Summary
Denne artikel beskriver protokoller til gelatine-methacryloyl-mikrogelfremstilling med høj kapacitet ved hjælp af mikrofluidiske enheder, konvertering af mikrogeler til resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), den kemiske samling af mikrogeler til dannelse af granulære hydrogelstilladser og udvikling af granulært hydrogelbioblæk med bevaret mikroporøsitet til 3D-bioprint.
Abstract
Fremkomsten af granulære hydrogelstilladser (GHS), fremstillet via samling af hydrogelmikropartikler (HMP'er), har muliggjort mikroporøs stilladsdannelse in situ. I modsætning til konventionelle bulkhydrogeler letter sammenkoblede mikroskalaporer i GHS nedbrydningsuafhængig celleinfiltration samt overførsel af ilt, næringsstoffer og cellulære biprodukter. Methacryloylmodificeret gelatine (GelMA), en (foto)kemisk tværbindbar, proteinbaseret biopolymer indeholdende celleklæbemiddel og biologisk nedbrydelige dele, er i vid udstrækning blevet anvendt som et celleresponsivt/instruktivt biomateriale. Konvertering af bulk GelMA til GHS kan åbne en overflod af muligheder for vævsteknik og regenerering. I denne artikel demonstrerer vi procedurerne for GelMA-mikrogelfremstilling med høj kapacitet, konvertering til resuspenderbare tørre mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-dannelse via kemisk samling af mikrogeler og granulær bioblækfabrikation til ekstruderingsbioprint. Vi viser, hvordan en sekventiel fysisk-kemisk behandling via køling og fototværbinding muliggør dannelsen af mekanisk robust GHS. Når lys er utilgængeligt (f.eks. under dyb vævsinjektion), kan individuelt tværbundne GelMA HMP'er samles bioortogonalt via enzymatisk tværbinding ved hjælp af transglutaminaser. Endelig demonstreres tredimensionel (3D) bioprint af mikroporøs GHS ved lav HMP-pakningstæthed via grænseflade-selvsamling af heterogent ladede nanopartikler.
Introduction
Montering af HMP-byggesten til dannelse af vævstekniske stilladser har fået enorm opmærksomhed i de sidste par år1. GHS, fremstillet via HMP-samling, har unikke egenskaber sammenlignet med deres bulkmodstykker, herunder mikroporøsitet i celleskala, der stammer fra de tomme rum blandt de diskrete byggesten. Yderligere egenskaber, såsom injicerbarhed, modularitet og afkoblet stivhed fra porøsitet, gør GHS til en lovende platform til forbedring af vævsreparation og regenerering2. Forskellige biomaterialer er blevet anvendt til GHS-fremstilling, herunder syntetiske PEG-baserede polymerer3,4 og polysaccharider, såsom alginat5 og hyaluronsyre 6,7. Blandt naturligt afledte polymerer er den mest almindelige proteinbaserede biopolymer til GHS-fremstilling GelMA 8,9,10,11, et tværbundet, biokompatibelt, bioklæbende og biologisk nedbrydeligt biomateriale 12,13.
HMP'er kan fremstilles via batchemulgering8, flowfokusering 14,15 eller trinemulgering9,11 mikrofluidiske enheder, blanding 16 eller kompleks koacervation17,18. Normalt er der en afvejning mellem fabrikationsgennemstrømningen og HMP-monodispersiteten. For eksempel giver blandingsteknikken uregelmæssigt formede og stærkt polydispergerede HMP'er. Batchemulgering eller kompleks koacervation muliggør produktion af store mængder polydispergerede sfæriske HMP'er. Flowfokuserende mikrofluidiske enheder er blevet brugt til at fremstille stærkt monodispergerede dråber med en variationskoefficient på <5%, men gennemstrømningen er signifikant lav. I mikrofluidiske enheder med trinemulgering muliggør de stærkt paralleliserede trin fremstilling med høj kapacitet af monodispergerede HMP'er19.
Methacryloyl-modificeret gelatine (GelMA) HMP-byggesten er termoresponsive og (foto)kemisk tværbindbare, hvilket muliggør let GHS-fabrikation20. Efter afkøling under den øvre kritiske opløsningstemperatur (UCST)21 (f.eks. ved 4 °C) omdannes dråber indeholdende en GelMA-opløsning til fysisk tværbundne HMP'er. Disse HMP-byggesten pakkes derefter ved hjælp af eksterne kræfter (f.eks. Via centrifugering) for at give fastklemte mikrogelsuspensioner. Interpartikelforbindelser etableres mellem tilstødende HMP'er via (foto)kemisk tværbinding for at danne mekanisk robust GHS14. En af de vigtigste egenskaber ved GHS er mikroporøsitet, der muliggør let cellepenetration in vitro11 og forbedret vævsindvækst in vivo22. Tredimensionel (3D) bioprint af HMP'er udføres konventionelt ved hjælp af tæt pakkede mikrogelsuspensioner, hvilket kompromitterer mikroporøsiteten23.
