Summary
Denna artikel beskriver protokoll för gelatinmetakrylylmikrogeltillverkning med hög genomströmning med hjälp av mikrofluidiska anordningar, omvandling av mikrogeler till resuspenderbart pulver (mikroaerogeler), kemisk sammansättning av mikrogeler för att bilda granulära hydrogelställningar och utveckling av granulära hydrogelbiobläck med bevarad mikroporositet för 3D-bioprinting.
Abstract
Framväxten av granulära hydrogelställningar (GHS), tillverkade via montering av hydrogelmikropartiklar (HMP), har möjliggjort mikroporös ställningsbildning in situ. Till skillnad från konventionella bulkhydrogeler underlättar sammankopplade porer i mikroskala i GHS nedbrytningsoberoende cellinfiltration samt överföring av syre, näringsämnen och cellulära biprodukter. Metaakryloylmodifierat gelatin (GelMA), en (foto) kemiskt tvärbindningsbar, proteinbaserad biopolymer innehållande celllim och biologiskt nedbrytbara delar, har i stor utsträckning använts som ett cellresponsivt / instruktivt biomaterial. Konvertering av bulk GelMA till GHS kan öppna en uppsjö av möjligheter för vävnadsteknik och regenerering. I den här artikeln demonstrerar vi procedurerna för GelMA-mikrogeltillverkning med hög kapacitet, omvandling till resuspenderbara torra mikrogeler (mikroaerogeler), GHS-bildning via kemisk montering av mikrogeler och granulär biobläcktillverkning för extruderingsbioprinting. Vi visar hur en sekventiell fysikalisk-kemisk behandling via kylning och fototvärbindning möjliggör bildandet av mekaniskt robust GHS. När ljus är otillgängligt (t.ex. under djup vävnadsinjektion) kan individuellt tvärbundna GelMA HMP monteras bioortogonalt via enzymatisk tvärbindning med användning av transglutaminaser. Slutligen demonstreras tredimensionell (3D) bioprinting av mikroporös GHS vid låg HMP-packningstäthet via gränssnittssjälvmontering av heterogent laddade nanopartiklar.
Introduction
Montering av HMP-byggstenar för att bilda vävnadstekniska byggnadsställningar har fått enorm uppmärksamhet under de senaste åren1. GHS, tillverkad via HMP-montering, har unika egenskaper jämfört med sina bulkmotsvarigheter, inklusive mikroporositet i cellskala som härrör från tomrummen bland de diskreta byggstenarna. Ytterligare egenskaper, såsom injicerbarhet, modularitet och frikopplad styvhet från porositet, gör GHS till en lovande plattform för att förbättra vävnadsreparation och regenerering2. Olika biomaterial har använts för GHS-tillverkning, inklusive syntetiska PEG-baserade polymerer3,4 och polysackarider, såsom alginat5 och hyaluronsyra 6,7. Bland naturligt framställda polymerer är den vanligaste proteinbaserade biopolymeren för GHS-tillverkning GelMA 8,9,10,11, ett tvärbindningsbart, biokompatibelt, bioadhesivt och biologiskt nedbrytbart biomaterial 12,13.
HMP kan tillverkas via batchemulgering8, flödesfokusering 14,15 eller stegemulgering9,11 mikrofluidiska anordningar, blandning 16, eller komplex koacervation17,18. Vanligtvis finns det en avvägning mellan tillverkningsgenomströmningen och HMP-monodispersiteten. Till exempel ger blandningstekniken oregelbundet formade och mycket polydispergerade HMP. Batchemulgering eller komplex koacervation möjliggör produktion av stora volymer polydispergerade sfäriska HMP. Flödesfokuserande mikrofluidiska enheter har använts för att tillverka mycket monodispersa droppar med en variationskoefficient på <5%, men genomströmningen är signifikant låg. I mikrofluidiska enheter med stegemulgering möjliggör de mycket parallelliserade stegen tillverkning med hög genomströmning av monodispergerade HMP19.
Metakrylmodifierat gelatin (GelMA) HMP-byggstenar är termoresponsiva och (foto)kemiskt tvärbindningsbara, vilket möjliggör enkel GHS-tillverkning20. Vid kylning under den övre kritiska lösningstemperaturen (UCST)21 (t.ex. vid 4 °C) omvandlas droppar som innehåller en GelMA-lösning till fysiskt tvärbundna HMP. Dessa HMP-byggstenar packas sedan med hjälp av externa krafter (t.ex. via centrifugering) för att ge fastnat mikrogelsuspensioner. Interpartikelbindningar upprättas mellan intilliggande HMP via (foto)kemisk tvärbindning för att bilda mekaniskt robust GHS14. En av de viktigaste egenskaperna hos GHS är mikroporositet, vilket möjliggör enkel cellpenetration in vitro11 och förbättrad vävnadsinväxt in vivo22. Tredimensionell (3D) bioprinting av HMP utförs konventionellt med tätt packade mikrogelsuspensioner, vilket äventyrar mikroporositeten23.
