैटुला का उपयोग करके, आगर स्लैब को हटा दें। पेट्री डिश के आधार को उलटा करें, और इसे बेंच पर सेट करें। अगर स्लैब को उल्टे पकवान के ऊपर रखें (चित्रा 2 ए)।
    3. पेट्री डिश का ढक्कन लें और सुनिश्चित करें कि यह सूखा है। दस्ताने पहनकर, ढक्कन के अंदर दो तरफा टेप का एक टुकड़ा रखें (टेप का टुकड़ा अगर स्लैब से थोड़ा बड़ा होना चाहिए; चित्रा 2 बी)।
  8. शीशियों को शेकर से निकालें, उन्हें बेंच पर सीधा सेट करें, और कार्बनिक और जलीय चरणों को अलग करने की अनुमति दें। ठीक से तय भ्रूण दो चरणों के बीच इंटरफ़ेस पर रहेंगे।
  9. लेटेक्स बल्ब के साथ फिट किए गए ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके निश्चित भ्रूण को आगर स्लैब पर स्थानांतरित करें। भ्रूण को पिपेट के अंदर का पालन करने से रोकने के लिए, भ्रूण को पिपेट की संकीर्ण गर्दन के भीतर रखने की कोशिश करें, और भ्रूण को एक बार में सभी के बजाय कई छोटे बैचों में स्थानांतरित करें। एक बार जब सभी भ्रूण आगर स्लैब पर होते हैं, तो पी 200 पिपेटर का उपयोग करके भ्रूण के चारों ओर से अधिकांश अवशिष्ट हेप्टेन को हटा दें। निश्चित भ्रूण को सूखने से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके (<3 मिनट) इस चरण को करें, जो आकृति विज्ञान को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है।
  10. ~ 2 सेमी की ऊंचाई से, भ्रूण को टेप (चित्रा 2 सी) का पालन करने के लिए आगर स्लैब पर डबल-पक्षीय टेप के साथ ढक्कन गिराएं। धीरे से आगर स्लैब से ढक्कन हटा दें, इसे बेंच पर उल्टा रखें, और फिर ढक्कन में भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस-ट्वीन (तालिका 1) जोड़ें।
  11. अप्रत्यक्ष प्रकाश व्यवस्था के साथ लगभग 100x आवर्धन पर एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, रूपात्मक मार्करों का उपयोग करके ठीक से मंचित भ्रूण की पहचान करें। चरण 6 भ्रूण के लिए, एक दृश्यमान सेफेलिक कुंड और इनवेजाइनेटेड मेसोडर्म जैसे मार्करों का उपयोग करें; चरण 7 भ्रूण के लिए, एक विस्तारित जर्मबैंड जैसे मार्करों का उपयोग करें; चरण 11 भ्रूण के लिए, सिर-से-पूंछ अक्ष16 के साथ पूरी तरह से विस्तारित जर्मबैंड और दृश्य विभाजन जैसे मार्करों का उपयोग करें।
    1. वांछित भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए, पहले भ्रूण के पूर्ववर्ती या पीछे के छोर के पास विटेलिन झिल्ली (भ्रूण के चारों ओर एक पारदर्शी अंडाकार झिल्ली) को एक महीन कांच की सुई के साथ चुभें; दबाव जारी होने के साथ झिल्ली थोड़ी कम हो जाएगी। फिर, बारीक बल या धातु की जांच का उपयोग करके, धीरे से छेद के माध्यम से भ्रूण को दूसरे छोर पर धक्का दें; विटेलिन झिल्ली दो तरफा टेप का पालन करती रहेगी। अवांछित भ्रूण को टेप से चिपका दें।
  12. समय-समय पर एक ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ फ्लोटिंग डेविटेलिनाइज्ड भ्रूण एकत्र करें, और उन्हें 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में ले जाएं।
  13. इस बिंदु पर, निम्न चरणों में से एक का पालन करें।
    1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग चरणों को सीधे जारी रखें। डेविटेलिनाइज्ड भ्रूण सीधे ब्लॉकिंग समाधान (चरण 2.2) में जा सकते हैं। अगले चरण में जाने से पहले भ्रूण को पीबीएस-ट्वीन या ब्लॉकिंग समाधान (तालिका 1) में 16 घंटे से अधिक समय तक रहने की अनुमति न दें।
    2. भंडारण के लिए भ्रूण को मेथनॉल में ले जाएं। जितना संभव हो उतना पीबीएस-ट्वीन निकालें, और फिर 1 एमएल मेथनॉल जोड़ें। एक बार भ्रूण व्यवस्थित हो जाने के बाद, जितना संभव हो उतना मेथनॉल निकालें, और 1 एमएल ताजा मेथनॉल जोड़ें। भ्रूण को -20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल तक स्टोर करें। मेथनॉल भंडारण भी कई संग्रहों से भ्रूण की पूलिंग के लिए अनुमति देता है।