Vi har for nylig udviklet en ny klasse af granulære bioblæk baseret på grænsefladenanoengineering af GelMA-mikrogeler via adsorption af heterogent ladede nanopartikler efterfulgt af nanopartikelreversibel selvsamling. Denne strategi gør løst pakkede mikrogeler forskydningsgivende og ekstrudering 3D bioprintbare, hvilket bevarer mikroskalaporøsiteten af additivt fremstillet GHS11. Denne artikel præsenterer metoderne til high-throughput GelMA dråbefabrikation, konvertering af disse dråber til fysisk tværbundne HMP'er, fremstilling af GelMA HMP'er ved hjælp af resuspenderbart pulver, GelMA GHS-dannelse, GelMA nanoengineered granulær bioink (NGB) forberedelse og 3D-bioprint.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, instrumenter og reagenser, der anvendes i denne protokol.
1. GelMA syntese
BEMÆRK: GelMA-syntese skal udføres i en kemisk damphætte, og korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) skal bruges hele tiden.
- Der tilsættes 200 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS, 1x) til en Erlenmeyerkolbe, og opløsningen opvarmes, indtil den når 50 °C. Dæk kolben med aluminiumsfolie for at forhindre fordampning.
- Der tilsættes 20 g gelatinepulver til DPBS-opløsningen ved 50 °C under omrøring ved 240 o/min, indtil pulveret er helt opløst.
- Tilsæt 16, 2,5 eller 0,5 ml methacrylatanhydrid (MA) til gelatineopløsningen dråbevis via en glaspasteurpipette for at syntetisere GelMA med henholdsvis en høj, medium eller lav grad af methacryloylsubstitution.
FORSIGTIG: MA er et farligt materiale. Korrekt PPE skal bruges, når du arbejder med MA. MA er også lysfølsom, så beskyt reaktionen mod lys ved at pakke kolben ind med aluminiumsfolie. - Efter 2 timer tilsættes 400 ml DPBS ved 50 °C for at standse reaktionen. Lad omrøringen fortsætte ved 50 °C i 10 minutter.
- Opløsningen hældes i en membranslange med 12-14 kDa afskæring i molekylvægten, og slangen anbringes derefter i et 5 L bægerglas fyldt med 40 °C ultrarent vand. Vandet omrøres ved 240 o/min og 40 °C.
- Dialyser opløsningen mod ultrarent vand i 10 dage og skift vandet 2x om dagen for at fjerne ureageret methacrylatanhydrid, biprodukter og andre urenheder.
- Efter 10 dage tilsættes 400 ml ultrarent vand ved 40 °C til GelMA-opløsningen. Opløsningen omrøres ved 240 o / min i 15 min.
- Opløsningen filtreres to gange ved hjælp af kaffefiltre, efterfulgt af vakuumfiltrering via en 0,2 μm vakuumfiltreringsenhed.
- 25 ml af den filtrerede opløsning hældes i 50 ml centrifugeglas og fryses ved -80 °C, idet glassene anbringes vandret.
- Efter 2 dage fjernes hætterne og dækkes centrifugerørene med laboratorieservietter. Brug tape eller et gummibånd til at holde kludene tæt.
- Frysetørrede den frosne GelMA-opløsning for at give hvid fast GelMA.
- For at udføre protonkernemagnetisk resonans (1 H NMR) spektroskopi tilsættes separat 30 mg gelatinepulver (kontrol) eller frysetørret GelMA i 1ml deuteriumoxid (D2O) og opretholdes prøverne ved 37 ° C, indtil gelatinepulveret eller GelMA er helt opløst.
