Summary
ここでは、ショウ ジョウバエ の初期胚に拡大顕微鏡を導入し、従来のレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて超解像イメージングを実現するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
発生生物学の主力は共焦点顕微鏡であり、研究者は複雑な生体サンプル内のタグ付き分子の3次元局在を決定することができます。従来の共焦点顕微鏡では、数百ナノメートル離れた2つの隣接する蛍光点源を分離することができますが、細胞内生物学のより細かい部分を観察するには、数十ナノメートルオーダーのシグナルを分離する能力が必要です。超解像顕微鏡法は、研究者がこのような分解能の限界を回避できるように、ハードウェアベースの手法が数多く開発されていますが、これらの手法には特殊な顕微鏡が必要であり、すべての研究者が利用できるわけではありません。分解能を高める別の方法は、2015年にBoydenグループによって最初に報告された拡大顕微鏡法(ExM)と呼ばれるプロセスを通じて、サンプル自体を等方的に拡大することです。ExMは、 それ自体 が顕微鏡の一種ではなく、構成分子の相対的な空間構成を維持しながらサンプルを膨潤させる方法です。拡大したサンプルは、従来の共焦点顕微鏡を使用して効果的に高められた分解能で観察することができます。ここでは、ショウ ジョウバエ の胚全体にExMを実装するためのプロトコルについて説明し、表面上皮細胞内のPar-3、ミオシンII、およびミトコンドリアの局在を調べるために使用されます。このプロトコルにより、サンプルサイズが約4倍に増加し、従来の共焦点顕微鏡では見えなかった細胞内の詳細を検出できます。原理の証明として、抗GFP抗体を使用して隣接する細胞皮質間のミオシン-GFPの異なるプールを区別し、蛍光標識ストレプトアビジンを使用して内因性ビオチン化分子を検出して、ミトコンドリアネットワーク構造の細部を明らかにします。このプロトコルは、蛍光標識に一般的な抗体と試薬を利用しており、多くの既存の免疫蛍光プロトコルと互換性があるはずです。
Introduction
細胞生物学や発生生物学では、百聞は一見にしかず、タンパク質の局在パターンを正確に決定する能力は、多くの種類の実験の基本です。レーザー走査型共焦点顕微鏡は、インタクトサンプル内の蛍光標識タンパク質を3次元でイメージングするための標準ツールです。従来の共焦点顕微鏡では、発する光の波長の2分の1以下しか離れていない隣り合う蛍光シグナルを区別(分解)することができませんでした1。言い換えれば、2つの点光源を2つの異なる信号として分解するには、横方向に少なくとも200〜300nm(軸方向に500〜700nm)離れている必要があります。この技術的障壁は回折限界として知られており、回折限界を下回る空間的特徴を持つ複雑な細胞内構造(アクトミオシンの細胞骨格網やミトコンドリア網など)を研究する上での根本的なハードルとなっています。したがって、従来の共焦点顕微鏡の解像力を高めるための技術は、生物学界にとって一般的な関心事です。
回折限界を回避するために、数十ナノメートル以下の分解能を可能にするさまざまな超解像顕微鏡技術が開発され1,2,3、以前は電子顕微鏡でしかアクセスできなかった生物学的複雑さの世界が明らかになりました。これらのハードウェアベースの方法には明らかな利点がありますが、超解像顕微鏡は、特定のサンプルラベリング要件と長い取得時間を持つことが多く、柔軟性が制限されたり、一部のラボではアクセスするには高価すぎる場合があります。顕微鏡ベースの超解像法に代わるのが拡大顕微鏡法(ExM)であり、これはそれ自体が顕微鏡の一種ではなく、構成分子の相対的な空間構成を維持しながらサンプルを膨潤させる方法です4。等方的に拡大したサンプルは、従来の蛍光共焦点顕微鏡を使用して、効果的に高められた分解能で観察することができます。ExMは2015年にBoydenグループによって最初に報告され5、それ以来、基本的な手法はさまざまな実験での使用に適応されています6,7,8。ExMは、特にショウジョウバエ9,10,11、C.エレガンス12、ゼブラフィッシュ13などのホールマウント胚での使用にも適応されており、発生生物学者にとって強力なツールとなっています。
ExMは、2つの異なるハイドロゲルの化学的性質に基づいています:1)水に浸すとサイズが大幅に大きくなる膨潤性高分子電解質ハイドロゲル14、および2)ポリマー間隔が非常に小さく、等方的なサンプル膨張を可能にするポリアクリルアミドハイドロゲル15。多くのExMプロトコルが公開されていますが、一般的には、サンプルの固定、標識、活性化、ゲル化、消化、および増殖のステップを共有しています4。固定条件と蛍光標識戦略は、もちろん実験とシステムのニーズによって異なり、一部のプロトコルでは、増殖後に標識が行われます。サンプル中の標的分子は、ヒドロゲルに結合するためにプライミング(活性化)されなければならず、これは異なる化学的性質を用いて達成することができる4。ゲル化ステップでは、サンプルを将来のハイドロゲルのモノマー(アクリル酸ナトリウム、アクリルアミド、架橋剤ビスアクリルアミド)で飽和させ、過硫酸アンモニウム(APS)などの開始剤やテトラメチレンジアミン(TEMED)などの促進剤によって触媒されるフリーラジカル重合によってヒドロゲルが形成されます4。ゲル化後、試料を酵素的に消化して、膨潤に対する試料耐性を均質化し、ヒドロゲル4の等方性膨張を確保する。最後に、消化されたヒドロゲルを水中に入れると、元の線状サイズの約4倍に膨張します4。
