Summary
이 기사에서는 미세유체 장치를 사용한 고처리량 젤라틴 메타크릴로일 마이크로겔 제조, 마이크로젤을 부유 가능한 분말(마이크로 에어로젤)로 변환, 마이크로겔의 화학적 조립을 위한 입상 하이드로겔 스캐폴드, 3D 바이오프린팅을 위한 미세 다공성이 보존된 입상 하이드로겔 바이오잉크 개발에 대해 설명합니다.
Abstract
하이드로겔 미세입자(HMP) 조립을 통해 제작된 입상 하이드로겔 스캐폴드(GHS)의 출현으로 현장에서 미세 다공성 스캐폴드 형성 이 가능해졌습니다. 기존의 벌크 하이드로겔과 달리 GHS의 상호 연결된 마이크로 스케일 기공은 분해와 무관한 세포 침투와 산소, 영양소 및 세포 부산물 전달을 촉진합니다. 메타크릴로일 변성 젤라틴(GelMA)은 세포 접착성 및 생분해성 부분을 포함하는 (광)화학적으로 가교 가능한 단백질 기반 생체 고분자로 세포 반응성/지시성 생체 재료로 널리 사용되었습니다. 벌크 GelMA를 GHS로 전환하면 조직 공학 및 재생을 위한 많은 기회가 열릴 수 있습니다. 이 기사에서는 고처리량 GelMA 마이크로겔 제조, 재현탁 가능한 건조 마이크로겔(마이크로 에어로젤)로의 전환, 마이크로젤의 화학적 조립을 통한 GHS 형성 및 압출 바이오프린팅을 위한 과립형 바이오잉크 제조 절차를 보여줍니다. 냉각 및 광가교를 통한 순차적인 물리화학적 처리가 기계적으로 견고한 GHS를 형성하는 방법을 보여줍니다. 빛에 접근할 수 없는 경우(예: 심부 조직 주입 중), 개별적으로 가교된 GelMA HMP는 트랜스글루타미나제를 사용한 효소 가교를 통해 생체직교적으로 조립될 수 있습니다. 마지막으로, 낮은 HMP 패킹 밀도에서 미세 다공성 GHS의 3차원(3D) 바이오프린팅은 이질적으로 하전된 나노입자의 계면 자가 조립을 통해 입증됩니다.
Introduction
조직 공학 스캐폴드를 형성하기 위해 HMP 빌딩 블록을 조립하는 것은지난 몇 년 동안 엄청난 주목을 받았습니다1. HMP 어셈블리를 통해 제작된 GHS는 개별 빌딩 블록 사이의 빈 공간에서 발생하는 셀 규모의 미세 다공성을 포함하여 벌크 대응 제품에 비해 고유한 특성을 가지고 있습니다. 주입성, 모듈성, 다공성에서 분리된 강성과 같은 추가 특성으로 인해 GHS는 조직 복구 및 재생을 향상시키는 유망한 플랫폼이 되었습니다2. 합성 PEG 기반 폴리머3,4 및 알 지네이트5 및 히알루론산 6,7과 같은 다당류를 포함하여 다양한 생체 재료가 GHS 제조에 사용되었습니다. 천연 유래 고분자 중에서 GHS 제조를 위한 가장 일반적인 단백질 기반 생체 고분자는 가교성, 생체적합성, 생체접착성 및 생분해성 생체재료인 GelMA 8,9,10,11 입니다12,13.
HMP는 배치 유화(batch emulsification)(8), 유동-포커싱(flow-focusing)(14, 15) 또는 스텝-유화(step-emulsification)(9,11) 미세유체 장치, 블렌딩(blending)(16), 또는 복합 코아세르베이션(complex coacervation)(17, 18)을 통해 제조될 수 있다. 일반적으로 제조 처리량과 HMP 단분산성 사이에는 절충점이 있습니다. 예를 들어, 블렌딩 기술은 불규칙한 모양의 고도로 분산된 HMP를 생성합니다. 배치 유화 또는 복합 코아세르베이션을 통해 대량의 다분산 구형 HMP를 생산할 수 있습니다. 유동 집속 미세유체 장치는 <5%의 변동 계수를 갖는 고도로 단분산된 액적을 제조하는 데 사용되었지만 처리량은 상당히 낮습니다. 스텝-유화 미세유체 장치에서, 고도로 병렬화된 스텝들은 단분산HMPs(19)의 고-처리량 제조를 가능하게 한다.
