인간의 모공에서 신경 크레스트 줄기 세포의 분리와 문화

이 문서는 인간의 모낭에서 신경 문장의 줄기 세포의 분리와 문화에 대한 강력한 프로토콜을 제공합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 인간의 두피 조직에서 원발성 신경능선 줄기세포 또는 N CSC를 분리하고 배양하는 것입니다. 이것은 먼저 인간의 두피 피부를 1cm 너비의 스트립으로 저주하고 디스 베이가 포함된 배지에서 배양함으로써 수행됩니다. 그런 다음 피부는 신선한 배지에 배열되고 모낭은 막힙니다.

절차의 두 번째 단계는 트립신으로 모낭을 치료하고 단세포 현탁액을 얻는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 유세포 분석을 사용하여 CD 2, 71 HNK, 하나의 이중 양성 ncsc를 분류하고 배양 플레이트에 플레이트를 삽입하는 것입니다. 궁극적으로 위상차 현미경 검사법은 현미경으로 피부와 건강 입자를 해부하는 것이 매우 어렵기 때문에 추출 및 분리 건강 수직 단계를 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시연이 중요합니다.

줄기 세포 배양을 준비하기 위해 6 개의 웰 플레이트의 각 웰 바닥을 폴리 드 리신으로 코팅하고 플레이트가 후드에서 건조되도록합니다. 우물이 마르면 멸균수로 헹구고 흡인시킨 다음 우물을 다시 건조시킵니다. 피브로넥틴의 밀리리터당 0.17mg 용액으로 플레이트를 코팅합니다.

그런 다음 NCSC 배양 배지에서 플레이트에서 피브로넥틴이 건조되기 전에 다음 배지와 시약을 준비하고 준비하십시오. 97%D-M-E-M-F 12 2%B 27 보충제 1% 및 2개의 보충제 B-F-G-F-E-G-F IGF 1개 및 디스. 안면 성형 절차 또는 태아 두피 조직에서 신선한 성인 인간 두피 피부를 수집하고 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 PBS로 세척합니다.

피부를 50ml 튜브로 옮기고 DMEM에서 밀리리터당 10mg의 DIS 공간을 두고 섭씨 37도에서 2-4시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 살균 된 페트리 접시에 피부를 옮기고 피부 표면 근처의 모간을 잡고 단단히 부드럽게 당겨 피부의 털을 제거합니다. 모낭은 항원 난포 형태를 보이거나 분리된 난포 조각을 EDTA에서 0.05% 트립으로 배양하여 실온에서 15-20분 동안 가끔 흔들립니다.

그런 다음 10%FBS가 포함된 DMEM 4ml를 첨가하여 반응을 중지합니다. 다음으로, 40 미크론 필터를 통해 여포 상피를 통과시켜 다양한 크기와 모양의 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 그런 다음 5분 동안 200회 G로 서스펜션을 돌립니다.

S 상등액을 조심스럽게 버리고 펠릿을 2%FBS로 PBS 1밀리리터에 재현탁시킵니다.사실을 사용하여 N CSC를 분리하기 위해 먼저 PC 접합 CD 2 71 FE C 접합 hnk one 또는 CD 2 71 PE 접합 알파 4 인테그린에 대한 항체로 세포를 라벨링합니다. 2%FBS와 밀리리터당 2마이크로그램을 함유한 PBS의 세포를 다시 현탁합니다. 프로피듐 요오드화물은 죽은 세포를 배출합니다.

유세포 분석에 의한 세포 분류를 수행하고 CD 2, 71 H 및 K, 1 이중 양성 또는 CD 2, 71 알파, 4 인테그린 이중 양성 세포 배양을 수집합니다. NCSC 배지의 초저 부착 플레이트에 있는 세포는 하루에 한 번 배지를 변경합니다. 현미경으로 매일 세포 배양을 확인하십시오.

NCSC는 며칠 후에 떠다니는 작은 응집체를 형성하기 시작하고 기증자의 연령에 따라 배양에서 2주에서 5주 안에 잘 형성된 구체를 형성하기 시작합니다. 성장은 며칠 안에 돌출 부위와 잘 형성된 구체에서 나타나며 전체 모낭이 NCSC 배지에서 배양될 때 몇 주 안에 제자리에서 잘 형성된 구체가 나타납니다. NCSC 배양을 확장하려면 PBS로 세포를 한 번 세척하고 EDTA를 섭씨 37도로 두 번 예열합니다.

그런 다음 우박 여포 줄기 세포가 분리될 때까지 7-15분 동안 세포에 첨가합니다. 트립을 중지하려면 10% FBS로 ADD DMEM을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분산시킵니다. 그런 다음 5분 동안 200배 G로 스핀다운합니다.

NCSC 배지에 세포를 다시 현탁시키고 섭씨 37도에서 배양하고 피브로넥틴 코팅된 플레이트를 배양합니다. NCSC 문화. 배지는 인간 NCSC를 미분화 상태로 유지하기에 충분합니다.

영양세포(feeder cell)가 필요하지 않으면 각질세포가 배지에서 증식하지 않고 점차적으로 죽습니다. 일부 작은 원형 세포는 증식하여 현탁액에서 작은 응집체를 형성합니다. 3일에서 5일 후, 이 부유 응집체는 서서히 크기가 커지면서 머리카락 구체라고 하는 구조와 같은 3차원 구를 생성합니다.

인코딩된 플레이트를 배양할 때 N CSC는 표면에 부착되어 현탁액에서 구를 형성하는 세포보다 빠르게 성장하며, 구체를 형성하고 부착된 줄기 세포를 모두 형성합니다. 전체 모낭이 배양된 구가 돌출 영역에 해당하는 영역에 형성될 때 NCSC 마커를 표현합니다. 비디오를 시청한 후에는 격리 방법과 문화를 잘 이해하게 될 것입니다.

헤르마 두피 조직에서 추출한 1차 신경 줄기 세포.