図1: ショウジョウバエ 胚の増殖顕微鏡法の概要。 ExM は、完了するまでに少なくとも 4 日かかるマルチステップ プロトコルです。胚の採取、固定、およびデビテリン化は、複数のコレクションからの胚がプールされているかどうかに応じて、1日以上かかります。免疫蛍光標識には、胚を一次抗体と一晩インキュベートするかどうかに応じて、1日または2日かかります。胚の活性化、ゲル化、消化、増殖を1日で行うことができます。ゲルは増殖後すぐにマウントしてイメージングできますが、実用的な理由から、翌日からイメージングを開始することが望ましいことがよくあります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
このプロトコルは超解像(図1)で細胞内蛋白質のローカリゼーション パターンを視覚化するために中間段階のショウジョウバエの胚16に全台紙の早いのExMを行う方法を記述する。この方法は、メチルアクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(MA-NHS)化学を使用してタンパク質分子を活性化し、ヒドロゲルに固定します17、これは、後期のショウジョウバエの胚および組織で使用するために以前に公開されたExMプロトコルの修正です11。このプロトコルでは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)ウェルを使用してヒドロゲルを成形し、活性化およびゲル化中の溶液交換を促進します。PDMSウェルの作成を必要としない代替方法は、カバーガラスに付着した胚を、実験室用シーリングフィルム22の断片上に座っているモノマー溶液の滴に下げることを含む。さらに、このプロトコルはimmunofluorescenceの汚損のための前提条件であるショウジョウバエの胚を囲む不浸透性のvitellineの膜を手動で取除くための方法を記述する。重要なことに、この手作業で胚を剥離する方法は、サンプルの標識の前に適切にステージングされたショウジョウバエの胚のみを選択するために使用でき、正しいステージと向きの拡張サンプルで終わる可能性が大幅に高まり、ダウンストリームのデータ収集がはるかに効率的になります。
Protocol
このプロトコルは、ショウ ジョウバエなどの無脊椎動物の研究に関するアーカンソー大学(UARK)のガイドラインに従っており、UARK機関バイオセーフティ委員会(プロトコル#20001)によって承認されました。
1. ショウジョウバエ の胚の固定とデビテリン化
注:ステップ1では、胚を囲む透明な不透過膜であるビテリン膜を手動で除去するための手順(手剥離)について説明します。重要なことは、手作業で剥離することで、ExMプロトコルの開始時に適切にステージングされた胚を選択できるため、ExMプロトコルの終了時に使用可能な向きの胚を得る可能性が大幅に高まることです。ただし、このExMプロトコルは、大量の胚採取およびビテリン膜のメタノールベースの除去のための標準的な手順と完全に互換性があり、その場合はステップ2(免疫蛍光標識)に直接スキップできます。
- 細いガラス針を何本か用意するか、購入します。針先の実際の寸法は重要ではありませんが、針が固定胚の硝子体膜を突き刺すのに十分な硬さと鋭さがあることを確認してください。胚マイクロインジェクション用の針を準備するように、マイクロピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーチューブ(外径1mm、内径0.75mm)から針を作ります18。または、事前に引っ張られた針を購入します。
- 標準的な ショウジョウバエ 技術19 を使用して、>100匹の成虫の ショウジョウバエ をフルーツジュース/寒天プレート20で密封された通気性のあるプラスチックカップに入れることにより、胚を収集します。時限収集ウィンドウを使用して、適切なステージ16の胚を濃縮します。例えば、原腸形成(ステージ6)と収束伸展(ステージ7)の段階で濃縮するには、フルーツジュースプレートを交換し、25°Cで2時間胚を採取し、プレートを取り外し、25°Cでさらに2時間エージングして、2~4時間齢の胚を取得します。
- 胚から卵殻のような絨毛膜を取り除くには、果汁プレートの表面を50%漂白剤で覆い(表1)、小さな絵筆で胚を寒天の表面から放出し、絨毛膜が溶解するまで3分間待ちます。
- 脱穂した胚を、4 mLのヘプタン(有機上相)と4 mLの固定バッファー(水性底相; 表1)。新たに調製したストックまたは最近開封したストックからホルムアルデヒドを新たに希釈し、胚を添加する直前に10x PBSおよび脱イオン水と混合します。
