Summary
Denne artikkelen beskriver protokoller for høy gjennomstrømning gelatinmetakryloylmikrogelfabrikasjon ved bruk av mikrofluidiske enheter, konvertering av mikrogeler til resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), kjemisk montering av mikrogeler for å danne granulære hydrogelstillas og utvikling av granulære hydrogelbioblekk med bevart mikroporøsitet for 3D-bioprinting.
Abstract
Fremveksten av granulære hydrogelstillas (GHS), fremstilt ved montering av hydrogelmikropartikler (HMP), har muliggjort mikroporøs stillasdannelse in situ. I motsetning til konvensjonelle bulkhydrogeler, letter sammenkoblede mikroskalaporer i GHS nedbrytningsuavhengig celleinfiltrasjon, samt oksygen, næringsstoffer og cellulær biproduktoverføring. Metakryloylmodifisert gelatin (GelMA), en (foto) kjemisk tverrbindbar, proteinbasert biopolymer som inneholder celleklebende og biologisk nedbrytbare deler, har mye blitt brukt som et celleresponsivt / instruktivt biomateriale. Konvertering av bulk GelMA til GHS kan åpne en mengde muligheter for vevsteknikk og regenerering. I denne artikkelen demonstrerer vi prosedyrene for GelMA-mikrogelfabrikasjon med høy gjennomstrømning, konvertering til resuspenderbare tørre mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-dannelse via kjemisk montering av mikrogeler og granulær bioblekkfabrikasjon for ekstruderingsbioprinting. Vi viser hvordan en sekvensiell fysisk-kjemisk behandling via kjøling og fotokryssbinding muliggjør dannelse av mekanisk robuste GHS. Når lyset er utilgjengelig (f.eks. under dyp vevsinjeksjon), kan individuelt tverrbundne GelMA HMPs settes sammen bioortogonalt via enzymatisk kryssbinding ved bruk av transglutaminaser. Til slutt demonstreres tredimensjonal (3D) bioprinting av mikroporøs GHS ved lav HMP-pakketetthet via grensesnittets selvmontering av heterogent ladede nanopartikler.
Introduction
Montering av HMP-byggeklosser for å danne vevstekniske stillaser har fått enorm oppmerksomhet de siste årene1. GHS, produsert via HMP-montering, har unike egenskaper sammenlignet med sine bulk-kolleger, inkludert mikroporøsitet i celleskala som stammer fra tomrommene blant de diskrete byggeklossene. Ytterligere egenskaper, som injiserbarhet, modularitet og frakoblet stivhet fra porøsitet, gjør GHS til en lovende plattform for å forbedre vevsreparasjon og regenerering2. Ulike biomaterialer har blitt brukt til GHS-fabrikasjon, inkludert syntetiske PEG-baserte polymerer3,4 og polysakkarider, som alginat5 og hyaluronsyre 6,7. Blant naturlig avledede polymerer er den vanligste proteinbaserte biopolymeren for GHS-fabrikasjon GelMA 8,9,10,11, et tverrbindbart, biokompatibelt, bioadhesivt og biologisk nedbrytbart biomateriale 12,13.
HMP kan fremstilles via batchemulgering8, strømningsfokuserende 14,15 eller trinn-emulgering9,11 mikrofluidiske enheter, blanding 16 eller kompleks koacervasjon17,18. Vanligvis er det en avveining mellom fabrikasjonsgjennomstrømningen og HMP-monodispersiteten. For eksempel gir blandingsteknikken uregelmessig formede og svært polydispergerte HMPer. Batchemulgering eller kompleks koacervasjon muliggjør produksjon av store mengder polydispergerte sfæriske HMPer. Strømningsfokuserende mikrofluidiske enheter har blitt brukt til å fremstille svært monodisperserte dråper med en variasjonskoeffisient på <5%, men gjennomstrømningen er betydelig lav. I trinn-emulgering mikrofluidiske enheter, muliggjør de svært parallelle trinnene høy gjennomstrømningsfabrikasjon av monodisperserte HMPer19.