- Der opnås 1H NMR-spektre, og graden af methacryloylsubstitution bestemmes ved at integrere de aromatiske syrer og lysinmethylenprotontoppene ved kemiske skift på henholdsvis ~6,5-7,5 og ~3,0 ppm. Der anvendes toppen af aromasyrerne som reference, og substitutionsgraden (DS) bestemmes ved hjælp af lysinmethylentoppene baseret på ligning (1):
DS (%) = [1 - (Areal af lysinmethylen i GelMA / Areal af lysinmethylen i gelatine)] × 100 (1)
Figur 1: GelMA syntese og karakterisering. (A) GelMA syntese reaktion. Gelatine modificeres med methacrylsyreanhydrid ved 50 °C i 2 timer. B) Gelatinens og GelMA's protonkernemagnetiske resonansspektre (1H NMR): a) toppen for aromatiske syrer, der vælges som reference for kalibrering, b) vinylfunktionelle gruppetoppe efter MA-modifikationen af gelatine og c) toppen for lysinproteiner. I dette eksempel var MA-substitutionsgraden 71% ± 3% (n = 3). Denne figur er blevet ændret med tilladelse fra Ataie et al.11 Forkortelser: GelMA = gelatine methacryloyl; DPBS = Dulbeccos fosfatbufferede saltvand; MA = methacryloyl. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. GelMA mikrogelfremstilling med høj kapacitet
- Enhed master skimmel mikrofabrikation
BEMÆRK: Masterforme kan mikrofabrikeres via blød litografi ved hjælp af KMPR 1000 negativ fotoresist serie19.- Optø KMPR 1025 og 1035 natten over. Undgå lyseksponering.
- For at belægge det første lag på waferen tilsættes KMPR 1025 direkte til midten af waferen for at lave en ca. 5 cm cirkel af fotoresist. Kør spincoateren ved 3.000 o / min i 30 sekunder.
- Blød bages i 12 min på en 100 °C kogeplade. Køl derefter ned på kølepladen i 5 min.
- Fastgør den første lagmaske til den tomme sodakalk, og udsæt derefter den coatede wafer for UV-lys ved hjælp af en maskejustering til 645 mJ / cm2 dosering.
- Efterbages i 3 min på en 100 °C kogeplade. Køl ned på kølepladen i 5 min.
BEMÆRK: Udvikl ikke efter dette trin. Udvikl kun én gang i slutningen af processen. - Drej det andet lag på skiven ved hjælp af KMPR 1035. Kør spincoateren ved 1.000 o / min i 30 sekunder.
- Blød bages i 30 min på en 100 °C kogeplade. Køl ned på kølepladen i 5 min.
- Fastgør det andet lag maske til den tomme soda kalk og justere den anden maske ved hjælp af justeringen gennem standard justeringstegn. Udsæt for UV-lys ved hjælp af en maskejustering på op til 2.000 mJ/cm2.
- Efterbages i 5 min på en 100 °C kogeplade.
- Udvikl i >6 min i SU-8 udvikleren.
BEMÆRK: Hvis waferen ser mælkeagtig ud, skal udviklingen fortsættes i længere tid. Brug frisk udvikler hver gang og imellem for et bedre resultat. - Spray med isopropanol. Sørg for, at vaflen er klar, uden mælkeagtige rester. Skiven tørres grundigt med nitrogen (N2)-gas.
- Fremstilling af mikrofluidiske enheder
- Hæld 50 g polydimethylsiloxan (PDMS) basedel i en gennemsigtig plastikkop. Derefter tilsættes 5 g af tværbindingen til plastikkoppen. Bland basen og tværbindingen kraftigt ved hjælp af en spatel, indtil der opnås en cremet konsistens.
- Vakuum afgasse blandingen ved hjælp af en ekssikkator i 20 minutter, indtil det bliver klart. Hæld blandingen på masterformen, som placeres indeni og tapes til en petriskål.
BEMÆRK: Sørg for, at tykkelsen (højden) af det hældte PDMS er ≤8 mm. - Sæt petriskålen i ekssikkatoren og vakuum afgas PDMS-blandingen igen i 20 minutter, indtil alle boblerne er fjernet. Anbring petriskålen i en 70 ° C ovn i 2 timer, indtil PDMS er tværbundet. Tag petrifadet ud af ovnen og lad det køle af.
- Skær enhederne ud af formen ved hjælp af en skalpel. Fjern enhederne langsomt fra masterformen. Brug biopsistansen (1,5 mm diameter) til at skære huller gennem indløbene og udløbet.
- Fjern støv fra PDMS-enhederne, og glasobjektstykkerne ved hjælp af maskeringstape, og placer glasobjektglassene og enhederne i et plasmarensekammer. Udfør plasmabehandlingen i 45 s (startende, når kammeret bliver lilla) med lufttryk under 400 mTorr. Fjern diasene og enhederne fra kammeret, sæt enheden på glasgliderne, og tryk let. Sæt enheden i 70 ° C ovnen i 30 minutter for at forbedre bindingen.