注:パラホルムアルデヒドパワーまたは16%EMグレードのホルムアルデヒドからガラスアンプルでホルムアルデヒドを調製します。濃縮ホルムアルデヒド(例:37%ホルムアルデヒド)のストックを使用できますが、結果の一貫性が損なわれる可能性があります。 - 胚は有機相と水相の間の界面に蓄積します。界面に単一の層を形成するように胚をいくつも追加します。バイアルに添加される胚が多すぎると、同様に固定されません。
- 強力なテープを使用して、卓上シェーカーでシンチレーションバイアルを横向きに固定し、220rpmで20分間攪拌します。最適な固定のために、固定全体を通して有機相と水相の間で活発なエマルジョンを維持します。
- 固定時間中は、各サンプルについて以下のいずれかを調製してください。
- 3%寒天を半分に充填したプラスチック製の6cmのシャーレベースを取り、かみそりの刃またはメスで寒天に~5cmx3cmの長方形に切り込みを入れます。フルーツジュース/寒天プレートもこの目的に使用できます。
- 小さなラボスパチュラを使用して、寒天スラブを取り除きます。シャーレの底をひっくり返し、ベンチに置きます。逆さにした皿の上に寒天スラブを置きます(図2A)。
- ペトリ皿の蓋を取り、乾いていることを確認します。手袋を着用し、蓋の内側に両面テープを貼ります(テープは寒天スラブより少し大きくする必要があります。 図2B)。
- バイアルをシェーカーから取り出し、ベンチに直立させ、有機相と水相を分離します。適切に固定された胚は、2つのフェーズ間の界面に残ります。
- 固定胚を寒天スラブに移し、ラテックス球根を取り付けたガラス製のパスツールピペットを使用します。胚がピペットの内側に付着するのを防ぐために、胚をピペットの狭い首の中に保ち、一度にすべてではなく、複数の小さなバッチで胚を移植するようにしてください。すべての胚が寒天スラブ上に配置されたら、P200ピペッターを使用して胚の周囲から残留ヘプタンの大部分を取り除きます。このステップをできるだけ早く(<3分)実行して、形態に悪影響を与える可能性のある固定胚の乾燥を回避します。
- ~2cmの高さから、両面テープで蓋を寒天スラブに落とし、胚をテープに接着します(図2C)。寒天スラブから蓋をそっと取り外し、ベンチに逆さまに置き、蓋の胚を覆うのに十分なPBS-Tween(表1)を追加します。
- 約100倍の倍率で間接照明を当てた実体解剖顕微鏡を用いて、形態マーカーを用いて適切に病期分類された胚を同定する。ステージ6の胚には、目に見える頭側溝や陥入中胚葉などのマーカーを使用します。ステージ7の胚には、拡張された生殖バンドのようなマーカーを使用します。ステージ11の胚には、完全に拡張された生殖バンドや頭から尾への軸に沿った目に見えるセグメンテーションなどのマーカーを使用します16。
- 目的の胚を採取するには、まず胚の前端または後端近くのビテリン膜(胚の周りの透明な楕円形の膜)を細いガラス針で刺します。圧力が解放されると、メンブレンは少し収縮します。次に、細かい鉗子または金属プローブを使用して、もう一方の端の胚を穴からそっと押し込みます。Vitellineメンブレンは両面テープに接着されたままになります。望ましくない胚をテープに付着させたままにします。
- 浮遊するデビテリン化胚をガラス製のパスツールピペットで定期的に回収し、1.5 mLのマイクロチューブに移します。
- この時点で、次のいずれかの手順を実行します。
- 免疫蛍光標識ステップに直接進んでください。デビテリン化された胚は、ブロッキング溶液に直接入れることができます(ステップ2.2)。次のステップに進む前に、胚をPBS-Tweenまたはブロッキング溶液(表1)に16時間以上放置しないでください。
- 胚をメタノールに移して保存します。PBS-Tweenをできるだけ多く除去し、1 mLのメタノールを加えます。胚が落ち着いたら、できるだけ多くのメタノールを取り除き、1 mLの新しいメタノールを加えます。胚は−20°Cで無期限に保管してください。メタノール貯蔵により、複数のコレクションからの胚のプールも可能になります。
2. 免疫蛍光標識
注:抗体のインキュベーションステップを除けば、このセクションでは正確な液体の量と時間は重要ではありません。すすぎまたは洗浄を行うには、胚をチューブの底に沈殿させ、胚を吸い上げずにできるだけ多くの液体を取り除き、~1 mLの新しい液体を追加します。ラテックスバルブを取り付けたガラス製のパスツールピペットを使用して、最適な透明度とコントロールを実現します。すすぎのステップでは、胚は揺り動かされず、落ち着くだけです。洗浄ステップでは、胚を配卵器上で指示された時間揺さぶり、その後沈降させます。
- 胚をメタノールで保存しなかった場合は、ステップ2.2に進みます。胚をメタノールで保存した場合は、PBS-Tweenで2回すすぎ、PBS-Tweenで20分間2回洗浄します。
- 1mLのブロッキング溶液で胚を30〜60分間洗浄します。
- 抗体溶液(表1)で希釈した一次抗体とともに胚を室温で2時間、できれば4°Cで一晩インキュベートします。 このステップは、一次抗体を保存するために、できるだけ少量(50〜300μL)で行ってください。Nutatorの揺動は厳密には必須ではありません。
- ExMでは、一般的な免疫蛍光実験で使用する一次抗体の量を少なくとも50%増やします。一次抗体濃度は、抗Par-3モルモットポリクローナル21 では1:200、抗GFPウサギポリクローナルでは1:100です。