2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग

नोट: एंटीबॉडी इनक्यूबेशन चरणों के अलावा, इस खंड में सटीक तरल मात्रा और समय महत्वपूर्ण नहीं हैं। कुल्ला करने या धोने के लिए, भ्रूण को ट्यूब के तल पर बसने की अनुमति दें, भ्रूण को चूसने के बिना जितना संभव हो उतना तरल निकालें, और फिर ~ 1 एमएल नया तरल जोड़ें; इष्टतम स्पष्टता और नियंत्रण के लिए लेटेक्स बल्ब के साथ सुसज्जित ग्लास पाश्चर पाइप का उपयोग करें। कुल्ला चरण के लिए, भ्रूण को हिलाया नहीं जाता है, बस बसने की अनुमति दी जाती है; धोने के चरण के लिए, भ्रूण को संकेतित समय के लिए एक न्यूटेटर पर हिलाया जाता है और फिर बसने की अनुमति दी जाती है।

  1. यदि भ्रूण मेथनॉल में संग्रहीत नहीं थे, तो चरण 2.2 पर आगे बढ़ें। यदि भ्रूण को मेथनॉल में संग्रहीत किया गया था, तो पीबीएस-ट्वीन के साथ दो बार कुल्ला करें, और फिर पीबीएस-ट्वीन के साथ दो बार 20 मिनट के लिए धो लें।
  2. ब्लॉकिंग घोल के 1 एमएल में 30-60 मिनट के लिए भ्रूण को धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए या अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एंटीबॉडी समाधान (तालिका 1) में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ भ्रूण को इनक्यूबेट करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के संरक्षण के लिए इस चरण को यथासंभव कम मात्रा में (50-300 μL) करें; एक नटटर पर रॉकिंग की सख्त आवश्यकता नहीं है।
    1. एक्सएम के लिए एक विशिष्ट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की मात्रा को कम से कम 50% तक बढ़ाएं। निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता का उपयोग करें: एंटी-पार -3 गिनी पिग पॉलीक्लोनल21 के लिए 1: 200 और एंटी-जीएफपी खरगोश पॉलीक्लोनल के लिए 1: 100।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें (यदि वांछित हो तो 4 डिग्री सेल्सियस पर सहेजें), पीबीएस-ट्वीन के साथ दो बार कुल्ला करें, और फिर पीबीएस-ट्वीन के साथ चार बार 15 मिनट के लिए धो लें।
  5. एक न्यूटेटर पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 300 μL (एंटीबॉडी समाधान में पतला) की अंतिम मात्रा में फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ भ्रूण को इनक्यूबेट करें। फ्लोरोसेंटली लेबल स्ट्रेप्टाविडिन को इस चरण के दौरान जोड़ा जा सकता है। इस कदम से, भ्रूण को अत्यधिक और लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क से बचाएं, जब संभव हो, उदाहरण के लिए ट्यूबों को एक अपारदर्शी बॉक्स ढक्कन के साथ कवर करके या नमूने को दराज में रखकर।
    1. निम्नलिखित सांद्रता का उपयोग करें: एंटी-खरगोश आईजीजी बकरी पॉलीक्लोनल के लिए 1:500 एलेक्सा फ्लुर 488 से जुड़ा हुआ है; एंटी-गिनी पिग आईजीजी बकरी पॉलीक्लोनल के लिए 1:500 एलेक्सा फ्लुर 568 से जुड़ा हुआ है; और स्ट्रेप्टाविडिन-एलेक्सा फ्लुर 488 के लिए 1:1000।
  6. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को निकालें और निपटाएं। पीबीएस-ट्वीन के साथ भ्रूण को दो बार कुल्ला करें, और पीबीएस-ट्वीन के साथ चार बार 15 मिनट के लिए धो लें।
  7. इस बिंदु पर, भ्रूण को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है लेकिन जितनी जल्दी हो सके नमूने संसाधित करें (<24 घंटे)।

3. पीडीएमएस कुएं तैयार करना

नोट: पीडीएमएस कुओं को 2 सप्ताह पहले तक बनाया जा सकता है।

  1. एक इनक्यूबेटर या गर्म प्लेट को 55 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, और एक सेंट्रीफ्यूज सेट करें जो शंक्वाकार ट्यूबों को 15 डिग्री सेल्सियस तक स्पिन कर सकता है।
  2. पीडीएमएस समाधान (तालिका 1) तैयार करने के लिए, एक पैमाने पर एक द्वितीयक कंटेनर में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब रखें, और सिरिंज का उपयोग करके ट्यूब में 10 ग्राम सिलिकॉन इलास्टोमेर बेस जोड़ें। फिर, 1 ग्राम सिलिकॉन इलास्टोमेर इलाज एजेंट जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए ट्यूब को कई बार उलटा करें।
  3. एक दूसरे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में उचित मात्रा में पानी जोड़कर एक बैलेंस ट्यूब बनाएं। पीडीएमएस घोल को 15 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर इसे ~ 1 मिमी की गहराई तक 10 सेमी पेट्री डिश में डालें। यदि आवश्यक हो, तो हवा की नली के साथ घोल पर धीरे से उड़ाकर बुलबुले निकालें। पीडीएमएस समाधान को 55 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जमने दें।
  4. एक बार पीडीएमएस स्लैब ठोस हो जाने के बाद, स्केलपेल का उपयोग करके, स्कोर वर्ग क्षेत्र जो 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप से थोड़ा छोटा है। प्रत्येक वर्ग के अंदर, स्कोर करें और ~ 8 मिमी-चौड़े वर्ग को अच्छी तरह से हटा दें।
  5. प्रत्येक वर्ग पीडीएमएस को 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप पर अच्छी तरह से स्थानांतरित करें, और दृढ़ता से इसका पालन करें (चित्रा 2 डी)। छह या अधिक कवरलिप्स तैयार करने से छवि बनाने के लिए विस्तारित भ्रूण की एक अच्छी संख्या प्राप्त होनी चाहिए।