- Fyld enhederne med trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl) silan (F-silan, 2% v / v) i den konstruerede væske for at gøre kanaloverfladen fluorofil. Injicer F-silanopløsningen gennem stikkontakten, og sørg for, at alle enheder er eksponerede. Vent i 5-10 min.
BEMÆRK: F-silan skal tilberedes frisk. Derudover bør F-silan ikke udsættes for luft i lang tid. - F-silanopløsningen suges ud af enheden gennem det vandige opløsningsindløb. Vask enheden to gange ved hjælp af ingeniørvæsken og aspirer igen. Anbring enheden i 70 °C ovnen i 30 minutter for at fordampe den resterende olie.
- Dråbedannelse og GelMA mikrogel fabrikation
- Der tilsættes 10 mg lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) til 10 ml DPBS for at fremstille en fotoinitiatoropløsning (PI) (0,1 % w/v). Beskyt opløsningen mod lys ved at pakke den ind i aluminiumsfolie.
- Den ønskede mængde GelMA opløses i PI-opløsningen og anbringes i 37 °C-ovnen i 1 time, indtil der opnås en klar opløsning. Beskyt opløsningen mod lys ved at pakke den ind i aluminiumsfolie.
- For at forberede oliefasen fremstilles en 2% v / v biokompatibel overfladeaktiv opløsning i ingeniørvæsken.
- Indsæt Tygon-slangen i PDMS-enhedens indløb og udløb. Indsæt en 25 G stump nål i den anden ende af Tygon-slangen til indløb. Brug den mindst mulige slangelængde.
- Placer enheden under mikroskopet. Hold miljøet varmt (~ 40 ° C) ved hjælp af en hårtørrer og / eller en rumvarmer.
- Læg de vandige og olieopløsninger i separate sprøjter, der er tilsluttet enheden. Start sprøjtepumperne med flowhastigheder på 160 og 80 μL/min for henholdsvis oliefasen (kontinuerlig) og vandig (dispergeret).
BEMÆRK: Start oliefasen først; Sørg for, at olien fylder kanalen, og start derefter den vandige fase. - Saml dråberne i en beholder og evaluer dem i billedkammeret via optisk mikroskopibilleddannelse.
- Placer dråberne ved 4 °C natten over, mens du beskytter dem mod lys for at starte GelMA HMP fysisk tværbinding og konvertere dråberne til stabile mikrogeler ved 4 °C.
3. Konvertering af mikrogeler til resuspenderbart pulver via den mikrokonstruerede emulsion-til-pulver (MEtoP) teknologi
BEMÆRK: MEtoP-teknologien til at konvertere de vand-i-olieemulsionsbaserede HMP'er til mikropartikelpulver (mikro-aerogels) med bevarede egenskaber, såsom resuspenderbarhed, form, størrelse og samling, er blevet udviklet.
- For at implementere MEtoP skal du indsamle de fysisk tværbundne HMP'er i ingeniørvæsken ved hjælp af termisk holdbare mikrocentrifugerør eller kryovialer. Åbn rørhætterne og forsegl dem med en laboratorieserviet og tape.
- De fysisk tværbundne HMP'er fryses i flydende nitrogen (-196 °C) i 10 minutter.
- Overfør de lynfrosne rør til et frysetørrerinstrument. Lyofiliser rørene ved lavt tryk (f.eks. 0,06 mbar) i mindst 6 timer for at give pulver.
BEMÆRK: Når frysetørringscyklussen er færdig, skal du bryde trykket langsomt, så pulveret ikke går tabt. - Tilsæt 1 ml afkølet PI-opløsning (0,1% w/v, 4 °C) til pulveret for at fremstille mikrogelsuspensioner. Vortex i 5 s, centrifuger derefter ved 3.000 × g i 15 s. Supernatanten kasseres.
- Den pakkede mikrogelsuspension overføres til en form ved hjælp af en positiv fortrængningspipette efterfulgt af UV-lyseksponering ved 400 nm bølgelængde med en intensitet på 15 mW/cm2 i 60 s for at danne GHS.
