Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nøytrofil levetidsforlengelse med CLON-G og en in vitro spontan dødsanalyse

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65132
Automatic Translation
*1,2, *3, *4, 1,2, 5, 1,2, 5
1State Key Laboratory of Experimental Hematology, National Clinical Research Center for Blood Diseases, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Institute of Hematology & Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Tianjin Institutes of Health Science, 3Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 4Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, Tianjin Medical University, 5Joint Program in Transfusion Medicine, Department of Pathology, Harvard Medical School; Division of Blood Bank, Department of Laboratory Medicine, The Stem Cell Program, Boston Children's Hospital, Dana-Farber /Harvard Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver fremstillingen av CLON-G for å forlenge den nøytrofile levetiden til mer enn 5 dager og gir en pålitelig prosedyre for evaluering av nøytrofil død med flowcytometri og konfokal fluorescensmikroskopi.

Abstract

Den gjennomsnittlige levetiden til en nøytrofil er mindre enn 24 timer, noe som begrenser grunnleggende forskning på nøytrofiler og anvendelse av nøytrofile studier. Vår tidligere forskning indikerte at flere veier kunne formidle spontan død av nøytrofiler. En cocktail ble utviklet ved samtidig å målrette disse veiene, kaspaser-lysosomale membranpermeabilisering-oksidant-nekroptoseinhibering pluss granulocytkolonistimulerende faktor (CLON-G), som forlenget den nøytrofile levetiden til mer enn 5 dager uten signifikant å kompromittere den nøytrofile funksjonen. Samtidig ble det også utviklet en pålitelig og stabil protokoll for vurdering og evaluering av nøytrofil død. I dette arbeidet viser vi at CLON-G kan forlenge den nøytrofile levetiden in vitro til mer enn 5 dager, og vi viser forlengelsen av den nøytrofile levetiden med FACS og konfokal fluorescensmikroskopi. Denne rapporten introduserer prosedyrer for fremstilling av CLON-G og viser en in vitro spontan dødsanalyse av nøytrofiler, som kan brukes til studier av nøytrofiler og for senere å undersøke nøytrofil død, og dermed gi en pålitelig ressurs for det nøytrofile samfunnet.

Introduction

Nøytrofiler er kjent for å omfatte et arsenal av rikelig cytoplasmatiske granulater, nikotinamid-adenin-dinukleotidfosfat (NADPH) oksidase, antimikrobielle enzymer og forskjellige organeller som forsvarer seg mot invaderende mikrober; I tillegg er de svært bevegelige og er de første cellene som rekrutteres til betennelsesstedet, noe som betyr at nøytrofiler er den første forsvarslinjen til det medfødte immunsystemet 1,2. Granulocyttransfusjonsbehandling har dermed blitt en lovende klinisk behandling for nøytropenirelaterte infeksjoner for forbigående å øke nøytrofil immunitet 3,4,5. Nylige funn har tydelig vist at nøytrofiler også fungerer som mangefasetterte effektorer i mange fysiopatologiske scenarier6. Den gjennomsnittlige levetiden til en nøytrofil er mindre enn 24 timer, og dermed er grunnleggende forskning på nøytrofiler og anvendelse av nøytrofile studier enormt vanskelig på grunn av begrensningene knyttet til stabil genetisk manipulasjon og langsiktig lagring 7,8,9,10,11 . Det er noen cellelinjer som delvis kan vise frem noen nøytrofile funksjoner, som HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 og induserte pluripotente stamceller12. Disse cellelinjene kan oppnå effektiv genredigering og kryopreservering; Imidlertid er de fortsatt ganske forskjellige ganske enormt fra primære nøytrofiler og kan derfor ikke trofast rekapitulere nøytrofile funksjoner13. Dermed er det meste av forskningen på dette feltet fortsatt avhengig av ferskt isolerte primære nøytrofiler. Feltet er fortsatt avhengig av å generere dyre og tidkrevende betingede knock-out mus for å undersøke spesifikke genfunksjoner i nøytrofiler, men ingen menneskelige modeller eksisterer for øyeblikket.