Metakryloylmodifisert gelatin (GelMA) HMP-byggeklosser er termoresponsive og (foto)kjemisk tverrbindbare, noe som muliggjør lett GHS-fabrikasjon20. Ved avkjøling under øvre kritiske løsningstemperatur (UCST)21 (f.eks. ved 4 °C) omdannes dråper som inneholder en GelMA-oppløsning til fysisk kryssbundne HMP-er. Disse HMP-byggesteinene pakkes deretter ved hjelp av eksterne krefter (f.eks. via sentrifugering) for å gi fastkjørte mikrogelsuspensjoner. Interpartikkelkoblinger etableres mellom tilstøtende HMP-er via (foto)kjemisk tverrbinding for å danne mekanisk robust GHS14. En av de viktigste egenskapene til GHS er mikroporøsitet, noe som muliggjør lettcellepenetrasjon in vitro11 og økt vevsinnvekst in vivo22. Tredimensjonal (3D) bioprinting av HMP utføres konvensjonelt ved bruk av tettpakkede mikrogelsuspensjoner, noe som kompromitterer mikroporøsiteten23.
Vi har nylig utviklet en ny klasse av granulære bioblekk basert på grensesnittet nanoengineering av GelMA mikrogeler via adsorpsjon av heterogent ladede nanopartikler, etterfulgt av nanopartikkel reversibel selvmontering. Denne strategien gjør løst pakkede mikrogeler skjærende og ekstrudering 3D bioprintable, noe som bevarer mikroskalaporøsiteten til additivt produsert GHS11. Denne artikkelen presenterer metodene for høy gjennomstrømning GelMA-dråpefabrikasjon, konvertering av disse dråpene til fysisk tverrbundne HMPer, fremstilling av GelMA HMPs ved bruk av resuspenderbart pulver, GelMA GHS-dannelse, GelMA nanoengineered granular bioink (NGB) forberedelse og 3D-bioprinting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, instrumenter og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. GelMA-syntese
MERK: GelMA-syntese skal utføres i en kjemisk avtrekkshette, og riktig personlig verneutstyr (PPE) bør brukes hele tiden.
- Tilsett 200 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS, 1x) til en Erlenmeyer-kolbe og varm opp oppløsningen til den når 50 °C. Dekk kolben med aluminiumsfolie for å forhindre fordampning.
- Tilsett 20 g gelatinpulver til DPBS-oppløsningen ved 50 °C under omrøring ved 240 o / min til pulveret er fullstendig oppløst.
- Tilsett 16, 2,5 eller 0,5 ml metakrylatanhydrid (MA) til gelatinoppløsningen dråpevis via en glass Pasteur-pipette for å syntetisere GelMA med henholdsvis høy, middels eller lav grad av metakryloylsubstitusjon.
FORSIKTIG: MA er et farlig materiale. Riktig PPE bør brukes når du arbeider med MA. MA er også lysfølsom, så beskytt reaksjonen mot lys ved å pakke kolben inn med aluminiumsfolie. - Etter 2 timer, tilsett 400 ml DPBS ved 50 °C for å stoppe reaksjonen. La omrøringen fortsette ved 50 °C i 10 minutter.
- Hell oppløsningen i et membranrør i dialyse med 12-14 kDa molekylvektgrense, og plasser deretter slangen i et 5 l beger fylt med 40 °C ultrarent vann. Rør vannet ved 240 o/min og 40 °C.
- Dialyser løsningen mot ultrarent vann i 10 dager og bytt vannet 2x om dagen for å fjerne uomsatt metakrylatanhydrid, biprodukter og andre urenheter.
- Etter 10 dager, tilsett 400 ml ultrarent vann ved 40 °C til GelMA-oppløsningen. Rør oppløsningen ved 240 o / min i 15 minutter.
- Filtrer oppløsningen to ganger ved hjelp av kaffefiltre, etterfulgt av vakuumfiltrering via en 0,2 μm vakuumfiltreringsenhet.
- Hell 25 ml av den filtrerte oppløsningen i 50 ml sentrifugerør og frys dem ved -80 °C, og plasser rørene horisontalt.
- Etter 2 dager, fjern kappene og dekk sentrifugerørene med laboratorieservietter. Bruk tape eller en gummistrikk for å holde våtserviettene tett.
- Lyofiliser den frosne GelMA-løsningen for å gi hvit, fast GelMA.
- For å utføre protonkjernemagnetisk resonans (1 H NMR) spektroskopi, tilsett separat 30 mg gelatinpulver (kontroll) eller lyofilisert GelMA i 1ml deuteriumoksid (D2O) og oppretthold prøvene ved 37 ° C til gelatinpulveret eller GelMA er helt oppløst.