Vi har nyligen utvecklat en ny klass av granulära biobläck baserade på gränssnittsnanoengineering av GelMA-mikrogeler via adsorption av heterogent laddade nanopartiklar, följt av nanopartikelreversibel självmontering. Denna strategi gör löst packade mikrogeler skjuvavkastande och extrudering 3D bioprintbar, vilket bevarar mikroskala porositeten hos additivt tillverkade GHS11. Denna artikel presenterar metoderna för tillverkning av GelMA-droppar med hög genomströmning, omvandling av dessa droppar till fysiskt tvärbundna HMP, tillverkning av GelMA HMP med resuspenderbart pulver, GelMA GHS-bildning, GelMA nanoengineered granulärt biobläckpreparat (NGB) och 3D-bioprinting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, instrument och reagenser som används i detta protokoll.
1. GelMA syntes
OBS: GelMA-syntes bör utföras i en kemisk dragskåp och korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) ska användas hela tiden.
- Tillsätt 200 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS, 1x) till en Erlenmeyerkolv och värm lösningen tills den når 50 °C. Täck kolven med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning.
- Tillsätt 20 g gelatinpulver till DPBS-lösningen vid 50 °C under omrörning vid 240 rpm tills pulvret är helt upplöst.
- Tillsätt 16, 2,5 eller 0,5 ml metakrylatanhydrid (MA) till gelatinlösningen droppvis via en glaspasteurpipett för att syntetisera GelMA med en hög, medium respektive låg grad av metakryloylsubstitution.
VARNING: MA är ett farligt material. Korrekt personlig skyddsutrustning bör användas vid arbete med MA. MA är också ljuskänslig, så skydda reaktionen från ljus genom att linda kolven med aluminiumfolie. - Efter 2 timmar, tillsätt 400 ml DPBS vid 50 °C för att stoppa reaktionen. Låt omrörningen fortsätta vid 50 °C i 10 minuter.
- Häll lösningen i en dialysmembranslang med 12–14 kDa molekylvikt och placera sedan slangen i en 5 L bägare fylld med ultrarent vatten på 40 °C. Rör om vattnet vid 240 rpm och 40 °C.
- Dialysera lösningen mot ultrarent vatten i 10 dagar och byt vatten 2x om dagen för att avlägsna oreagerad metakrylatanhydrid, biprodukter och andra föroreningar.
- Efter 10 dagar, tillsätt 400 ml ultrarent vatten vid 40 ° C till GelMA-lösningen. Rör om lösningen vid 240 rpm i 15 min.
- Filtrera lösningen två gånger med kaffefilter, följt av vakuumfiltrering via en 0,2 μm vakuumfiltreringsenhet.
- Häll 25 ml av den filtrerade lösningen i 50 ml centrifugrör och frys dem vid -80 °C och placera rören horisontellt.
- Efter 2 dagar, ta bort locken och täck centrifugrören med laboratoriedukar. Använd tejp eller ett gummiband för att hålla våtservetterna ordentligt.
- Frysa den frysta GelMA-lösningen för att ge vit fast GelMA.
- För att genomföra protonkärnmagnetisk resonans (1 H NMR) spektroskopi, tillsätt separat 30 mg gelatinpulver (kontroll) eller frystorkad GelMA i 1ml deuteriumoxid (D2O) och håll proverna vid 37 ° C tills gelatinpulvret eller GelMA är helt upplöst.
- Erhåll 1H NMR-spektra och bestäm graden av metakryloylsubstitution genom att integrera aromatiska syror och lysinmetylenprotontoppar vid kemiska skift på ~ 6,5-7,5 respektive ~ 3,0 ppm. Använd aromatiska syror topp som referens och bestäm graden av substitution (DS) med hjälp av lysinmetylentoppar baserat på ekvation (1):
DS (%) = [1 - (Areal lysinmetylen i GelMA / Område lysinmetylen i gelatin)] × 100 (1)
Figur 1: GelMA-syntes och karakterisering . (A) GelMA-syntesreaktion. Gelatin modifieras med metakrylanhydrid vid 50 °C i 2 timmar. B) Protonkärnmagnetisk resonans (1H NMR) spektra för gelatin och GelMA: a) toppen för aromatiska syror, som väljs som referens för kalibrering, b) toppar i den funktionella vinylgruppen efter MA-modifieringen av gelatin och c) toppen för lysinproteiner. I detta exempel var MA-substitutionsgraden 71% ± 3% (n = 3). Denna siffra har ändrats med tillstånd från Ataie et al.11 Förkortningar: GelMA = gelatinmetakryloyl; DPBS = Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning; MA = metakryloyl. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. GelMA-mikrogeltillverkning med hög genomströmning
- Mikrofabrikation av enhetsmasterform
OBS: Masterformar kan mikrofabriceras via mjuk litografi med KMPR 1000 negativ fotoresistserie19.- Tina KMPR 1025 och 1035 över natten. Undvik ljusexponering.
- För att belägga det första lagret på skivan, lägg till KMPR 1025 direkt i mitten av skivan för att skapa en cirka 5 cm cirkel av fotoresist. Kör spinnlacken vid 3 000 varv per minut i 30 sekunder.
