Summary
この記事では、マイクロ流体デバイスを使用したハイスループットゼラチンメタクリロイルミクロゲル製造、ミクロゲルの再懸濁可能な粉末(マイクロエアロゲル)への変換、粒状ヒドロゲル足場を形成するためのミクロゲルの化学集合、および3Dバイオプリンティング用のマイクロ多孔性が保存された粒状ヒドロゲルバイオインクの開発のプロトコルについて説明します。
Abstract
ヒドロゲル微粒子(HMP)を組み立て ることによって 製造された粒状ヒドロゲル足場(GHS)の出現により、 その場での微多孔性足場の形成が可能になりました。従来のバルクヒドロゲルとは異なり、GHSの相互接続されたマイクロスケールの細孔は、分解に依存しない細胞浸潤、ならびに酸素、栄養素、および細胞の副産物の移動を促進します。メタクリロイル修飾ゼラチン(GelMA)は、細胞接着性および生分解性部分を含む(光)化学的に架橋可能なタンパク質ベースの生体ポリマーであり、細胞応答性/有益な生体材料として広く使用されています。バルクGelMAをGHSに変換すると、組織工学と再生のための多くの機会が開かれる可能性があります。本稿では、ハイスループットGelMAミクロゲル作製、再懸濁乾燥ミクロゲル(マイクロエアロゲル)への変換、ミクロゲルの化学集合 体による GHS形成、および押出バイオプリンティングのための顆粒バイオインク作製の手順を示す。冷却と光架橋 による 逐次物理化学的処理により、機械的に堅牢なGHSの形成がどのように可能になるかを示します。光にアクセスできない場合(例えば、深部組織注入中)、個別に架橋されたGelMA HMPは、トランスグルタミナーゼを用いた酵素架橋 を介して 生物学的に直交的に組み立てることができます。最後に、低HMP充填密度での微多孔性GHSの3次元(3D)バイオプリンティングは、不均一に荷電したナノ粒子の界面自己組織化 を介して 実証される。
Introduction
HMPビルディングブロックを組み立てて組織工学の足場を形成することは、過去数年間で大きな注目を集めています1。HMPアセンブリを介して製造されたGHSは、個別のビルディングブロック間のボイドスペースに由来するセルスケールのマイクロ多孔性など、バルク対応物と比較して独自の特性を持っています。注入性、モジュール性、多孔性から分離された剛性などの追加の特性により、GHSは組織の修復と再生を強化するための有望なプラットフォームとなっています2。合成PEGベースのポリマー3,4およびアルギン酸5およびヒアルロン酸6,7などの多糖類を含む、異なる生体材料がGHS製造に使用されている。天然由来のポリマーの中で、GHS製造のための最も一般的なタンパク質ベースのバイオポリマーは、架橋性、生体適合性、生体接着性、および生分解性の生体材料であるGelMA 8,9,10,11です12,13。
HMPsは、バッチ乳化8、フローフォーカシング14、15またはステップ乳化9、11マイクロ流体デバイス、ブレンド16、または複雑なコアセルベーション17、18を介して作製することができる。通常、製造スループットとHMP単分散度の間にはトレードオフがあります。例えば、ブレンド技術により、不規則な形状で高度に分散したHMPが得られます。 バッチ乳化または複雑なコアセルベーションにより、大量の多分散球状HMPの製造が可能になります。 フローフォーカシングマイクロ流体デバイスは、変動係数が<5%の高度に単分散した液滴を製造するために使用されてきましたが、スループットは大幅に低くなっています。ステップ乳化マイクロ流体デバイスにおいて、高度に並列化されたステップにより、単分散HMP19のハイスループット製造が可能になる。
メタクリロイル修飾ゼラチン(GelMA)HMPビルディングブロックは、温度応答性および(光)化学的に架橋可能であり、容易なGHS製造を可能にする20。上限臨界溶解温度(UCST)21未満(例えば、4°C)に冷却すると、GelMA溶液を含む液滴は物理的に架橋されたHMPに変換されます。次に、これらのHMPビルディングブロックを外力(遠心分離など)を使用して充填し、詰まったミクロゲル懸濁液を生成します。隣接するHMP間に(光)化学的架橋を介して粒子間結合が確立され、機械的に堅牢なGHS14が形成されます。GHSの最も重要な特性の1つは、マイクロ多孔性であり、in vitroでの容易な細胞浸透11およびin vivoでの組織内殖の増強を可能にする22。HMPの三次元(3D)バイオプリンティングは、従来、密に充填されたミクロゲル懸濁液を用いて行われ、微多孔性を損なう23。