Etter å ha lagt vår innsats i å utforske de heterogene prosessene som er involvert i nøytrofil død og de mange veiene som regulerer disse prosessene14,15, ble det nylig rapportert en ny behandling kalt CLON-G (caspases-lysosomal membranpermeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor) 16. CLON-G består av Q-VD-oph (kinolyl-valyl-O-metylaspartyl-[-2,6-difluorfenoksy]-metylketon), Hsp70 (varmesjokkprotein 70), DFO (deferoksamin), NAC (N-acetylcystein), Nec-1s (nekrostatin-1s) og G-CSF (granulocyttkolonistimulerende faktor). Nøytrofil spontan død er mediert av flere veier, inkludert apoptose, nekroptose og pyroptose. Q-VD-oph hemmer apoptosen av nøytrofiler som en pan-caspase-hemmer ved å målrette caspase 1, caspase 3, caspase 8 og caspase 917. Nøytrofil nekroptose er avhengig av en signalvei som involverer reseptorinteragerende proteinkinase-1 (RIPK1) og blandet avstamning kinase domenelignende protein (MLKL)18. Som en RIPK1-hemmer Nec-1s nekriptosen av nøytrofiler. Hsp70 og DFO kan hemme lysosomal membranpermeabilisering (LMP), som kan indusere nøytrofil apoptose19 og pyroptose20. Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i nøytrofil død ved å formidle LMP19 og apoptose21 og ved å hemme overlevelsessignaler22. Som en antioksidant som kan redusere ROS-akkumulering, forsinker NAC nøytrofil død. Som vekstfaktor aktiverer G-CSF nøytrofile overlevelsessignaler og hemmer kalpainindusert apoptose23,24. Ved samtidig å målrette mot flere nøytrofile spontane dødsveier, kan den nøytrofile levetiden effektivt forlenges til mer enn 5 dager uten at det går ut over funksjonen. CLON-G-behandling utvider mulighetene for nøytrofil bevaring, transport og genmanipulasjon, noe som kan akselerere forskning i nøytrofilsamfunnet. I mellomtiden, basert på kunnskapen om nøytrofil død, kan de for tiden godkjente protokollene for celledødsanalyser forårsake uventet skade på nøytrofiler14, så disse protokollene har blitt raffinert for å være mer hensiktsmessige for nøytrofile studier. Denne rapporten gir detaljerte protokoller for nøytrofildyrking med CLON-G og en in vitro celledødsanalyse av nøytrofile museer ved bruk av flowcytometri og fluorescensavbildning. CLON-G er effektiv på både mus og humane nøytrofiler; Imidlertid er museprøvene demonstrert her for å forenkle denne protokollen. Konsentrasjonen av NAC er 1 mM for nøytrofiler fra mus og 10 μM for humane nøytrofiler. Hsp70 er artsspesifikk og bør derfor utnyttes i henhold til kilden til nøytrofilen. For denne protokollen spiller det ingen rolle om nøytrofiler er isolert fra perifert blod eller benmarg og hvordan de er isolert.

For denne studien ble nøytrofiler isolert fra musebenmarg for å oppnå nok nøytrofiler til forsøkene, da ca. 1 x 10 7-1,5 x 107 nøytrofiler kan fås fra benmargen, mens bare 1 x 10 6 nøytrofiler kan isoleres fra perifert blod av en enkelt 8-12 uker gammel C57BL /6 mus (av begge kjønn). Gradient sentrifugering ble utført for å unngå mulig skade og aktivering fra mekanisk stimulering av FACS sortering eller MACS sortering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Boston Children's Hospital og State Key Laboratory of Experimental Hematology (SKLEH) Animal Care and Use Committee godkjente og overvåket alle prosedyrene. Figur 1 viser flytskjema for dyrkning av nøytrofile granulocytter med CLON-G og in vitro dødsanalyse.

1. Forlengelse av nøytrofil levetid med CLON-G

MERK: Alle nevnte operasjoner og materialer må være sterile. Sørg for at alle løsningene er godt blandet og fordelt jevnt.