- 一次抗体溶液を除去し(必要に応じて4°Cで保存)、PBS-Tweenで2回すすぎ、PBS-Tweenで15分間4回洗浄します。
- 胚を蛍光二次抗体と最終容量300 μL(抗体溶液で希釈)で、吸育剤上で室温で1時間インキュベートします。蛍光標識されたストレプトアビジンは、このステップ中に添加することができます。このステップ以降は、チューブを不透明な箱の蓋で覆ったり、サンプルを引き出しに保管したりするなどして、可能であれば過度で長時間の光曝露から胚を保護します。
- 以下の濃度を使用してください:Alexa Fluor 488に融合した抗ウサギIgGヤギポリクローナルの場合は1:500。Alexa Fluor 568に融合した抗モルモットIgGヤギポリクローナルは1:500。streptavidin-Alexa Fluor 488 では 1:1000 です。
- 二次抗体溶液を取り出し、廃棄します。PBS-Tweenで胚を2回すすぎ、PBS-Tweenで15分間4回洗浄します。
- この時点で、胚は暗所で4°Cで保存できますが、サンプルはできるだけ早く(<24時間)処理できます。
3. PDMSウェルの準備
注:PDMSウェルは、最大2週間前に作成できます。
- インキュベーターまたはホットプレートを55°Cに設定し、円錐形のチューブを回転できる遠心分離機を15°Cに設定します。
- PDMS溶液(表1)を調製するには、50 mLのコニカルチューブをスケールの二次容器に入れ、シリンジを使用してチューブに10 gのシリコーンエラストマーベースを添加します。次に、シリコーンエラストマー硬化剤1gを加え、チューブを数回反転させて混合します。
- 2本目の50 mLコニカルチューブに適量の水を加えてバランスチューブを作成します。PDMS溶液を500 x g で15°Cで3分間遠心分離し、10cmのシャーレに~1mmの深さまで注ぎます。必要に応じて、エアホースで溶液に軽く息を吹きかけて気泡を取り除きます。PDMS溶液を55°Cで一晩固化させます。
- PDMSスラブが固まったら、メスを使用して、22 mm x 22 mmのカバーガラスよりもわずかに小さい正方形の領域にスコアを付けます。各正方形の内側に、~8mm幅の正方形のウェルに切り込みを入れて取り除きます。
- 各正方形のPDMSを22 mm x 22 mmのカバーガラスによく移し、しっかりと接着します(図2D)。6枚以上のカバーガラスを準備すると、画像化できる拡張胚が多数得られるはずです。
4.カバーガラスに胚を接着する
- 各ウェル内のカバーガラス表面を覆うのに十分な量の0.1%ポリ-L-リジン(~50 μL)を塗布し、55°Cのインキュベーターに入れて自然乾燥します。この手順を繰り返して、接着性を高めます。
- 1x PBSで胚を1回簡単にすすぎ、Tween界面活性剤を除去し、>10個の胚をポリ-L-リジンでコーティングされた各ウェルに移します。
- 胚が井戸の底に落ち着くのを待ちます。付着した胚からパスツールピペットを使用して余分な液体を取り除きます。すぐに次のステップに進みます。
5.活性化とゲル化
注:活性化とは、胚にMA-NHSを添加することを指し、サンプルタンパク質と抗体を修飾してハイドロゲルに結合できるようにします。ゲル化とは、各ウェルの胚内およびその周辺にヒドロゲルを生成することを指します。ゲル化中、胚はモノマー溶液で浸透され、次いでゲル化溶液で処理されてヒドロゲルを形成します。
- ウェルに活性化溶液(1x PBSで新たに希釈した1 mM MA-NHS; 表1)。この溶液を約10分ごとに1時間にわたって交換します。
- 胚を1x PBSで3回すすぎます。胚をモノマー溶液(表1)中で4°Cで45分間インキュベートします。
- 胚がモノマー溶液中にある間に、ゲル化溶液を調製します(表1)。~2 mLのゲル化溶液を調製するだけで、10 cmのシャーレ全体からPDMSウェルを覆うのに十分です。APSは重合を開始してゲル化を開始するため、必ず最後に追加してください。
- 触媒酸化剤を粉末から新たに希釈します(例:1% TEMPO w/vを水に溶かします)。1,960 μL のモノマー溶液を 30 μL の 10% TEMED および 10 μL の 1% TEMPO と組み合わせます。
- ゲル化溶液のバッチ全体を一度に重合させないように、小さなバッチで作業してください。ゲル化溶液(APSなし)を125 μLのアリコートに分割し、PCRストリップの8本のチューブに挟みます。
- 胚を破壊しないように注意しながら、真空を使用して3つのPDMSウェルからモノマー溶液を除去します。ゲル化溶液を入れたPCRチューブの1つにAPSを5 μL添加し、重合を開始します。重合ゲル化溶液をウェル(ウェルあたり~40 μL)に素早く分配します。すべてのウェルと胚が覆われるまでこれを繰り返します。
- サンプルを37°Cで1.5〜2.5時間ゲル化させます。 ハイドロゲルを頻繁に攪拌して、重合を監視します。凝固したハイドロゲルは小刻みに揺れません。厚いハイドロゲルは、重合が完了して固化するのに時間がかかります。
6.消化と膨張