메타크릴로일 변성 젤라틴(GelMA) HMP 빌딩 블록은 열에 반응하고 (광)화학적으로 가교 결합이 가능하여 GHS 제조가 용이합니다20. 상부 임계 용액 온도(UCST)21 이하로 냉각되면(예: 4°C에서) GelMA 용액을 포함하는 액적이 물리적으로 가교된 HMP로 전환됩니다. 그런 다음 이러한 HMP 빌딩 블록은 걸린 마이크로겔 현탁액을 생성하기 위해 외부 힘(예: 원심분리를 통해)을 사용하여 패킹됩니다. (광)화학적 가교를 통해 인접한 HMP 사이에 입자 간 결합이 형성되어 기계적으로 견고한 GHS14를 형성합니다. GHS의 가장 중요한 특성 중 하나는 미세 다공성으로, 시험관 내 세포 침투를 용이하게 하고(11) 생체 내에서 조직 내 성장을 강화합니다(22). HMP의 3차원(3D) 바이오프린팅은 통상적으로 밀집된 마이크로겔 현탁액을 사용하여 수행되며, 미세 다공성을 손상시킨다23.
우리는 최근 이질적으로 하전된 나노 입자의 흡착을 통해 GelMA 마이크로 젤의 계면 나노 엔지니어링을 기반으로 한 새로운 종류의 과립 바이오 잉크를 개발 한 후 나노 입자 가역적 자기 조립을 개발했습니다. 이 전략은 느슨하게 포장된 마이크로젤을 전단 항복 및 압출 3D 바이오프린팅이 가능하게 하여 적층 제조된 GHS11의 미세 다공성을 보존합니다. 이 기사에서는 고처리량 GelMA 액적 제조 방법, 이러한 액적을 물리적으로 가교된 HMP로 변환, 재현탁 가능한 분말을 사용하여 GelMA HMP 제조, GelMA GHS 형성, GelMA 나노 공학 과립 바이오잉크(NGB) 준비 및 3D 바이오프린팅을 제공합니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. GelMA 합성
알림: GelMA 합성은 화학 흄 후드에서 수행해야 하며 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다.
- 200mL의 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS, 1x)을 삼각 플라스크에 넣고 용액을 50°C에 도달할 때까지 가열합니다. 증발을 방지하기 위해 플라스크를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
- 젤라틴 분말 20g을 DPBS 용액에 50°C에서 첨가하면서 분말이 완전히 용해될 때까지 240rpm으로 교반합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 통해 젤라틴 용액에 16, 2.5 또는 0.5mL의 메타크릴릴 무수물(MA)을 적가하여 각각 높은, 중간 또는 낮은 수준의 메타크릴로일 치환도를 갖는 GelMA를 합성합니다.
주의 : MA는 유해 물질입니다. MA로 작업할 때는 적절한 PPE를 사용해야 합니다. MA는 또한 빛에 민감하므로 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 반응을 보호하십시오. - 2시간 후, 50°C에서 DPBS 400mL를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 50°C에서 10분 동안 계속 교반합니다.
- 분자량 컷오프가 12-14kDa인 투석막 튜브에 용액을 붓고 40°C 초순수로 채워진 5L 비커에 튜브를 넣습니다. 물을 240rpm 및 40°C에서 저어줍니다.
- 용액을 초순수에 대해 10일 동안 투석하고 하루에 2번 물을 바꿔 미반응 메타크릴레이트 무수물, 부산물 및 기타 불순물을 제거합니다.
- 10일 후, 40°C에서 초순수 400mL를 GelMA 용액에 첨가한다. 용액을 240rpm에서 15분 동안 저어줍니다.
- 커피 필터를 사용하여 용액을 두 번 여과한 다음 0.2μm 진공 여과 장치를 통해 진공 여과합니다.
- 여과된 용액 25mL를 50mL 원심분리기 튜브에 붓고 -80°C에서 동결하여 튜브를 수평으로 놓습니다.
- 2 일 후 캡을 제거하고 원심 분리기 튜브를 실험실 물티슈로 덮습니다. 테이프나 고무줄을 사용하여 물티슈를 단단히 잡으십시오.
- 동결된 GelMA 용액을 동결건조하여 백색 고체 GelMA를 생성한다.
- 양성자 핵자기 공명(1HNMR) 분광법을 수행하기 위해, 별도로 30mg의 젤라틴 분말(대조군) 또는 동결건조된 GelMA를 1mL의 산화중수소(D2O)에 첨가하고 젤라틴 분말 또는 GelMA가 완전히 용해될 때까지 샘플을 37°C로 유지한다.
- 1HNMR 스펙트럼을 얻고 각각 ~6.5-7.5 및 ~3.0ppm의 화학적 이동에서 방향족 산 및 라이신 메틸렌 양성자 피크를 통합하여 메타크릴로일 치환 정도를 결정합니다. 방향족 산 피크를 기준으로 사용하고 방정식 (1)에 따라 라이신 메틸렌 피크를 사용하여 치환도(DS)를 결정합니다.