- Mjuk grädda i 12 min på en 100 ° C kokplatta. Kyl sedan ner på kylplattan i 5 minuter.
- Fäst det första lagret av mask på den tomma sodakalken och utsätt sedan den belagda skivan för UV-ljus med en maskjusterare för 645 mJ / cm2 dosering.
- Lägg grädda i 3 minuter på en 100 ° C kokplatta. Kyl ner på kylplattan i 5 min.
OBS: Utveckla inte efter detta steg. Utveckla bara en gång i slutet av processen. - Spinnbelägg det andra lagret på skivan med KMPR 1035. Kör spinnbeläggaren vid 1 000 varv per minut i 30 sekunder.
- Mjuk grädda i 30 min på en 100 ° C kokplatta. Kyl ner på kylplattan i 5 min.
- Fäst den andra lagermasken på den tomma sodakalken och rikta in den andra masken med hjälp av alignern genom standardjusteringsskyltar. Utsätt för UV-ljus med en maskinriktare upp till 2 000 mJ/cm2.
- Lägg grädda i 5 minuter på en 100 ° C kokplatta.
- Utveckla i >6 minuter i SU-8-utvecklaren.
OBS: Om skivan ser mjölkaktig ut, bör utvecklingen fortsätta under en längre tid. Använd ny utvecklare varje gång och däremellan för ett bättre resultat. - Spraya med isopropanol. Se till att skivan är klar, utan mjölkrester. Torka skivan noggrant med kvävegas (N2).
- Tillverkning av mikrofluidiska enheter
- Häll 50 g polydimetylsiloxan (PDMS) basdel i en genomskinlig plastkopp. Tillsätt sedan 5 g av tvärbindaren i plastkoppen. Blanda basen och tvärbindaren med en spatel kraftigt tills en krämig konsistens erhålls.
- Vakuumavgasa blandningen med exsickator i 20 minuter tills den blir klar. Häll blandningen på huvudformen, som placeras inuti och tejpas på en petriskål.
OBS: Se till att tjockleken (höjden) på det hällda PDMS är ≤8 mm. - Lägg petriskålen i exsickatorn och vakuumavgasa PDMS-blandningen igen i 20 minuter tills alla bubblor har tagits bort. Ställ in petriskålen i en ugn på 70 °C i 2 timmar tills PDMS är tvärbunden. Ta ut petriskålen ur ugnen och låt den svalna.
- Skär enheterna ur formen med en skalpell. Lossa enheterna långsamt från huvudformen. Använd biopsistansen (1,5 mm diameter) för att skära hål genom inloppen och utloppet.
- Ta bort damm från PDMS-enheterna och glasskivorna med maskeringstejp och placera glasskivorna och enheterna i en plasmarengöringskammare. Utför plasmabehandlingen i 45 s (börjar när kammaren blir lila) med lufttryck under 400 mTorr. Ta bort glasen och enheterna från kammaren, sätt enheten på glasskivorna och applicera lätt tryck. Sätt in enheten i ugnen på 70 °C i 30 minuter för att förbättra bindningen.
- Fyll enheterna med triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl)silan (F-silan, 2% v/v) i den konstruerade vätskan för att göra kanalytan fluorofil. Injicera F-silanlösningen genom utloppet och se till att alla enheter är exponerade. Vänta i 5-10 min.
OBS: F-silan bör beredas färskt. Dessutom bör F-silan inte utsättas för luft under lång tid. - Aspirera F-silanlösningen ur enheten genom vattenlösningens inlopp. Tvätta enheten två gånger med hjälp av konstruktionsvätskan och aspirera igen. Placera enheten i ugnen på 70 °C i 30 minuter för att avdunsta den återstående oljan.
- Droppbildning och GelMA mikrogeltillverkning
- Tillsätt 10 mg litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP) till 10 ml DPBS för att bereda en fotoinitiatorlösning (PI) (0,1 % vikt/volym). Skydda lösningen från ljus genom att förpacka den i aluminiumfolie.
- Lös upp önskad mängd GelMA i PI-lösningen och placera den i ugnen vid 37 °C i 1 timme tills en klar lösning erhålls. Skydda lösningen från ljus genom att linda in i aluminiumfolie.
- För att förbereda oljefasen, gör en 2% v / v biokompatibel ytaktiv lösning i konstruktionsvätskan.
- Sätt i Tygon-slangen i PDMS-enhetens inlopp och utlopp. För in en 25 G trubbig nål i andra änden av Tygonslangen för inlopp. Använd minsta möjliga slanglängd.
- Placera enheten under mikroskopet. Håll miljön varm (~ 40 ° C) med en hårtork och / eller en rumsvärmare.
- Fyll vatten- och oljelösningarna i separata sprutor, anslutna till enheten. Starta sprutpumparna med flödeshastigheter på 160 och 80 μl/min för oljefasen (kontinuerlig) respektive vattenhaltig (dispergerad).
OBS: Starta oljefasen först; Se till att oljan fyller kanalen och starta sedan vattenfasen. - Samla dropparna i en behållare och utvärdera dem i bildkammaren via optisk mikroskopiavbildning.