4. भ्रूण को कवरलिप्स का पालन करना

  1. प्रत्येक कुएं (~ 50 μL) के अंदर कवरस्लिप सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त 0.1% पॉली-एल-लाइसिन लागू करें, और उन्हें हवा में सूखने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। चिपकने की क्षमता बढ़ाने के लिए इस चरण को दोहराएं।
  2. ट्वीन डिटर्जेंट को हटाने के लिए 1x PBS में एक बार भ्रूण को संक्षेप में कुल्ला करें, और फिर पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कुओं में से प्रत्येक में >10 भ्रूण स्थानांतरित करें।
  3. भ्रूण को कुओं के तल पर बसने दें। पाश्चर पाइप का उपयोग करके पालन किए गए भ्रूण से अतिरिक्त तरल निकालें। तुरंत अगले चरण पर जाएं।

5. सक्रियण और गेलेशन

नोट: सक्रियण भ्रूण में एमए-एनएचएस के अतिरिक्त को संदर्भित करता है, जो नमूना प्रोटीन और एंटीबॉडी को संशोधित करेगा ताकि वे हाइड्रोगेल से बंध सकें। गेलेशन प्रत्येक कुएं में भ्रूण में और उसके आसपास एक हाइड्रोगेल की पीढ़ी को संदर्भित करता है। गेलेशन के दौरान, भ्रूण को एक मोनोमर समाधान के साथ पार किया जाता है और फिर हाइड्रोगेल बनाने के लिए गेलेशन समाधान के साथ इलाज किया जाता है।

  1. कुओं को सक्रियण समाधान से भरकर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए भ्रूण को सक्रिय करें (1 x पीबीएस में 1 एमएम एमए-एनएचएस ताजा पतला; तालिका 1)। इस घोल को 1 घंटे के दौरान लगभग हर 10 मिनट में बदलें।
  2. भ्रूण को 1x PBS के साथ तीन बार धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए मोनोमर समाधान (तालिका 1) में भ्रूण को इनक्यूबेट करें।
  3. जबकि भ्रूण मोनोमर समाधान में बैठे हैं, गेलेशन समाधान तैयार करें (तालिका 1)। पूरे 10 सेमी पेट्री डिश से पीडीएमएस कुओं को कवर करने के लिए ~ 2 एमएल गेलेशन समाधान तैयार करना पर्याप्त है। एपीएस को अंतिम रूप से जोड़ना सुनिश्चित करें, क्योंकि यह पोलीमराइजेशन शुरू करेगा और गेलेशन शुरू करेगा।
    1. पाउडर से उत्प्रेरक ऑक्सीडेंट को ताजा पतला करें (उदाहरण के लिए, पानी में 1% टेम्पो डब्ल्यू / वी)। मोनोमर समाधान के 1,960 μL को 10% TEMED के 30 μL और 1% टेम्पो के 10 μL के साथ मिलाएं।
    2. एक बार में गेलेशन समाधान के पूरे बैच को पॉलीमराइज़ करने से बचने के लिए, छोटे बैचों में काम करें। पीसीआर पट्टी के आठ ट्यूबों के बीच गेलेशन समाधान (एपीएस के बिना) को 125 μL एलिकोट में विभाजित करें।
    3. भ्रूण को बाधित न करने के लिए सावधान रहते हुए वैक्यूम का उपयोग करके तीन पीडीएमएस कुओं से मोनोमर समाधान को हटा दें। पोलीमराइजेशन शुरू करने के लिए गेलेशन समाधान युक्त पीसीआर ट्यूबों में से एक में एपीएस के 5 μL जोड़ें। कुओं के बीच पोलीमराइजिंग गेलेशन समाधान को जल्दी से वितरित करें (~ 40 μL प्रति कुआं)। इसे तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कुएं और भ्रूण कवर न हो जाएं।
  4. नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5-2.5 घंटे के लिए जेल होने दें। पोलीमराइजेशन की निगरानी के लिए हर बार हाइड्रोगेल को उत्तेजित करें। ठोस हाइड्रोगेल हिलने नहीं लगेंगे। मोटे हाइड्रोगेल को पोलीमराइजेशन पूरा करने और जमने में अधिक समय लगेगा।

