Summary
Dit artikel beschrijft protocollen voor high-throughput gelatine methacryloyl microgel fabricage met behulp van microfluïdische apparaten, het omzetten van microgels in resususpensable poeder (micro-aerogels), de chemische assemblage van microgels om granulaire hydrogel scaffolds te vormen, en het ontwikkelen van granulaire hydrogel bioinks met behoud van microporositeit voor 3D bioprinting.
Abstract
De opkomst van granulaire hydrogelsteigers (GHS), vervaardigd via het assembleren van hydrogelmicrodeeltjes (HMP's), heeft microporeuze steigervorming in situ mogelijk gemaakt. In tegenstelling tot conventionele bulkhydrogels, vergemakkelijken onderling verbonden poriën op microschaal in GHS degradatie-onafhankelijke celinfiltratie en overdracht van zuurstof, voedingsstoffen en cellulaire bijproducten. Methacryloyl-gemodificeerde gelatine (GelMA), een (foto)chemisch crosslinkable, op eiwitten gebaseerd biopolymeer dat cellijm en biologisch afbreekbare stoffen bevat, is op grote schaal gebruikt als een celresponsief / instructief biomateriaal. Het omzetten van bulk GelMA naar GHS kan een overvloed aan mogelijkheden bieden voor tissue engineering en regeneratie. In dit artikel demonstreren we de procedures van high-throughput GelMA microgel fabricage, conversie naar resususdable droge microgels (micro-aerogels), GHS-vorming via de chemische assemblage van microgels en granulaire bioinkfabricage voor extrusie bioprinting. We laten zien hoe een sequentiële fysisch-chemische behandeling via koeling en fotocrosslinking de vorming van mechanisch robuust GHS mogelijk maakt. Wanneer licht ontoegankelijk is (bijvoorbeeld tijdens diepe weefselinjectie), kunnen individueel verknoopte GelMA HMP's bioorthogonaal worden geassembleerd via enzymatische crosslinking met behulp van transglutaminasen. Ten slotte wordt driedimensionaal (3D) bioprinten van microporeus GHS bij lage HMP-verpakkingsdichtheid gedemonstreerd via de interfaciale zelfassemblage van heterogeen geladen nanodeeltjes.
Introduction
Het assembleren van HMP-bouwstenen om tissue engineering-steigers te vormen heeft de afgelopen jaren enorm veel aandacht gekregen1. GHS, vervaardigd via HMP-assemblage, heeft unieke eigenschappen in vergelijking met hun bulktegenhangers, waaronder microporositeit op celschaal afkomstig van de lege ruimtes tussen de discrete bouwstenen. Bijkomende eigenschappen, zoals injecteerbaarheid, modulariteit en ontkoppelde stijfheid van porositeit, maken GHS een veelbelovend platform om weefselherstel en regeneratie te verbeteren2. Verschillende biomaterialen zijn gebruikt voor ghs-fabricage, waaronder synthetische peg-gebaseerde polymeren3,4 en polysacchariden, zoals alginaat5 en hyaluronzuur 6,7. Onder natuurlijk afgeleide polymeren is het meest voorkomende op eiwitten gebaseerde biopolymeer voor GHS-fabricage GelMA 8,9,10,11, een crosslinkable, biocompatibele, bioadhesieve en biologisch afbreekbare biomateriaal 12,13.
HMP's kunnen worden vervaardigd via batch-emulsificatie8, stroomfocussen 14,15 of stap-emulgering9,11 microfluïdische apparaten, blending 16 of complexe coacervatie17,18. Meestal is er een afweging tussen de fabricagedoorvoer en HMP-monodispersiteit. De mengtechniek levert bijvoorbeeld onregelmatig gevormde en sterk gepolydisperseerde HMP's op. Batchemulgering of complexe coacervatie maakt de productie van grote volumes polydispersed bolvormige HMP's mogelijk. Stroomgerichte microfluïdische apparaten zijn gebruikt om sterk monodisperse druppels te fabriceren met een variatiecoëfficiënt van <5%, maar de doorvoer is aanzienlijk laag. In microfluïdische apparaten met stap-emulsificatie maken de sterk geparallelliseerde stappen de high-throughput fabricage van monodispersed HMP'smogelijk 19.
