תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי
May 17th, 2011
שיטה זו מתארת את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את ההשפעה של ליגנד מהיר של גירוי אפופטוטי במוח הקטן המתפתח של עכברים מסוג בר ועכברים מוטנטיים. זה מושג על ידי ניתוח מוח של עכברים מסוג פרא ונוקאאוט בין הימים 8 ל-12 שלאחר הלידה. השלב השני הוא לפרוס את המוחות לפרוסות בעובי 400 מיקרומטר ולבודד את המוח הקטן מכל פרוסה.
השלב השלישי הוא תרבית פרוסות המוח הקטן במשך חמישה ימים כדי לוודא שהן בריאות לפני גרימת מוות תאים עם ליגנד מהיר. השלב האחרון של ההליך הוא לנתח את ההשפעה של ליגנד מהיר באוכלוסיות תאי המוח הקטן השונות של עכברים מסוג בר ועכברי נוקאאוט על סמך צביעה אימונו-פלואורסצנטית עבור מנהרת הסמן האפופטוטית, בשילוב עם סמנים ספציפיים לסוג התא כמו קלבינדין לתאי ביקיני. היתרון העיקרי של תרבויות חיים במוח הקטן הוא שהוא מאפשר את הסגנון של מבנה אזורי של המוח הקטן וכמו תרבויות מנותקות ראשוניות שבהן הרשתות העצביות ומספר ארגונים משובשים.
אז העניין הזה יאפשר לענות על כמה שאלות מפתח במדעי המוח, במיוחד מכיוון שיש לאדם את הטיפוס הפראי והעכבר המוטנטי. אז אפשר ללמוד התפתחות השוואתית, אפשר ללמוד פיזיולוגיה, וגם אלקטרופיזיולוגיה ופרמקולוגיה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקודו של ליגנד מהיר בהישרדות המוח הקטן או התא, ניתן להשתמש בה גם בתוך ההשפעות של ליגנד מהיר בקליפת המוח ובהיפוקמפוס.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שעל מנת להשיג ליזה מוחית בריאה, קריטי להכניס אותם לתרבות במהירות האפשרית מבלי לפגוע בשלמותם. לכן, חשוב להיות בעל כישורי ניתוח וחיתוך טובים לפני שמנסים את כל התהליך. במידת האפשר.
יש לבצע את השלבים של ההליך הבא במכסה המנוע של תרבית רקמות לפני הדיסקציה. הכינו אמצעי CSF לדיסקציה של המוח והכנת פרוסות, כמו גם מדיה של תרבית פרוסות לפי הפרוטוקול הכתוב ואחסנו אותם בארבע מעלות צלזיוס ביום הדיסקציה. הכן צלחות תרבית רקמות לטיפוח פרוסות המוח הקטן.
הוסף מיליליטר אחד של מדיית תרבית פרוסות לכל באר של צלחת שש בארות. לאחר מכן השתמש במלקחיים סטריליים כדי למקם את תוספות צלחת התרבות לכל אחד מהם. ובכן ודא שאין בועות אוויר כלואות מתחת לתוספת.
הנח את צלחת התרבות באינקובטור תרבית רקמות הגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים לפחות כדי לתקן את המדיה. לאחר מכן, מבעבעים את הקרח קר. מדיית CSF עם רוויית גז קרבוגן של המדיה עם קרבוגן משנה את ה-pH של התמיסה ומייצרת שינוי צבע מאדום לכתום.
יוצקים מעט מבעבע הקרח של מדיה CSF לצלחת פטרי סטרילית וצלחת שש בארות. הניחו אותם על קרח יחד עם צלחת הוויברטו שתשמש לחיתוך המוח. צלחת הפטרי המכילה קר קרח מבעבע מדיה CSF תשמש לניתוח המוח מגור עכבר P 8 עד P 12 לאחר נתיחה.
השתמש בסכין גילוח כדי לבצע חתך סגיטלי בחצי כדור אחד כדי לספק משטח ישר להרכבה על לוחית הוויברם. ניתן גם לחתוך את החלק הרוסטרלי של קליפת המוח. יבש את צלחת הוויברם המצוננת במגבת נייר.
לאחר מכן מוסיפים מעט דבק סופר לבמה ומורחים אותו בצורה זיגזג עם קצה צינור הדבק הסופר. ליצירת שכבת דבק דקה, השתמשו במרית כדי להעביר את המוח לשלב הוויברטו כשהצד השטוח במגע עם דבק העל. ברגע שהמוח מחובר לצלחת הוויברם, הוסיפו מספיק מדיית CSF כדי לכסות את המוח והוסיפו קרח מתחת לצלחת כדי לשמור עליו קר.