  1. Bevaring av CLON-G-komponentene
    1. Løs opp 50 mg Q-VD-oph (se materialfortegnelse) til en endelig konsentrasjon på 100 mM ved å tilsette 973,7 μl dimetylsulfoksid (DMSO), og pipetter væsken til blandingen blir klar. Aliquot 50 μL per rør, og konserveres ved -20 °C.
      FORSIKTIG: DMSO er en skadelig kjemisk væske. Bruk en laboratoriefrakk, vernebriller og en maske for å unngå hudkontakt, øyekontakt og innånding.
    2. Tine Hsp70 (se materialfortegnelsen) ved 4 °C, og spinn ned innholdet i hetteglasset. Aliquot 1 μL Hsp70 per rør på is, og konserveres ved -80 °C.
      MERK: Hsp70 er et protein; Ultrakald lagring er nødvendig for å holde den stabil. Unngå fryse-tine-syklusen.
    3. Løs opp 1 mg DFO (se materialfortegnelse) med 7,61 ml RPMI 1640 for å oppnå en bestand på 200 μM. Aliquot 500 μL per rør, og konserveres ved -20 °C.
    4. Løs opp 0,1 g NAC (se materialfortegnelse) med 2,5 ml RPMI 1640 i et 15 ml sentrifugerør, og juster pH til 7-7,4 med NaOH. Legg RPMI 1640 til et endelig volum på 3,06 ml for å lage en 200 mM NAC-aksje. Filtrer den med en 0,2 μm filtreringsenhet. Aliquot 500 μL per rør, og konserveres ved -20 °C.
      MERK: Oppløsning av NAC i denne høye konsentrasjonen er ikke lett, og vortexing kan bidra til å oppløse den. Fenolrødt i RPMI 1640 er en perfekt indikasjon på pH; når NAC nettopp er oppløst, er fargen gulaktig; Juster den til den blir rosa. NACs lagerløsninger er stabile i opptil 1 måned ved −20 °C.
    5. Løs opp 10 mg Nec-1 (se materialfortegnelse) til 20 mM med 1,8 ml DMSO, og pipetter blandingen til den blir klar. Aliquot 50 μL per rør, og konserveres ved -20 °C. Beskytt mot lys.
    6. Løs opp 250 mikrogram G-CSF (se materialfortegnelse) til 200 μg/ml med 1,25 ml RPMI 1640. Aliquot 50 μL per tube, og konserveres ved 4 °C.
  2. Fremstilling av 2x CLON-G kulturmedium
    1. Forbered det grunnleggende mediet. Legg til 39,5 ml RPMI 1640, 10 ml føtal bovint serum (FBS) og 0,5 ml pen-strep (antibiotika) til et 50 ml rør for å lage RPMI 1640 med 20% FBS og 1% PS som et grunnleggende medium.
      MERK: Denne høye konsentrasjonen av FBS brukes til å sørge for langvarig kultur av nøytrofiler, som kan være større enn 5 dager. Hvis dyrkingstiden er 1-2 dager, er 10% -15% FBS tilstrekkelig.
    2. Tine alle lagerløsningene til CLON-G-komponentene på is.
    3. Fortynn 1 μL Hsp70 til 20 μM ved å tilsette 606 μL av basismediet. Fortynn 1 μL på 200 μg/ml g-csf til 20 μg/ml ved å tilsette 9 μL av basismediet.
    4. Tilsett 976 μL basisk medium til et 15 ml sentrifugerør. Tilsett 1 μL Q-VD-oph (100 mM), 10 μL DFO (200 μM), 1 μL Hsp70 (20 μM), 10 μL NAC (200 mM), 1 μL Nec-1s (20 mM) og 1 μL G-CSF (20 μg / ml) for å lage 1 ml 2x CLON-G medium.
      MERK: 2x CLON-G-mediet skal brukes umiddelbart etter tilberedning. Man kan oppbevare 2x CLON-G midlertidig ved 4 °C. Rester av 20 μM Hsp70 må kastes.
  3. Nøytrofil kultur
    1. Isoler nøytrofile mus ved gradientsentrifugering etter en tidligere rapport25. Resuspender de isolerte nøytrofilene fra mus i basisk medium (1 million celler/100 μL).
      MERK: Unngå å aktivere nøytrofilene ved å håndtere dem forsiktig. Unngå skumdannelse under hele prosessen.
    2. Tilsett 500 μL av 2x CLON-G medium, 400 μL av basisk medium og 100 μL av cellesuspensjonen til 24-brønns ikke-vevskulturplater (se materialfortegnelse), og pipetter forsiktig tre til fire ganger.
      MERK: Høye konsentrasjoner av komponentene i 2x CLON-G-mediet kan skade nøytrofilene. Unngå å legge dem sammen uten det grunnleggende mediet. Den ikke-vevskulturerte kulturplaten er nødvendig for å unngå nøytrofil adhesjon.
    3. Dyrkningsplaten plasseres jevnt i en 37 °C og 5 % CO2 -inkubator.
      MERK: Det er unødvendig å bytte cellemedium innen 7 dager. De endelige konsentrasjonene av CLON-G-sammensetningen er 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s og 10 ng / ml g-csf.
    4. Beis de dyrkede nøytrofilene med Wright Giemsa-sammensatt flekk (se materialtabell), og analyser med et lysmikroskop (figur 2A-D). Alternativt kan du farge med APC-CD11b og PE-Cy7-Ly6G antistoffer, og analysere med flowcytometri (figur 2E-I) som beskrevet tidligere26.