Methacryloyl-gemodificeerde gelatine (GelMA) HMP-bouwstenen zijn thermoresponsief en (foto)chemisch verknoopbaar, waardoor gemakkelijke GHS-fabricage mogelijk is20. Bij afkoeling onder de temperatuur van de bovenste kritische oplossing (UCST)21 (bv. bij 4 °C) worden druppels die een GelMA-oplossing bevatten, omgezet in fysiek verknoopte HMP's. Deze HMP-bouwstenen worden vervolgens verpakt met behulp van externe krachten (bijvoorbeeld via centrifugatie) om vastgelopen microgel-suspensies te verkrijgen. Tussendeeltjeskoppelingen worden via (foto)chemische crosslinking tussen aangrenzende HMP's tot stand gebracht om mechanisch robuust GHS14 te vormen. Een van de belangrijkste eigenschappen van GHS is microporositeit, waardoor gemakkelijke celpenetratie in vitro11 en verbeterde weefselingroei in vivo22 mogelijk is. Driedimensionaal (3D) bioprinten van HMP's wordt conventioneel uitgevoerd met behulp van dicht opeengepakte microgel-suspensies, waardoor de microporositeit23 in het gedrang komt.
We hebben onlangs een nieuwe klasse van granulaire bioinks ontwikkeld op basis van de interfaciale nano-engineering van GelMA-microgels via de adsorptie van heterogeen geladen nanodeeltjes, gevolgd door nanodeeltjes reversibele zelfassemblage. Deze strategie maakt los verpakte microgels afschuif- en extrusie-3D-bioprintbaar, waardoor de porositeit op microschaal van additief vervaardigd GHS11 behouden blijft. Dit artikel presenteert de methoden voor high-throughput GelMA-druppelfabricage, het omzetten van deze druppels in fysiek gekruiste HMP's, het fabriceren van GelMA HMP's met behulp van reusbaar poeder, GelMA GHS-formatie, GelMA nanoengineered granular bioink (NGB) -voorbereiding en 3D-bioprinting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
1. GelMA synthese
OPMERKING: GelMA-synthese moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) moeten altijd worden gebruikt.
- Voeg 200 ml dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS, 1x) toe aan een erlenmeyer en verwarm de oplossing tot 50 °C. Dek de kolf af met aluminiumfolie om verdamping te voorkomen.
- Voeg onder roeren bij 240 rpm 20 g gelatinepoeder toe aan de DPBS-oplossing bij 50 °C tot het poeder volledig is opgelost.
- Voeg 16, 2,5 of 0,5 ml methacrylaatanhydride (MA) druppelsgewijs toe aan de gelatineoplossing via een glazen Pasteurpipet om GelMA te synthetiseren met respectievelijk een hoge, gemiddelde of lage mate van methacryloylsubstitutie.
LET OP: MA is een gevaarlijk materiaal. De juiste PBM's moeten worden gebruikt bij het werken met MA. MA is ook lichtgevoelig, dus bescherm de reactie tegen licht door de kolf te omwikkelen met aluminiumfolie. - Voeg na 2 uur 400 ml DPBS bij 50 °C toe om de reactie te stoppen. Laat het roeren gedurende 10 minuten doorgaan bij 50 °C.
- Giet de oplossing in een dialysemembraanslang met 12-14 kDa moleculair gewicht afsnijding en plaats de slang vervolgens in een bekerglas van 5 L gevuld met 40 °C ultrapuur water. Roer het water op 240 rpm en 40 °C.
- Dialyseer de oplossing tegen ultrapuur water gedurende 10 dagen en ververs het water 2x per dag om niet-gereageerd methacrylaatanhydride, bijproducten en andere onzuiverheden te verwijderen.
- Voeg na 10 dagen 400 ml ultrapuur water van 40 °C toe aan de GelMA-oplossing. Roer de oplossing bij 240 rpm gedurende 15 min.
- Filter de oplossing tweemaal met koffiefilters, gevolgd door vacuümfiltratie via een vacuümfiltratie-eenheid van 0,2 μm.
- Giet 25 ml van de gefilterde oplossing in centrifugebuizen van 50 ml en vries ze in bij -80 °C, waarbij de buizen horizontaal worden geplaatst.
- Verwijder na 2 dagen de doppen en bedek de centrifugebuizen met laboratoriumdoekjes. Gebruik tape of een elastiekje om de doekjes stevig vast te houden.
- Lyofiliseer de bevroren GelMA-oplossing tot witte vaste GelMA.
- Om protonkernspinresonantie (1 H NMR) spectroscopie uit te voeren, voegt u afzonderlijk 30 mg gelatinepoeder (controle) of gelgelMA gelMA gelMA toe in 1ml deuteriumoxide (D2O) en houdt u de monsters op 37 °C totdat het gelatinepoeder of GelMA volledig is opgelost.