- Placera dropparna vid 4 °C över natten samtidigt som du skyddar dem från ljus för att initiera GelMA HMP fysisk tvärbindning och omvandla dropparna till stabila mikrogeler vid 4 °C.
3. Konvertera mikrogeler till resuspenderbart pulver via mikrokonstruerad emulsion-till-pulver (MEtoP) -teknik
MEtoP-tekniken för att omvandla vatten-i-oljeemulsionsbaserade HMP till mikropartikelpulver (mikroaerogeler) med bevarade egenskaper, såsom återsuspenderingsförmåga, form, storlek och montering, har utvecklats.
- För att implementera MEtoP, samla in de fysiskt tvärbundna HMP: erna i konstruktionsvätskan med hjälp av termiskt hållbara mikrocentrifugrör eller kryovialer. Öppna rörlocken och försegla dem med en laboratorieduk och tejp.
- Djupfrys de fysiskt tvärbundna HMP:erna i flytande kväve (-196 °C) i 10 minuter.
- Överför de blixtfrysta rören till ett frystorkinstrument. Frystorka rören vid lågt tryck (t.ex. 0,06 mbar) i minst 6 timmar för att ge pulver.
OBS: När frystorkningscykeln är klar, bryt trycket långsamt så att pulvret inte går förlorat. - Tillsätt 1 ml kyld PI-lösning (0,1 % vikt/volym, 4 °C) till pulvret för att göra mikrogelsuspensioner. Virvel i 5 s, centrifugera sedan vid 3 000 × g i 15 s. Kassera supernatanten.
- Överför den packade mikrogelsuspensionen till en form med en deplacementpipett, följt av exponering för UV-ljus vid 400 nm våglängd med en intensitet på 15 mW/cm2 under 60 s för att bilda GHS.
Figur 2: GelMA mikropartikelpulverberedning via MEtoP-teknik. (A) Bilder av GelMA-pulver erhållet från MEtoP-tekniken eller konventionell frystorkning av HMP. I MEtoP-teknik eller konventionell frystorkning suspenderas HMP i olje-ytaktiva medel respektive vattenhaltiga medier. Konstruktionsvätskan skyddar den dispergerade fasen (HMP) från aggregering och bevarar de fysiokemiska egenskaperna hos GelMA-mikropartiklar under frystorkning. (B) Schematisk illustration av torkade HMP beredda via MEtoP jämfört med konventionellt frystorkad HMP i ett vattenhaltigt medium. (C) SEM-bilder av torkade GelMA-mikropartiklar framställda via MEtoP jämfört med konventionell frystorkning. Skalstänger = 2 mm (vänster; A), 500 μm (höger; A), 10 μm (vänster; C) och 200 μm (höger; C). Denna siffra modifierades med tillstånd från Sheikhi et al.26 Förkortningar: GelMA = gelatinmetakryloyl; DPBS = Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning; MEtoP = mikrokonstruerad emulsion-till-pulver; HMP = hydrogelmikropartikel; SEM = svepelektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. GelMA GHS-bildning
OBS: Detta protokoll är avsett för beredning av 400 μL mikrogelsuspension. För större kvantiteter behövs uppskalning. För att hålla GelMA HMP: erna fysiskt tvärbundna bör alla steg utföras vid cirka 4 ° C genom att placera mikrogelbehållarna i en isvattenhink.
- Tillsätt 400 μL 1H,1H-perfluor-1-oktanol (PFO)-lösning i konstruktionsvätskan (20% v/v) till de fysiskt tvärbundna GelMA HMP:erna. Därefter virvel i 5 s och centrifugera i 15 s vid 300 × g.
PFO-lösningen i konstruktionsvätskan bör beredas nyligen och förvaras i en sluten behållare för att förhindra avdunstning. - Ta bort oljefasen från GelMA HMP via pipettering.
- Tillsätt 400 μl PI-lösning (0,1 % vikt/volym) vid 4 °C till mikrogelsuspensionen. Därefter virvel i 5 s och centrifugera vid 300 × g i 15 s. Kassera oljan efteråt.
- Upprepa föregående steg men centrifugera vid 3 000 × g. Ta bort supernatanten på packade GelMA HMP via pipettering.
- Överför de packade GelMA HMP: erna till en form med en positiv förskjutningspipett, följt av UV-ljusexponering (våglängd = 400 nm, intensitet = 15 mW / cm2, exponeringstid = 60 s).
5. Nanokonstruerade granulära biobläck (NGB) för 3D-bioprinting av GHS med bevarad mikroporositet
- Tillsätt 100 mg nanotrombocytpulver till 3 ml 4 °C ultrarent vatten för att bilda en nanopartikeldispersion (3,33% w/v). Virvla dispersionen kraftigt inuti ett kylskåp på 4 °C i 15 minuter för att exfoliera de annars aggregerade nanopartiklarna. Korrekt exfolierade nanopartiklar ger en tydlig dispersion.
- Lös 50 mg LAP i 5 ml ultrarent vatten vid 4 °C för att bereda en PI-lösning (1 % vikt/volym).