DS (%) = [1 - (GelMA 내 라이신 메틸렌 면적 / 젤라틴 내 라이신 메틸렌 면적)] × 100 (1)
그림 1: GelMA 합성 및 특성 분석. (A) GelMA 합성 반응. 젤라틴은 50°C에서 2시간 동안 메타크릴산 무수물로 변형된다. (b) 젤라틴 및 GelMA의 양성자 핵자기 공명(1HNMR) 스펙트럼: (a) 보정을 위한 기준으로 선택되는 방향족산에 대한 피크, (b) 젤라틴의 MA 변형 후의 비닐 작용기 피크, 및 (c) 라이신 단백질에 대한 피크. 이 예에서, MA 치환도는 71% ± 3%(n=3)였다. 이 수치는 Ataie et al.11 의 허가를 받아 수정되었습니다. 약어: GelMA = 젤라틴 메타크릴로일; DPBS = 둘베코 인산염 완충 식염수; MA = 메타크릴로일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 고처리량 GelMA 마이크로겔 제조
- 장치 마스터 금형 미세 가공
참고: 마스터 몰드는 KMPR 1000 네거티브 포토레지스트 시리즈19를 사용하여 소프트 리소그래피를 통해 미세 가공할 수 있습니다.- KMPR 1025 및 1035를 밤새 해동합니다. 빛의 노출을 피하십시오.
- 웨이퍼의 첫 번째 층을 코팅하려면 KMPR 1025를 웨이퍼 중앙에 직접 추가하여 약 5cm 원의 포토레지스트를 만듭니다. 스핀 코터를 3,000rpm에서 30초 동안 실행합니다.
- 100°C 핫플레이트에서 12분 동안 소프트 베이킹합니다. 그런 다음 냉각판에서 5분 동안 식힙니다.
- 첫 번째 레이어 마스크를 블랭크 소다 라임에 부착한 다음 645mJ/cm2 용량의 마스크 얼라이너를 사용하여 코팅된 웨이퍼를 UV 광에 노출시킵니다.
- 100°C 핫플레이트에서 3분 동안 굽습니다. 냉각판에서 5분 동안 식힙니다.
참고: 이 단계 후에 개발하지 마십시오. 프로세스가 끝날 때 한 번만 개발하십시오. - KMPR 1035를 사용하여 웨이퍼 상의 제2 층을 스핀 코팅한다. 스핀 코터를 1,000rpm에서 30초 동안 실행합니다.
- 100°C 핫플레이트에서 30분 동안 소프트 베이킹합니다. 냉각판에서 5분 동안 식힙니다.
- 두 번째 레이어 마스크를 블랭크 소다 라임에 부착하고 표준 정렬 기호를 통해 얼라이너를 사용하여 두 번째 마스크를 정렬합니다. 마스크 얼라이너를 사용하여 최대 2,000mJ/cm2의 자외선에 노출시킵니다.
- 100°C 핫플레이트에서 5분 동안 굽습니다.
- SU-8 개발자에서 >6분 동안 개발합니다.
참고: 웨이퍼가 유백색으로 보이면 현상을 더 오래 계속해야 합니다. 더 나은 결과를 위해 매번 그리고 그 사이에 새로운 개발자를 사용하십시오. - 이소프로판올로 스프레이하십시오. 웨이퍼가 유백색 잔류물 없이 깨끗한지 확인하십시오. 질소(N2) 가스를 사용하여 웨이퍼를 완전히 건조시킵니다.
- 미세 유체 장치 제작
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 베이스 부품 50g을 투명 플라스틱 컵에 붓습니다. 그런 다음 플라스틱 컵에 가교제 5g을 추가합니다. 크림 같은 질감이 될 때까지 주걱을 사용하여 베이스와 가교제를 세게 섞습니다.
- 혼합물이 투명해질 때까지 20분 동안 데시케이터를 사용하여 혼합물의 가스를 진공 탈기합니다. 혼합물을 마스터 몰드에 붓고 내부에 놓고 페트리 접시에 테이프로 붙입니다.
알림: 주입된 PDMS의 두께(높이)가 ≤8mm인지 확인하십시오. - 페트리 접시를 데시케이터에 넣고 모든 기포가 제거될 때까지 PDMS 혼합물을 다시 20분 동안 진공 탈기합니다. PDMS가 가교될 때까지 페트리 접시를 70°C 오븐에 2시간 동안 넣습니다. 페트리 접시를 오븐에서 꺼내 식히십시오.
- 메스를 사용하여 장치를 금형에서 잘라냅니다. 마스터 몰드에서 장치를 천천히 분리합니다. 생검 펀치(직경 1.5mm)를 사용하여 입구와 배출구를 통해 구멍을 자릅니다.