- Verkrijg de 1H NMR-spectra en bepaal de mate van methacryloylsubstitutie door de aromatische zuren en lysinemethyleenprotonpieken te integreren bij chemische verschuivingen van respectievelijk ~ 6,5-7,5 en ~ 3,0 ppm. Gebruik de piek van de aromatische zuren als referentie en bepaal de mate van substitutie (DS) met behulp van lysinemethyleenpieken op basis van vergelijking (1):
DS (%) = [1 - (Oppervlakte van lysinemethyleen in GelMA / Oppervlakte van lysinemethyleen in gelatine)] × 100 (1)
Figuur 1: GelMA synthese en karakterisering. (A) GelMA synthesereactie. Gelatine wordt gemodificeerd met methacrylanhydride bij 50 °C gedurende 2 uur. (B) De proton nucleaire magnetische resonantie (1H NMR) spectra van gelatine en GelMA: (a) de piek voor aromatische zuren, die is geselecteerd als referentie voor kalibratie, (b) vinyl functionele groep piekt na de MA-modificatie van gelatine, en (c) de piek voor lysine-eiwitten. In dit voorbeeld was de MA-substitutiegraad 71% ± 3% (n = 3). Dit cijfer is met toestemming van Ataie et al.11 gewijzigd Afkortingen: GelMA = gelatine methacryloyl; DPBS = Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing; MA = methacryloyl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. High-throughput GelMA microgel fabricage
- Apparaat master matrijs microfabricage
OPMERKING: Master mallen kunnen worden gemicrofabriceerd via zachte lithografie met behulp van de KMPR 1000 negatieve fotoresist serie19.- Ontdooi KMPR 1025 en 1035 's nachts. Vermijd blootstelling aan licht.
- Om de eerste laag op de wafer te coaten, voegt u KMPR 1025 direct toe aan het midden van de wafer om een cirkel van ongeveer 5 cm fotoresist te maken. Laat de spincoater 30 s lang op 3.000 tpm draaien.
- Zacht bakken gedurende 12 minuten op een kookplaat van 100 °C. Laat vervolgens 5 minuten afkoelen op de koelplaat.
- Bevestig het eerste laagmasker aan de blanke sodakalk en stel de gecoate wafer vervolgens bloot aan UV-licht met behulp van een maskeraligner voor 645 mJ / cm2 dosering.
- Bak na 3 min op een kookplaat van 100 °C. Laat 5 min afkoelen op de koelplaat.
OPMERKING: Ontwikkel niet na deze stap. Ontwikkel slechts één keer aan het einde van het proces. - Spin coat de tweede laag op de wafer met behulp van de KMPR 1035. Laat de spincoater 30 s lang op 1.000 tpm draaien.
- Bak zachtjes gedurende 30 minuten op een kookplaat van 100 °C. Laat 5 min afkoelen op de koelplaat.
- Bevestig het tweede laagmasker aan de lege sodakalk en lijn het tweede masker uit met behulp van de aligner via standaarduitlijningsborden. Blootstellen aan UV-licht met behulp van een maskeraligner tot 2.000 mJ/cm2.
- Bak na 5 min op een kookplaat van 100 °C.
- Ontwikkel >6 minuten in de SU-8 ontwikkelaar.
OPMERKING: Als de wafer er melkachtig uitziet, moet de ontwikkeling voor een langere tijd worden voortgezet. Gebruik elke keer en tussendoor een nieuwe ontwikkelaar voor een beter resultaat. - Spray met isopropanol. Zorg ervoor dat de wafel helder is, zonder melkachtige resten. Droog de wafer grondig met stikstof (N2) gas.
- Fabricage van microfluïdische apparaten
- Giet 50 g polydimethylsiloxaan (PDMS) basisdeel in een transparante plastic beker. Voeg vervolgens 5 g van de crosslinker toe aan de plastic beker. Meng de basis en crosslinker krachtig met een spatel tot een romige textuur is verkregen.
- Ontgast het mengsel met behulp van een exsiccator gedurende 20 minuten totdat het helder wordt. Giet het mengsel op de hoofdvorm, die erin wordt geplaatst en op een petrischaal wordt geplakt.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de dikte (hoogte) van het gegoten PDMS ≤8 mm is. - Doe de petrischaal in de exsiccator en ontgast het PDMS-mengsel opnieuw gedurende 20 minuten totdat alle belletjes zijn verwijderd. Plaats de petrischaal 2 uur in een oven van 70 °C totdat het PDMS is verknoopt. Haal de petrischaal uit de oven en laat afkoelen.
- Knip de apparaten uit de vorm met behulp van een scalpel. Maak de apparaten langzaam los van de hoofdmal. Gebruik de biopsiepons (diameter 1,5 mm) om gaten door de inlaten en de uitlaat te snijden.