2. In vitro spontan dødsanalyse av nøytrofiler

  1. Analyse av flowcytometri
    1. Dyrkning isolerte nøytrofiler med en tetthet på 1 million celler/ml i basisk medium ved 37 °C og 5 % CO2. Den 24-brønns kulturplaten er ikke-vevsdyrket. Tilsett 1 ml cellemedium per brønn.
    2. Løs opp 1 gCaCl2 med 45 ml saltvann for å lage 200 mM CaCl2. Filtrer den med en 0,2 μm filtreringsenhet. Konserveres ved 4 °C.
    3. Forbered fargeblandingen. Tilsett 7 μL saltvann per prøve til et 1,5 ml rør, og tilsett 0,4 mg / ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg / ml propidiumjodid (PI) og 200 mM CaCl2-oppløsning ved 1 μL hver per prøve. Bland godt. Bruk løsningen umiddelbart etter tilberedning.
    4. Pipetter cellemediet forsiktig fem til syv ganger for å blande godt, etterfulgt av overføring av 100 μL til et flowcytometrirør ved de ønskede tidspunktene.
      NOTAT: Unngå skumdannelse under hele prosessen.
    5. Vortex teller perler (se Materialfortegnelse) for å blande dem godt. Pipett 10 μL av de godt blandede tellekulene til samme flowcytometrirør som i trinn 2.1.4.
    6. Tilsett 10 μL den tilberedte fargeblandingen (trinn 2.1.3) til flowcytometrirøret. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter fra lys.
    7. Tilsett 100 μL saltvann til røret, og bland godt for å sikre jevn fordeling av tellekulene og cellene.
    8. Utføre flowcytometrianalyse av cellemediet. Samle cellene med lav hastighet med ~ 400 hendelser / s. Gate APC-PE-Cy7-cellene til FSC-A og SSC-A, og port de intakte cellene med medium FSC-A og SSC-A posisjoner til FITC-Annexin-V og PE-PI; Annexin-V-PI-populasjonen er klassifisert som friske celler.
      MERK: Følgende ligninger bestemmer det totale antall friske celler per prøve og levedyktigheten til nøytrofilene:
      Totalt antall friske celler per prøve27 = (1000/antall tellekuler) × antall Annexin-V-PI− populasjoner × 10
      Levedyktighet av nøytrofiler = totalt antall friske celler på angitt tid / totalt antall friske celler på tidspunkt null
  2. Fluorescerende bildeanalyse
    1. Dyrkning isolerte nøytrofiler med en tetthet på 1 million celler/ml i basisk medium ved 37 °C og 5 % CO 2 i en konfokalplate med2 ml cellemedium per plate.
      MERK: Et konfokalfluorescensmikroskop har den beste bildekvaliteten, men ethvert fluorescensmikroskop som har 488/561/DIC-kanaler er tilstrekkelig til å støtte dette eksperimentet.
    2. Ta platen forsiktig ut på det angitte tidspunktet. Tilsett 10 μL hver av 0,4 mg / ml FITC-Annexin-V, 0,5 mg / ml PI og 200 mM CaCl2 jevnt til platen. Beis i romtemperatur i 5 min.
      MERK: Unngå risting under hele prosessen. Tilsett fargestoffene jevnt og forsiktig.
    3. Ta fluorescensbilder ved 488 (annexin-V) / 561 (PI) / DIC-kanaler ved hjelp av et konfokalfluorescensmikroskop med en 20x objektivlinse (se materialtabellen). Angi eksponeringstiden for 488-kanalen som 500 ms, 561-kanalen som 200 ms og DIC-kanalen som 100 ms. Velg 5-10 tilfeldige områder for hver plate. Celletypene er definert i vår tidligere publiserte rapport14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wright-Giemsa-farget morfologi (figur 2A-D) og FACS-fenotyper (figur 2E-J) av CLON-G-behandlede nøytrofiler ble ikke