- 마스킹 테이프를 사용하여 PDMS 장치 및 유리 슬라이드에서 먼지를 제거하고 유리 슬라이드 및 장치를 플라즈마 클리너 챔버에 넣습니다. 400mTorr 미만의 기압으로 45초(챔버가 보라색으로 변할 때부터 시작) 동안 플라즈마 처리를 수행합니다. 챔버에서 슬라이드와 장치를 제거하고 장치를 유리 슬라이드에 놓고 약간의 압력을 가하십시오. 장치를 70°C 오븐에 30분 동안 넣어 접착력을 높입니다.
- 엔지니어링 유체에 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란(F-실란, 2% v/v)을 채워 채널 표면을 형광성으로 만듭니다. 배출구를 통해 F-실란 용액을 주입하고 모든 장치가 노출되었는지 확인합니다. 5-10분 동안 기다립니다.
참고: F-실란은 신선하게 준비해야 합니다. 또한 F-실란은 장시간 공기에 노출되어서는 안 됩니다. - 수용액 입구를 통해 장치에서 F-실란 용액을 흡인합니다. 엔지니어링 유체를 사용하여 장치를 두 번 세척하고 다시 흡인하십시오. 장치를 70°C 오븐에 30분 동안 넣어 남은 오일을 증발시킵니다.
- 액적 형성 및 GelMA 마이크로겔 제작
- 10mg의 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)를 10mL의 DPBS에 첨가하여 광개시제(PI) 용액(0.1% w/v)을 제조합니다. 용액을 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오.
- 원하는 양의 GelMA를 PI 용액에 녹이고 맑은 용액이 얻어질 때까지 37°C 오븐에 1시간 동안 두십시오. 알루미늄 호일로 싸서 용액을 빛으로부터 보호하십시오.
- 유상을 준비하려면 엔지니어링 유체에 2% v/v의 생체적합성 계면활성제 용액을 만듭니다.
- Tygon 튜브를 PDMS 장치의 입구와 출구에 삽입합니다. 입구용 Tygon 튜브의 다른 쪽 끝에 25G 무딘 바늘을 삽입합니다. 가능한 최소 튜브 길이를 사용하십시오.
- 장치를 현미경 아래에 놓습니다. 헤어 드라이어 및/또는 스페이스 히터를 사용하여 환경을 따뜻하게 유지하십시오(~40 °C).
- 장치에 연결된 별도의 주사기에 수용액과 오일 용액을 넣습니다. 오일상(연속상) 및 수성상(분산상)에 대해 각각 160 및 80 μL/min의 유속으로 주사기 펌프를 시작합니다.
알림: 먼저 오일 단계를 시작하십시오. 오일이 채널을 채우고 있는지 확인한 다음 수상을 시작하십시오. - 용기에 물방울을 수집하고 광학 현미경 이미징을 통해 이미징 챔버에서 평가합니다.
- 방울을 빛으로부터 보호하면서 밤새 4°C에 놓아 GelMA HMP 물리적 가교를 시작하고 4°C에서 방울을 안정적인 마이크로겔로 전환시킵니다.
3. 마이크로 엔지니어링 에멀젼 대 파우더 (MEtoP) 기술을 통해 마이크로 젤을 재현 가능한 분말로 변환
참고: 유성 에멀젼 기반 HMP를 재부유성, 모양, 크기 및 조립과 같은 특성이 보존된 미세 입자 분말(마이크로 에어로젤)로 변환하는 MEtoP 기술이 개발되었습니다.
- MEtoP를 구현하려면 내열성 마이크로 원심분리기 튜브 또는 극저온 유체를 사용하여 엔지니어링 유체에서 물리적으로 가교된 HMP를 수집합니다. 튜브 캡을 열고 실험실 물티슈와 테이프로 밀봉합니다.
- 물리적으로 가교된 HMP를 액체 질소(-196°C)에서 10분 동안 급속 냉동합니다.
- 급속 냉동 튜브를 동결 건조기 기기로 옮깁니다. 튜브를 저압(예: 0.06mbar)에서 최소 6시간 동안 동결건조하여 분말을 생성합니다.
참고: 동결건조 사이클이 완료되면 분말이 손실되지 않도록 천천히 압력을 해제합니다. - 분말에 냉각된 PI 용액(0.1% w/v, 4°C) 1mL를 첨가하여 마이크로겔 현탁액을 만듭니다. 5초 동안 소용돌이친 다음 3,000× g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
- 양변위 피펫을 사용하여 패킹된 마이크로겔 현탁액을 몰드에 옮긴 다음, 400nm 파장에서 15mW/cm2 의 강도로 60초 동안 UV 광 노출하여 GHS를 형성합니다.