注意: ゲルが厚くて大きいほど、膨張に時間がかかり、ゲルの中心が完全に膨張するまでに数時間かかる場合があります。これは、ゲルの端をトリミングすることでスピードアップできます。ゲルが膨張すると、屈折率は水とほぼ同じになり、非常に見づらくなります。
- ゲル化が完了したら、ハイドロゲルを乱さないようにしながら、PDMSウェルをカバーガラスから剥がします。必要に応じて、余分なハイドロゲル材料を切り取ります。
- ハイドロゲル(カバーガラスに付着したまま)を6ウェルプレートのウェルに個別に移します(図2E)。ヒドロゲルは消化中にわずかに膨張する可能性があることに注意してください。
- ゲルを消化バッファー(表1)で37°Cで1時間完全に覆います。 一般に、30 mL の消化バッファーは、6 ウェルプレートでゲルを覆うのに十分です。
- 消化後、各ハイドロゲルをカバーガラスからスライドさせて6cmのシャーレに個別に移します。ゲルを剥がすために、2枚目のカバーガラスを使用する必要があるかもしれません。各ペトリ皿に脱イオン水を入れてゲルを膨張させます。ゲルが完全に膨張するまで、1〜2時間の間に水を3〜4回交換します(幅が約4倍に増加すると予想されます)。
7. 実装とイメージング
注:膨張したハイドロゲルは、ほぼ完全に水で構成されているため、ほぼ透明で非常に壊れやすいです。ゲルは、長いカバーガラスを使用して操作し、ゲルを動かしたり拾ったりすることができます。一度に1つまたは2つのゲルのみをマウントしてイメージングすると、ゲルは徐々に水を放出し、カバーガラスの周りを滑り始めます。
- パスツールピペットを使用して、ペトリ皿から余分な水分をできるだけ取り除き、取り扱い時にゲルが動き回るのを最小限に抑えます。
- 胚を底面に置いて、各膨張ゲルを大きなカバーガラス(例:24 mm x 40 mm)に操作してイメージングします。
- 各カバーガラスをゲルで倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡の対物レンズに取り付けます。低倍率(5倍または10倍)または中倍率(20倍)の空気対物レンズを備えた顕微鏡の落射蛍光または明視野顕微鏡モードを使用して、適切にステージングおよび配向された標本を見つけます。
- 高解像度で画像化するには、高倍率(60倍、63倍、または100倍)の油浸対物レンズまたは水浸対物レンズに切り替えます。画像化するには、胚の表面が対物レンズの焦点範囲(63倍対物レンズの場合はカバーガラスから<300 μm)内にある必要があります。
- 顕微鏡のレーザー走査型共焦点モードを使用してサンプルからデータを収集します。良好なダイナミックレンジを有する非飽和画像を収集し、サンプル23に関する可能な限り最大の情報を捕捉するために、画像当たりの適切な画素数を使用するようにする。
図2:手作業による失性化とハイドロゲルの操作 。 (A)寒天/果汁プレートから寒天スラブを切り取ります。(B)6cmのシャーレの蓋の内側に両面テープを貼る。(C)テープで留められた蓋に胚を接着する。(D)22 mm x 22 mmのカバーガラスに正方形のウェルを接着したPDMSスラブ。(E)6ウェルプレート内にPDMSウェルを装着したカバーガラス。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Representative Results
ショウジョウバエの胚全体におけるExMの一般的な有効性を特徴付けるために、頭から尾までの軸に沿った胚の長さを、非増殖対照胚と増殖胚で測定しました(図3A-C)。未増殖対照胚は、イメージング前に固化封入培地を用いてマウントした以外は、増殖胚と同じ固定条件および免疫蛍光標識ステップに供した。個々の未増殖胚は、10倍の対物レンズを使用した場合、視野の約半分に及びました(図3A)。対照的に、増殖した胚は、同じ10倍の対物レンズを使用した場合、約2つの全視野に及びました(図3B)。実験内および実験間で増殖の程度がどのように変化するかを評価するために、同じExMプロトコルを3回に分けて実施し、個々の実験内で3つの異なるゲルで胚の長さを測定しました。未増殖対照胚の平均頭から尾までの長さは398.8μmであった(標準偏差[SD] = 22.93 μm;n = 74;図3C)。実験1、実験2、実験3の平均胚長は、それぞれ1,596 μm(SD = 159.9 μm;n=57)、1,868 μm(SD = 150.5 μm;n=51)、1,954 μm(SD = 120.3 μm;n=44)であり、それぞれ4.0倍、4.7倍、4.9倍の膨張率を示しました(図3C)。ゲル間の実験内変動は、実験間変動(約20%)よりもはるかに目立たなかった(図3C)。細胞および胚の形態に対するExMの影響を評価するために、接着結合成分Par-3(Bazooka)21に対する抗体を使用して頂端細胞膜を標識し、ステージ11のショウジョウバエ胚(複雑なセグメント構造を持つステージ)の発育中の口セグメントを画像化しました(図3D-F)。対照試料において、上顎セグメントの細胞の平均幅は4.76μmであった(SD = 1.053 μm、n = 25;図3D、F)。同じ40倍対物レンズとズーム倍率(1倍)を使用してイメージングされた拡大サンプルでは、上顎セグメントの細胞の平均幅は19.10 μmでした(SD = 3.966 μm、n = 18;図3E,F)は、4.0倍の拡大を表しています。したがって、以前のレポート11と一致して、ExMを使用して、サンプルの引き裂きや細胞または組織の形態の明らかな歪みなしに、ホールマウントのショウジョウバエ胚を直線寸法で約4倍に拡大することができました。