6. पाचन और विस्तार

नोट: मोटे और बड़े जैल का विस्तार करने में अधिक समय लगेगा, और जैल के केंद्र को पूरी तरह से विस्तार करने में कई घंटे लग सकते हैं; इसे जेल के किनारों को ट्रिम करके बढ़ाया जा सकता है। जैसे-जैसे जैल का विस्तार होता है, उनका अपवर्तक सूचकांक लगभग पानी के समान हो जाएगा, और उन्हें देखना बहुत कठिन हो जाएगा।

  1. गेलेशन पूरा होने के बाद, हाइड्रोगेल को परेशान न करने की कोशिश करते हुए कवरस्लिप से पीडीएमएस कुओं को छील लें। यदि वांछित हो, तो अतिरिक्त हाइड्रोगेल सामग्री को काट दें।
  2. हाइड्रोगेल (अभी भी कवरलिप्स से जुड़े) को छह-वेल प्लेट (चित्रा 2 ई) के कुओं में व्यक्तिगत रूप से स्थानांतरित करें। ध्यान दें कि पाचन के दौरान हाइड्रोगेल का थोड़ा विस्तार हो सकता है।
  3. जैल को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पाचन बफर (तालिका 1) के साथ पूरी तरह से कवर करें। सामान्य तौर पर, 6-वेल प्लेट में जैल को कवर करने के लिए 30 एमएल पाचन बफर पर्याप्त होता है।
  4. पाचन के बाद, प्रत्येक हाइड्रोगेल को कवरस्लिप से स्लाइड करके 6 सेमी पेट्री डिश में व्यक्तिगत रूप से स्थानांतरित करें। जेल को हटाने के लिए दूसरे कवरस्लिप का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है। जेल का विस्तार करने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ प्रत्येक पेट्री डिश भरें। 1-2 घंटे के दौरान पानी को तीन से चार बार बदलें जब तक कि जैल पूरी तरह से विस्तारित न हो जाएं (चौड़ाई में अनुमानित चार गुना वृद्धि की उम्मीद करें)।

7. माउंटिंग और इमेजिंग

नोट: विस्तारित हाइड्रोगेल लगभग पूरी तरह से पानी से बने होते हैं, जिससे वे लगभग पारदर्शी और बेहद नाजुक हो जाते हैं। जैल को लंबे कवरलिप्स का उपयोग करके उन्हें चारों ओर ले जाने और उन्हें उठाने के लिए हेरफेर किया जा सकता है। एक समय में केवल एक या दो जैल को माउंट और इमेज करें, क्योंकि जैल धीरे-धीरे पानी छोड़ देंगे और कवरस्लिप के चारों ओर स्लाइड करना शुरू कर देंगे।

  1. पाश्चर पाइप का उपयोग करके, पेट्री डिश से जितना संभव हो उतना अतिरिक्त पानी निकालें ताकि संभाले जाने पर जैल को कम से कम किया जा सके।
  2. इमेजिंग के लिए एक बड़े कवरस्लिप (जैसे, 24 मिमी x 40 मिमी) पर नीचे की सतह पर भ्रूण के साथ प्रत्येक विस्तारित जेल को पैंतरेबाज़ी करें।
  3. उल्टे लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उद्देश्य पर जेल के साथ प्रत्येक कवरस्लिप माउंट करें। कम आवर्धन (5x या 10x) या मध्यम-आवर्धन (20x) वायु उद्देश्यों के साथ माइक्रोस्कोप पर एपिफ्लोरेसेंस या ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी मोड का उपयोग करके उचित रूप से मंचित और उन्मुख नमूने खोजें।
  4. उच्च रिज़ॉल्यूशन पर छवि बनाने के लिए, उच्च-आवर्धन (60x, 63x, या 100x) तेल- या जल-विसर्जन उद्देश्य पर स्विच करें। भ्रूण की सतह को छवि बनाने के लिए उद्देश्य की ध्यान केंद्रित सीमा के भीतर होना चाहिए (63x उद्देश्य के लिए कवरस्लिप से <300 μm)।
  5. माइक्रोस्कोप पर लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल मोड का उपयोग करके नमूने से डेटा एकत्र करें। अच्छी गतिशील सीमा के साथ गैर-संतृप्त छवियों को एकत्र करना सुनिश्चित करें, और नमूना23 के बारे में अधिकतम संभव जानकारी कैप्चर करने के लिए प्रति छवि उचित संख्या में पिक्सेल का उपयोग करें।

Figure 2
चित्रा 2: मैनुअल डेविटेलिनाइजेशन और हाइड्रोगेल के साथ काम करना । (ए) एक आगर / फलों के रस की प्लेट से एक आगर स्लैब काटना। (बी) 6 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन के अंदर दो तरफा टेप रखना। (सी) टेप किए गए ढक्कन के लिए भ्रूण का पालन करना। (डी) एक चौकोर कुएं के साथ एक पीडीएमएस स्लैब 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप का पालन करता है। (ई) 6-वेल प्लेट के अंदर अच्छी तरह से पीडीएमएस के साथ कवरस्लिप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