- Verwijder stof van de PDMS-apparaten en de glasglaasjes met behulp van afplaktape en plaats de glasglaasjes en de apparaten in een plasmareinigingskamer. Voer de plasmabehandeling uit gedurende 45 s (beginnend wanneer de kamer paars wordt) met een luchtdruk van minder dan 400 mTorr. Verwijder de dia's en apparaten uit de kamer, plaats het apparaat op de glazen dia's en oefen lichte druk uit. Zet het apparaat 30 minuten in de oven van 70 °C om de hechting te verbeteren.
- Vul de apparaten met trichloor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silaan (F-silaan, 2% v / v) in de ontworpen vloeistof om het kanaaloppervlak fluorofiel te maken. Injecteer de F-silaanoplossing door het stopcontact en zorg ervoor dat alle apparaten worden blootgesteld. Wacht 5-10 min.
OPMERKING: F-silaan moet vers worden bereid. Bovendien mag F-silaan niet lang aan lucht worden blootgesteld. - Zuig de F-silaanoplossing uit het apparaat via de inlaat van de waterige oplossing. Was het apparaat twee keer met behulp van de technische vloeistof en zuig opnieuw op. Plaats het apparaat gedurende 30 minuten in de oven van 70 °C om de resterende olie te verdampen.
- Druppelvorming en GelMA microgel fabricage
- Voeg 10 mg lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfaat (LAP) toe aan 10 ml DPBS om een foto-initiator (PI)-oplossing (0,1% m/v) te bereiden. Bescherm de oplossing tegen licht door deze in aluminiumfolie te wikkelen.
- Los de gewenste hoeveelheid GelMA op in de PI-oplossing en plaats deze gedurende 1 uur in de oven van 37 °C totdat een heldere oplossing is verkregen. Bescherm de oplossing tegen licht door deze in aluminiumfolie te wikkelen.
- Om de oliefase voor te bereiden, maakt u een 2% v / v biocompatibele oppervlakteactieve oplossing in de technische vloeistof.
- Plaats de Tygon-buizen in de in- en uitlaat van het PDMS-apparaat. Steek een stompe naald van 25 G in het andere uiteinde van de Tygon-buis voor inlaten. Gebruik de minimaal mogelijke slanglengte.
- Plaats het apparaat onder de microscoop. Houd de omgeving warm (~40 °C) met behulp van een haardroger en/of een ruimteverwarming.
- Laad de waterige en olie-oplossingen in afzonderlijke spuiten, aangesloten op het apparaat. Start de spuitpompen met debieten van 160 en 80 μL/min voor respectievelijk de oliefase (continu) en waterige (gedispergeerde) fase.
OPMERKING: Start eerst de oliefase; Zorg ervoor dat de olie het kanaal vult en begin vervolgens met de waterige fase. - Verzamel de druppels in een container en evalueer ze in de beeldkamer via optische microscopiebeeldvorming.
- Plaats de druppels een nacht op 4 °C terwijl u ze beschermt tegen licht om GelMA HMP fysieke crosslinking te initiëren en de druppels om te zetten in stabiele microgels bij 4 °C.
3. Microgels omzetten in ophangbaar poeder via de microengineered emulsion-to-powder (MEtoP) technologie
OPMERKING: De MEtoP-technologie om de op water-in-olie-emulsie gebaseerde HMP's om te zetten in microdeeltjespoeder (micro-aerogels) met bewaarde eigenschappen, zoals ophangbaarheid, vorm, grootte en assemblage, is ontwikkeld.
- Om de MEtoP te implementeren, verzamelt u de fysiek verknoopte HMP's in de technische vloeistof met behulp van thermisch duurzame microcentrifugebuizen of cryovials. Open de doppen van de buis en sluit ze af met een laboratoriumdoekje en tape.
- Vries de fysiek verknoopte HMP's in vloeibare stikstof (-196 °C) gedurende 10 minuten in.
- Breng de flash-bevroren buizen over op een vriesdrogerinstrument. Lyofiliseer de buizen bij lage druk (bijv. 0,06 mbar) gedurende ten minste 6 uur om poeder te verkrijgen.
OPMERKING: Wanneer de lyofilisatiecyclus is voltooid, breekt u de druk langzaam zodat het poeder niet verloren gaat. - Voeg 1 ml gekoelde PI-oplossing (0,1% m/v, 4 °C) toe aan het poeder om microgelsuspensies te maken. Vortex gedurende 5 s, dan centrifugeren bij 3.000 × g gedurende 15 s. Gooi het supernatant weg.
- Breng de verpakte microgelsuspensie over in een mal met behulp van een pipet met positieve verplaatsing, gevolgd door blootstelling aan UV-licht bij een golflengte van 400 nm met een intensiteit van 15 mW / cm2 gedurende 60 s om GHS te vormen.