図3:ショウ ジョウバエ 胚の4 倍拡大。 (A)非増殖および(B)拡大ショウ ジョウバエ 胚は、1倍ズームで10倍対物レンズ(0.3 NA)を使用して画像化されました。個々の視野 (FOV) は破線で示されます。胚はGFPタグ付きミオシン軽鎖を発現し、抗GFP抗体で染色した。(C)実験ごとに3つのハイドロゲルで、3つの別々のExM実験から、未増殖対照と比較した胚の長さ(頭から尾の軸に沿った)の定量化。(D、E)(D)非拡張および(E)拡大ステージ11の ショウジョウバエ 胚の上顎セグメントを、1倍ズームで40倍対物レンズ(1.3 NA)を使用して画像化しました。細胞の輪郭(接着接合部)は、抗Par-3/Bazooka抗体(白色)で検出しました。(F) (D) と (E) の同等のセル群からのセル幅 (長軸) の定量化。(C)と(F)の箱ひげ図は、25、50、75パーセンタイルの範囲を示しています。ひげは最小値と最大値を示します。「+」記号は平均を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
ExMを使用して典型的な回折限界を下回る細胞内の詳細を解析できることを実証するために、アクトミオシン細胞骨格を非拡張対照と収斂伸長(ステージ7)を受けた増殖胚でイメージングしました。原腸形成および収束伸展の組織リモデリング事象は、主にモータータンパク質ミオシンII24の局在の変化によって制御される。しかし、ショウ ジョウバエ 前期の外胚葉の密集した円柱状上皮では、レーザー走査型共焦点顕微鏡の典型的な最大解像力である158倍の倍率(2.5倍の光学ズームで63倍の対物レンズ)で画像化しても、ミオシンIIの局在パターンの多くの細部を観察することは困難です。例えば、ミオシンIIは皮質タンパク質(原形質膜の真下に位置する)であるため、細胞間接触の両側に位置するミオシンII25 のプールは、ステージ7の胚では分解できず、隣接する細胞が出会う単一の線として現れました(図4A)。対照的に、拡大したステージ7の胚では、ミオシンIIの平行線が細胞間接合部に観察され、隣接する細胞の皮質タンパク質プールを表しています(図4B)。拡大試料中の平行ミオシンII系統間の距離は892.7 nm(SD = 0.171 nm、n = 12)であった。これを4で割ると、未増殖胚の隣接細胞のミオシン株間の予測距離は~220 nmとなり、Alexa 488で検出されたシグナルの回折限界(~520 nm/2 = 260 nmのピーク発光)をわずかに下回っています。
さらに、ショウジョウバエの胚(ステージ6)の高密度細胞におけるミトコンドリアネットワーク構造の解明にExMを使用できるかどうかも検証しました。ミトコンドリアの機能はネットワーク構造と密接に関連しています(つまり、融合した細胞小器官と断片化された細胞小器官)が、ミトコンドリアネットワーク構成の詳細を従来の共焦点顕微鏡で可視化することは困難でした。ミトコンドリアはビオチン化分子を自然に豊富に含んでいるため、ミトコンドリアはショウジョウバエの初期胚において、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて標識することができる26。ストレプトアビジン-Alexa 488で標識された未増殖期の6期胚では、シグナルは細胞質点として現れ、しばしば重なり合って解決が困難でした(図4C)。対照的に、拡大した第6期の胚では、ミトコンドリアネットワークのより細かい詳細が見え、プンクタはより簡単に解決可能になりました(図4D)26,27。これらの結果は、ExMが従来ミトコンドリア解析に適していなかった細胞種のミトコンドリアネットワーク構成の研究に使用できることを示しています。
図4:拡大顕微鏡で明らかになったアクトミオシン細胞骨格とミトコンドリアの詳細。 (A,B)ステージ7の2.5倍ズームで63倍対物レンズ(1.4 NA)でイメージングした神経外胚葉(生殖細胞)細胞におけるミオシンII局在(A)非拡大胚と(B)拡張胚。ミオシンIIは、ミオシンII調節軽鎖(sqh-GFP)のトランスジェニックGFPタグ付きバージョンを発現する胚で検出され、抗GFP抗体(赤)で検出されました。隣接する細胞にある皮質ミオシンの明確なプールは、拡張された胚(白い矢印)で解決できます。(C、D)神経外胚葉細胞のミトコンドリアネットワークを、ステージ6の未拡張(C)および拡張(D)胚で2.5倍ズームで63×対物レンズ(1.4 NA)でイメージングしました。ミトコンドリアはストレプトアビジン-Alexa 488(緑色)で検出し、細胞の輪郭は抗Par-3/バズーカ抗体(マゼンタ)で検出しました。実験はレーザー走査型共焦点顕微鏡で行われました。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:溶液レシピ。 このプロトコルで使用される溶液の組成を出現順に示します。特に断りのない限り、すべての株式は液体です。化学物質は、特に断りのない限り、オートクレーブ滅菌したろ過水で再懸濁または希釈しました。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