我々は最近、不均一に荷電したナノ粒子の吸着とそれに続くナノ粒子の可逆的自己組織化 を介した GelMAミクロゲルの界面ナノエンジニアリングに基づく新しいクラスの粒状バイオインクを開発しました。この戦略により、緩く充填されたミクロゲルのせん断収量と押出3Dバイオプリントが可能になり、積層造形されたGHS11のマイクロスケールの多孔性が維持されます。本稿では、ハイスループットのGelMA液滴作製、これらの液滴を物理的に架橋されたHMPに変換する方法、再懸濁可能な粉末を用いたGelMA HMPの作製、GelMA GHS形成、GelMAナノエンジニアリング粒状バイオインク(NGB)調製、および3Dバイオプリンティングの方法を紹介します。
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Protocol
注:このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. ゲルマ合成
注意: GelMA合成は化学ヒュームフードで行い、適切な個人用保護具(PPE)を常に使用する必要があります。
- 200 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、1x)を三角フラスコに加え、50°Cに達するまで溶液を加熱します。 蒸発を防ぐためにフラスコをアルミホイルで覆います。
- DPBS溶液にゼラチン粉末20gを加え、粉末が完全に溶解するまで240rpmで攪拌しながら50°Cで。
- 16、2.5、または0.5 mLの無水メタクリレート(MA)をガラスパスツールピペット を介して ゼラチン溶液に滴下し、それぞれ高、中、または低のメタクリロイル置換度を持つGelMAを合成します。
注意: MAは危険物です。MAを使用する場合は、適切なPPEを使用する必要があります。MAも光に敏感なので、フラスコをアルミホイルで包んで反応を光から保護します。 - 2時間後、50°Cで400 mLのDPBSを加えて反応を停止します。50°Cで10分間攪拌を継続します。
- 分子量カットオフが12〜14 kDaの透析膜チューブに溶液を注ぎ、40°Cの超純水で満たされた5 Lビーカーにチューブを置きます。240rpmと40°Cで水をかき混ぜます。
- 超純水に対して10日間透析し、水を1日2回交換して、未反応のメタクリル酸無水物、副生成物、その他の不純物を除去します。
- 10日後、GelMA溶液に40°Cの超純水400mLを加えます。溶液を240rpmで15分間攪拌する。
- コーヒーフィルターを使用して溶液を2回ろ過した後、0.2μmの真空ろ過ユニット で 真空ろ過します。
- ろ過した溶液25 mLを50 mLの遠沈管に注ぎ、-80°Cで凍結し、チューブを水平に置きます。
- 2日後、キャップを外し、遠心チューブを実験用ワイプで覆います。テープまたは輪ゴムを使用して、ワイプをしっかりと保持します。
- 凍結したGelMA溶液を凍結乾燥して、白色固体のGelMAを得た。
- プロトン核磁気共鳴(1HNMR)分光法を実施するには、1 mLの酸化重水素(D2O)に30 mgのゼラチン粉末(コントロール)または凍結乾燥GelMAを別途加え、ゼラチン粉末またはGelMAが完全に溶解するまでサンプルを37°Cに維持します。
- 1HNMRスペクトルを取得し、芳香族酸とリジンメチレンプロトンピークをそれぞれ~6.5-7.5および~3.0ppmの化学シフトで積分することにより、メタクリロイル置換度を決定します。芳香族酸ピークを基準として使用し、式(1)に基づいてリジンメチレンピークを用いて置換度(DS)を求めます。
DS(%)=[1-(GelMA中のリジンメチレンの面積/ゼラチン中のリジンメチレンの面積)]×100 (1)