- Tillsätt 333 μL PI-lösning (1% w/v) till den exfolierade nanopartikeldispersionen. Linda in i aluminiumfolie för att skydda mot omgivande ljus. Virvel i 1 min för att blanda nanopartikeldispersionen och PI. De slutliga ler- och PI-koncentrationerna är 3% w/v respektive 0,1% w/v.
- Tillsätt PFO 20% v/v i konstruktionsvätska (4 °C) till de fysiskt tvärbundna GelMA HMP:erna i volymförhållandet 1:1. Vortex noggrant i 5 s. Centrifugera sedan vid 300 × g i 15 s och kassera oljefasen som innehåller ytaktivt ämne.
- Tillsätt den LAP-kompletterade nanopartikeldispersionen (4 °C) till de tvättade GelMA HMP: erna. Virvel i 15 sekunder, centrifugera vid 3 000 × g i 15 s och kassera återstående olja i botten samt supernatantdispersionen.
- Förvara suspensionen vid 4 °C samtidigt som den skyddas från ljus med aluminiumfolie i 1 dag. Produkten av detta steg är GelMA NGB.
- Ladda NGB i en 3 ml spruta, försegla den laddade sprutan med lock och parafilm och pulscentrifugera vid 200 × g för att avlägsna den fångade luften. Överför biobläcket till en 3 ml patron med en hona-hona Luer-Lok-kontakt. Centrifugera patronen kort vid 200 × g igen för att avlägsna den instängda luften. Förvara NGB vid 4 °C i kylskåp innan du använder den.
- Före cellbelastad biobläckberedning, bereda en koncentrerad cellsuspension (t.ex. NIH / 3T3 murina fibroblastceller), innehållande ~ 24 miljoner celler i 100 μL cellodlingsmedium. Fyll cellsuspensionen i en 3 ml spruta, koppla ihop den NGB-laddade sprutan och den cellladdade sprutan med en hona-hona Luer-Lok-kontakt och blanda cellerna och NGB försiktigt genom att trycka fram och tillbaka 40x.
- Skriv ut NGB eller cellladdad NGB med en korrekt bioprinter med ett vanligt koniskt munstycke. Fyll munstycket i 3 ml skrivhuvudet. Håll tryckbäddens temperatur under 10 °C. Optimera utskriftsparametrar som hastighet och mottryck före utskrift.
- Välj substrat och munstyckstyp (pneumatisk 3 ml spruta utrustad med standard koniskt munstycke), kalibrera bioprintern med hjälp av enhetens riktlinjer, välj önskad gcode eller STL-fil och börja skriva ut.
OBS: Vid cellbelastad bioprinting bör alla material och enheter hållas under det biologiska säkerhetsskåpet för att minimera kontaminering. - Efter utskriften, exponera konstruktionen för UV-ljus för fototvärbindning (våglängd = 400 nm, intensitet = 15 mW / cm2, exponeringstid = 60 s).
Figur 3: Scheman över GelMA-mikrogel och GHS-bildning. (A) Scheman över GelMA-mikrogelseparation från olja och NGB-preparat. PFO (20% v/v i teknisk vätska) tillsattes till GelMA-mikrogeloljeemulsionen vid ett volymetriskt förhållande 1: 1, följt av virvelning och centrifugering vid 300 × g i 15 s. För att tillverka GelMA GHS tillsattes PI-lösningen (LAP 0,1% w/v i DPBS) till GelMA HMP: erna, följt av virvelning och centrifugering vid 3,000 × g i 15 s. För beredning av NGB tillsattes PI-lösningen (LAP 0,1% w/v i ultrarent vatten) och nanotrombocytdispersion (3% w/v i ultrarent vatten) till GelMA HMP-suspensionen, följt av virveling och centrifugering vid 3 000 × g i 15 s. Figur 3A modifierades med tillstånd från Ataie, Z. et al.11 (B) Exponering av förpackade GelMA HMP för lätta ger GHS. Figur 3B modifierades med tillstånd från Sheikhi et al.15 Förkortningar: GelMA = gelatinmetakryloyl; GHS = granulär hydrogelställning; NGB = nanokonstruerat granulärt biobläck, PFO = 1H,1H-perfluor-1-oktanol; PI = fotoinitiator; LAP = litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat; HMP = hydrogelmikropartikel; DPBS = Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GelMA syntetiserades genom reaktion av gelatin med MA, som presenteras i figur 1A. Genom att skräddarsy reaktionsbetingelserna, såsom MA-koncentration, erhölls olika grader av MA-substitution. För att kvantifiera graden av MA-substitution bedömdes GelMA via 1H NMR-spektroskopi (figur 1B). Vinylfunktionella grupper med representativa toppar vid de kemiska skiften på ~ 5-6 ppm bekräftade den framgångsrika GelMA-syntesen från gelatin. Reaktionsutbytet efter dialys och steril filtrering var >70 % (mg GelMA/mg gelatin). Utbytet av dropp-/mikrogeltillverkning var ~ 100%. Olika metoder kan användas för att kvantifiera substitutionsgraden24. Vi bedömde minskningen av lysinaminosyra (primär amin), normaliserad med användning av den opåverkade aromatiska syraprotonen baserat på ekvation (1).