- Oppnå 1H NMR-spektra og bestem graden av metakryloylsubstitusjon ved å integrere aromatiske syrer og lysinmetylenprotontopper ved kjemiske skift på henholdsvis ~ 6,5-7,5 og ~ 3,0 ppm. Bruk aromasyretoppen som referanse og bestem graden av substitusjon (DS) ved bruk av lysinmetylentopper basert på ligning (1):
DS (%) = [1 - (Areal av lysinmetylen i GelMA / Areal av lysinmetylen i gelatin)] × 100 (1)
Figur 1: GelMA-syntese og karakterisering . (A) GelMA-syntesereaksjon. Gelatin modifiseres med metakrylanhydrid ved 50 °C i 2 timer. (B) Protonkjernemagnetisk resonans (1H NMR) spektra av gelatin og GelMA: (a) toppen for aromatiske syrer, som er valgt som referanse for kalibrering, (b) vinylfunksjonell gruppe topper etter MA-modifikasjonen av gelatin, og (c) toppen for lysinproteiner. I dette eksemplet var MA-graden av substitusjon 71 % ± 3 % (n = 3). Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Ataie et al.11 Forkortelser: GelMA = gelatinmetakryloyl; DPBS = Dulbeccos fosfatbufrede saltvann; MA = metakryloyl. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. GelMA-mikrogelfabrikasjon med høy gjennomstrømning
- Enhetsmaster mold mikrofabrikasjon
MERK: Masterformer kan mikrofremstilles via myk litografi ved hjelp av KMPR 1000 negativ fotoresistserie19.- Tine KMPR 1025 og 1035 over natten. Unngå lyseksponering.
- For å belegge det første laget på skiven, legg til KMPR 1025 direkte på midten av platen for å lage en sirkel av fotoresist på ca. 5 cm. Kjør spinnbeleggeren ved 3,000 o / min i 30 s.
- Bløtstekt i 12 min på en kokeplate på 100 °C. Kjøl deretter ned på kjøleplaten i 5 min.
- Fest den første lagmasken til den tomme sodakalken, og utsett deretter den belagte skiven for UV-lys ved hjelp av en maskeregulering for 645 mJ / cm2 dosering.
- Stek etter stekingen i 3 min på en kokeplate på 100 °C. Kjøl ned på kjøleplaten i 5 min.
MERK: Ikke utvikle etter dette trinnet. Utvikle bare en gang på slutten av prosessen. - Spinn det andre laget på waferen ved hjelp av KMPR 1035. Kjør spinnbelegget ved 1000 o / min i 30 s.
- Bløtstekt i 30 min på en kokeplate på 100 °C. Kjøl ned på kjøleplaten i 5 min.
- Fest den andre lagmasken til den tomme bruskalken og juster den andre masken ved hjelp av reguleringen gjennom standard justeringsskilt. Utsett for UV-lys ved hjelp av en maskejustering opp til 2000 mJ / cm2.
- Stek etter stekingen i 5 min på en kokeplate på 100 °C.
- Utvikle i >6 min i SU-8 utvikleren.
MERK: Hvis skiven ser melkeaktig ut, bør utviklingen fortsette i lengre tid. Bruk fersk utvikler hver gang og i mellom for et bedre resultat. - Spray med isopropanol. Forsikre deg om at platen er klar, uten melkeaktige rester. Tørk skiven grundig med nitrogen (N2) gass.
- Fabrikasjon av mikrofluidisk enhet
- Hell 50 g polydimetylsiloksan (PDMS) basedel i en gjennomsiktig plastkopp. Tilsett deretter 5 g av tverrbinderen til plastkoppen. Bland basen og tverrbinderen med en slikkepott kraftig til en kremaktig tekstur er oppnådd.
- Vakuum degas blandingen ved hjelp av en tørketrommel i 20 minutter til den blir klar. Hell blandingen på hovedformen, som er plassert inne og tapet til en petriskål.
MERK: Pass på at tykkelsen (høyden) på den hellede PDMS er ≤8 mm. - Sett petriskålen i tørkeren og vakuum degas PDMS-blandingen igjen i 20 minutter til alle boblene er fjernet. Sett petriskålen i en ovn på 70 °C i 2 timer til PDMS-en er tverrbundet. Ta petriskålen ut av ovnen og la den avkjøles.
- Klipp enhetene ut av formen ved hjelp av en skalpell. Løsne enhetene sakte fra hovedformen. Bruk biopsistansen (1,5 mm diameter) til å skjære hull gjennom innløpene og utløpet.
- Fjern støv fra PDMS-enhetene og glasslysbildene ved hjelp av maskeringstape, og plasser glasslysbildene og enhetene i et plasmarensekammer. Utfør plasmabehandlingen i 45 s (starter når kammeret blir lilla) med lufttrykk under 400 mTorr. Fjern lysbildene og enhetene fra kammeret, sett enheten på glasslysbildene og bruk lite trykk. Sett apparatet i 70 °C ovnen i 30 minutter for å forbedre bindingen.