पूरे माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण में एक्सएम की सामान्य प्रभावकारिता को चिह्नित करने के लिए, सिर से पूंछ की धुरी के साथ भ्रूण की लंबाई को विस्तारित भ्रूण बनाम विस्तारित भ्रूण (चित्रा 3 ए-सी) में मापा गया था। अविस्तारित नियंत्रण भ्रूण को विस्तारित भ्रूण के समान निर्धारण स्थितियों और इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग चरणों के अधीन किया गया था, सिवाय इसके कि उन्हें इमेजिंग से पहले एक ठोस माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके लगाया गया था। 10x उद्देश्य (चित्रा 3 ए) का उपयोग करते समय व्यक्तिगत अविस्तारित भ्रूण दृश्य के क्षेत्र के लगभग आधे हिस्से में फैले हुए थे। इसके विपरीत, विस्तारित भ्रूण एक ही 10x उद्देश्य (चित्रा 3 बी) का उपयोग करते समय दृश्य के लगभग दो पूर्ण क्षेत्रों में फैले हुए थे। यह आकलन करने के लिए कि प्रयोगों के भीतर और बीच विस्तार की डिग्री कैसे भिन्न होती है, एक ही एक्सएम प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग अवसरों पर किया गया था, और भ्रूण की लंबाई को प्रत्येक व्यक्तिगत प्रयोग के भीतर तीन अलग-अलग जैल में मापा गया था। अविस्तारित नियंत्रण भ्रूण की औसत सिर-से-पूंछ की लंबाई 398.8 μm थी (मानक विचलन [SD] = 22.93 μm; n = 74; चित्रा 3 सी)। प्रयोग 1, प्रयोग 2 और प्रयोग 3 के लिए, औसत भ्रूण की लंबाई क्रमशः 1,596 μm (SD = 159.9 μm; n = 57), 1,868 μm (SD = 150.5 μm; n = 51), और 1,954 μm (SD = 120.3 μm; n = 44) थी, जो क्रमशः 4.0 गुना, 4.7 गुना और 4.9 गुना के विस्तार कारकों का प्रतिनिधित्व करती है। जैल के बीच अंतर-प्रयोगात्मक भिन्नता अंतर-प्रयोगात्मक भिन्नता की तुलना में बहुत कम ध्यान देने योग्य थी, जो लगभग 20% थी (चित्रा 3 सी)। कोशिका और भ्रूण आकृति विज्ञान पर एक्सएम के प्रभावों का आकलन करने के लिए, एपिकल सेल झिल्ली को लेबल करने के लिए जंक्शन घटक पार -3 (बाज़ूका) 21 का पालन करने के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, और हमने चरण 11 ड्रोसोफिला भ्रूण के विकासशील मुंह खंडों को चित्रित किया - एक जटिल खंडित संरचना के साथ एक चरण (चित्रा 3 डी-एफ)। नियंत्रण नमूने में, मैक्सिलरी खंड में कोशिकाओं की औसत चौड़ाई 4.76 μm (SD = 1.053 μm, n = 25; चित्रा 3 डी, एफ)। एक ही 40x उद्देश्य और ज़ूम कारक (1x) का उपयोग करके चित्रित विस्तारित नमूनों में, मैक्सिलरी खंड में कोशिकाओं की औसत चौड़ाई 19.10 μm (SD = 3.966 μm, n = 18; चित्रा 3 ई, एफ), 4.0 गुना विस्तार का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, पिछली रिपोर्ट11 के अनुरूप, हम सेलुलर या ऊतक आकृति विज्ञान में नमूना फाड़ने या स्पष्ट विकृतियों के बिना एक्सएम का उपयोग करके रैखिक आयामों में पूरे-माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण का लगभग चार गुना विस्तार करने में सक्षम थे।