HMP är vanligtvis suspenderade i vattenhaltiga medier, såsom DPBS eller cellodlingsmedia. Det hydratiserade tillståndet hos HMP kan medföra flera utmaningar inom sterilisering, frakt, lagring och långsiktig stabilitet. MEtoP är en ny metod för att omvandla HMP till torkat pulver utan att påverka deras ursprungliga molekylära och kolloidala egenskaper25. MEtoP-tekniken ger resuspenderbara, torkade HMP (mikroaerogeler) via frystorkning med lågt tryck, samtidigt som HMP: erna skyddas från aggregering och allvarlig deformation med hjälp av en flyktig olja snarare än ett vattenhaltigt medium (figur 2A). Med hjälp av denna teknik torkas mikrogelerna individuellt utan aggregering (figur 2B) och behåller därmed sin sfäriska form efter frystorkning (figur 2C). Dessa mikropartiklar återfår lätt sina ursprungliga egenskaper vid rehydrering, vilket ger HMP-suspensioner som är redo att bilda GHS vid montering.
Stegemulgerande mikrofluidiska enheter ger monodispergerade GelMA-droppar med hög genomströmning, oberoende av vattenhaltiga / oljefasflödeshastigheter. Eftersom GelMA är en värmekänslig biopolymer omvandlas droppar till termiskt tvärbundna HMP genom att sänka temperaturen till ~ 4 ° C. De stabila HMP: erna kan sköljas för att avlägsna oljan och ytaktivt ämne med PFO (20% v / v). Efter borttagning av olja / ytaktivt medel kan GelMA HMP blandas med en PI för kemisk montering eller med nanopartiklar för gränssnittsmontering (figur 3A). GHS-bildning initieras via ljus (våglängd = 400 nm, intensitet = 15 mW/cm2, exponeringstid = 60 s)-medierad friradikalpolymerisation, vilket resulterar i mikrogel-mikrogelbindning (figur 3B).
Mikroporositet är en av de viktigaste egenskaperna hos GHS, vilket möjliggör facilt utbyte av syre och cellulärt avfall, cellinfiltration, migration och spridning. För att bedöma mikroporositeten används ett fluorescensfärgämne med hög molekylvikt för att visualisera tomrumsutrymmena bland HMP: erna. Figur 4A visar de övre och 3D-vyerna av GHS-byggnadsställningar, med det gröna området som visar den sammankopplade mikroporositeten. Figur 4B visar en fluorescensbild, bedömd med hjälp av ett specialskrivet MATLAB-skript för att detektera porområdet. Mätningar av hålrumsfraktion (figur 4C) och medianporekvivalentdiameter (figur 4D) visar ingen signifikant skillnad mellan GHS- och 3D-printade NGB-ställningar, vilket intygar tillgängligheten och sammankopplingen av NGB-porer i mikroskala.
Figur 4: Porkarakterisering av GelMA GHS och NGB. (A) Ortografiska vyer i topp- och 3D av GHS- och NGB-ställningar. Stegvis är 100 μm. (B) Fluorescensbilden av tomrumsområde och pordetektering via en specialskriven MATLAB-kod för fototvärbunden GelMA, GHS och NGB. Skalstapel = 200 μm. (C) Hålrumsfraktionen av GelMA, GHS och NGB. d) Den ekvivalenta medianpordiametern för GelMA, GHS och NGB. Denna siffra modifierades med tillstånd från Ataie et al.11 Förkortningar: GelMA = gelatinmetakryloyl; GHS = granulär hydrogelställning; NGB = nanokonstruerat granulärt biobläck, NS = icke-signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
NGB är utformad som en tryckbar HMP-suspension med bevarad mikroporositet. För att demonstrera extruderbarheten och tryckbarheten hos NGB utförde vi extruderingsbaserad 3D-utskrift, som presenteras i figur 5. PSU-bokstäver skrevs ut med NGB, följt av ljusexponering (figur 5A). För att bedöma NGB:s överlägsenhet jämfört med tätt packade och löst packade GelMA HMP mättes den hängande glödtrådens längd (Lf) (figur 5B). NGB hade den högsta Lf jämfört med de packade HMP: erna. De löst packade HMP: erna gav inte filament. Dessutom 3D-printades en ihålig cylinder och hela konstruktionen utsattes för ljus för fototvärbindning (figur 5D) och hölls fysiskt (figur 5E) för att demonstrera 3D-tryckbarheten och formtroheten hos fototvärbunden GelMA NGB.