Figuur 2: GelMA microdeeltjes poederbereiding via MEtoP technologie. (A) Afbeeldingen van GelMA-poeder verkregen uit de MEtoP-technologie of conventionele lyofilisatie van HMP. In MEtoP-technologie of conventionele lyofilisatie worden HMP's gesuspendeerd in respectievelijk olie-oppervlakteactieve stof of waterige media. De technische vloeistof beschermt de gedispergeerde fase (HMP's) tegen aggregatie en behoudt de fysiochemische eigenschappen van GelMA-microdeeltjes tijdens lyofilisatie. (B) Schematische illustratie van gedroogde HMP's bereid via de MEtoP in vergelijking met conventioneel gelyofiliseerd HMP in een waterig medium. (C) SEM-beelden van gedroogde GelMA-microdeeltjes bereid via de MEtoP in vergelijking met conventionele lyofilisatie. Schaalbalken = 2 mm (links; A), 500 μm (rechts; A), 10 μm (links; C), en 200 μm (rechts; C). Dit cijfer is met toestemming gewijzigd van Sheikhi et al.26 Afkortingen: GelMA = gelatine methacryloyl; DPBS = Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing; MEtoP = microengineered emulsie-naar-poeder; HMP = hydrogel microdeeltje; SEM = scanning elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. GelMA GHS vorming
OPMERKING: Dit protocol is voor het bereiden van 400 μL microgel suspensie. Voor grotere hoeveelheden is opschaling nodig. Om de GelMA HMP's fysiek verknoopt te houden, moeten alle stappen bij ongeveer 4 °C worden uitgevoerd door de microgelcontainers in een ijswateremmer te plaatsen.
- Voeg 400 μL 1H,1H-perfluoro-1-octanol (PFO)-oplossing in de technische vloeistof (20% v/v) toe aan de fysiek verknoopte GelMA HMP's. Vervolgens vortex gedurende 5 s en centrifugeer gedurende 15 s bij 300 × g.
OPMERKING: De PFO-oplossing in de technische vloeistof moet vers worden bereid en in een afgesloten container worden bewaard om verdamping te voorkomen. - Verwijder de oliefase uit de GelMA HMP's via pipetteren.
- Voeg 400 μL PI-oplossing (0,1% m/v) bij 4 °C toe aan de microgelsuspensie. Vervolgens draaikolk gedurende 5 s en centrifugeer op 300 × g gedurende 15 s. Gooi de olie daarna weg.
- Herhaal de vorige stap, maar centrifugeer bij 3.000 × g. Verwijder het supernatant van verpakte GelMA HMP's via pipetteren.
- Breng de verpakte GelMA HMP's over in een mal met behulp van een pipet met positieve verplaatsing, gevolgd door blootstelling aan UV-licht (golflengte = 400 nm, intensiteit = 15 mW/cm2, belichtingstijd = 60 s).
5. Nanoengineered granulaire bioinks (NGB) voor het 3D-bioprinten van GHS met behoud van microporositeit
- Voeg 100 mg nanoplaatjespoeder toe aan 3 ml ultrapuur water van 4 °C om een nanodeeltjesdispersie te vormen (3,33% m/v). Vortex de dispersie krachtig in een koelkast van 4 °C gedurende 15 minuten om de anders geaggregeerde nanodeeltjes te exfoliëren. Goed geëxfolieerde nanodeeltjes leveren een duidelijke dispersie op.
- Los 50 mg LAP op in 5 ml ultrapuur water van 4 °C om een standaard PI-oplossing (1% m/v) te bereiden.
- Voeg 333 μL PI-oplossing (1% m/v) toe aan de geëxfolieerde nanodeeltjesdispersie. Wikkel in aluminiumfolie ter bescherming tegen omgevingslicht. Vortex gedurende 1 minuut om de nanodeeltjesdispersie en PI te mengen. De uiteindelijke klei- en PI-concentraties zijn respectievelijk 3% w/v en 0,1% w/v.
- Voeg PFO 20% v/v in technische vloeistof (4 °C) toe aan de fysiek verknoopte GelMA HMP's met een volumeverhouding van 1:1. Vortex grondig gedurende 5 s. Centrifugeer vervolgens gedurende 15 s op 300 × g en gooi de oliefase met de oppervlakteactieve stof weg.
- Voeg de LAP-aangevulde nanodeeltjesdispersie (4 °C) toe aan de gewassen GelMA HMP's. Vortex gedurende 15 s, centrifugeer bij 3.000 × g gedurende 15 s en gooi de resterende olie op de bodem weg, evenals de supernatantdispersie.
- Bewaar de suspensie bij 4 °C en bescherm deze tegen licht met aluminiumfolie gedurende 1 dag. Het product van deze stap is de GelMA NGB.