- Fyll enhetene med triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl)silan (F-silan, 2% v / v) i den konstruerte væsken for å gjøre kanaloverflaten fluorofil. Injiser F-silanoppløsningen gjennom stikkontakten og sørg for at alle enhetene er utsatt. Vent i 5-10 min.
MERK: F-silan bør tilberedes ferskt. I tillegg bør F-silan ikke utsettes for luft i lang tid. - Aspirer F-silanoppløsningen ut av enheten gjennom innløpet til den vandige oppløsningen. Vask enheten to ganger med teknisk væske og aspirer igjen. Sett apparatet i 70 °C ovnen i 30 minutter for å fordampe resten av oljen.
- Dråpedannelse og GelMA mikrogelfabrikasjon
- Tilsett 10 mg litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfat (LAP) til 10 ml DPBS for å fremstille en fotoinitiator (PI) løsning (0,1% w/v). Beskytt løsningen mot lys ved å pakke den inn i aluminiumsfolie.
- Løs opp ønsket mengde GelMA i PI-oppløsningen og sett den i 37 °C ovnen i 1 time til en klar oppløsning er oppnådd. Beskytt løsningen mot lys ved å pakke den inn i aluminiumsfolie.
- For å forberede oljefasen, lag en 2% v / v biokompatibel overflateaktiv løsning i konstruksjonsvæsken.
- Sett inn Tygon-slangen i innløpene og utløpet til PDMS-enheten. Sett inn en 25 G butt kanyle i den andre enden av Tygon-slangen for innløp. Bruk minst mulig slangelengde.
- Plasser enheten under mikroskopet. Hold miljøet varmt (~ 40 ° C) ved hjelp av en hårføner og / eller en romvarmer.
- Legg de vandige og oljeoppløsningene i separate sprøyter, koblet til enheten. Start sprøytepumpene med strømningshastigheter på 160 og 80 μL/min for henholdsvis oljefasen (kontinuerlig) og vandige (dispergerte).
MERK: Start oljefasen først; Forsikre deg om at oljen fyller kanalen, og start deretter den vandige fasen. - Samle dråpene i en beholder og evaluer dem i bildekammeret via optisk mikroskopiavbildning.
- Plasser dråpene ved 4 ° C over natten mens du beskytter dem mot lys for å starte GelMA HMP fysisk tverrbinding og konvertere dråpene til stabile mikrogeler ved 4 ° C.
3. Konvertering av mikrogeler til resuspenderbart pulver via mikrokonstruert emulsjon-til-pulver (MEtoP) -teknologi
MERK: MEtoP-teknologien for å konvertere vann-i-oljeemulsjonsbaserte HMP-er til mikropartikkelpulver (mikroaerogeler) med bevarte egenskaper, som resuspenderbarhet, form, størrelse og montering, er utviklet.
- For å implementere MEtoP, samle de fysisk tverrbundne HMPene i ingeniørvæsken ved hjelp av termisk holdbare mikrosentrifugerør eller kryovialer. Åpne rørhettene og forsegl dem med en laboratorieserviett og tape.
- Dypfrys de fysisk tverrbundne HMP-ene i flytende nitrogen (-196 °C) i 10 minutter.
- Overfør de flashfrosne rørene til et frysetørkerinstrument. Lyofiliser rørene ved lavt trykk (f.eks. 0,06 mbar) i minst 6 timer for å gi pulver.
MERK: Når lyofiliseringssyklusen er ferdig, bryt trykket sakte slik at pulveret ikke går tapt. - Tilsett 1 ml avkjølt PI-oppløsning (0,1 % w/v, 4 °C) til pulveret for å lage mikrogelsuspensjoner. Vortex i 5 s, deretter sentrifuge ved 3000 × g i 15 s. Kast supernatanten.
- Overfør den pakkede mikrogelsuspensjonen til en form ved hjelp av en positiv fortrengningspipette, etterfulgt av UV-lyseksponering ved 400 nm bølgelengde med en intensitet på 15 mW/cm2 i 60 s for å danne GHS.