手動デビテリン化
ほとんどの ショウジョウバエ の胚の固定のプロトコルは浸透圧の破裂によって破裂させるメタノールおよびヘプタンの乳剤の固定胚の振とう によって vitellineの膜を取除くことを含む26。メタノールベースのデビテリン化(メタノールポッピング)は多くの用途に効果的で適切ですが、手動のデビテリン化(ハンドピーリング)にはいくつかの大きな利点があります。まず、手作業で皮をむくことで、正確にステージングされた胚を選択してデビテリン化して採取することができ、実験の最後に使用可能な向きで増殖した胚を得る可能性が大幅に高まります。この濃縮は、急速な発生過程(例えば、中胚葉の陥入や収斂伸長)の特定の側面を研究する場合に重要であり、適切にステージングされた胚は、タイトなタイミングの収集期間内であっても、すべての胚の数パーセントしか占めない可能性があります。もちろん、多くの用途では、時限収集ウィンドウから胚をバルクメタノールでポップするだけで十分であり、手作業で皮をむくことは余分な労力に見合わない場合があります。第二に、特定の一次抗体および色素の結合は、サンプルのメタノールへの以前の曝露によって悪影響を受けます。このため、ハンドピーリングは、メタノールポップサンプルと比較して免疫蛍光シグナル品質を大幅に向上させることができ、ショウ ジョウバエ の発生生物学者にとって有用な一般的な手法となっています。
ショウジョウバエの胚全体拡大における高分解能共焦点顕微鏡
膨張した試料で高分解能共焦点顕微鏡を行うことは、概念的には非拡大試料で行うのと同じですが、ExMにはいくつかの技術的なハードルがあります。特に、高倍率、高NA対物レンズはカバーガラス27に非常に近いサンプル領域からのみ光を集束させることができるため、サンプルサイズが大きくなるにつれて、ランダムである胚の配向がさらに重要になります。したがって、通常、ゲルが形成されたときにカバーガラスに隣接して終わった胚の表面または表面近くの細胞に焦点を合わせることしかできません。最後に正しい向きの標本があることを確認する最善の方法は、固定胚の厳密な段階的コレクションからExMプロトコルを開始し(例:手剥離を使用)、各ウェルに多くの胚を播種することです(>10)。胚の内部の深部にある細胞を可視化するには、ライトシート顕微鏡28のような、より特殊なイメージング装置を利用する必要があるかもしれない。さらに、共焦点ピンホールをエアリーユニット1台分よりも大きいサイズに開くことで画質を向上させることができることがわかりました。もちろん、ピンホールサイズを大きくすると、最大分解能が低下しますが、実際には、ピンホールサイズをわずかに増やすだけでも信号強度を大幅に向上させることができます(データは示されていません)。今後の研究では、ExMサンプルのピンホールサイズと効果的な分解能を体系的に取り上げる必要があります。
基本的なExMのバリエーション
ここで説明するプロトコルは、ExMの比較的単純な例であり、多くのアプリケーションで機能し、ほとんどの発生生物学ラボで簡単に実装できるはずです。しかし、ExM 4,5,7の基本概念には多くのバリエーションがあり、シグナル強度を高めたり、さらなる膨張度を達成したり、タンパク質だけでなく核酸分子を検出したりするために使用できます。このプロトコルでは、胚はゲル化および拡張の前に抗体とインキュベートされます。あるいは、サンプルを増殖させた後に抗体で処理することもでき6,30、これはエピトープへのアクセス性を高め、増殖ステップ中に結合した抗体の損失を減らすことでシグナル強度を高めることができる。さらに、特定の架橋剤分子を使用してRNA分子をヒドロゲルに結合させ、ハイブリダイゼーション連鎖反応方法30を使用して膨張ゲル中のRNAの検出を可能にすることができる。最後に、反復拡大顕微鏡法(iExM)31、汎ExM32、拡大露析(ExR)31のように、サンプルを複数回拡大することで、さらに高い分解能向上を達成することができます。
Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
モルモット抗Par-3一次抗体を提供してくださったJennifer Zallen博士に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)のメンバーの1つである国立総合医学研究所(NIGMS)と、共焦点顕微鏡の購入に一部資金を提供してくれたアーカンソー生物科学研究所(ABI)からの寛大な資金(1R15GM143729-01および1P20GM139768-01 5743)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acrylamide | Milipore Sigma | 1490-100ML | |
| ammonium persulfate | VWR | BDH9214-500G | |