그림 2: MEtoP 기술을 통한 GelMA 미세입자 분말 준비. (A) MEtoP 기술 또는 HMP의 기존 동결 건조로부터 얻어진 GelMA 분말의 이미지. MEtoP 기술 또는 기존의 동결 건조에서 HMP는 각각 오일 계면 활성제 또는 수성 매체에 현탁됩니다. 엔지니어링 유체는 분산상(HMP)을 응집으로부터 보호하고 동결건조 중에 GelMA 미세입자의 물리화학적 특성을 보존합니다. (B) 수성 매질에서 통상적으로 동결건조된 HMP와 비교하여 MEtoP를 통해 제조된 건조된 HMP의 개략도. (C) MEtoP를 통해 제조된 건조된 GelMA 미세입자의 SEM 이미지를 기존의 동결건조와 비교한 결과. 스케일 바 = 2 mm (왼쪽; A), 500 μm(우측; A), 10 μm(좌측; C) 및 200 μm(우측; 이 수치는 Sheikhi et al.26의 허가를 받아 수정되었습니다. 약어: GelMA = 젤라틴 메타크릴로일; DPBS = 둘베코 인산염 완충 식염수; MEtoP = 미세 공학 에멀젼-분말; HMP = 하이드로겔 미세입자; SEM = 주사 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. GelMA GHS 형성
참고: 이 프로토콜은 400μL의 마이크로겔 현탁액을 준비하기 위한 것입니다. 대량의 경우 스케일 업이 필요합니다. GelMA HMP를 물리적으로 가교 상태로 유지하려면 마이크로겔 용기를 얼음물 통에 넣어 약 4°C에서 모든 단계를 수행해야 합니다.
- 엔지니어링 유체(20% v/v)에 400μL의 1H,1H-퍼플루오로-1-옥탄올(PFO) 용액을 물리적으로 가교된 GelMA HMP에 추가합니다. 그런 다음 300 × g에서 5 초 동안 와류하고 15 초 동안 원심 분리합니다.
알림: 엔지니어링 유체의 PFO 용액은 증발을 방지하기 위해 신선하게 준비하고 밀폐된 용기에 보관해야 합니다. - 피펫팅을 통해 GelMA HMP에서 오일상을 제거합니다.
- 4°C에서 400μL의 PI 용액(0.1% w/v)을 마이크로겔 현탁액에 추가합니다. 그런 다음 5초 동안 소용돌이를 일으키고 300× g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 나중에 기름을 버리십시오.
- 이전 단계를 반복하되 3,000× g에서 원심분리합니다. 피펫팅을 통해 포장된 GelMA HMP의 상층액을 제거합니다.
- 포지티브 치환 파이펫을 사용하여 패킹된 GelMA HMP를 금형으로 옮긴 후 UV 광 노출(파장 = 400nm, 강도 = 15mW/cm2, 노출 시간 = 60초)을 수행합니다.
5. 미세 다공성이 보존된 GHS의 3D 바이오프린팅을 위한 나노 공학 과립형 바이오잉크(NGB)
- 나노 혈소판 분말 100mg을 4 °C 초순수 3mL에 첨가하여 나노 입자 분산액 (3.33 % w / v)을 형성한다. 분산액을 4°C 냉장고 내에서 15분 동안 격렬하게 소용돌이치게 하여 그렇지 않으면 응집된 나노입자를 각질 제거합니다. 적절하게 각질 제거 된 나노 입자는 명확한 분산을 생성합니다.
- 50 mg의 LAP를 4 °C 초순수 5 mL에 용해시켜 스톡 PI 용액 (1 % w / v)을 제조합니다.
- 박리된 나노입자 분산액에 333μL의 PI 용액(1% w/v)을 추가합니다. 주변광으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸십시오. 나노입자 분산액과 PI를 혼합하기 위해 1분 동안 와동시켰다. 최종 점토 및 PI 농도는 각각 3% w/v 및 0.1% w/v입니다.
- 엔지니어링 유체(4°C)에 PFO 20% v/v를 물리적으로 가교된 GelMA HMP에 1:1 부피비로 추가합니다. 5초 동안 완전히 소용돌이칩니다. 이어서, 300 × g 에서 15초 동안 원심분리하고, 계면활성제가 함유된 오일상을 버린다.
- LAP가 보충된 나노입자 분산액(4°C)을 세척된 GelMA HMPs에 첨가한다. 15초 동안 소용돌이치고, 3,000× g 에서 15초 동안 원심분리하고, 바닥에 남아 있는 오일과 상등액 분산액을 버린다.
- 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하면서 현탁액을 4°C에서 1일 동안 보관합니다. 이 단계의 산물은 GelMA NGB입니다.
