Name: 인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 배우세요 인간 두피 모낭에서 신경 크레스트 줄기 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 흐름 세포측정법으로 CD271 HNK1 양성 세포를 분류하고 신경구 형성을 관찰하여 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

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1. 조직 문화 플레이트의 작성 <ol><li> 코트는 각이 잘 폴리-D-리신 (PDL)이 우물의 바닥을 커버 할 수있을만큼. 플레이트는 후드에서 건조하도록 허용합니다. </li><li> 우물이 건조 후, 멸균 물을 헹구고, 대기음. 플레이트는 후드에서 건조하도록 허용합니다. </li><li> 때 fibronectin과 건조, 코트 (6 ML 1 밀리그램의 농도에서 37 ° C에서 하룻밤 biowhittaker 물에 용해 된 것). </li><li> NCSC 매체를 추가합니다 [95 ML DMEM/F12, 1 ML 펜 / 패 혈성 (P / S), 1 ML N2, 2 ML B27, 100 μl 메르 캅토 에탄올 (2ME, 50 MM 주식), bFGF는 (20 NG / ML 중간), IGF -1 (20 NG / 매체의 ML)과 EGF (20 NG / 매체의 ML)] 접시에 건조하기 전에 fibronectin, </li></ol> 2. 인간의 두피에서 헤어 소낭 세포를 추출 <ol><li> 분리 NCSCs의 절차를 시작하기 전에, 하나는 (표 1 참조) 각 매체와 시약을 준비해야합니다. </li><li> 새롭게 단장 절차 나 FE 신선한 성인의 두피 피부할거야, 두피 조직은 PBS의 페니실린 - 스트렙토 마이신을 포함하는으로 씻어 수집하고 있습니다. </li><li> 피부 후 50 ML 튜브로 옮겨와 4 ° C.에서 하루 아침에 Dispase (10 MG / ML)과 DMEM에 incubated 수 있습니다 37 번 2-4 시간을위한 부화는 ° C도 효과적입니다. 피부 조각이 관통하는 효소를 허용하는 1cm의 최대 너비해야합니다. </li><li> 소독 페트리 접시에 피부를 전송하고, 피부 표면 근처에 머리 샤프트​​을 쥐었고 단단히하고 부드럽게 당겨 피부의 각 머리를 당긴다. 모낭은 anagen (그림 1A) 또는 telogen (그림 1B) 또는의 형태를 보여줍니다. </li><li> 주기적으로 진동과 실내 온도 15-20 분 동안 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Invitrogen)에 절연 고치 조각을 길러, 반응을 중지 10 % FBS와 4 ML DMEM을 추가합니다. follicular 상피는 trypsinized와 다양한 크기와 모양의 세포를 포함하는 단일 셀 정지를 얻기 위해 필터 40 μm를 통해 필터링됩니다. </li><li> 회전5 분 200 XG에, 1 ML PBS는 2 % 혈청 (FBS)을 포함에 다시 중지 조심스럽게 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 또한 뽑혀 모낭은 원위치에 헤어 분야를 성장 트립신 소화하지 않고 문화에 배치 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 흐름 Cytometric 셀 정렬을 사용하여 헤어 소낭의 NCSCs의 절연 <ol><li> 헤어 대과 단일 셀 정지는 트립신의 소화에 의해 획득 및 CD271 (APC-복합) / HNK1 (FITC-복합) 또는 CD271 / alpha4 어둠 속에서 얼음에 40 분 인테그린 (PE-복합)에 대한 항체로 분류되었습니다. </li><li> 상온에서 200 XG에서 5 분 동안 원심 분리기와 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> PBS는 2 % 혈청 (FBS)을 포함에 Resuspend 세포 및 정렬하기 전에 PI는 죽은 세포 밖으로 게이트에 추가됩니다. </li><li> 유동 세포 계측법 (FACS)에 의해 세포 정렬을 수행합니다. CD271를 수집 +, HNK1 + 더블 긍정적 인 셀 또는 CD271 +, alpha4 인테그린 + 더블 긍정적 인 세포 (그림 2). </li><li> 후 정렬ING, CD271 +, HNK1 + 더블 긍정적 인 셀 또는 CD271 +, alpha4 인테그린 + 더블 긍정적 인 셀은 NCSC 매체에 초저 첨부 파일 접시에 배양 아르 </li></ol> 4. 