Figure 3
चित्रा 3: ड्रोसोफिला भ्रूण का चार गुना विस्तार। (ए) अविस्तारित और (बी) विस्तारित ड्रोसोफिला भ्रूण 1x ज़ूम पर 10x उद्देश्य (0.3 NA) का उपयोग करके चित्रित किया गया। अलग-अलग दृश्य क्षेत्रों (एफओवी) को धराशायी रेखाओं के साथ इंगित किया जाता है। भ्रूण ने मायोसिन प्रकाश श्रृंखला के जीएफपी-टैग किए गए संस्करण को व्यक्त किया और एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। (सी) प्रति प्रयोग तीन हाइड्रोजेल में भ्रूण की लंबाई (सिर से पूंछ अक्ष के साथ) का परिमाणीकरण और अविस्तारित नियंत्रणों की तुलना में तीन अलग-अलग एक्सएम प्रयोगों से। (D, E) (डी) अविस्तारित और (ई) विस्तारित चरण 11 ड्रोसोफिला भ्रूण से मैक्सिलरी खंडों को 1x ज़ूम पर 40x उद्देश्य (1.3 NA) का उपयोग करके चित्रित किया गया है। सेल की रूपरेखा (पालन जंक्शनों) को एंटी पार -3 / बज़ूका एंटीबॉडी (सफेद) के साथ पाया गया था। (एफ) (डी) और (ई) से कोशिकाओं के समकक्ष समूहों से सेल चौड़ाई (लंबी धुरी) का परिमाणीकरण। (सी) और (एफ) में बॉक्स प्लॉट 25 वें, 50 वें और 75 वें प्रतिशत रेंज दिखाते हैं; मूंछें न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों को इंगित करती हैं; "+" प्रतीक माध्य को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यह प्रदर्शित करने के लिए कि एक्सएम का उपयोग विशिष्ट विवर्तन सीमा के नीचे उपकोशिकीय विवरणों को हल करने के लिए किया जा सकता है, एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन को अभिसरण विस्तार (चरण 7) से गुजरने वाले विस्तारित भ्रूण बनाम विस्तारित नियंत्रण में चित्रित किया गया था। गैस्ट्रुलेशन और अभिसरण विस्तार की ऊतक रीमॉडेलिंग घटनाओं को मोटर प्रोटीन मायोसिन II24 के स्थानीयकरण में परिवर्तन द्वारा काफी हद तक नियंत्रित किया जाता है। हालांकि, प्रारंभिक ड्रोसोफिला एक्टोडर्म के घनी आबादी वाले स्तंभ उपकला में, मायोसिन II स्थानीयकरण पैटर्न के कई बारीक विवरणों का निरीक्षण करना मुश्किल है, भले ही इसे 158x आवर्धन (2.5x ऑप्टिकल ज़ूम के साथ 63x उद्देश्य) पर चित्रित किया गया हो - लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए एक विशिष्ट अधिकतम समाधान शक्ति। उदाहरण के लिए, क्योंकि मायोसिन II एक कॉर्टिकल प्रोटीन है (प्लाज्मा झिल्ली के नीचे सीधे स्थित), सेल-सेल संपर्कों के दोनों ओर स्थित मायोसिन II25 के पूल चरण 7 भ्रूण में हल करने योग्य नहीं थे, और वे एक एकल रेखा के रूप में दिखाई दिए जहां पड़ोसी कोशिकाएं मिलीं (चित्रा 4 ए)। इसके विपरीत, विस्तारित चरण 7 भ्रूण में, मायोसिन II की समानांतर रेखाएं सेल-सेल जंक्शनों पर देखी जा सकती हैं, जो आसन्न कोशिकाओं में कॉर्टिकल प्रोटीन पूल का प्रतिनिधित्व करती हैं (चित्रा 4 बी)। विस्तारित नमूनों में समानांतर मायोसिन II लाइनों के बीच की दूरी 892.7 एनएम (एसडी = 0.171 एनएम, एन = 12) थी; जब चार से विभाजित किया जाता है, तो यह अविस्तारित भ्रूण में आसन्न कोशिकाओं में मायोसिन लाइनों के बीच ~ 220 एनएम की अनुमानित दूरी उत्पन्न करता है, जो वास्तव में एलेक्सा 488 (~ 520 एनएम / 2 = 260 एनएम का चरम उत्सर्जन) के साथ पता लगाए गए संकेत के लिए विवर्तन सीमा से ठीक नीचे है।

इसके अलावा, हमने यह भी परीक्षण किया कि क्या एक्सोएम का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण (चरण 6) के घनी पैक कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क आर्किटेक्चर को हल करने के लिए किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन नेटवर्क संरचना (यानी, फ्यूज्ड बनाम खंडित ऑर्गेनेल) से निकटता से जुड़ा हुआ है, लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क संगठन का विवरण सेल प्रकारों में पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना करना मुश्किल है जो सपाट और / या पतले नहीं हैं। माइटोकॉन्ड्रिया स्वाभाविक रूप से बायोटिनीलेटेड अणुओं में समृद्ध होते हैं, और, इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रिया को फ्लोरोसेंटली लेबल स्ट्रेप्टाविडिन26 का उपयोग करके प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में लेबल किया जा सकता है। स्ट्रेप्टाविडिन-एलेक्सा 488 के साथ लेबल किए गए अविस्तारित चरण 6 भ्रूण में, संकेत साइटोप्लाज्मिक पंक्टा के रूप में दिखाई दिया जो अक्सर अतिव्यापी और हल करने में मुश्किल होते थे (चित्रा 4 सी)। इसके विपरीत, विस्तारित चरण 6 भ्रूण में, माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के कई और बारीक विवरण दिखाई दे रहे थे और पंक्टा अधिक आसानी से हल करने योग्य थे (चित्रा 4 डी)26,27। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एक्सएम का उपयोग सेल प्रकारों में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क संगठन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जो पारंपरिक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं है।