図1:ゲルMAの合成と特性評価。 (a)ゲルMA合成反応。ゼラチンを無水メタクリル酸で50°Cで2時間修飾する。 (b)ゼラチンおよびGelMAのプロトン核磁気共鳴(1HNMR)スペクトル:(a)較正の基準として選択された芳香族酸のピーク、(b)ゼラチンのMA修飾後のビニル官能基ピーク、および(c)リジンタンパク質のピーク。本実施例において、MA置換度は71%±3%であった(n=3)。この図は、Ataieらの許可を得て修正されています11 略語:GelMA =ゼラチンメタクリロイル;DPBS = ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水;MA=メタクリロイル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. ハイスループットGelMAミクロゲル作製
- デバイスマスターモールド微細加工
注:マスターモールドは、KMPR 1000ネガフォトレジストシリーズ19を使用したソフトリソグラフィーによって微細加工できます。- KMPR 1025と1035を一晩解凍します。光への露出を避けてください。
- ウェーハの最初の層をコーティングするには、KMPR 1025をウェーハの中央に直接追加して、約5cmのフォトレジストの円を作ります。スピンコーターを3,000rpmで30秒間運転します。
- 100°Cのホットプレートで12分間ソフトベイクします。次に、冷却プレートで5分間冷却します。
- 最初の層マスクをブランクソーダライムに取り付け、次にマスクアライナーを使用して645 mJ / cm2 の投与量でコーティングされたウェーハをUV光にさらします。
- 100°Cのホットプレートで3分間ポストベークします。冷却プレートで5分間冷却します。
注: この手順の後に開発しないでください。プロセスの最後に一度だけ開発します。 - KMPR 1035を使用してウェーハ上の第2層をスピンコートします。スピンコーターを1,000rpmで30秒間運転します。
- 100°Cのホットプレートで30分間ソフトベイクします。冷却プレートで5分間冷却します。
- 2番目のレイヤーマスクをブランクソーダライムに取り付け、標準のアライメントサインを介してアライナーを使用して2番目のマスクを位置合わせします。2,000mJ/cm2までのマスクアライナーを使用してUV光に露光します。
- 100°Cのホットプレートで5分間ポストベークします。
- SU-8現像液で>6分間現像します。
注:ウェーハが乳白色に見える場合は、開発を長期間継続する必要があります。より良い結果を得るために、毎回およびその間に新鮮な開発者を使用してください。 - イソプロパノールをスプレーします。ウェーハが透明で、乳白色の残留物がないことを確認してください。窒素(N2)ガスを用いてウェーハを完全に乾燥させる。
- マイクロ流体デバイス作製
- 50 gのポリジメチルシロキサン(PDMS)ベース部分を透明なプラスチックカップに注ぎます。次に、5 gの架橋剤をプラスチックカップに追加します。クリーミーな食感が得られるまで、スパチュラを使用してベースと架橋剤を激しく混合します。
- 透明になるまでデシケーターを使用して混合物を20分間真空脱気します。混合物をマスターモールドに注ぎ、マスターモールドを内側に配置し、ペトリ皿にテープで留めます。
注意: 注ぐPDMSの厚さ(高さ)が≤8mmであることを確認してください。 - ペトリ皿をデシケーターに入れ、すべての気泡が除去されるまでPDMS混合物を20分間真空脱気します。PDMSが架橋されるまで、ペトリ皿を70°Cのオーブンに2時間入れます。ペトリ皿をオーブンから取り出し、冷まします。
- メスを使用して金型からデバイスを切り取ります。デバイスをマスターモールドからゆっくりと取り外します。生検パンチ(直径1.5 mm)を使用して、入口と出口に穴を開けます。
- マスキングテープを使用してPDMSデバイスとスライドガラスからほこりを取り除き、スライドガラスとデバイスをプラズマクリーナーチャンバーに入れます。400mTorr未満の空気圧で45秒間(チャンバーが紫色に変わったときに開始)プラズマ処理を実行します。スライドとデバイスをチャンバーから取り外し、デバイスをスライドガラスの上に置き、わずかな圧力をかけます。デバイスを70°Cのオーブンに30分間入れて、接着を強化します。