기본 NCSCs의 문화 <ol><li> 문화 disassociated follicular 세포 또는 FACS는 NCSC 매체의 초저 첨부 파일 접시에 세포를 정렬 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 현미경으로 매일 세포 배양을 확인합니다. NCSCs는 여러 일 기증자 (그림 3A)의 나이에 따라 문화에 2~5주에서 잘 구성된 영역 이후 부동 작은 응집체를 형성하기 시작합니다. 가지가 솟아 오른 지역 여러 주 동안 현장에서 잘 구성된 영역 (그림 3B) 전체 모낭은 NCSC 매체에 배양 아르에서 몇 일에 나타납니다. </li></ol> 5. NCSCs의 확장 <ol><li> 한 번 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 사전 예열을 추가 (37 ° C, 임계) 37시 accutase 및 배양 ° C 5-10에하나의 셀에 있는지 신경 줄기 세포 분야는 dissociated하기 위해 주기적으로 진동이있는 분 (첨부 파일 양식 NCSC, 37에서 accutase과 배양 세포에 대한 확인 헤어 소낭의 줄기 세포 분리하기 위해 5 분에 대한 ° C). </li><li> 남아있는 accutase 솔루션을 제거 할 DMEM/F12 중간에 상온 200 XG에서 5 분에 두 번 세척하고 세포를 원심 분리기. </li><li> NCSC 문화 매체와 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 부동 문화를 들어, 초저 첨부 파일 플레이트에 세포를 넣어. 첨부 파일 문화를 들어, pretreated 조직 배양 플레이트에 세포를 넣어. </li></ol> 6. 대표 결과 NCSC 문화 매체 피더 셀 필요없이 undifferentiated 상태에서 hNCSCs를 유지하기에 충분합니다. Keratinocytes는 세포 분열 따위에 의해 번식하고 점차 매체에서 죽었되지 않습니다. 특정 작고 둥근 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식하고 3-5일 후 정지의 작은 집합체를 형성합니다. 이러한 부동 집계는 천천히 증가우리가 헤어 분야 (그림 3A)이라고한다 N의 크기, 생성 입체 영역과 같은 구조. 코팅 접시에 배양하면 NCSCs는 표면에 부착하고 영역을 형성하지 않습니다. 첨부 NCSCs는 중지보다 더 빠르게 성장합니다. 영역 - 성형 또는 첨부 된 줄기 세포는 NCSCs 마커를 표현한다. 전체 모낭이 문화가되면 영역이 솟아 오른 지역 (그림 3B)에 해당하는 지역에서 형성된다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 1 그림. anagen (A)와 telogen (B) 모낭을 뜯어 낸. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. NCSCs의 FACS 분석의 대표 이미지 왼쪽 패널 :. 셀 안티 CD271 및 안티 alphe 4 인테그린 항체를 사용하여 출입을 금지합니다. 오른쪽 패널 : 셀 안티 CD271 및 안티 HNK1 항체를 사용하여 출입을 금지 아르. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3194/3194fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 헤어 분야의 형태 부동 헤어 분야, 왼쪽 패널의 (A) 형태론 :. 저전력, 오른쪽 패널 :. 높은 전력 (B) 솟아 오른 지역, 왼쪽 패널에서 원래의 장소에 헤어 영역의 형태론 : telogen의 팽창에서 헤어 영역, 오른쪽 패널 : anagen 헤어 소낭의 볼록한 지역에서 헤어 영역.