חותכים את המוח לפרוסות של 400 מיקרומטר. לאחר מכן השתמש בפיפטת פסטה מפלסטיק עם חתך. קצה מורחב להעברת הפרוסות לצלחת שש הבארות המכילה מדיה CSF על קרח העובד תחת מיקרוסקופ הניתוח.
השתמש בשני מזרקי אינסולין בקוטר קטן של 28 מחטים כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח. אם לאחת מהפרוסות יש דבק סופר בקצה, השתמש בשתי מחטי המזרק כדי להסיר את הדבק מהפרוסה. השתמש בפיפטת הפסטה מפלסטיק עם קצה חתוך מורחב כדי להעביר את הפרוסות לחלק העליון של המסננים.
הוספת פרוסה אחת עד שלוש לכל תוספת מבטיחה שהפרוסות מורחבות במלואן ושאין נוזל שמכסה אותן. במידת הצורך יש לשאוב עודפי מדיה כשהפיפטה מודגרת, 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות, החלף מחצית מנפח המדיה במדיה חדשה, וודא שאין בועות אוויר כלואות מתחת לתוספת.
המדיום המקורי הנותר מכיל גורמים טרופיים נגזרים חתוכים החשובים להישרדות התאים. האתגר האפופטוטי מבוצע לאחר חמישה ימים של תרבית. הוסף את הנוגדן האגוניסטי המהיר JO 2 למצע תרבית התאים בבארות לטיפול.
השאירו מחצית מהבארות ללא טיפול כבקרה. לאחר שחלפו 24 שעות, שאפו את המדיה מתחת לבארות. לאחר מכן תקן את הפרוסות על ידי פיפטינג של מיליליטר קר כקרח, 4% פרלדהיד מתחת לתוספת ומיליליטר אחד של PFA על גבי התוספת.
אפשר לפרוסות לתקן ב- PFA, 10 דקות טמפרטורת החדר לאחר 10 דקות. שאפו את ה-PFA ושטפו לזמן קצר עם שני מיליליטר של פיפטינג PBS קר. מיליליטר אחד על גבי התוספת ומיליליטר אחד מתחת לתוספת.
לאחר מכן, שאפו את ה-PBS ופיפטה מיליליטר אחד של 20% מתנול קר כקרח ב-PBS מתחת לתוספת ומיליליטר אחד מעל התוספת. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז שואבים את 20% המתנול מהבאר ושוטפים היטב את הפרוסה ו-D עם PBS. כמו קודם, פיפטה מיליליטר אחד של 0.5% טריטון X 100 ב-PBS על גבי התוספת, ועוד מיליליטר אחד מתחת לתוספת.
דגירה למשך 12 שעות לפחות בארבע מעלות צלזיוס כדי לחלחל את הפרוסות לאחר החלחול. שאפו את ה-0.5% טריטון X 100 ב-PBS ופיפטה מיליליטר אחד של 20% BSA ב-PBS על גבי הפרוסה ומיליליטר אחד מתחת לפרוסה. חוסמים את הפרוסות למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלמת החסימה, השתמש במספריים נקיים כדי לחתוך בזהירות את פיסת תוספת הממברנה המחוברת לפרוסת המוח הקטן. לאחר מכן השתמש במלקחיים נקיים כדי להעביר את פיסת הממברנה לצלחת של 24 בארות המכילה PBS, לשאוב את ה-PBS ולהוסיף 250 מיקרוליטר של מגיב מנהרה לכל באר. וודא שהמגיב מכסה את כל שטח הפרוסה.
דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בחושך כשחלפה השעה. שאפו את מגיב המנהרה מהבארות והחליפו ב -500 מיקרוליטר PBS. הגן על הצלחת מפני אור ודגר אותה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לכביסה.
חזור על תהליך זה פעמיים לאחר הכביסה האחרונה. שאפו את ה-PBS והוסיפו 250 מיקרוליטר של דילול של 1 עד 1000 של נוגדן הקלבינדין ב-PBS ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך. למחרת.
שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטפו עם PB S3 פעמים למשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל אחד ל-500 ב-PBS. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ומדגרים לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה.
שוטפים את הפרוסות שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS ובאמצעות אמצעי הרכבה המכיל dappy. הרכיבו את הפרוסות על מיקרוסקופ זכוכית, החליקו וכסו. דמיין את הפרוסות במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות אורכי גל עירור של 488 ננומטר ו-561 ננומטר עבור קייל, בנדין ומנהרה בהתאמה.