- チャネル表面を蛍光性にするために、設計された流体にトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン(F-シラン、2%v / v)を充填します。F-silane溶液を出口から注入し、すべてのデバイスが露出していることを確認します。5〜10分待ちます。
注:F-シランは新たに調製する必要があります。さらに、F-シランは長時間空気にさらされるべきではありません。 - F-silane溶液を水溶液入口から装置から吸引します。エンジニアリング液を使用してデバイスを2回洗浄し、再度吸引します。デバイスを70°Cのオーブンに30分間置き、残りのオイルを蒸発させます。
- 液滴形成とGelMAミクロゲル作製
- 10 mgのフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を10 mLのDPBSに加え、光開始剤(PI)溶液(0.1%w/v)を調製します。溶液をアルミホイルで包んで光から保護します。
- 必要量のGelMAをPI溶液に溶解し、透明な溶液が得られるまで37°Cのオーブンに1時間入れます。アルミホイルで包んで溶液を光から保護します。
- 油相を調製するには、エンジニアリング流体中に2%v/vの生体適合性界面活性剤溶液を作ります。
- PDMSデバイスの入口と出口にタイゴンチューブを挿入します。インレット用のタイゴンチューブのもう一方の端に25Gの鈍い針を挿入します。可能な限り最小のチューブ長を使用してください。
- デバイスを顕微鏡の下に置きます。ヘアドライヤーおよび/またはスペースヒーターを使用して環境を暖かく(~40°C)保ちます。
- 水溶液と油溶液を別々のシリンジに入れ、装置に接続します。シリンジポンプは、油相(連続)相と水性(分散)相でそれぞれ160μL/minと80 μL/minの流量で始動します。
注意: 最初に油相を開始します。オイルがチャネルを満たしていることを確認してから、水相を開始します。 - 液滴を容器に集め、光学顕微鏡イメージング によって イメージングチャンバー内で評価します。
- 液滴を光から保護しながら4°Cで一晩置き、GelMA HMPの物理的架橋を開始し、液滴を4°Cで安定したミクロゲルに変換します。
3.マイクロエンジニアリングされたエマルジョンから粉末(MEtoP)技術 による ミクロゲルの再懸濁可能な粉末への変換
注:水中油エマルジョンベースのHMPを、再懸濁性、形状、サイズ、組み立てなどの特性が保存された微粒子粉末(マイクロエアロゲル)に変換するMEtoP技術が開発されました。
- MEtoPを実装するには、熱的に耐久性のあるマイクロ遠心チューブまたはクライオバイアルを使用して、エンジニアリング流体中の物理的に架橋されたHMPを収集します。チューブキャップを開き、実験室用ワイプとテープで密封します。
- 物理的に架橋されたHMPを液体窒素(-196°C)中で10分間急速凍結します。
- 瞬間凍結チューブを凍結乾燥機装置に移します。チューブを低圧(0.06 mbarなど)で少なくとも6時間凍結乾燥して、粉末を生成します。
注意: 凍結乾燥サイクルが終了したら、粉末が失われないようにゆっくりと圧力を下げます。 - 1 mLの冷却PI溶液(0.1%w/v、4°C)を粉末に加え、ミクロゲル懸濁液を作ります。ボルテックスを5秒間、次に3,000 × g で15秒間遠心分離します。上澄み液を捨てる。
- 容積式ピペットを使用して充填したミクロゲル懸濁液を型に移し、続いて波長400nm、強度15mW/cm2 のUV光を60秒間露光してGHSを形成します。