Figur 2: GelMA mikropartikelpulverpræparation via MEtoP-teknologi. (A) Billeder af GelMA-pulver opnået ved hjælp af MEtoP-teknologien eller konventionel frysetørring af HMP. I MEtoP-teknologi eller konventionel lyofilisering suspenderes HMP'er i henholdsvis olieoverfladeaktivt middel eller vandigt medie. Ingeniørvæsken beskytter den dispergerede fase (HMP'er) mod aggregering og bevarer de fysiokemiske egenskaber af GelMA-mikropartikler under frysetørring. (B) Skematisk illustration af tørrede HMP'er fremstillet via MEtoP sammenlignet med konventionelt frysetørret HMP i et vandigt medium. (C) SEM-billeder af tørrede GelMA-mikropartikler fremstillet via MEtoP sammenlignet med konventionel frysetørring. Skalastænger = 2 mm (venstre; A), 500 μm (højre; A), 10 μm (venstre; C) og 200 μm (højre; C). Dette tal blev ændret med tilladelse fra Sheikhi et al.26 Forkortelser: GelMA = gelatine methacryloyl; DPBS = Dulbeccos fosfatbufferede saltvand; MEtoP = mikromanipuleret emulsion-til-pulver; HMP = hydrogel mikropartikel; SEM = scanning elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. GelMA GHS dannelse
BEMÆRK: Denne protokol er til fremstilling af 400 μL mikrogelsuspension. For større mængder er opskalering nødvendig. For at holde GelMA HMP'erne fysisk tværbundne skal alle trin udføres ved ca. 4 °C ved at placere mikrogelbeholderne i en isvandspand.
- Der tilsættes 400 μL 1H,1H-perfluor-1-octanol (PFO)-opløsning i maskinvæsken (20 % v/v) til de fysisk tværbundne GelMA HMP'er. Derefter hvirvel i 5 s og centrifugeres i 15 s ved 300 × g.
BEMÆRK: PFO-opløsningen i ingeniørvæsken skal tilberedes frisk og opbevares i en lukket beholder for at forhindre fordampning. - Fjern oliefasen fra GelMA HMP'erne via pipettering.
- Der tilsættes 400 μL PI-opløsning (0,1 % w/v) ved 4 °C til mikrogelsuspensionen. Derefter hvirvel i 5 s og centrifugeres ved 300 × g i 15 s. Kassér olien bagefter.
- Gentag det forrige trin, men centrifuger ved 3.000 × g. Supernatanten på pakkede GelMA HMP'er fjernes via pipettering.
- Overfør de pakkede GelMA HMP'er til en form ved hjælp af en positiv fortrængningspipette efterfulgt af UV-lyseksponering (bølgelængde = 400 nm, intensitet = 15 mW/cm2, eksponeringstid = 60 s).
5. Nanomanipuleret granulært bioblæk (NGB) til 3D-bioprintning af GHS med bevaret mikroporøsitet
- Tilsæt 100 mg nanotrombocytpulver til 3 ml 4 °C ultrarent vand for at danne en nanopartikeldispersion (3,33% w/v). Vortex dispersionen kraftigt inde i et 4 ° C køleskab i 15 minutter for at eksfoliere de ellers aggregerede nanopartikler. Korrekt eksfolierede nanopartikler giver en klar spredning.
- 50 mg LAP opløses i 5 ml 4 °C ultrarent vand for at fremstille en stam-PI-opløsning (1 % w/v).
- Der tilsættes 333 μL PI-opløsning (1 % w/v) til den eksfolierede nanopartikeldispersion. Pak ind i aluminiumsfolie for at beskytte mod omgivende lys. Vortex i 1 min for at blande nanopartikeldispersionen og PI. De endelige ler- og PI-koncentrationer er henholdsvis 3% w/v og 0,1% w/v.
- Tilføj PFO 20% v/v i teknisk væske (4 °C) til de fysisk tværbundne GelMA HMP'er i et volumenforhold på 1:1. Vortex grundigt i 5 s. Derefter centrifugeres ved 300 × g i 15 sek., og oliefasen indeholdende det overfladeaktive stof kasseres.
- Der tilsættes den LAP-supplerede nanopartikeldispersion (4 °C) til de vaskede GelMA HMP'er. Vortex i 15 s, centrifugeres ved 3.000 × g i 15 s, og den resterende olie i bunden samt supernatantdispersionen kasseres.
- Opbevar suspensionen ved 4 °C, samtidig med at den beskyttes mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie i 1 dag. Produktet af dette trin er GelMA NGB.