Figur 5: NGB:s tryckbarhet följt av UV-ljusmedierad fototvärbindning (våglängd = 395–405 nm, intensitet = 15 mW/cm2, exponeringstid = 60 s). (A) Schematisk bild av utskriftsprocessen, som visar PSU-bokstäver som 3D-skrivs ut med hjälp av den fluorescerande märkta NGB. Skalstång = 3 mm. (B) Visuell jämförelse av filamentsträngsprutning med NGB, tätt packade GelMA HMP och löst packade GelMA HMP. Skalstång = 10 mm. (C) Hängande filamentlängd av NGB, tätt packade och löst packade granulära hydrogeler. NGB bildar längre hängande filament (filamentlängd L f = 45,0 ± 5,0 mm, n = 10) än tätt packade mikrogeler (L f = 19,3 ± 0,7 mm, n = 10). De löst packade mikrogelerna ger droppstorlek (Lf = 5,7 ± 0,7 mm, n = 10) filament. (D) NGB användes för 3D-utskrift av ihåliga cylindrar med en diameter på 5 mm och en höjd på 10 mm. (E) Hela konstruktionen (ihålig cylinder med d = 5 och h = 10 mm) trycktes och utsattes sedan för UV-ljus. Fotokorslänkning lager för lager kan öka formåtergivningen men minska den strukturella integriteten eftersom lagren inte är korsbundna med varandra. Den ihåliga tryckta cylindern hölls med pincett, vilket visade mekanisk robusthet. Skalstång = 1 cm. Denna siffra modifierades från Ataie et al.11 Förkortningar: NGB = nanoengineered granular bioink; GelMA = gelatinmetakryloyl; HMP = hydrogelmikropartikel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gelatin och dess derivat är de vanligaste proteinbaserade biomaterialen för HMP-tillverkning. Utmaningen med genomströmning kontra monodispersitetsavvägning av partikelstorlek kan övervinnas med hjälp av stegemulgerande mikrofluidiska enheter. Dessa enheter kan bilda mer än 40 miljoner droppar per timme, med en variationskoefficient mindre än 5%27. I den här artikeln diskuterade vi mikrofabrikation av droppar som innehåller GelMA-lösningar, följt av att konvertera dem till GelMA HMP, pulver, GHS och NGB.
GelMAs termoresponsivitet möjliggör enkel mikrofluidisk aktiverad HMP-tillverkning och stabilisering. Vid en temperatur högre än UCST (t.ex. 37 °C) löses GelMA i en vattenlösning, vilket ger en lämplig vattenhaltig vätska för vatten-i-olja-emulsionsbildning i steg-emulgeringsanordningar. Sjunkande temperatur (t.ex. 4 °C) möjliggör GelMA HMP-bildning via fysisk tvärbindning efter droppbildning. GelMA HMP kan användas som byggstenar för GHS-tillverkning genom olika metoder. Termiskt stabila HMP kan fotomonteras för att bilda ett mekaniskt robust GHS, som uppnår en av de högsta rapporterade kompressionsmodulerna bland granulära byggnadsställningar, exklusive de interpenetrerande perkolerande nätverken28. I fotomonteringsmetoden bör alla procedurer utföras vid låg temperatur (t.ex. 4 °C) för att undvika GelMA HMP-smältning.
3D-(bio)utskrift av HMP möjliggör tillverkning av geometriskt väldefinierad GHS; Detta har dock utförts med tätt packade HMP, vilket äventyrar mikroporositeten hos additivt tillverkade granulära konstruktioner. För att ta itu med denna utmaning visar vi hur den reversibla självmonteringen av heterogent laddade nanopartiklar adsorberade till HMP-ytor gör löst packade HMP: er skjuvavkastande och 3D-utskrivbara (NGB) med bevarad mikroporositet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill tacka T. Pond, forskningsstödsspecialist vid Institutionen för kemiteknik vid Pennsylvania State University (Penn State), Nanofabrication Lab-personalen vid Penn State och Dr. J. de Rutte från Partillion Bioscience för hjälp och diskussion om nanofabrikationsprocesser. A. Sheikhi erkänner stödet från Materials Research Institute (MRI) och College of Engineering Materials Matter på Human Level fröbidrag, Convergence Center for Living Multifunctional Material Systems (LiMC2) och Cluster of Excellence Living, Adaptive and Energy-autonomous Materials Systems (livMatS) Living Multifunctional Materials Collaborative Research Seed Grant Program och startfonden från Penn State. Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes delvis av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) vid National Institutes of Health (NIH) under tilldelningsnummer R56EB032672.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1H,1H-perfluoro-1-octanol | Alfa Aesar, MA, USA | B20156-18 | 98% purity |
| Biopsy punch | Integra Miltex, NY, USA | 33-31A-P/25 | 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System |
| Blunt needle | SANANTS | 30-002-25 | 25 G |
| Bruker Avance NEO 400 MHz | 400 MHz Bruker NEO, MA, USA | NMR device | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5415 C | |
| Centrifuge tube | Celltreat, MA ,USA | 229423 | |
| Coffee filters | BUNN, IL, USA | 20104.0006 | BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct |
| Desiccator | Thermo Scientific | 5311-0250 | Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD |
| Deuterium oxide | Sigma, MA, USA | 151882 | |
| Dialysis membrane (12-14 kDa) | Spectrum Laboratories, NJ, USA | 08-667E | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) | Sigma, MA, USA | 56064C-10L | dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture |
| Erlenmeyer flask | Corning, NY, USA | 4980 | Corning PYREX |
| Ethanol | VWR, PA, USA | 89125-188 | Koptec 200 proof |
| External thread cryogenic vials (cryovials) | Corning, NY, USA | 430659 | |