Figur 2: GelMA mikropartikkelpulverfremstilling via MEtoP-teknologi. (A) Bilder av GelMA-pulver hentet fra MEtoP-teknologien eller konvensjonell lyofilisering av HMP. I MEtoP-teknologi eller konvensjonell lyofilisering suspenderes HMP i henholdsvis olje-surfaktant eller vandige medier. Ingeniørvæsken beskytter den dispergerte fasen (HMP) mot aggregering og bevarer de fysiokjemiske egenskapene til GelMA-mikropartikler under lyofilisering. (B) Skjematisk illustrasjon av tørkede HMPs fremstilt via MEtoP sammenlignet med konvensjonelt lyofilisert HMP i et vandig medium. (C) SEM-bilder av tørkede GelMA-mikropartikler fremstilt via MEtoP sammenlignet med konvensjonell lyofilisering. Skalastenger = 2 mm (venstre; A), 500 μm (høyre; A), 10 μm (venstre; C), og 200 μm (høyre; C). Denne figuren ble modifisert med tillatelse fra Sheikhi et al.26 Forkortelser: GelMA = gelatin metakryloyl; DPBS = Dulbeccos fosfatbufrede saltvann; MEtoP = mikrokonstruert emulsjon til pulver; HMP = hydrogel mikropartikkel; SEM = skanning elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. GelMA GHS dannelse
MERK: Denne protokollen er for fremstilling av 400 μL mikrogelsuspensjon. For større mengder er det nødvendig med oppskalering. For å holde GelMA HMPs fysisk tverrbundet, bør alle trinnene utføres ved ca. 4 ° C ved å plassere mikrogelbeholderne i en isvannsbøtte.
- Tilsett 400 μL 1H, 1H-perfluoro-1-oktanol (PFO) løsning i ingeniørvæsken (20% v / v) til de fysisk tverrbundne GelMA HMPs. Deretter virvel i 5 s og sentrifuge i 15 s ved 300 × g.
MERK: PFO-løsningen i konstruksjonsvæsken skal tilberedes ferskt og lagres i en lukket beholder for å forhindre fordampning. - Fjern oljefasen fra GelMA HMPs via pipettering.
- Tilsett 400 mikrogelens suspensjon (0,1 % w/v) ved 4 °C. Deretter virvel for 5 s og sentrifuge ved 300 × g i 15 s. Kast oljen etterpå.
- Gjenta forrige trinn, men sentrifuge ved 3000 × g. Fjern supernatanten til pakkede GelMA HMP-er via pipettering.
- Overfør de pakkede GelMA HMP-ene til en form ved hjelp av en positiv fortrengningspipette, etterfulgt av UV-lyseksponering (bølgelengde = 400 nm, intensitet = 15 mW/cm2, eksponeringstid = 60 s).
5. Nanoengineered granulære bioblekk (NGB) for 3D bioprinting av GHS med bevart mikroporøsitet
- Tilsett 100 mg nanoplateletpulver til 3 ml 4 ° C ultrarent vann for å danne en nanopartikkeldispersjon (3,33% w / v). Virvel dispersjonen kraftig inne i et 4 ° C kjøleskap i 15 minutter for å eksfoliere de ellers aggregerte nanopartiklene. Riktig eksfolierte nanopartikler gir en klar spredning.
- Løs opp 50 mg LAP i 5 ml 4 °C ultrarent vann for å tilberede en stamløsning (1 % w/v).
- Tilsett 333 μL PI-oppløsning (1% w / v) til den eksfolierte nanopartikkeldispersjonen. Pakk inn i aluminiumsfolie for å beskytte mot omgivelseslys. Vortex i 1 min for å blande nanopartikkeldispersjonen og PI. Den endelige konsentrasjonen av leire og PI er henholdsvis 3 % w/v og 0,1 % w/v.
- Tilsett PFO 20 % v/v i konstruksjonsvæske (4 °C) til de fysisk kryssbundne GelMA HMP-ene i et volumforhold på 1:1. Vortex grundig i 5 s. Deretter sentrifuger ved 300 × g i 15 s og kast bort oljefasen som inneholder overflateaktivt middel.
- Tilsett LAP-supplert nanopartikkeldispersjon (4 ° C) til de vasket GelMA HMPs. Vortex i 15 s, sentrifuge ved 3000 × g i 15 s, og kast den gjenværende oljen i bunnen, så vel som supernatantdispersjonen.
- Oppbevar suspensjonen ved 4 °C mens du beskytter den mot lys med aluminiumsfolie i 1 dag. Produktet av dette trinnet er GelMA NGB.