図2:MEtoP技術によるGelMA微粒子粉末調製。 (A)MEtoP技術またはHMPの従来の凍結乾燥から得られたGelMA粉末の画像。MEtoP技術または従来の凍結乾燥では、HMPはそれぞれ油性界面活性剤または水性媒体に懸濁されます。エンジニアリング液は、分散相(HMP)を凝集から保護し、凍結乾燥中のGelMA微粒子の物理化学的特性を維持します。(B)MEtoPを介して調製された乾燥HMPを水性媒体中で従来の凍結乾燥HMPと比較した模式図。(C)MEtoPを介して調製された乾燥GelMA微粒子のSEM画像と従来の凍結乾燥の比較。スケールバー = 2 mm (左;A)、500 μm(右;A)、10 μm(左;C)、および200μm(右;この図は、Sheikhiらの許可を得て修正されました26略語:GelMA =ゼラチンメタクリロイル;DPBS = ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水;MEtoP =マイクロエンジニアリングされたエマルジョンから粉末へ。HMP = ヒドロゲル微粒子;SEM = 走査型電子顕微鏡。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. ゲルマGHS形成
注:このプロトコルは、400μLのミクロゲル懸濁液を調製するためのものです。大量の場合は、スケールアップが必要です。GelMA HMPを物理的に架橋した状態に保つには、ミクロゲル容器を氷水バケツに入れて、すべてのステップを約4°Cで実行する必要があります。
- エンジニアリング液中の400 μLの1H,1H-パーフルオロ-1-オクタノール(PFO)溶液(20%v/v)を物理的に架橋されたGelMA HMPに加えます。その後、300 × gで5秒間渦巻きし、15秒間遠心分離します。
注意: エンジニアリング液中のPFO溶液は、蒸発を防ぐために、新たに調製し、密閉容器に保管する必要があります。 - ピペッティング で GelMA HMPから油相を除去します。
- 4°Cで400 μLのPI溶液(0.1% w/v)をミクロゲル懸濁液に加えます。その後、5秒間渦巻き、300 × g で15秒間遠心分離します。その後、オイルを廃棄してください。
- 前の手順を繰り返しますが、3,000 × gで遠心分離します。充填されたGelMA HMPの上清をピペッティング で 除去します。
- 容積式ピペットを使用して充填されたGelMA HMPを型に移し、続いてUV光露光を行います(波長= 400 nm、強度= 15 mW/cm2、露光時間= 60秒)。
5.保存されたマイクロ多孔性を有するGHSの3Dバイオプリンティングのためのナノエンジニアリング粒状バイオインク(NGB)
- 4°Cの超純水3mLにナノプレートレット粉末100mgを加え、ナノ粒子分散液(3.33%w/v)を形成します。分散液を4°Cの冷蔵庫内で15分間激しくボルテックスし、凝集したナノ粒子を剥離します。適切に剥離されたナノ粒子は、透明な分散液を生成する。
- 50 mgのLAPを5 mLの4°C超純水に溶解し、ストックPI溶液(1% w/v)を調製しました。
- 剥離ナノ粒子分散液に333 μLのPI溶液(1% w/v)を加えます。周囲光から保護するためにアルミホイルで包みます。1分間ボルテックスし、ナノ粒子分散液とPIを混合する。最終的な粘土濃度とPI濃度はそれぞれ3%w / vと0.1%w / vです。
- エンジニアリング流体(4°C)中のPFO 20% v/vを物理的に架橋されたGelMA HMPに1:1の体積比で添加します。5秒間徹底的に渦巻きます。その後、300× g で15秒間遠心分離し、界面活性剤を含む油相を廃棄する。
- 洗浄したGelMA HMPsにLAP添加ナノ粒子分散液(4°C)を加えます。 ボルテックスで15秒間、3,000 × g で15秒間遠心分離し、底部に残っている油と上清分散液を廃棄します。
- 懸濁液をアルミホイルで光から保護しながら4°Cで1日間保存します。このステップの生成物が ゲルマNGBです。
- NGBを3 mLシリンジにセットし、ロードしたシリンジをキャップとパラフィルムで密封し、200 × g でパルス遠心分離して閉じ込められた空気を除去します。雌-雌Luer-Lokコネクタを使用して、バイオインクを3 mLカートリッジに移します。カートリッジを再び200 × g で短時間遠心分離して、閉じ込められた空気を取り除きます。NGBは冷蔵庫で4°Cで保管してからご使用ください。