תמונה זו מציגה פרוסה בריאה של המוח הקטן. לאחר יומיים במבחנה, שכבת גוף התא נראית שקופה ומבנה העלים של המוח הקטן נראה בבירור במיקרוסקופ. לאחר שבעה ימים במבחנה, המבנה העלווה של פרוסת המוח הקטן הבריאה עדיין נראה לעין.
בנוסף, גופי תאים כהים, ככל הנראה מקרופאגים, מכסים בדרך כלל את הפרוסה. התמונה הקונפוקלית הנראית כאן מייצגת פרוסת מוח קטן שטופלה במהירות. תאי הביקיני נראים ירוקים לאחר צביעה בנוגדנים ראשוניים, ואחריהם נוגדן משני מצומד Alexa 4 88.
התאים האפופטוטיים החיוביים לצביעת מנהרה נראים אדומים מכיוון שערכת המנהרה המשמשת מסומנת ב-TMR. תאי ביקיני אדומים אינם מופיעים בשורה אחת, אלא אשכול היוצר מבנה דומה תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לזכור לעבוד במכסה המנוע של תרבית רקמות במידת האפשר, ולמזער את משך הזמן שרקמת המוח נחשפת למזהמים אפשריים כמו חיידקים או פטריות.
באמצעות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות על פרוסות אלה, כולל ביוכימיה וניתוחים אלקטרופיזיולוגיים כדי לספק מידע נוסף על תכולת החלבון כמו גם ריגוש עצבי. טכניקה זו פותחה במקור כדי לחקור את ההשפעה של מוות תאי מתווך מהיר בתאי פרקין הנושאים מוטציות המשפיעות על המסלול המהיר. תאי פריאל שורדים לעתים רחוקות בתרבית ראשונית.
אז ההליך הזה היה הגישה הניסיונית הטובה ביותר. אז אני מקווה שאחרי שתצפו בסרטון הזה, יהיה לכם מושג טוב כיצד להכין פרוסות חבית קרס וכיצד ניתן לחקור את הגירויים האדישים והשפעתם על סוגי תאי מוח שונים.
סקירה
שיטה זו מתארת את יצירתם של תרבויות מוחיות מסוג אורגנוטיפי ואת ההשפעה של גירויים אפופטוטיים מסוימים על חיוניות סוגי תאים מוחיים שונים. המחקר בוחן את ההשפעה של ליגנד מהיר על תאי מוח מסוג טיפוסי ומוטציוני מעכברים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- אפופטוזיס
רקע
- הבנת חיוניות תאי המוח היא חיונית למדעי המוח.
- ידוע שהליגנד המהיר גורם לאפופטוזיס בסוגי תאים שונים.
- תרבויות אורגנוטיפיות שומרות על שלמות המבנה של רקמות המוח.
- מחקרים השוואתיים בין עכברים מסוג טיפוסי ומוטציוני מספקים תובנות על הבדלים בהתפתחות.
מטרת המחקר
- לחקור את ההשפעות של ליגנד מהיר על אוכלוסיות תאי המוח.
- להשוות בין תגובות עכברים מסוג טיפוסי ומסוג נוקאאוט.
- לשפר את ההבנה של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של המוח.
שיטות בהן נעשה שימוש
- ניתוח רקמות מוח מסוג פוסטנטלי מעכברים.
- חיתוך רקמות מוח לחלקים בגודל 400 מיקרומטר.
- גידול פרוסות מוח במשך חמישה ימים לפני הטיפול.
- צביעה אימונופלואורסצנטית לניתוח מרקרים אפופטוטיים.
תוצאות עיקריות
- טיפול בליגנד מהיר גורם לאפופטוזיס בסוגי תאים מוחיים מסוימים.
- הבדלים בחיוניות התאים נצפו בין עכברים מסוג טיפוסי ומסוג נוקאאוט.
- השיטה מאפשרת ניתוח מפורט של תגובות תאי המוח.
- התובנות שהושגו יכולות להודיע על מחקרים עתידיים על תפקוד המוח.
מסקנות
- תרבויות מוחיות אורגנוטיפיות יעילות לחקר חיוניות תאים.
- הליגנד המהיר משמש ככלי שימושי לחקר מסלולי אפופטוזיס.
- ניתן להתאים את השיטה למחקרים באזורים אחרים במוח.