- NGB를 3mL 주사기에 넣고 로드된 주사기를 캡과 파라필름으로 밀봉하고 200× g 에서 원심분리기를 펄스하여 갇힌 공기를 제거합니다. 암-암 Luer-Lok 커넥터를 사용하여 바이오잉크를 3mL 카트리지로 옮깁니다. 카트리지를 다시 200× g 에서 잠시 원심분리하여 갇힌 공기를 제거합니다. 사용하기 전에 NGB를 냉장고에 4 °C에 보관하십시오.
- 세포가 함유된 바이오잉크를 준비하기 전에 100μL의 세포 배양 배지에 ~2,400만 개의 세포를 포함하는 농축된 세포 현탁액(예: NIH/3T3 쥐 섬유아세포)을 준비합니다. 세포 현탁액을 3mL 주사기에 넣고 암-암 Luer-Lok 커넥터를 사용하여 NGB 로드 주사기와 세포 로드 주사기를 결합하고 앞뒤로 40배 밀어 세포와 NGB를 부드럽게 혼합합니다.
- 표준 원뿔형 노즐이 있는 적절한 바이오프린터를 사용하여 NGB 또는 셀 함유 NGB를 인쇄합니다. 노즐을 3mL 프린트 헤드에 로드합니다. 인쇄 베드 온도를 10 °C 미만으로 유지하십시오. 인쇄하기 전에 속도 및 배압 과 같은 인쇄 매개 변수를 최적화하십시오.
- 기판 및 노즐 유형(표준 원추형 노즐이 장착된 공압 3mL 주사기)을 선택하고, 장치 지침을 사용하여 바이오프린터를 보정하고, 원하는 gcode 또는 STL 파일을 선택하고, 인쇄를 시작합니다.
참고: 세포가 함유된 바이오프린팅을 수행할 때 모든 재료와 장치는 오염을 최소화하기 위해 생물학적 안전 캐비닛 아래에 유지되어야 합니다. - 인쇄 후, 광가교를 위해 구조물을 UV 광에 노출시킨다(파장 = 400nm, 강도 = 15mW/cm2, 노출 시간 = 60초).
그림 3: GelMA 마이크로겔 및 GHS 형성 개략도. (A) 오일 및 NGB 제제에서 GelMA 마이크로겔 분리의 개략도. PFO(엔지니어링 유체 중 20% v/v)를 GelMA 마이크로겔-오일 에멀젼에 1:1 부피비로 첨가한 후 300×g에서 15초 동안 볼텍싱 및 원심분리했습니다. GelMA GHS를 제작하기 위해 PI 용액(DPBS에서 LAP 0.1% w/v)을 GelMA HMP에 첨가한 후 3,000×g에서 15초 동안 볼텍싱 및 원심분리했습니다. NGB를 제조하기 위해, PI 용액 (초순수에서 LAP 0.1 % w / v) 및 나노 혈소판 분산 (초순수에서 3 % w / v)을 GelMA HMP 현탁액에 첨가 한 후, 15 초 동안 3,000 × g에서 볼텍싱 및 원심 분리를 수행하였다. 그림 3A는 Ataie, Z. et al.11 (B)의 허가를 받아 수정되었다. 패킹된 GelMA HMP를 빛에 노출시키면 GHS가 생성됩니다. 그림 3B는 Sheikhi et al.15의 허가를 받아 수정되었습니다. 약어: GelMA = 젤라틴 메타크릴로일; GHS = 과립형 하이드로겔 스캐폴드; NGB = 나노 공학 과립 바이오 잉크; PFO = 1H, 1H- 퍼플루오로 -1- 옥탄올; PI = 광개시제; LAP = 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트; HMP = 하이드로겔 미세입자; DPBS = 둘베코의 인산염 완충 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
GelMA는 그림 1A에 제시된 바와 같이 젤라틴과 MA의 반응을 통해 합성되었습니다. MA 농도와 같은 반응 조건을 조정함으로써, 상이한 MA 치환도가 얻어졌다. MA 치환 정도를 정량화하기 위해, GelMA를 1H NMR 분광법을 통해 평가하였다(도 1B). ~5-6 ppm의 화학적 이동에서 대표적인 피크를 갖는 비닐 작용기는 젤라틴으로부터 성공적인 GelMA 합성을 확인시켜 주었다. 투석 및 멸균 여과 후의 반응 수율은 >70%(GelMA mg/젤라틴 mg)였다. 액적/마이크로겔 제조 수율은 ~100%였다. 치환 정도를 정량화하기 위해 상이한 방법들이 사용될 수 있다24. 우리는 라이신 아미노산(1차 아민)의 감소를 평가했으며, 식(1)에 기초하여 영향을 받지 않는 방향족 산 양성자를 사용하여 정규화했습니다.