<ol><li>Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+slow-cycling+limbal+epithelial+basal+cells+that+can+be+preferentially+stimulated+to+proliferate%3A+implications+on+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells.</a> Cell. 57, 201-209 (1989).</li>
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</ol>

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

설명 셀 절연과 문화 방법은 재현하고 강력한 있습니다. 우리는 폭 넓은 연령대에 걸쳐 개인의 수십에서 NCSCs를 생성했습니다. 그것은 바로 조직의 수확 후 조직을 처리하는 것이 좋습니다 있지만, 우리는 두피의 조직이 안전하게 세포 생존에 미치는 영향을 최소화 하루 아침에 교통 얼음의 미디어에 저장할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 이 항생제로 두피 조직을 치료하고 잠재적 인 미생물의 오염을 방지하기 위해 머리 소낭 격리하는 동안 무균 기술을 사용하는 것이 중요합니다. 보통 폐기 새롭게 단장의 피부 나 가능한 모낭 태아 두피 조직 수율의 수백은 단 몇 일 만에 FACS 정렬이나 추가 실험을위한 충분한 조직을 생성합니다. 두피 조직의 펀치 생검은 보통 세포의 제한된 수의 생성 및 추가 실험을위한 충분한 세포를 생산하기 위해 추가의 문화 조직이 필요합니다. 배아 NCSCs 서로 다른 수많은을 야기 할 수몸 11</su...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-32</td><td></td></tr><tr><td>열 불활성화 FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0026</td><td></td></tr><tr><td>상피세포 성장인자</td><td>R&amp;amp;D 시스템</td><td>236-EG-01M</td><td></td></tr><tr><td>IGF-I</td><td>R&amp;amp;D 시스템</td><td>291-G1-050</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>디스파제(Dispase)</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;제공해주신 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.&quot;&gt;&lt;강한&gt;표 1.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

모낭은 평생 성장을 받아야과 헤어 사이클은 줄기 세포 증식 및 정지를 포함 잘 제어 과정입니다. 헤어 팽창은 성인의 줄기 세포 1에 대한 잘 특징 틈새 시장입니다. 바깥 쪽 루트 피복의이 부분은 ​​상피 줄기 세포 2, melanocyte 줄기 세포 3 4-7 줄기 세포와 같은 신경 문장을 포함한 줄기 세포의 다른 유형의 번호를 포함하고 있습니다. 모낭은 인간 줄기 세포의 다른 유형에 대한 접근과 풍부한 소스를 나타냅니다. 우리와 다른 사람들은 4,5 인간의 태아 및 성인 모낭에서 신경 문장의 줄기 세포를 (NCSCs) 분리했습니다. 이러한 인간의 줄기 세포는 라벨 - 유지 전지이며, 체외에서 비대칭 세포 분열을 통해 자기 갱신 할 수 있습니다. 그들은이지나 신경 크레스트 세포 마커가 아닌 차별화 마커를 표현한다. 우리 식 프로파일 연구들은 손쥐 피부에 미숙 한 신경 cre와 유사한 유전자 발현 패턴을 공유했다성 세포. 그들은 체외 clonal 하나의 세포 배양에 후, myogenic melanocytic, 그리고 neuronal 세포 lineages을 야기 할 수 있습니다 clonal multipotency을 나타냅니다. 차별화 된 세포는 계보 (Lineage) - 특정 마커를 취득뿐만 아니라 전 생체 조건에 적합한 기능을 보여줍니다 없습니다. 또한 이러한 NCSCs는 중간 엽 lineages 대한 차별화의 잠재력을 보여줍니다. 차별화 된 neuronal 세포는 마우스의 뇌에 계속하고 neuronal 차별화 마커를 유지 할 수 있습니다. 그것은 머리가 NCSCs 신경 regrowth을 할 수 있습니다 파생 고치, 그리고 그들이 끊어 버렸네 척추 부상 8 다음이 줄기 세포를 이식 마우스에 모터 기능을 향상시키는 것이 보여왔다. 또한, 주변 신경은 줄기 세포 이식은 9, 눌린 좌골 신경에 인접 해 피부 파생 전구체 세포의 주입과 수리 된 remyelination 10 결과입니다. 따라서 헤어 대과 / 피부 파생 NCSCs은 이미 연구에 대한 긍정적 인 결과를 보여 주었다잠복기 모델 egenerative 치료. 유도 만능 줄기 (IPS) 셀에 재 프로그램 체세포는 재생 의료에 대한 엄청난 잠재력을 보여 주었다. 그러나, 특히 IPS 세포, 종양 유전자 / 바이러스 통합 만능 줄기 세포의 잠재적 tumorigenicity의 장기적 효과 아직 많은 문제를 적절하게 해결되지 않은이 있습니다. IPS 세포는 재생 의료에 사용하기 전에 극복 할 많은 장애물은 여전히​​ 있습니다. 성인 줄기 세포는 안전한 것으로 알려져 있으며, 그들은 같은 골수 이식 등 많은 년에 임상 적으로 사용되었습니다 반면. 대부분의 환자는 이미 치료의 혜택을했습니다. Autologous 성인 줄기 세포는 아직 이식에 대한 선호 세포입니다. 따라서, 인간의 피부 / 머리카락 모낭에 쉽게 액세스 할 수 있으며 확장이 성인 줄기 세포는 재생 의료에 대한 가치있는 소스입니다.