- 細胞を含んだバイオインク調製の前に、100 μLの細胞培養培地に~2,400万個の細胞を含む濃縮細胞懸濁液(NIH/3T3マウス線維芽細胞など)を調製してください。細胞懸濁液を3 mLシリンジにロードし、雌-雌Luer-Lokコネクターを使用してNGB装填シリンジと細胞装填シリンジを結合し、細胞とNGBを40倍前後に押して穏やかに混合します。
- 標準的な円錐形ノズルを備えた適切なバイオプリンターを使用して、NGBまたは細胞を含んだNGBを印刷します。ノズルを3 mLプリントヘッドにセットします。印刷ベッドの温度を10°C未満に保ちます。 印刷前に 速度 や 背圧 などの印刷パラメータを最適化します。
- 基板とノズルのタイプ(標準の円錐形ノズルを備えた空気圧式3mLシリンジ)を選択し、デバイスガイドラインを使用してバイオプリンターを校正し、目的のgcodeまたはSTLファイルを選択して、印刷を開始します。
注:細胞を含んだバイオプリンティングを行う場合、汚染を最小限に抑えるために、すべての材料とデバイスを生物学的安全キャビネットの下に維持する必要があります。 - 印刷後、光架橋のためにコンストラクトをUV光にさらします(波長= 400 nm、強度= 15 mW / cm2、露光時間= 60秒)。
図3:GelMAミクロゲルとGHS形成の概略図。 (A)GelMAミクロゲルの油およびNGB調製物からの分離の概略図。PFO(エンジニアリング液中の20%v/v)をGelMAミクロゲル-オイルエマルジョンに1:1の体積比で添加し、続いて300 × gで15秒間ボルテックスおよび遠心分離を行った。GelMA GHSを作製するために、PI溶液(DPBS中のLAP 0.1% w/v)をGelMA HMPに添加し、続いて3,000 × gで15秒間ボルテックスおよび遠心分離を行った。NGBを調製するために、PI溶液(超純水中のLAP 0.1% w/v)およびナノプレートレット分散液(超純水中の3% w/v)をGelMA HMP懸濁液に添加し、続いてボルテックスおよび遠心分離を3,000 × gで15秒間行った。 図3Aは、Ataie, Z. et al.11(B)充填されたGelMA HMPを光にさらすとGHSが得られる。図3Bは、Sheikhiらの許可を得て改変した15略語:GelMA=ゼラチンメタクリロイル;GHS =粒状ヒドロゲル足場;NGB =ナノエンジニアリングされた粒状バイオインク;PFO = 1H,1H-パーフルオロ-1-オクタノール;PI =光開始剤;LAP = フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム;HMP = ヒドロゲル微粒子;DPBS = ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
GelMAは、図1Aに示すように、ゼラチンとMAの反応によって合成されました。MA濃度などの反応条件を調整することにより、異なる程度のMA置換が得られた。MA置換の程度を定量化するために、GelMAを1H NMR分光法を介して評価した(図1B)。~5-6 ppmの化学シフトに代表的なピークを持つビニル官能基は、ゼラチンからのGelMA合成の成功を確認しました。透析および滅菌濾過後の反応収率は>70%(GelMAのmg/ゼラチンのmg)であった。液滴/ミクロゲル作製収率は~100%であった。置換度24を定量化するために、異なる方法を用いることができる。リジンアミノ酸(1級アミン)の減少を、影響を受けていない芳香族酸プロトンを用いて式(1)に基づいて正規化して評価した。
HMPは通常、DPBSや細胞培養培地などの水性培地に懸濁されます。HMPの水和状態は、滅菌、出荷、保管、および長期安定性にいくつかの課題をもたらす可能性があります。MEtoPは、HMPの本来の分子特性やコロイド特性に影響を与えることなく、HMPを乾燥粉末に変換する新しい方法です25。MEtoP技術は、水性媒体ではなく揮発性油を使用してHMPを凝集や激しい変形から保護しながら、低圧凍結乾燥 によって 再懸濁可能な乾燥HMP(マイクロエアロゲル)を生成します(図2A)。この技術を使用して、ミクロゲルは凝集することなく個々に乾燥され(図2B)、したがって凍結乾燥後もそれらの球形を保持する(図2C)。これらの微粒子は、再水和時に初期特性を容易に回復し、組み立て時にGHSを形成する準備ができているHMP懸濁液を生成します。