Figure 4
चित्रा 4: विस्तार माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रकट एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन और माइटोकॉन्ड्रिया का विवरण। (ए, बी) न्यूरोएक्टोडर्म (जर्मबैंड) कोशिकाओं में मायोसिन II स्थानीयकरण को चरण 7 (ए) अविस्तारित और (बी) विस्तारित भ्रूण में 2.5 एक्स ज़ूम पर 63 x उद्देश्य (1.4 एनए) के साथ चित्रित किया गया है। मायोसिन II नियामक प्रकाश श्रृंखला (sqh-GFP) के ट्रांसजेनिक जीएफपी-टैग किए गए संस्करण को व्यक्त करने वाले भ्रूण में मायोसिन II का पता लगाया गया था, जिसे एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी (लाल) के साथ पता लगाया गया था। आसन्न कोशिकाओं में स्थित कॉर्टिकल मायोसिन के अलग-अलग पूल को विस्तारित भ्रूण (सफेद तीर) में हल किया जा सकता है। (C, D) न्यूरोएक्टोडर्म कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क को चरण 6 में 2.5 x ज़ूम पर 63× उद्देश्य (1.4 एनए) के साथ चित्रित किया गया है। माइटोकॉन्ड्रिया को स्ट्रेप्टाविडिन-एलेक्सा 488 (हरा) के साथ पाया गया था, और सेल की रूपरेखा को एंटी-पार -3 / बाज़ूका एंटीबॉडी (मैजेंटा) के साथ पता लगाया गया था। प्रयोगों को लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: समाधान व्यंजनों. उपस्थिति के क्रम में इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए संरचना। सभी स्टॉक तरल पदार्थ हैं जब तक कि अन्यथा नोट न किया जाए। रसायनों को आटोक्लेव फ़िल्टर किए गए पानी में फिर से निलंबित या पतला किया गया था जब तक कि अन्यथा नोट न किया गया हो। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

मैनुअल डेविटेलिनाइजेशन
अधिकांश ड्रोसोफिला भ्रूण निर्धारण प्रोटोकॉल में मेथनॉल और हेप्टेन के इमल्शन में निश्चित भ्रूण को हिलाकर विटेलिन झिल्ली को हटाना शामिल है, जिसके कारण झिल्ली आसमाटिक टूटनेके माध्यम से फट जाती है। जबकि मेथनॉल-आधारित डेविटेलिनाइजेशन (मेथनॉल पॉपिंग) कई अनुप्रयोगों के लिए प्रभावी और उपयुक्त है, मैनुअल डेविटेलिनाइजेशन (हाथ से छीलना) कुछ महत्वपूर्ण फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, हाथ छीलने से किसी को सटीक रूप से मंचित भ्रूण चुनने और इकट्ठा करने की अनुमति मिलती है, जिससे प्रयोग के अंत में एक उपयोग योग्य अभिविन्यास में विस्तारित भ्रूण प्राप्त करने की संभावना बढ़ जाती है। तेजी से विकास प्रक्रियाओं (जैसे, मेसोडर्म इनवेजिनेशन या अभिसरण विस्तार) के विशिष्ट पहलुओं का अध्ययन करते समय यह संवर्धन महत्वपूर्ण है, जिसके लिए उचित रूप से मंचित भ्रूण सभी भ्रूणों के केवल कुछ प्रतिशत का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, यहां तक कि कसकर समयबद्ध संग्रह खिड़की के भीतर भी। बेशक, कई अनुप्रयोगों के लिए, समयबद्ध संग्रह खिड़की से भ्रूण का अधिक पारंपरिक थोक मेथनॉल पॉपिंग पर्याप्त होगा, और हाथ से छीलना अतिरिक्त प्रयास के लायक नहीं हो सकता है। दूसरा, मेथनॉल के नमूने के पिछले जोखिम से कुछ प्राथमिक एंटीबॉडी और रंजक का बंधन नकारात्मक रूप से प्रभावित होता है। इस कारण से, हाथ छीलने से मेथनॉल-पॉप्ड नमूनों की तुलना में इम्यूनोफ्लोरेसेंस सिग्नल की गुणवत्ता में महत्वपूर्ण वृद्धि हो सकती है, जिससे यह ड्रोसोफिला विकास जीवविज्ञानी के लिए एक उपयोगी सामान्य तकनीक बन जाती है।

विस्तारित पूरे माउंट ड्रोसोफिला भ्रूण में उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
जबकि विस्तारित नमूनों पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी करना वैचारिक रूप से अविस्तारित नमूनों के समान है, एक्सएम कुछ तकनीकी बाधाओं को पेश करता है। विशेष रूप से, भ्रूण अभिविन्यास, जो यादृच्छिक है, नमूना आकार बढ़ने के साथ और भी महत्वपूर्ण हो जाता है, क्योंकि उच्च-आवर्धन, उच्च-एनए उद्देश्य केवल नमूना क्षेत्रों से प्रकाश पर ध्यान केंद्रित करने में सक्षम होते हैं जो कवरस्लिप27 के बहुत करीब हैं। इसलिए, आमतौर पर केवल भ्रूण की सतह पर या उसके पास की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करना संभव होता है जो जेल बनने पर कवरस्लिप के निकट समाप्त हो जाते हैं। यह सुनिश्चित करने का सबसे अच्छा तरीका है कि अंत में सही अभिविन्यास के नमूने हैं, निश्चित भ्रूण के कसकर मंचित संग्रह के साथ एक्सएम प्रोटोकॉल शुरू करना है (उदाहरण के लिए, हाथ से छीलने का उपयोग करके) और प्रत्येक कुएं में कई भ्रूणों को बीज देना (>10). भ्रूण के इंटीरियर में गहरी कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, अधिक विशेष इमेजिंग सेटअप का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है, जैसे कि लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी28। इसके अतिरिक्त, हम पाते हैं कि कॉन्फोकल पिनहोल को एक हवादार इकाई से अधिक आकार में खोलकर छवि की गुणवत्ता में सुधार किया जा सकता है। बेशक, एक बढ़ा हुआ पिनहोल आकार कम अधिकतम रिज़ॉल्यूशन की कीमत पर आएगा, लेकिन व्यवहार में, पिनहोल आकार में छोटी वृद्धि भी सिग्नल तीव्रता को काफी बढ़ा सकती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। भविष्य के अध्ययनों को व्यवस्थित रूप से एक्सएम नमूनों में पिनहोल आकार और प्रभावी संकल्प को संबोधित करना चाहिए।