- Laad de NGB in een spuit van 3 ml, sluit de geladen spuit af met een dop en parafilm en puls centrifuge op 200 × g om de ingesloten lucht te verwijderen. Breng de bioink over in een patroon van 3 ml met behulp van een vrouwelijke-vrouwelijke Luer-Lok-connector. Centrifugeer de patroon nogmaals kort op 200 × g om de ingesloten lucht te verwijderen. Bewaar de NGB op 4 °C in een koelkast voor gebruik.
- Bereid vóór de celbeladen bioink-bereiding een geconcentreerde celsuspensie voor (bijv. NIH / 3T3 murine fibroblastcellen), die ~ 24 miljoen cellen bevat in 100 μL celkweekmedium. Laad de celsuspensie in een spuit van 3 ml, koppel de met een NGB geladen spuit en de met cellen geladen spuit met behulp van een vrouwelijke-vrouwelijke Luer-Lok-connector en meng de cellen en NGB voorzichtig door 40x heen en weer te duwen.
- Print de NGB of met cellen beladen NGB met behulp van een goede bioprinter met een standaard conisch mondstuk. Plaats het mondstuk in de printkop van 3 ml. Houd de temperatuur van het printbed onder de 10 °C. Optimaliseer afdrukparameters zoals snelheid en tegendruk voorafgaand aan het afdrukken.
- Selecteer het substraat- en spuittype (pneumatische spuit van 3 ml uitgerust met standaard conisch mondstuk), kalibreer de bioprinter met behulp van de richtlijnen van het apparaat, selecteer het gewenste gcode- of STL-bestand en begin met afdrukken.
OPMERKING: Bij het uitvoeren van met cellen beladen bioprinting moeten alle materialen en apparaten onder de biologische veiligheidskast worden gehouden om verontreiniging tot een minimum te beperken. - Stel de construct na het afdrukken bloot aan UV-licht voor fotocrosslinking (golflengte = 400 nm, intensiteit = 15 mW/cm2, belichtingstijd = 60 s).
Figuur 3: Schema's van GelMA-microgel en GHS-vorming. (A) Schema's van GelMA-microgelscheiding uit olie en NGB-preparaat. PFO (20% v/v in technische vloeistof) werd toegevoegd aan de GelMA microgel-olie-emulsie met een volumetrische verhouding van 1:1, gevolgd door vortexing en centrifugatie bij 300 × g gedurende 15 s. Om GelMA GHS te fabriceren, werd de PI-oplossing (LAP 0,1% w/v in DPBS) toegevoegd aan de GelMA HMP's, gevolgd door vortexing en centrifugatie bij 3.000 × g gedurende 15 s. Voor de bereiding van de NGB werden de PI-oplossing (LAP 0,1% m/v in ultrapuur water) en nanoplaatjesdispersie (3% m/v in ultrapuur water) toegevoegd aan de GelMA HMP-suspensie, gevolgd door vortexing en centrifugatie bij 3.000 × g gedurende 15 s. Figuur 3A werd gewijzigd met toestemming van Ataie, Z. et al.11 (B) Het blootstellen van verpakte GelMA HMP's aan licht levert GHS op. Figuur 3B is met toestemming van Sheikhi et al.15 Afgekortingen: GelMA = gelatine methacryloyl; GHS = korrelige hydrogel steiger; NGB = nanoengineered granulaire bioink; PFO = 1H,1H-perfluor-1-octanol; PI = foto-initiator; LAP = lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat; HMP = hydrogel microdeeltje; DPBS = Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GelMA werd gesynthetiseerd door de reactie van gelatine met MA, zoals weergegeven in figuur 1A. Door de reactiecondities, zoals MA-concentratie, aan te passen, werden verschillende gradaties van MA-substitutie verkregen. Om de mate van MA-substitutie te kwantificeren, werd GelMA beoordeeld via 1H NMR-spectroscopie (figuur 1B). Vinyl functionele groepen met representatieve pieken bij de chemische verschuivingen van ~5-6 ppm bevestigden de succesvolle GelMA synthese uit gelatine. De reactieopbrengst na dialyse en steriele filtratie was >70% (mg GelMA/mg gelatine). De druppel/microgel fabricage opbrengst was ~100%. Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de mate van substitutie te kwantificeren24. We beoordeelden de afname van lysine-aminozuur (primair amine), genormaliseerd met behulp van het niet-aangetaste aromatische zuurproton op basis van vergelijking (1).