이 문서는 인간의 모낭에서 신경 문장의 줄기 세포의 분리와 문화에 대한 강력한 프로토콜을 제공합니다.

모낭은 평생에 걸쳐 성장을 거듭하며, 모주기는 줄기세포의 증식과 휴지기를 포함하는 정교하게 제어되는 과정입니다. 모낭 팽대부(Hair bulge)는...

본 절차의 전반적인 목표는 인간 두피 조직으로부터 일차 신경능선 줄기세포(N CSCs)를 분리하고 배양하는 것입니다. 이는 먼저 인간 두피 피부를 1cm 너비의 띠 형태로 자른 후 dis bays가 포함된 배지에서 배양함으로써 수행됩니다. 그 후 피부를 신선한 배지에 배치하고 모낭을 뽑아냅니다.절차의 두 번째 단계는 모낭을 trypsin으로 처리하여 단일 세포 현탁액을 얻는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 유세포 분석법을 사용하여 CD 2 71 HNK one 이중 양성 ncsc를 분리하고 배양 플레이트에 플레이팅하는 것입니다. 최종적으로 위상차 현미경을 사용하여 신경구 형성 및 성장을 관찰하는데, 피부와 모낭을 현미경 하에서 박리하는 것이 매우 어렵기 때문에 추출 및 분리 단계의 시연이 이 방법에서 매우 중요합니다.줄기세포 배양을 준비하기 위해, 6-웰 플레이트의 각 웰 바닥을 poly-D-lysine으로 코팅하고 후드 내에서 플레이트를 건조시킵니다. 웰이 건조되면 멸균수로 헹구고 흡입 제거한 후, 웰을 다시 건조시킵니다. 0.17 mg/mL 농도의 fibronectin 용액으로 플레이트를 코팅합니다.그 후 NCSC 배양 배지가 담긴 플레이트 내의 피브로넥틴이 마르기 전에, 다음의 배지와 시약을 준비하십시오. 97% D-M-E-M-F 12, 2% B 27 보충제, 1% 및 두 가지 보충제 B-F-G-F-E-G-F IGF one과 diss. 안면거상술을 통해 얻은 신선한 성인 인간 두피 피부 또는 태아 두피 조직을 수집하고 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 PBS로 세척하십시오.피부를 50 mL 튜브로 옮기고 10 mg/mL DIS가 포함된 DMEM에서 37°C로 2~4시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 피부를 멸균된 페트리 접시로 옮기고 피부 표면 근처의 모간을 잡아 단단하고 부드럽게 당겨 피부에서 털을 제거합니다. 모낭은 항원 기관 형태를 나타내며, 분리된 모낭 조각을 0.05% trypsin-EDTA에 넣고 실온에서 가끔 흔들어주며 15~20분 동안 배양합니다.그런 다음 반응을 중단시키기 위해 10% FBS가 포함된 DMEM 4 mL를 첨가합니다. 이어서, 난포 상피를 40 micron 필터에 통과시켜 다양한 크기와 모양의 세포가 포함된 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 그런 다음 현탁액을 200 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.S 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛을 2% FBS가

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 마우스 표피 신경 능선의 줄기 세포를 (에피 NCSC) 분리하기 위해 방법을 보여줍니다. 기술과 관련된 마이크로 해부, 수염 모공 볼록한 분리하고 조직 문화에 그것을 placeing. 사일 - 에피 NCSC 3 이내 하층에 팽창의 explants에서 이민을 시작합니다.