मूल ExM पर भिन्नताएं
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक्सएम का एक अपेक्षाकृत सरल उदाहरण है जिसे कई अनुप्रयोगों के लिए काम करना चाहिए और अधिकांश विकासात्मक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में लागू करना आसान होना चाहिए। हालांकि, एक्सएम 4,5,7 की मूल अवधारणा पर कई भिन्नताएं हैं जिनका उपयोग सिग्नल तीव्रता को बढ़ाने, विस्तार की और भी डिग्री प्राप्त करने और न्यूक्लिक एसिड अणुओं के साथ-साथ प्रोटीन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, भ्रूण को गेलेशन और विस्तार से पहले एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को 6,30 का विस्तार करने के बाद एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जा सकता है, जो विस्तार चरणों के दौरान एपिटोप पहुंच में वृद्धि और बाध्य एंटीबॉडी के नुकसान में कमी के कारण सिग्नल की तीव्रता बढ़ा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट क्रॉसलिंकर अणुओं का उपयोग हाइड्रोगेल में आरएनए अणुओं को संलग्न करने के लिए किया जा सकता है ताकि संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया विधि30 का उपयोग करके विस्तारित जैल में आरएनए का पता लगाया जा सके। अंत में, नमूनों को विस्तार के कई दौरों के अधीन किया जा सकता है, जैसे कि पुनरावृत्ति विस्तार माइक्रोस्कोपी (iExM)31, पैन-ExM32, और विस्तार प्रकटीकरण (ExR)31 में, बढ़े हुए रिज़ॉल्यूशन की उच्च डिग्री प्राप्त करने के लिए।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम गिनी पिग एंटी-पार -3 प्राथमिक एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए डॉ जेनिफर ज़लेन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंस (एनआईजीएमएस), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) के सदस्यों में से एक, साथ ही अर्कांसस बायोसाइंसेज इंस्टीट्यूट (एबीआई) से उदार वित्त पोषण (1R15GM143729-01 और 1P20GM139768-01 5743) द्वारा समर्थित किया गया था, जिसने हमारे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की खरीद के लिए आंशिक धन प्रदान किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acrylamide Milipore Sigma 1490-100ML
ammonium persulfate VWR BDH9214-500G
anti-GFP rabbit polyclonal antibody Torrey Pines BioLabs TP-401
anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A-11075
anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008
bisacrylamide Research Products International A11275
bovine serum albumin (30% solution) Millipore Sigma A7284
conical tubes, 50 mL fisherscientific  21008-940
coverlip glass, square 22 mm VWR 48366-227
coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm VWR 48393-230
glass capillaries for pulling needles World Precision Instruments TW100F-4
glass microinjection needles (pre-pulled) World Precision Instruments TIP10LT
guanidine HCl VWR 101970-606
heptane VWR EM-HX0078-1
latex pipet bulbs VWR 82024-554
methanol VWR BDH1135-4LP
methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester VWR 730300-1G
microfuge tube, 1.5 mL VWR 20170-038
multi-well plate, 6-well Genesee 25-100
paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) Electron Microscopy Sciences 509804487 (Fisher)
Pasteur pipet (2 mL, short tip) VWR 14673-010
PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) VWR 102092-312
Petri plates Genesee 32-107
phosphate-buffered saline (10x solution) VWR 97063-660
Poly-L-lysine solution (0.1% solution) VWR P8920-1ooML
Proteinase K Thermo Fisher Scientific E00491
scintillation vials (30 mL) VWR 66022-128
sodium acrylate VWR 101181-226
sodium azide (powder) Millipore Sigma 71289 make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration!
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific S32354
TAE (50x) VWR 97063-692
tape (double-sided, 1 inch wide) Scotch  3M 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed
TEMED Thermo Fisher Scientific PI17919
TEMPO VWR EM8.14681.0005 catalytic oxidant
Tween-20 VWR 97063-872 extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water
Zeiss LSM 900 Zeiss Laser scanning microscope used without AiryScan

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References

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Parveen, S., Jones, N. W., Millerschultz, I., Paré, A. C. Using Expansion Microscopy to Physically Enlarge Whole-Mount Drosophila Embryos for Super-Resolution Imaging. J. Vis. Exp. (194), e64662, doi:10.3791/64662 (2023).

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