HMP's worden gewoonlijk gesuspendeerd in waterige media, zoals DPBS of celkweekmedia. De gehydrateerde toestand van HMP's kan verschillende uitdagingen met zich meebrengen op het gebied van sterilisatie, verzending, opslag en stabiliteit op lange termijn. MEtoP is een nieuwe methode om HMP's om te zetten in gedroogd poeder zonder hun oorspronkelijke moleculaire en colloïdale eigenschappen aan te tasten25. De MEtoP-technologie levert reusbare, gedroogde HMP's (micro-aerogels) via vriesdrogen onder lage druk, terwijl de HMP's worden beschermd tegen aggregatie en ernstige vervorming met behulp van een vluchtige olie in plaats van een waterig medium (figuur 2A). Met behulp van deze techniek worden de microgels individueel gedroogd zonder aggregatie (figuur 2B), waardoor hun bolvorm na lyofilisatie behouden blijft (figuur 2C). Deze microdeeltjes herstellen gemakkelijk hun oorspronkelijke eigenschappen bij rehydratie, wat HMP-suspensies oplevert die klaar zijn om GHS te vormen bij montage.
Microfluïdische apparaten met stap-emulsificatie leveren monodisperse GelMA-druppels met hoge doorvoer, onafhankelijk van de waterige/oliefasedebieten. Omdat GelMA een thermogevoelig biopolymeer is, worden druppels omgezet in thermisch verknoopte HMP's door de temperatuur te verlagen tot ~ 4 ° C. De stabiele HMP's kunnen worden gespoeld om de olie en oppervlakteactieve stof te verwijderen met PFO (20% v/v). Na verwijdering van olie/oppervlakteactieve stoffen kunnen de GelMA HMP's worden gemengd met een PI voor chemische assemblage of met nanodeeltjes voor interfaciale zelfassemblage (figuur 3A). GHS-vorming wordt geïnitieerd via licht (golflengte = 400 nm, intensiteit = 15 mW/cm2, blootstellingstijd = 60 s)-gemedieerde polymerisatie van vrije radicalen, resulterend in microgel-microgelbinding (figuur 3B).
Microporositeit is een van de belangrijkste kenmerken van GHS, waardoor gemakkelijke zuurstof- en cellulaire afvaluitwisseling, celinfiltratie, migratie en proliferatie mogelijk zijn. Om de microporositeit te beoordelen, wordt een fluorescentiekleurstof met een hoog molecuulgewicht gebruikt om de lege ruimtes tussen de HMP's te visualiseren. Figuur 4A toont de bovenste en 3D-weergaven van GHS-steigers, waarbij het groene gebied de onderling verbonden microporositeit toont. Figuur 4B toont een fluorescentiebeeld, beoordeeld met behulp van een op maat geschreven MATLAB-script om het poriegebied te detecteren. Metingen van de lege fractie (figuur 4C) en de mediane porie-equivalente diameter (figuur 4D) laten geen significant verschil zien tussen GHS- en 3D-geprinte NGB-steigers, die getuigen van de beschikbaarheid en interconnectiviteit van microschaalporiën van NGB.
Figuur 4: Poriënkarakterisering van GelMA GHS en NGB. (A) Bovenste en 3D orthografische weergaven van GHS- en NGB-steigers. Stappen zijn 100 μm. (B) Het fluorescentiebeeld van leegtegebied en poriedetectie via een op maat geschreven MATLAB-code voor fotocrosslinked GelMA GHS en NGB. Schaalbalk = 200 μm. (C) De lege fractie van GelMA GHS en NGB. (D) De mediane equivalente poriediameter van GelMA GHS en NGB. Dit cijfer is met toestemming van Ataie et al.11 gewijzigd Afkortingen: GelMA = gelatine methacryloyl; GHS = korrelige hydrogel steiger; NGB = nanoengineered granulaire bioink; NS = niet-significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
NGB is ontworpen als een afdrukbare HMP-ophanging met behoud van microporositeit. Om de extrudeerbaarheid en printbaarheid van NGB aan te tonen, hebben we op extrusie gebaseerd 3D-printen uitgevoerd, zoals weergegeven in figuur 5. Psu-letters werden afgedrukt met behulp van de NGB, gevolgd door blootstelling aan licht (figuur 5A). Om de superioriteit van NGB ten opzichte van dicht opeengepakte en los verpakte GelMA HMP's te beoordelen, werd de hangende filamentlengte (Lf) gemeten (figuur 5B). De NGB had de hoogste Lf in vergelijking met de volgepakte HMP's. De los verpakte HMP's leverden geen filamenten op. Bovendien werd een holle cilinder 3D-geprint en werd het hele construct blootgesteld aan licht voor fotocrosslinking (figuur 5D) en fysiek vastgehouden (figuur 5E) om respectievelijk de 3D-printbaarheid en vormgetrouwheid van fotocrosslinked GelMA NGB aan te tonen.