- Legg NGB i en 3 ml sprøyte, forsegl den fylte sprøyten med en hette og parafilm, og pulssentrifuge ved 200 × g for å fjerne den fangede luften. Overfør bioblekket til en 3 ml kassett ved hjelp av en hunn-hunn Luer-Lok-kontakt. Sentrifuger patronen kort ved 200 × g igjen for å fjerne den fangede luften. Oppbevar NGB ved 4 °C i kjøleskap før bruk.
- Før cellebelastet bioblekkpreparasjon, lag en konsentrert cellesuspensjon (f.eks. NIH / 3T3 murine fibroblastceller), som inneholder ~ 24 millioner celler i 100 μL cellekulturmedium. Legg cellesuspensjonen i en 3 ml sprøyte, koble den NGB-lastede sprøyten og den cellefylte sprøyten ved hjelp av en hunn-hunn Luer-Lok-kontakt, og bland cellene og NGB forsiktig ved å skyve frem og tilbake 40x.
- Skriv ut NGB eller cellebelastet NGB ved hjelp av en skikkelig bioprinter med en standard konisk dyse. Legg dysen inn i skrivehodet på 3 ml. Hold temperaturen under 10 °C. Optimaliser utskriftsparametere som hastighet og mottrykk før utskrift.
- Velg underlag og dysetype (pneumatisk 3 ml sprøyte utstyrt med standard konisk dyse), kalibrer bioprinteren ved hjelp av enhetens retningslinjer, velg ønsket gcode eller STL-fil, og start utskriften.
MERK: Når du utfører cellebelastet bioprinting, bør alle materialer og enheter opprettholdes under det biologiske sikkerhetsskapet for å minimere forurensning. - Etter utskriften, utsett konstruksjonen for UV-lys for fotokryssbinding (bølgelengde = 400 nm, intensitet = 15 mW / cm2, eksponeringstid = 60 s).
Figur 3: Skjema for GelMA-mikrogel- og GHS-dannelse. (A) Skjemaer av GelMA-mikrogelseparasjon fra olje og NGB-preparat. PFO (20% v / v i ingeniørvæske) ble tilsatt til GelMA-mikrogeloljeemulsjonen ved et volumetrisk forhold på 1: 1, etterfulgt av vortexing og sentrifugering ved 300 × g i 15 s. For å fremstille GelMA GHS ble PI-løsningen (LAP 0,1% w/v i DPBS) tilsatt til GelMA HMPs, etterfulgt av vortexing og sentrifugering ved 3000 × g i 15 s. For fremstilling av NGB ble PI-løsningen (LAP 0,1% w / v i ultrarent vann) og nanoplateletdispersjon (3% w / v i ultrarent vann) tilsatt til GelMA HMP-suspensjonen, etterfulgt av vortexing og sentrifugering ved 3,000 × g i 15 s. Figur 3A ble modifisert med tillatelse fra Ataie, Z. et al.11 (B) Eksponering av pakkede GelMA HMPs for lys gir GHS. Figur 3B ble modifisert med tillatelse fra Sheikhi et al.15 Forkortelser: GelMA = gelatinmetakryloyl; GHS = granulært hydrogelstillas; NGB = nanoengineered granulært bioblekk; PFO = 1H,1H-perfluoro-1-oktanol; PI = fotoinitiator; LAP = litiumfenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfinat; HMP = hydrogel mikropartikkel; DPBS = Dulbeccos fosfatbufrede saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GelMA ble syntetisert gjennom reaksjonen av gelatin med MA, som presentert i figur 1A. Ved å skreddersy reaksjonsbetingelsene, slik som MA-konsentrasjon, ble forskjellige grader av MA-substitusjon oppnådd. For å kvantifisere graden av MA-substitusjon ble GelMA vurdert med 1H NMR-spektroskopi (figur 1B). Vinylfunksjonelle grupper med representative topper ved kjemiske skift på ~ 5-6 ppm bekreftet den vellykkede GelMA-syntesen fra gelatin. Reaksjonsutbyttet etter dialyse og steril filtrering var >70 % (mg GelMA/mg gelatin). Den dråpe / microgel fabrikasjon utbyttet var ~ 100%. Ulike metoder kan brukes for å kvantifisere graden av substitusjon24. Vi vurderte reduksjonen av lysinaminosyre (primær amin), normalisert ved bruk av uaffisert aromasyreproton basert på ligning (1).