påvirket. Levedyktigheten til de CLON-G-behandlede nøytrofile ved 24 timer var ca. 90 %+ basert på flowcytometrianalyse (figur 3) og fluorescerende bildeanalyser (figur 4). Lavere levedyktighet kan skyldes feil lagring, feil konsentrasjoner av CLON-G-komponentene eller dårlig kvalitet på de startisolerte nøytrofilene. Flowcytometrianalysen av de ubehandlede nøytrofile som ble dyrket med basisk medium i 24 timer, viste at disse nøytrofile granulocytter hadde en annexin-V-positiv populasjon (figur 3B). Tapet av denne populasjonen kan skyldes etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i cellemediet. Fluorescensbildene av nøytrofilene dyrket med basismediet i 24 timer skal inneholde oppblåste celler (hvit pil i figur 4A). Tapet av puffede celler kan skyldes risting eller pipettering av konfokalplaten.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema for nøytrofildyrkning med CLON-G og in vitro dødsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Morfologi og celleoverflatemarkørfenotyper av de CLON-G-behandlede nøytrofile musene. Cellene ble (A-D) farget med Wright-Giemsa-sammensatt flekk etter dyrkning og vurdert ved mikroskopi ved hjelp av en 40x objektivlinse eller (E-I) farget med APC-CD11b og PE-Cy7-Ly6G antistoffer og analysert med flowcytometri. (J) Forholdet mellom CD11b + og Ly6G + celler ved de angitte tidspunktene ble statistisk analysert. Skalastangen er 10 μm. Data presenteres som et SD-middel ± tre eksperimenter. NS = ingen statistisk signifikant forskjell sammenlignet med tilsvarende gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Flowcytometrianalyse av CLON-G-behandlede nøytrofile nøytrofile benmargsnøytrofile mus. (A) Gating strategi, (B) representative resultater, og (C) levedyktigheten av nøytrofiler etter dyrkning i 24 timer. Data presenteres som et SD-middel ± tre eksperimenter. **P < 0,001 sammenlignet med tilsvarende gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater for nøytrofil død basert på fluorescensbildeanalysen. Nøytrofil død etter dyrkning med (A) basisk medium i 24 timer eller CLON-G i (B) 24 timer, (C) 3 dager eller (D) 5 dager. Etter dyrkning ble cellene farget med FITC-Annexin-V (grønn) og PI (rød) og vurdert ved konfokal fluorescensmikroskopi. Skalastangen er 40 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutrofiler spiller viktige roller i medfødt og adaptiv immunitet, og deres homeostase er tett regulert. Neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i humant perifert blod, og de har en robust og rask omsetning. En frisk voksen kan frigjøre 1 x 109 nøytrofiler/kg daglig fra benmargen28. Døden av nøytrofiler har dermed blitt en av de forvirrende gåtene i dette feltet, og mye innsats har blitt viet til å bedre forstå dem. Kaspase 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, nekrose 34,35,36,37 og nekropolose 18,38 har vist seg å være involvert i disse heterogene prosessene. GM-CSF 24 og G-CSF23 kan forlenge den nøytrofile levetiden til ca.24timer med undertrykte funksjoner. CLON-G retter seg mot alle kjente nøytrofile spontane dødsmekanismer. Så vidt vi vet, gir CLON-G for tiden den lengste forlengelsen av den nøytrofile levetiden in vitro uten at det går ut over funksjonen.