Figuur 5: Printbaarheid van de NGB gevolgd door UV-licht gemedieerde fotocrosslinking (golflengte = 395-405 nm, intensiteit = 15 mW/cm2, belichtingstijd = 60 s). (A) Schema van het drukproces, met psu-letters die 3D-geprint worden met behulp van de fluorescerend gelabelde NGB. Schaalbalk = 3 mm. (B) Visuele vergelijking van filamentextrusie met behulp van de NGB, dicht opeengepakte GelMA HMP's en los verpakte GelMA HMP's. Schaalbalk = 10 mm. (C) Hangende filamentlengte van NGB, dicht opeengepakte en los verpakte korrelige hydrogels. De NGB vormt langere hangende filamenten (filamentlengte L f = 45,0 ± 5,0 mm, n = 10 ) dan dicht opeengepakte microgels (L f = 19,3 ± 0,7 mm, n = 10). De los verpakte microgels leveren druppelgrote (Lf = 5,7 ± 0,7 mm, n = 10) filamenten op. (D) De NGB werd gebruikt voor het 3D-printen van holle cilinders met een diameter van 5 mm en een hoogte van 10 mm. (E) De hele constructie (holle cilinder met d = 5 en h = 10 mm) werd geprint en vervolgens blootgesteld aan UV-licht. Laag-voor-laag fotocrosslinking kan de vormgetrouwheid verhogen, maar vermindert de structurele integriteit omdat de lagen niet aan elkaar zijn gekoppeld. De holle bedrukte cilinder werd vastgehouden met een pincet, wat mechanische robuustheid vertoonde. Schaalbalk = 1 cm. Dit cijfer is gewijzigd uit Ataie et al.11 Afkortingen: NGB = nanoengineered granular bioink; GelMA = gelatinemethacryloyl; HMP = hydrogel microdeeltje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelatine en zijn derivaten zijn de meest gebruikte biomaterialen op basis van eiwitten voor HMP-fabricage. De uitdaging van doorvoer versus deeltjesgrootte monodispersiteit trade-off kan worden overwonnen met behulp van stap-emulsificatie microfluïdische apparaten. Deze apparaten zijn in staat om meer dan 40 miljoen druppels per uur te vormen, met een variatiecoëfficiënt van minder dan 5%27. In dit artikel bespraken we de microfabricage van druppels die GelMA-oplossingen bevatten, gevolgd door ze om te zetten in GelMA HMP's, poeder, GHS en NGB.
De thermoresponsiviteit van GelMA maakt gemakkelijke microfluïdische HMP-fabricage en -stabilisatie mogelijk. Bij een temperatuur hoger dan de UCST (bijv. 37 °C) lost GelMA op in een waterige oplossing, wat een geschikte waterige vloeistof oplevert voor de vorming van water-in-olie-emulsie in stap-emulgeringsapparaten. Dalende temperatuur (bijv. 4 °C) maakt GelMA HMP-vorming mogelijk via fysieke crosslinking na druppelvorming. GelMA HMP's kunnen worden gebruikt als bouwstenen voor GHS-fabricage via verschillende benaderingen. Thermisch stabiele HMP's kunnen worden gefotografeerd om een mechanisch robuust GHS te vormen, waarbij een van de hoogste gerapporteerde compressiemoduli onder korrelige steigers wordt bereikt, met uitzondering van de in elkaar grijpende doorsijpelende netwerken28. Bij de fotoassemblagemethode moeten alle procedures worden uitgevoerd bij lage temperatuur (bijv. 4 °C) om te voorkomen dat GelMA HMP smelt.
Het 3D (bio)printen van HMP's maakt de fabricage van geometrisch goed gedefinieerde GHS mogelijk; dit is echter uitgevoerd met behulp van dicht opeengepakte HMP's, waardoor de microporositeit van additief vervaardigde granulaire constructies in gevaar is gebracht. Om deze uitdaging aan te gaan, laten we zien hoe de omkeerbare zelfassemblage van heterogeen geladen nanodeeltjes geadsorbeerd aan HMP-oppervlakken losjes verpakte HMP's afschuifbaar en 3D-printbaar (NGB) maakt met behoud van microporositeit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen T. Pond, onderzoeksondersteuningsspecialist bij de afdeling Chemical Engineering van de Pennsylvania State University (Penn State), de medewerkers van het Nanofabrication Lab van Penn State en Dr. J. de Rutte van Partillion Bioscience bedanken voor de hulp en discussie over nanofabricageprocessen. A. Sheikhi erkent de steun van het Materials Research Institute (MRI) en het College of Engineering Materials Matter at the Human Level seed grants, het Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) en het Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program en het startup-fonds van Penn State. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) van de National Institutes of Health (NIH) onder toekenningsnummer R56EB032672.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
- Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
- Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
- Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
- Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , 17/279,283 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
- Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , 17/425,027 (2022).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
- Charlet, A., Bono, F., Amstad, E.