HMP er vanligvis suspendert i vandige medier, for eksempel DPBS eller cellekulturmedier. Den hydrerte tilstanden til HMP kan introdusere flere utfordringer i sterilisering, frakt, lagring og langsiktig stabilitet. MEtoP er en ny metode for å konvertere HMP til tørket pulver uten å påvirke deres opprinnelige molekylære og kolloidale egenskaper25. MEtoP-teknologien gir resuspenderbare, tørkede HMP-er (mikroaerogeler) via frysetørking med lavt trykk, samtidig som HMP-ene beskyttes mot aggregering og alvorlig deformasjon ved bruk av en flyktig olje, i stedet for et vandig medium (figur 2A). Ved hjelp av denne teknikken tørkes mikrogelene individuelt uten aggregering (figur 2B), og beholder dermed sin sfæriske form etter lyofilisering (figur 2C). Disse mikropartiklene gjenoppretter lett sine opprinnelige egenskaper ved rehydrering, noe som gir HMP-suspensjoner som er klare til å danne GHS ved montering.
Trinn-emulgering mikrofluidiske enheter gir høy gjennomstrømning monodisperserte GelMA-dråper, uavhengig av de vandige / oljefasestrømningshastighetene. Siden GelMA er en termosensitiv biopolymer, blir dråper omdannet til termisk kryssbundne HMP ved å redusere temperaturen til ~ 4 ° C. De stabile HMP-ene kan skylles for å fjerne olje og surfaktant ved bruk av PFO (20% v/v). Etter fjerning av olje / surfaktant kan GelMA HMPs blandes med en PI for kjemisk montering eller med nanopartikler for grenseflate-selvmontering (figur 3A). GHS-dannelse initieres via lys (bølgelengde = 400 nm, intensitet = 15 mW/cm2, eksponeringstid = 60 s)-mediert friradikalpolymerisasjon, noe som resulterer i mikrogel-mikrogelbinding (figur 3B).
Mikroporøsitet er en av de viktigste egenskapene til GHS, noe som muliggjør lett oksygen- og cellulær avfallsutveksling, celleinfiltrasjon, migrasjon og spredning. For å vurdere mikroporøsiteten brukes et fluorescensfargestoff med høy molekylvekt for å visualisere tomromrommene blant HMP-ene. Figur 4A viser topp- og 3D-visningene av GHS-stillas, med det grønne området som viser den sammenkoblede mikroporøsiteten. Figur 4B viser et fluorescensbilde, vurdert ved hjelp av et spesialskrevet MATLAB-skript for å oppdage poreområdet. Målinger av tomromfraksjon (figur 4C) og median porekvivalent diameter (figur 4D) viser ingen signifikant forskjell mellom GHS og 3D-printede NGB-stillaser, noe som vitner om tilgjengeligheten og sammenkoblingen av mikroskalaporene til NGB.
Figur 4: Porekarakterisering av GelMA GHS og NGB. (A) Topp og 3D ortografiske visninger av GHS og NGB stillas. Inkrementer er 100 μm. (B) Fluorescensbildet av tomrom og poredeteksjon via en spesialskrevet MATLAB-kode for fototverrbundet GelMA, GHS og NGB. Skala bar = 200 μm. (C) Voidfraksjonen av GelMA, GHS og NGB. (D) Median ekvivalent porediameter av GelMA, GHS og NGB. Denne figuren ble modifisert med tillatelse fra Ataie et al.11 Forkortelser: GelMA = gelatinmetakryloyl; GHS = granulært hydrogelstillas; NGB = nanoengineered granulært bioblekk; NS = ikke-signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
NGB er utformet som en utskrivbar HMP-fjæring med bevart mikroporøsitet. For å demonstrere NGBs ekstruderbarhet og trykkbarhet utførte vi ekstruderingsbasert 3D-printing, som vist i figur 5. PSU-bokstaver ble skrevet ut med NGB, etterfulgt av lyseksponering (figur 5A). For å vurdere NGBs overlegenhet til tett pakket og løst pakket GelMA HMP, ble den hengende filamentlengden (Lf) målt (figur 5B). NGB hadde den høyeste Lf sammenlignet med de pakkede HMP-ene. De løst pakkede HMP-ene ga ikke filamenter. I tillegg ble en hul sylinder 3D-printet, og hele konstruksjonen ble utsatt for lys for fotocrosslinking (figur 5D) og fysisk holdt (figur 5E) for å demonstrere henholdsvis 3D-utskriftsevnen og formtroskapen til fotokryssbundet GelMA NGB.