HMP는 일반적으로 DPBS 또는 세포 배양 배지와 같은 수성 배지에 현탁됩니다. HMP의 수화 상태는 멸균, 운송, 보관 및 장기 안정성에 몇 가지 문제를 야기할 수 있습니다. MEtoP는 HMP를 원래의 분자 및 콜로이드 특성에 영향을 미치지 않고 건조 분말로 전환하는 새로운 방법입니다25. MEtoP 기술은 저압 동결 건조를 통해 재현탁 가능한 건조 HMP(마이크로 에어로겔)를 생성하는 동시에 수성 매질이 아닌 휘발성 오일을 사용하여 HMP를 응집 및 심각한 변형으로부터 보호합니다(그림 2A). 이 기술을 사용하여 마이크로겔은 응집 없이 개별적으로 건조되어(그림 2B), 동결건조 후에도 구형 모양을 유지합니다(그림 2C). 이러한 미립자는 재수화 시 초기 특성을 쉽게 회복하여 조립 시 GHS를 형성할 준비가 된 HMP 현탁액을 생성합니다.
스텝 유화 미세유체 장치는 수성/유상 유속과 무관하게 고처리량 단분산 GelMA 액적을 생성합니다. GelMA는 온도에 민감한 생체 고분자이기 때문에 온도를 ~4°C로 낮추어 액적을 열가교 HMP로 전환합니다. 안정적인 HMP는 PFO(20% v/v)를 사용하여 오일과 계면활성제를 제거하기 위해 헹굴 수 있습니다. 오일/계면활성제 제거 후 GelMA HMP는 화학적 조립을 위해 PI와 혼합하거나 계면 자가 조립을 위해 나노 입자와 혼합할 수 있습니다(그림 3A). GHS 형성은 빛(파장 = 400nm, 강도 = 15mW/cm2, 노출 시간 = 60초) 매개 자유 라디칼 중합을 통해 시작되어 마이크로겔-마이크로겔 결합을 생성합니다(그림 3B).
미세 다공성은 GHS의 주요 특성 중 하나로, 산소 및 세포 폐기물 교환, 세포 침투, 이동 및 증식을 용이하게 합니다. 미세 다공성을 평가하기 위해 고분자량 형광 염료를 사용하여 HMP 사이의 빈 공간을 시각화합니다. 그림 4A 는 GHS 스캐폴드의 상단 및 3D 보기를 보여주며, 녹색 영역은 상호 연결된 미세 다공성을 보여줍니다. 그림 4B 는 기공 면적을 검출하기 위해 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 평가한 형광 이미지를 보여줍니다. 공극 분율(그림 4C)과 중간 공극 등가 직경(그림 4D) 측정은 GHS와 3D 프린팅된 NGB 스캐폴드 간에 큰 차이가 없음을 보여주며, 이는 NGB의 마이크로 스케일 기공의 가용성과 상호 연결성을 입증합니다.
그림 4: GelMA GHS 및 NGB의 기공 특성화. (A) GHS 및 NGB 스캐폴드의 상단 및 3D 직교 보기. 증분은 100μm입니다. (B) 광가교된 GelMA, GHS 및 NGB에 대해 사용자 지정 작성된 MATLAB 코드를 통한 공극 영역 및 기공 검출의 형광 이미지. 스케일 바 = 200 μm. (C) GelMA, GHS 및 NGB의 공극 분율. (D) GelMA, GHS 및 NGB의 중앙값 등가 기공 직경. 이 수치는 Ataie et al.11의 허가를 받아 수정되었습니다. 약어: GelMA = 젤라틴 메타크릴로일; GHS = 과립형 하이드로겔 스캐폴드; NGB = 나노 공학 과립 바이오 잉크; NS = 유의하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
NGB는 미세 다공성이 보존된 인쇄 가능한 HMP 현탁액으로 설계되었습니다. NGB의 압출성 및 인쇄성을 입증하기 위해 그림 5와 같이 압출 기반 3D 프린팅을 수행했습니다. PSU 문자는 NGB를 사용하여 인쇄한 다음 빛을 노출시켰습니다(그림 5A). 빽빽하게 포장되고 느슨하게 포장된 GelMA HMP에 대한 NGB의 우월성을 평가하기 위해, 행잉 필라멘트 길이(Lf)를 측정하였다(도 5B). NGB는 포장된 HMP에 비해 가장 높은Lf 값을 가졌다. 느슨하게 포장된 HMP는 필라멘트를 생성하지 못했습니다. 또한, 중공 실린더를 3D 프린팅하고, 전체 구조물을 광가교 결합(그림 5D) 및 물리적으로 고정(그림 5E)을 위해 빛에 노출시켜 광가교 GelMA NGB의 3D 프린팅 가능성과 형상 충실도를 각각 입증했습니다.