- Læg NGB i en 3 ml sprøjte, forsegl den fyldte sprøjte med en hætte og parafilm, og pulscentrifuger ved 200 × g for at fjerne den indespærrede luft. Overfør bioblækket til en 3 ml patron ved hjælp af et Luer-Lok-stik, der hunner hunkønnet. Centrifuger cylinderampullen kortvarigt ved 200 × g igen for at fjerne den indespærrede luft. Opbevar NGB ved 4 °C i køleskab inden brug.
- Før cellebelastet bioink-forberedelse fremstilles en koncentreret cellesuspension (f.eks. NIH / 3T3 murine fibroblastceller), der indeholder ~ 24 millioner celler i 100 μL cellekulturmedium. Læg cellesuspensionen i en 3 ml sprøjte, sammenkæd den NGB-fyldte sprøjte og den cellefyldte sprøjte ved hjælp af et Luer-Lok-stik mellem hun og hun, og bland cellerne og NGB forsigtigt ved at skubbe 40x frem og tilbage.
- Udskriv NGB eller cellebelastet NGB ved hjælp af en ordentlig bioprinter med en standard konisk dyse. Læg dysen i 3 ml skrivehovedet. Hold printlejetemperaturen under 10 °C. Optimer udskrivningsparametre som hastighed og modtryk inden udskrivning.
- Vælg substrat og dysetype (pneumatisk 3 ml sprøjte udstyret med standard konisk dyse), kalibrer bioprinteren ved hjælp af enhedens retningslinjer, vælg ønskelig gcode eller STL-fil, og start udskrivningen.
BEMÆRK: Ved udførelse af cellebelastet bioprint skal alle materialer og enheder vedligeholdes under det biologiske sikkerhedsskab for at minimere kontaminering. - Efter udskrivningen udsættes konstruktionen for UV-lys for fototværbinding (bølgelængde = 400 nm, intensitet = 15 mW/cm2, eksponeringstid = 60 s).
Figur 3: Skemaer over dannelse af GelMA-mikrogel og GHS. (A) Skemaer over GelMA-mikrogelseparation fra olie og NGB-præparation. PFO (20% v/v i ingeniørvæske) blev tilsat til GelMA mikrogel-olieemulsionen i et volumetrisk forhold på 1:1 efterfulgt af hvirvelstrøm og centrifugering ved 300 × g i 15 s. For at fremstille GelMA GHS blev PI-opløsningen (LAP 0,1% w/v i DPBS) tilsat GelMA HMP'erne, efterfulgt af hvirvelstrøm og centrifugering ved 3.000 × g i 15 s. Til fremstilling af NGB blev PI-opløsningen (LAP 0,1% w/v i ultrarent vand) og nanoplatelet dispersion (3% w/v i ultrarent vand) tilsat til GelMA HMP-suspensionen efterfulgt af hvirvelstrøm og centrifugering ved 3.000 × g i 15 s. Figur 3A blev ændret med tilladelse fra Ataie, Z. et al.11 (B) Udsættelse af pakkede GelMA HMP'er for lys giver GHS. Figur 3B blev ændret med tilladelse fra Sheikhi et al.15 Forkortelser: GelMA = gelatine methacryloyl; GHS = granulært hydrogelstillads; NGB = nanomanipuleret granuleret bioblæk; PFO = 1H,1H-perfluor-1-octanol; PI = fotoinitiator; LAP = lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat; HMP = hydrogel mikropartikel; DPBS = Dulbeccos fosfatbufferede saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GelMA blev syntetiseret gennem reaktionen af gelatine med MA, som præsenteret i figur 1A. Ved at skræddersy reaktionsbetingelserne, såsom MA-koncentration, blev der opnået forskellige grader af MA-substitution. For at kvantificere graden af MA-substitution blev GelMA vurderet via 1H NMR-spektroskopi (figur 1B). Vinylfunktionelle grupper med repræsentative toppe ved de kemiske skift på ~ 5-6 ppm bekræftede den vellykkede GelMA-syntese fra gelatine. Reaktionsudbyttet efter dialyse og steril filtrering var >70% (mg GelMA/mg gelatine). Dråbe / mikrogel fabrikationsudbyttet var ~ 100%. Der kan anvendes forskellige metoder til at kvantificere substitutionsgraden24. Vi vurderede faldet i lysinaminosyre (primær amin), normaliseret ved hjælp af den upåvirkede aromatiske syreproton baseret på ligning (1).