Figur 5: Utskriftsevne for NGB etterfulgt av UV-lysmediert fotokryssbinding (bølgelengde = 395-405 nm, intensitet = 15 mW / cm2, eksponeringstid = 60 s). (A) Skjematisk av utskriftsprosessen, som viser PSU-bokstaver som 3D-skrives ut ved hjelp av fluorescerende merket NGB. Skalastang = 3 mm. (B) Visuell sammenligning av filamentekstrudering ved bruk av NGB, tettpakkede GelMA HMP-er og løst pakkede GelMA HMP-er. Skalastang = 10 mm. (C) Hengende filamentlengde av NGB, tett pakket og løst pakket granulære hydrogeler. NGB danner lengre hengende filamenter (filamentlengde L f = 45,0 ± 5,0 mm, n = 10) enn tettpakkede mikrogeler (Lf = 19,3 ± 0,7 mm, n = 10). De løst pakkede mikrogelene gir dråpestørrelse (Lf = 5,7 ± 0,7 mm, n = 10) filamenter. (D) NGB ble brukt til 3D-utskrift av hule sylindere med en diameter på 5 mm og en høyde på 10 mm. (E) Hele konstruksjonen (hul sylinder med d = 5 og h = 10 mm) ble skrevet ut og deretter utsatt for UV-lys. Fototverrbinding lag for lag kan øke formfideliteten, men reduserer strukturell integritet ettersom lagene ikke kryssbindes sammen. Den hule trykte sylinderen ble holdt med pinsett, som viser mekanisk robusthet. Skala bar = 1 cm. Denne figuren ble modifisert fra Ataie et al.11 Forkortelser: NGB = nanoengineered granular bioink; GelMA = gelatinmetakryloyl; HMP = hydrogel mikropartikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelatin og dets derivater er de mest brukte proteinbaserte biomaterialene for HMP-fabrikasjon. Utfordringen med kompromiss mellom gjennomstrømning og monodispersjon av partikkelstørrelse kan overvinnes ved hjelp av mikrofluidiske enheter for trinnemulgering. Disse enhetene er i stand til å danne mer enn 40 millioner dråper per time, med en variasjonskoeffisient mindre enn 5%27. I denne artikkelen diskuterte vi mikrofabrikasjon av dråper som inneholder GelMA-løsninger, etterfulgt av å konvertere dem til GelMA HMPs, pulver, GH og NGB.
Termoresponsiviteten til GelMA muliggjør enkel mikrofluidisk aktivert HMP-fabrikasjon og stabilisering. Ved en temperatur høyere enn UCST (f.eks. 37 ° C), oppløses GelMA i en vandig løsning, noe som gir en egnet vandig væske for vann-i-olje-emulsjonsdannelse i trinn-emulgeringsanordninger. Synkende temperatur (f.eks. 4 °C) muliggjør dannelse av GelMA HMP via fysisk kryssbinding etter dråpedannelse. GelMA HMPs kan brukes som byggesteiner for GHS fabrikasjon gjennom ulike tilnærminger. Termisk stabile HMP-er kan fotomonteres for å danne en mekanisk robust GHS, og oppnå en av de høyeste rapporterte kompresjonsmodulene blant granulære stillas, unntatt de interpenetrerende perkolerende nettverkene28. I fotomonteringsmetoden skal alle prosedyrene utføres ved lav temperatur (f.eks. 4 ° C) for å unngå GelMA HMP-smelting.
3D (bio)printing av HMP-er muliggjør fremstilling av geometrisk veldefinerte GHS; Dette har imidlertid blitt utført ved hjelp av tettpakkede HMP-er, noe som kompromitterer mikroporøsiteten til additivt produserte granulære konstruksjoner. For å møte denne utfordringen viser vi hvordan reversibel selvmontering av heterogent ladede nanopartikler adsorbert til HMP-overflater gjør løst pakket HMP skjærutbyttende og 3D-utskrivbar (NGB) med bevart mikroporøsitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke T. Pond, forskningsstøttespesialist ved Institutt for kjemisk ingeniørfag ved Pennsylvania State University (Penn State), Nanofabrication Lab-personalet ved Penn State og Dr. J. de Rutte fra Partillion Bioscience for hjelp og diskusjon om nanofabrikasjonsprosesser. A. Sheikhi anerkjenner støtten fra Materials Research Institute (MRI) og College of Engineering Materials Matter på menneskelig nivå frøtilskudd, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) og Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program, og oppstartsfondet fra Penn State. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble delvis støttet av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) fra National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R56EB032672.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
- Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
- Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
- Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
- Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , 17/279,283 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
- Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , 17/425,027 (2022).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
- Charlet, A., Bono, F., Amstad, E.