그림 5: 자외선 매개 광가교 후 NGB의 인쇄 가능성(파장 = 395-405nm, 강도 = 15mW/cm2, 노출 시간 = 60초). (A) 형광 라벨이 붙은 NGB를 사용하여 3D 프린팅되는 PSU 문자를 보여주는 인쇄 과정의 개략도. 스케일 바 = 3mm. (B) NGB, 단단히 포장된 GelMA HMP 및 느슨하게 포장된 GelMA HMP를 사용한 필라멘트 압출의 시각적 비교. 스케일 바 = 10mm. (C) NGB의 매달린 필라멘트 길이, 단단히 포장되고 느슨하게 포장된 과립형 하이드로겔. NGB는 밀집된 마이크로겔(Lf = 19.3 ± 0.7 mm, n = 10)보다 더 긴 매 달린 필라멘트(필라멘트 길이 Lf = 45.0 ± 5.0 mm, n = 10)를 형성합니다. 느슨하게 포장된 마이크로겔은 액적 크기(Lf = 5.7 ± 0.7mm, n = 10) 필라멘트를 생성합니다. (D) NGB는 직경 5mm, 높이 10mm의 중공 실린더의 3D 프린팅에 사용되었습니다. (E) 전체 구조물(d = 5 및 h = 10 mm인 중공 실린더)을 인쇄한 다음 UV 광에 노출시켰습니다. 레이어별 광가교는 형상 충실도를 높일 수 있지만 레이어가 함께 가교되지 않기 때문에 구조적 무결성을 감소시킵니다. 속이 빈 인쇄 실린더는 핀셋을 사용하여 고정되어 기계적 견고성을 보여주었습니다. 스케일 바 = 1cm. 이 수치는 Ataie et al.11 약어: NGB = nanoengineered granular bioink; GelMA = 젤라틴 메타크릴로일; HMP = 하이드로겔 미세입자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
젤라틴과 그 유도체는 HMP 제조에 가장 일반적으로 사용되는 단백질 기반 생체 재료입니다. 처리량 대 입자 크기 단분산 절충의 문제는 스텝 유화 미세유체 장치를 사용하여 극복할 수 있습니다. 이 장치는 시간당 4천만 개 이상의 물방울을 형성할 수 있으며 변동 계수는 5%27 미만입니다. 이 기사에서는 GelMA 용액을 포함하는 액적의 미세 가공에 대해 논의한 후 GelMA HMP, 분말, GHS 및 NGB로 변환했습니다.
GelMA의 열반응성은 미세유체 지원 HMP 제조 및 안정화를 용이하게 합니다. UCST보다 높은 온도(예를 들어, 37°C)에서, GelMA는 수용액에 용해되어, 스텝-유화 장치에서 유중수 에멀젼 형성에 적합한 수성 유체를 생성한다. 온도를 낮추면(예: 4°C) 액적 형성 후 물리적 가교를 통해 GelMA HMP 형성이 가능합니다. GelMA HMP는 다양한 접근 방식을 통해 GHS 제조를 위한 빌딩 블록으로 사용될 수 있습니다. 열적으로 안정한 HMP는 기계적으로 견고한 GHS를 형성하기 위해 광조립될 수 있으며, 상호침투 침투 침투 네트워크(28)를 제외하고 과립형 스캐폴드 중에서 가장 높은 보고된 압축 계수 중 하나를 달성한다. 광조립 방법에서 모든 절차는 GelMA HMP가 녹는 것을 방지하기 위해 저온(예: 4°C)에서 수행해야 합니다.
HMP의 3D (바이오) 프린팅을 통해 기하학적으로 잘 정의 된 GHS를 제작할 수 있습니다. 그러나 이것은 적층 제조된 과립 구조의 미세 다공성을 손상시키는 밀집된 HMP를 사용하여 수행되었습니다. 이 문제를 해결하기 위해 HMP 표면에 흡착된 이질적으로 하전된 나노입자의 가역적 자가 조립이 어떻게 느슨하게 채워진 HMP를 보존된 미세 다공성으로 전단 항복 및 3D 프린팅 가능(NGB)으로 만드는지 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 펜실베니아 주립 대학 (Penn State)의 화학 공학과의 연구 지원 전문가 인 T. Pond, Penn State의 Nanofabrication Lab 직원 및 Partillion Bioscience의 J. de Rutte 박사에게 나노 제조 공정에 대한 도움과 토론에 감사드립니다. A. Sheikhi는 Materials Research Institute (MRI) 및 College of Engineering Materials Matter at the Human Level 종자 보조금, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) 및 Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-Autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program 및 Penn State의 창업 기금. 이 간행물에 보고된 연구는 수상 번호 R56EB032672로 NIH(National Institutes of Health)의 NIBIB(National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)에서 부분적으로 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
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