HMP'er suspenderes almindeligvis i vandige medier, såsom DPBS eller cellekulturmedier. Den hydrerede tilstand af HMP'er kan introducere flere udfordringer inden for sterilisering, forsendelse, opbevaring og langsigtet stabilitet. MEtoP er en ny metode til at omdanne HMP'er til tørret pulver uden at påvirke deres oprindelige molekylære og kolloide egenskaber25. MEtoP-teknologien giver resuspenderbare, tørrede HMP'er (mikroaerogeler) via frysetørring ved lavt tryk, samtidig med at HMP'erne beskyttes mod aggregering og alvorlig deformation ved hjælp af en flygtig olie snarere end et vandigt medium (figur 2A). Ved hjælp af denne teknik tørres mikrogelerne individuelt uden aggregering (figur 2B) og bevarer således deres sfæriske form efter frysetørring (figur 2C). Disse mikropartikler genvinder let deres oprindelige egenskaber ved rehydrering, hvilket giver HMP-suspensioner, der er klar til at danne GHS ved samling.
Trinemulgerende mikrofluidiske enheder giver monodispergerede GelMA-dråber med høj kapacitet, uafhængigt af de vandige / oliefasestrømningshastigheder. Da GelMA er en termofølsom biopolymer, omdannes dråber til termisk tværbundne HMP'er ved at reducere temperaturen til ~ 4 ° C. De stabile HMP'er kan skylles for at fjerne olien og overfladeaktivt middel ved hjælp af PFO (20% v / v). Efter fjernelse af olie / overfladeaktivt stof kan GelMA HMP'erne blandes med en PI til kemisk samling eller med nanopartikler til grænseflade selvmontering (figur 3A). GHS-dannelse initieres via lys (bølgelængde = 400 nm, intensitet = 15 mW/cm2, eksponeringstid = 60 s)-medieret fri radikalpolymerisation, hvilket resulterer i mikrogel-mikrogelbinding (figur 3B).
Mikroporøsitet er et af de vigtigste kendetegn ved GHS, der muliggør let ilt- og cellulær affaldsudveksling, celleinfiltration, migration og spredning. For at vurdere mikroporøsiteten anvendes et fluorescensfarvestof med høj molekylvægt til at visualisere tomrummene blandt HMP'erne. Figur 4A viser top- og 3D-visningerne af GHS-stilladser, hvor det grønne område viser den sammenkoblede mikroporøsitet. Figur 4B viser et fluorescensbillede, vurderet ved hjælp af et specialskrevet MATLAB-script til at detektere poreområdet. Målinger af tomrumsfraktion (figur 4C) og median poreækvivalent diameter (figur 4D) viser ingen signifikant forskel mellem GHS og 3D-printede NGB-stilladser, hvilket vidner om tilgængeligheden og sammenkoblingen af mikroskalaporer i NGB.
Figur 4: Porekarakterisering af GelMA GHS og NGB. (A) Top- og 3D-ortografiske visninger af GHS- og NGB-stilladser. Trintrin er 100 μm. (B) Fluorescensbilledet af tomrumsområde og poredetektion via en specialskrevet MATLAB-kode til fototværbundet GelMA, GHS og NGB. Skalabjælke = 200 μm. (C) Hulrumsfraktionen af GelMA GHS og NGB. D) Den mediane ækvivalente porediameter for GelMA, GHS og NGB. Denne figur blev ændret med tilladelse fra Ataie et al.11 Forkortelser: GelMA = gelatine methacryloyl; GHS = granulært hydrogelstillads; NGB = nanomanipuleret granuleret bioblæk; NS = ikke-signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
NGB er designet som en printbar HMP-affjedring med bevaret mikroporøsitet. For at demonstrere NGB's ekstruderbarhed og printbarhed udførte vi ekstruderingsbaseret 3D-print, som vist i figur 5. PSU-bogstaver blev trykt ved hjælp af NGB efterfulgt af lyseksponering (figur 5A). For at vurdere NGB's overlegenhed i forhold til tætpakkede og løst pakkede GelMA HMP'er blev den hængende filamentlængde (Lf) målt (figur 5B). NGB havde den højeste Lf sammenlignet med de pakkede HMP'er. De løst pakkede HMP'er gav ikke filamenter. Derudover blev en hul cylinder 3D-printet, og hele konstruktionen blev udsat for lys til fototværbinding (figur 5D) og fysisk holdt (figur 5E) for at demonstrere henholdsvis 3D-printbarhed og formfidelitet af fototværbundet GelMA NGB.