| anti-GFP rabbit polyclonal antibody | Torrey Pines BioLabs | TP-401 | |
| anti-guinea pig IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11075 | |
| anti-rabbit IgG goat polyclonal antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| bisacrylamide | Research Products International | A11275 | |
| bovine serum albumin (30% solution) | Millipore Sigma | A7284 | |
| conical tubes, 50 mL | fisherscientific | 21008-940 | |
| coverlip glass, square 22 mm | VWR | 48366-227 | |
| coverslip glass, rectangular 40 mm x 24 mm | VWR | 48393-230 | |
| glass capillaries for pulling needles | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| glass microinjection needles (pre-pulled) | World Precision Instruments | TIP10LT | |
| guanidine HCl | VWR | 101970-606 | |
| heptane | VWR | EM-HX0078-1 | |
| latex pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| methylacylic acid N-hydroxysuccinimidyl ester | VWR | 730300-1G | |
| microfuge tube, 1.5 mL | VWR | 20170-038 | |
| multi-well plate, 6-well | Genesee | 25-100 | |
| paraformaldehyde (16%, EM-grade, methanol-free) | Electron Microscopy Sciences | 509804487 (Fisher) | |
| Pasteur pipet (2 mL, short tip) | VWR | 14673-010 | |
| PDMS kit (Sylgard 184 Kit, base and curing agent) | VWR | 102092-312 | |
| Petri plates | Genesee | 32-107 | |
| phosphate-buffered saline (10x solution) | VWR | 97063-660 | |
| Poly-L-lysine solution (0.1% solution) | VWR | P8920-1ooML | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | E00491 | |
| scintillation vials (30 mL) | VWR | 66022-128 | |
| sodium acrylate | VWR | 101181-226 | |
| sodium azide (powder) | Millipore Sigma | 71289 | make a 1% w/v working stock; acute POISON at this concentration! |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | S32354 | |
| TAE (50x) | VWR | 97063-692 | |
| tape (double-sided, 1 inch wide) | Scotch 3M | 665 Scotch double sided 1inch/1296 inches Boxed | |
| TEMED | Thermo Fisher Scientific | PI17919 | |
| TEMPO | VWR | EM8.14681.0005 | catalytic oxidant |
| Tween-20 | VWR | 97063-872 | extremely viscous when pure; make a 10% working stock with water |
| Zeiss LSM 900 | Zeiss | Laser scanning microscope used without AiryScan |
References
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