| Freeze dryer | Labconco, MO, USA | 71042000 | Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000) |
| Gelatin powder | Sigma, MA, USA | G1890-5100G | Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom |
| Glass microscope slides | VWR, PA, USA | 82027-788 | |
| Hotplate | FOUR E'S SCIENTIFIC | MI0102003 | 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F |
| Kimwipes | Fischer scientific, MA, USA | 06-666 | |
| KMPR 1000 negative photoresist series | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | 121619 | KMPR1025 and KMP1035 are included |
| LAPONITE XLG | BYK USA Inc., CT, USA | 2344265 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma, MA, USA | 900889-1G | >95% |
| Luer-Lok connector | BD, NJ, USA | BD 302995 | |
| MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner | SÜSS MicroTeck, German | Nanofabrication device | |
| Methacylate anhydride | Sigma, MA, USA | 276685-100ML | contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94% |
| Milli-Q water | Millipore Corporation, MA, USA | ZRQSVR5WW | electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System |
| Novec 7500 engineering fluid | 3M, MN, USA | 3M ID 7100003723 | |
| Oven | VWR, PA, USA | VWR-1410 | 1410 Vacuum Oven |
| Parafilm | Fischer scientific, MA, USA | HS234526C | |
| Pasteur pipette | VWR, PA, USA | 14673-010 | |
| Petri dish | VWR, PA, USA | 25384-092 | polystyrene |
| Pico-Surf | Sphere Fluidics, UK | C022 | (5% (w/w) in Novec 7500) |
| Pipette | VWR, PA, USA | 89079-970 | |
| Pipette tips | VWR, PA, USA | 87006-060 | |
| Plasma cleaner chamber | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-001-HP | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning, MI, USA | 2065623 | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit |
| Positive displacement pipette | Microman E M100E, Gilson, OH, USA | M100E | |
| Silicon wafers | UniversityWafer, MA, USA | 452/1196 | 4-inch mechanical grade |
| Spatula | VWR, PA, USA | 231-0104 | Disposable |
| SU-8 | Kayaku Advanced Materials, MA, USA | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA, USA | 70-2001 | PHD 2000 |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Millipore Sigma, MA, USA | 448931-10G | 97% |
| Tygon tubings | Saint-globain, PA, USA | AAD04103 | |
| UV light | QUANS | Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W | |
| Vacuum filtration unit | VWR, PA, USA | 10040-460 | 0.20 µm |
| Vortex | Fischer scientific, USA | 14-955-151 | Mini Vortex Mixer |
References
- Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioactive Materials. 9, 105-119 (2022).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for four-dimensional living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394 (2022).
- Muir, V. G., et al. Sticking together: injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 18 (36), 2201115 (2022).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Molley, T. G., Hung, T., Kilian, K. A. Cell-laden gradient microgel suspensions for spatial control of differentiation during biofabrication. Advanced Healthcare Materials. , 2201122 (2022).
- Zoratto, N., et al. In situ forming microporous gelatin methacryloyl hydrogel scaffolds from thermostable microgels for tissue engineering. Bioengineering and Translational. 5 (3), (2020).
- Yuan, Z., et al. In situ fused granular hydrogels with ultrastretchability, strong adhesion, and mutli-bioactivities for efficient chronic wound care. Chemical Engineering Journal. 450, 138076 (2022).
- Ataie, Z., et al. Nanoengineered granular hydrogel bioinks with preserved interconnected microporosity for extrusion bioprinting. Small. 18 (37), 2202390 (2022).
- Annabi, N., et al. 25th anniversary article: rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Advanced Materials. 26 (1), 85-124 (2014).
- Rajabi, N., et al. Recent advances on bioprinted gelatin methacrylate-based hydrogels for tissue repair. Tissue Engineering. Part A. 27 (11-12), 679-702 (2021).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A., De Rutte, J. Methods for fabricating modular hydrogels from macromolecules with orthogonal physico-chemical responsivity. U.S. Patent Application. , 17/279,283 (2021).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Modular microporous hydrogels formed from microgel beads with orthogonal thermo-chemical responsivity: Microfluidic fabrication and characterization. MethodsX. 6, 1747-1752 (2019).
- Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and rheological properties of methacrylamide modified gelatin hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3d printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
- Claaßen, C., et al. Quantification of substitution of gelatin methacryloyl: best practice and current pitfalls. Biomacromolecules. 19 (1), 42-52 (2018).
- Sheikhi, A., Di Carlo, D., Khademhosseini, A. Methods for converting colloidal systems to resuspendable/redispersable powders that preserve the original properties of the colloids. U.S. Patent Application. , 17/425,027 (2022).
- Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
- Lee, S., de Rutte, J., Dimatteo, R., Koo, D., Di Carlo, D. Scalable fabrication and use of 3d structured microparticles spatially functionalized with biomolecules. ACS Nano. 16 (1), 38-49 (2022).
- Charlet, A., Bono, F., Amstad, E.