Figur 5: NGB's printbarhed efterfulgt af UV-lysmedieret fototværbinding (bølgelængde = 395-405 nm, intensitet = 15 mW/cm2, eksponeringstid = 60 s). (A) Skematisk over udskrivningsprocessen, der viser PSU-bogstaver, der 3D-printes ved hjælp af den fluorescerende mærkede NGB. Skalastang = 3 mm. (B) Visuel sammenligning af filamentekstrudering ved hjælp af NGB, tæt pakkede GelMA HMP'er og løst pakkede GelMA HMP'er. Skalastang = 10 mm. (C) Hængende filamentlængde af NGB, tæt pakket og løst pakket granulære hydrogeler. NGB danner længere hængende filamenter (filamentlængde L f = 45,0 ± 5,0 mm, n = 10) end tæt pakket mikrogel (L f = 19,3 ± 0,7 mm, n = 10). De løst pakkede mikrogeler giver dråbestørrelse (Lf = 5,7 ± 0,7 mm, n = 10) filamenter. (D) NGB blev brugt til 3D-udskrivning af hule cylindre med en diameter på 5 mm og en højde på 10 mm. (E) Hele konstruktionen (hul cylinder med d = 5 og h = 10 mm) blev trykt og derefter udsat for UV-lys. Lag-for-lag fototværbinding kan øge formgengivelsen, men mindsker strukturel integritet, da lagene ikke er tværbundet sammen. Den hule trykte cylinder blev holdt ved hjælp af pincet, hvilket viste mekanisk robusthed. Skalastang = 1 cm. Denne figur blev ændret fra Ataie et al.11 Forkortelser: NGB = nanoengineered granulært bioblæk; GelMA = gelatine methacryloyl; HMP = hydrogel mikropartikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelatine og dets derivater er de mest almindeligt anvendte proteinbaserede biomaterialer til HMP-fremstilling. Udfordringen med afvejning af gennemstrømning versus partikelstørrelsesmonodispersitet kan overvindes ved hjælp af mikrofluidiske enheder med trinemulgering. Disse enheder er i stand til at danne mere end 40 millioner dråber i timen med en variationskoefficient mindre end 5%27. I denne artikel diskuterede vi mikrofabrikation af dråber indeholdende GelMA-opløsninger efterfulgt af konvertering af dem til GelMA HMP'er, pulver, GHS og NGB.
GelMAs termoresponsivitet muliggør let mikrofluidisk aktiveret HMP-fabrikation og stabilisering. Ved en temperatur, der er højere end UCST (f.eks. 37 °C), opløses GelMA i en vandig opløsning, hvilket giver en passende vandig væske til vand-i-olie-emulsionsdannelse i trin-emulgeringsanordninger. Faldende temperatur (f.eks. 4 °C) muliggør dannelse af GelMA HMP via fysisk tværbinding efter dråbedannelse. GelMA HMP'er kan bruges som byggesten til GHS-fremstilling gennem forskellige tilgange. Termisk stabile HMP'er kan fotosamles til dannelse af et mekanisk robust GHS, der opnår et af de højeste rapporterede kompressionsmoduler blandt granulære stilladser, bortset fra de interpenetrerende perkolerende netværk28. I fotomonteringsmetoden skal alle procedurer udføres ved lav temperatur (f.eks. 4 °C) for at undgå GelMA HMP-smeltning.
3D (bio) print af HMP'er muliggør fremstilling af geometrisk veldefineret GHS; Dette er imidlertid blevet udført ved hjælp af tæt pakkede HMP'er, hvilket kompromitterer mikroporøsiteten af additivt fremstillede granulære konstruktioner. For at løse denne udfordring viser vi, hvordan den reversible selvsamling af heterogent ladede nanopartikler adsorberet til HMP-overflader gør løst pakkede HMP'er forskydningsgivende og 3D-printbare (NGB) med bevaret mikroporøsitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke T. Pond, forskningsstøttespecialist ved Institut for Kemiteknik ved Pennsylvania State University (Penn State), Nanofabrication Lab-personalet i Penn State og Dr. J. de Rutte fra Partillion Bioscience for hjælp og diskussion vedrørende nanofabrikationsprocesser. A. Sheikhi anerkender støtten fra Materials Research Institute (MRI) og College of Engineering Materials Matter at the Human Level frøtilskud, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) og Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program og opstartsfonden fra Penn State. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist støttet af National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) af National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R56EB032672.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
- Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
- Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
- Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
- Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , 17/279,283 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
- Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , 17/425,027 (2022).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
- Charlet, A., Bono, F., Amstad, E.