ステップ乳化マイクロ流体デバイスは、水/油相の流量に関係なく、ハイスループットの単分散GelMA液滴を生成します。GelMAは感温性生体高分子であるため、温度を~4°Cに下げることで液滴が熱架橋HMPに変換されます。 安定したHMPは、PFO(20%v / v)を使用して油と界面活性剤を除去するためにすすぎます。油/界面活性剤を除去した後、GelMA HMPは、化学集合のためのPIまたは界面自己組織化のためのナノ粒子と混合することができます(図3A)。GHS形成は、光(波長= 400 nm、強度= 15 mW / cm2、露光時間= 60秒)を介したフリーラジカル重合を介して開始され、ミクロゲル-ミクロゲル結合をもたらします(図3B)。
微多孔性はGHSの主要な特性の1つであり、酸素と細胞の老廃物の交換、細胞の浸潤、遊走、および増殖を容易にします。マイクロポロシティを評価するために、高分子量蛍光色素を使用してHMP間の空隙空間を視覚化します。 図4A は、GHSスキャフォールドの上部と3Dビューを示し、緑色の領域は相互接続されたマイクロポロシティを示しています。 図4B は、細孔面積を検出するためにカスタム記述されたMATLABスクリプトを使用して評価された蛍光画像を示しています。ボイド率(図4C)と細孔等価径の中央値(図4D)の測定値は、GHSと3DプリントされたNGB足場の間に有意差を示さず、NGBのマイクロスケール細孔の利用可能性と相互接続性を証明しています。
図4:GelMA GHSおよびNGBの細孔特性評価。 (A)GHSおよびNGB足場の上部および3D正投影図。増分は100μmです。 (B)光架橋されたGelMA GHSおよびNGB用のカスタム記述されたMATLABコードを介したボイド領域および細孔検出の蛍光画像。スケールバー = 200 μm。 (C)ゲルマGHSおよびNGBのボイド率。(D)ゲルマGHSおよびNGBの中央値等価細孔径。この図は、Ataieらの許可を得て修正されました11略語:GelMA =ゼラチンメタクリロイル;GHS =粒状ヒドロゲル足場;NGB =ナノエンジニアリングされた粒状バイオインク;NS = 有意ではありません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
NGBは、マイクロポロシティが保存された印刷可能なHMP懸濁液として設計されています。NGBの押出し加工性と印刷適性を実証するために、図5に示すように、押出ベースの3D印刷を実行しました。PSUの文字はNGBを使用して印刷され、続いて光が露光されました(図5A)。密充填および緩充填のGelMA HMPに対するNGBの優位性を評価するために、吊りフィラメント長(LF)を測定した(図5B)。NGBは、充填されたHMPと比較して最も高いLfを有した。緩く充填されたHMPはフィラメントを生成しませんでした。さらに、中空シリンダーを3Dプリントし、コンストラクト全体を光架橋用の光にさらし(図5D)、物理的に保持して(図5E)、光架橋されたGelMA NGBの3D印刷適性と形状忠実度をそれぞれ実証しました。
図5:NGBとそれに続くUV光媒介光架橋の印刷適性(波長= 395-405 nm、強度= 15 mW / cm2、露光時間= 60秒)。 (A)蛍光標識されたNGBを使用して3D印刷されているPSU文字を示す印刷プロセスの概略図。スケールバー= 3 mm。 (B)NGB、密充填されたGelMA HMP、および緩く充填されたGelMA HMPを使用したフィラメント押出の視覚的比較。 スケールバー= 10 mm。 (C)NGBの吊りフィラメント長、密充填、および緩く充填された粒状ヒドロゲル。NGBは、密に充填されたミクロゲル(L f = 19.3 ± 0.7 mm、n = 10)よりも長い吊りフィラメント(フィラメント長Lf = 45.0 ± 5.0 mm、n = 10)を形成します。