Flere forbehold må vurderes for å oppnå de beste resultatene fra nøytrofildyrkning med CLON-G. Gjennom vår tidligere farmakologiske screening16 ble det understreket at nøyaktige konsentrasjoner av CLON-G-komponentene er nøkkelen til suksess, og at man derfor bør prøve å unngå å gjøre feil under preparatet og å bevare dem riktig. Når det gjelder nøytrofil manipulasjon og rensing, er det lett å aktivere og drepe nøytrofilene; Derfor bør de behandles forsiktig under hele prosessen og dyrkes når de er isolert. De er følsomme for cellekonsentrasjonen, tilstanden til kulturplaten, temperaturen og pH; Man må være forsiktig når man endrer denne protokollen. Med hensyn til in vitro dødsanalysen har tidligere resultater vist at spontant døde nøytrofiler svulmer til puffede celler som er utålelige for mekanisk kraft; spinning ned, pipettering og vasking vil redusere antall nøytrofiler, og å erstatte standard bindingsbuffer med en CaCl2-løsning kan forenkle denne prosessen og sikre nøyaktig avbildning av nøytrofilene14. Uoverensstemmelser mellom de tekniske duplikatene i samme eksperiment kan skyldes skumdannelse under operasjonen. Forskjeller mellom uavhengige eksperimenter kan skyldes variasjoner i renheten og friskheten til nøytrofilene39.

CLON-G kombinerer kjente reaksjonsveier og tilsvarende hemmende kjemikalier for å forhindre spontan nøytrofil død. Imidlertid gjenstår kjernespørsmålet i dette feltet angående de kompliserte veiene som formidler nøytrofil død, da disse fortsatt ikke er fullt ut forstått. Død av CLON-G-behandlede nøytrofiler er uunngåelig. Dermed har CLON-G fortsatt rom for forbedring. Når det gjelder komponentene i CLON-G, er de beste valgene klinisk anvendte legemidler for å utvide muligheten for klinisk anvendelse av CLON-G-behandlede nøytrofiler; Q-VD-oph og REC-1 er imidlertid kun for forskning, og kliniske studier som fokuserer på dem er for øyeblikket ikke tilgjengelige. Dermed er alternative forbindelser nødvendige for klinisk anvendelse.