마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

체외에서 신경 크레스트 줄기 세포 (NCSC)을 육성하기 위해 특수 매체 (NCSCM)가 필요합니다. NCSCM의 필수적인 부분은 여자의 배아 추출물 (시)입니다. 우리는 여기서 고립, 물에 담가서 부드럽게 함, 원심 분리 및 여과 공정과 같은 세부 사항을 포함하여 순수하고 고품질시의 최대 금액을 생산하는 정확한 방법을 설명합니다.

Murine 신경 크레스트 줄기 세포의 배양 칙의 배아 추출 생산

인간의 피부에서 가능한 성인 상피 줄기 세포를 분리의 신속하고 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 모낭과 세포 배양에 대한 단세포 suspensions 또는 조직의 파편의 격리에 따버릴 다음 피부 콜라겐 매트릭스의 효소 소화를 활용합니다.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

신경 튜브의 배아 신경 능선의 분리가의 사용을...

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

이 동영상은 인간 진피 조직에서 슈반 세포를 분리하고 배양하는 프로토콜을 보여줍니다. 인간의 진피에는 섬유아세포(fibroblast)와 슈반(Schwann) 세포 등 다양한 유형의 세포가 포함되어 있습니다. 분리 후, 세포는 증식하는 섬유아세포를 제거하기 위해 항유사분열제로 처리되어 슈반 세포의 순수한 배양이 이루어집니다.

Isolation and Culture of Primary Schwann cells from a Human Dermis(인간 진피로부터 일차 슈반세포의 분리 및 배양)

이 비디오는 병아리 배아의 중뇌 영역에서 두개골 신경 주름을 분리하는 기술을 보여줍니다. 신경 주름의 상세한 해부 과정, 그 위치 및 피브로넥틴으로 코팅된 커버슬립에 부착된 후 신경 주름에서 신경능선 세포의 이동을 관찰합니다.

신경 능선 세포 배양을 위해 병아리 배아에서 두개골 신경 주름 분리

우리는 인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 능성 피부에서 파생 된 전구체 (SKP) 세포를 분리하는 방법을보고합니다. 우리는 섬유 아세포 문화에서 파생 된 이러한 SKPs은 인간의 피부 생검에서 직접 파생 된 것과 유사한 줄기 세포 특성을 공유하는 것을 보여줍니다. 이러한 세포는 OCT4와 나노 등 능성 마커뿐만 아니라 신경 능선 마커 스틴을 표현한다.

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에서 파생 된 신경 능선 (NC) 세포는 인간 발달과 질병 모델링을위한 세포 대체 요법에 대한 큰 가능성이있다. 여기에, 현재 널리 사용의 공급이없는...

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

이 프로토콜은 주로 세포 이동 연구를 위해 마우스 모델에서 두개골 신경 문장 세포의 해부 및 배양을 설명합니다. 우리는 사용된 살아있는 화상 진찰 기술 및 속도 및 세포 모양 변경의 분석을 기술합니다.

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

우리는 마우스 배아 줄기 세포에서 두개골 신경 능선 세포를 생성하기 위해 재현 가능한 크기의 신경구를 생성하는 3차원(3D) 체외 분화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 방법론이 이전 프로토콜에 비해 변동성을 줄이고 두개골 신경 능선 세포 발달을 연구하기 위한 다중 분석에 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.

Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

배우세요 인간 두피 모낭에서 신경 크레스트 줄기 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 흐름 세포측정법으로 CD271 HNK1 양성 세포를 분류하고 신경구 형성을 관찰하여 재생의학 연구에 활용할 수 있습니다.

인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

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