緩く充填されたミクロゲルは、液滴サイズ(Lf = 5.7 ± 0.7 mm、n = 10)のフィラメントを生成します。(D)NGBは、直径5mm、高さ10mmの中空円筒の3D印刷に使用された。 (E)構成物全体(d = 5およびh = 10mmの中空円筒)を印刷し、次いでUV光に露光した。層ごとの光架橋は、形状の忠実性を高める可能性がありますが、層が互いに架橋されないため、構造の完全性が低下します。中空の印刷されたシリンダーはピンセットを使用して保持され、機械的堅牢性を示しました。スケールバー= 1 cm。この図は、Ataieら11の略語から変更されました:NGB =ナノエンジニアリングされた粒状バイオインク;ゲルMA =ゼラチンメタクリロイル;HMP =ヒドロゲル微粒子。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ゼラチンとその誘導体は、HMP製造に最も一般的に使用されるタンパク質ベースの生体材料です。スループットと粒子サイズの単分散性のトレードオフの課題は、ステップ乳化マイクロ流体デバイスを使用して克服できます。これらのデバイスは、変動係数が5%未満で、毎時4,000万個以上の液滴を形成することができます27。本稿では、GelMA溶液を含む液滴を微細加工し、その後、GelMA HMP、粉末、GHS、NGBに変換する方法について説明しました。
GelMAの熱応答性により、マイクロ流体対応のHMP製造と安定化が容易になります。UCSTよりも高い温度(例えば、37°C)では、GelMAは水溶液に溶解し、ステップ乳化装置における油中水型エマルジョン形成に適した水性流体を得る。温度を下げると(例えば、4°C)、液滴形成後の物理的架橋 を介して GelMA HMPを形成することができます。GelMA HMPは、さまざまなアプローチを通じてGHS製造のビルディングブロックとして使用できます。熱的に安定なHMPは、機械的に堅牢なGHSを形成するために光アセンブルされ得、相互侵入浸透ネットワーク28を除いて、粒状足場の中で最も高い報告された圧縮弾性率の1つを達成する。光アセンブリ法では、GelMA HMPの融解を避けるために、すべての手順を低温(4°Cなど)で実行する必要があります。
HMPの3D(バイオ)印刷は、幾何学的に明確に定義されたGHSの製造を可能にします。ただし、これは密に充填されたHMPを使用して実行されており、付加的に製造された粒状構築物のマイクロ多孔性を損なっています。この課題に対処するために、HMP表面に吸着された不均一に荷電したナノ粒子の可逆的な自己組織化により、緩く充填されたHMPがせん断降伏し、マイクロポロシティが保存された3D印刷可能(NGB)になる方法を示します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、ペンシルベニア州立大学(ペンシルベニア州立大学)の化学工学科の研究支援スペシャリストであるT.ポンド、ペンシルベニア州立大学のナノファブリケーションラボのスタッフ、およびナノファブリケーションプロセスに関する支援と議論を提供してくれたPartillion BioscienceのJ.デルッテ博士に感謝します。A. Sheikhiは、材料研究所(MRI)と工学部の人間レベルの材料問題シード助成金、生活多機能材料システムのためのコンバージェンスセンター(LiMC2)とクラスターオブエクセレンスリビング、適応およびエネルギー自律材料システム(livMatS)リビング多機能材料共同研究シード助成プログラム、およびペンシルベニア州立大学からのスタートアップ基金の支援を認めています。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立生物医学画像生物工学研究所(NIBIB)によって、賞番号R56EB032672で部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
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