Ved å forlenge den nøytrofile levetiden til mer enn 5 dager med funksjonene intakte, kan CLON-G låse opp uendelige muligheter for nøytrofil forskning. Med dette utvidede vinduet kan observasjon, genmanipulasjon, langtidslagring, transport og kryopreservering utvikles basert på CLON-G. Arbeids-, tids- og pengekostnadene vil bli redusert betydelig, noe som vil senke inngangsbarrierene for nye forskere. CLON-G kan også fremme nøytrofile kliniske anvendelser som granulocyttransfusjonsbehandling. Nøytropen infeksjon etter kjemoterapi er en viktig dødsårsak for pasienter som lider av kreft og hematopoietiske maligniteter 40,41,42,43,44. Granulocyttransfusjonsbehandling, som har stort potensial som alternativ terapi for å hjelpe disse pasientene, er sterkt begrenset av den korte levetiden til nøytrofiler45. Den nåværende prosessstrømmen for granulocyttransfusjon tar lengre tid enn levetiden til en nøytrofil, noe som fører til at transfunderte nøytrofiler mister sin effektivitet som en førstelinje immuncelle. CLON-G-behandling gir nok tid til fremstilling av granulocyttransfusjoner, som har potensial til å redde utallige liv for nøytropeninfiserte pasienter og for å bidra til å redusere overforbruk av antibiotika. Samtidig kan den nåværende protokollen for nøytrofil dødsanalyse nøyaktig demonstrere statusen til nøytrofiler og forbedre reproduserbarheten av eksperimentelle resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble støttet av Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Special Research Fund for Central Universities, Peking Union Medical College (3332022062), og Science and Technology Support Program of Sichuan Province (NO. 2021YJ0480).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filter Pall Corporation 4612 Filtrate prepared CLON-G components.
1.5 mL micro centrifuge tube LABSELECT MCT-001-150 Lab consumable.
15 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-15 Lab consumable.
24 well cell culture plate Falcon 351147 Neutrophil culture plate.
50 mL Centrifuge Tubes LABSELECT CT-002-50 Lab consumable.
BD LSRII BD Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Calcium chloride (CaCl2) Sigma Aldrich C4901 Assitant of Annexin-V binding  to phosphatidylserine.
Confocal microscope Perkinelmer UltraVIEW VOX Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death.
Confocal plate NEST 801001-20mm Lab consumable for fluorescent image assay.
Counting beads Thermo Fisher C36950 Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death.
DFO Sigma Aldrich D9533 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
Dimethyl sulfoxide ( DMSO) Sigma Aldrich D2650 Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s.
Fetal Bovine Serum Gibco 10099141C Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply.
FITC-Annexin-V BD 51-65874X Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel.
Hsp70 Abcam ab113187 Component of CLON-G. LMP inhibitor.
NAC Sigma Aldrich A9165 Component of CLON-G. Antioxidant.
Nec-1s EMD Millipore 852391-15-2 Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor.
Penicillin-Streptomycin Solution (PS) Gibco 15070063 Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination.
Propidium Iodide (PI) BioLegend 421301 For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA  but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane.
Q-VD-oph Selleck chem S7311 Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor.
Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) Chugai Pharma China GRANOCYTE Component of CLON-G.  Promote neutrophil survival through Akt pathway.
Round-Bottom Polystyrene Tubes Falcon 100-0102 Lab consumable for flow cytometry analysis.
RPMI1640 Gibco C11875500BT Component of neutrophil culture basic medium.
Saline LEAGENE R00641 Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death.
Sodium hydroxide (NaOH) FENG CHUAN 13-011-00029 pH adjustion for NAC.
Wright-Giemsa Stain Solution Solarbio G1020 Neutrophil cytospin staining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Segal, A. W. How neutrophils kill microbes. Annual Review of Immunology. 23, 197-223 (2005).
  2. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
  3. Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
  4. Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
  5. Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
  6. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
  7. Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
  8. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  9. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  10. Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
  11. McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
  12. Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
  13. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  14. Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H. Heterogeneity of neutrophil spontaneous death. American Journal of Hematology. 92 (8), E156-E159 (2017).
  15. Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
  16. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  17. Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
  18. Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U. Necroptosis and neutrophil-associated disorders. Cell Death and Disorders. 9 (2), 111 (2018).
  19. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  20. Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
  21. Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
  22. Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
  23. van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
  24. Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
  25. Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
  26. Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
  27. Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
  28. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  29. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death and Differentiation. 6 (2), 99-104 (1999).
  30. Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
  31. Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
  32. Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
  33. Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
  34. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  35. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  36. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
  37. Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
  38. Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
  39. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  40. George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
  41. Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
  42. Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
  43. Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
  44. Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
  45. Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).

Tags

Biologi utgave 195
Nøytrofil levetidsforlengelse med CLON-G og en <em>in vitro</em> spontan dødsanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma,… More

Fan, Y., Teng, Y., Liu, F. t., Ma, F., Hsu, A. Y., Feng, S., Luo, H. R. Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay. J. Vis. Exp. (195), e65132, doi:10.3791/65132 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter