태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

본 절차의 목적은 태아 폐 세포의 기계적 신호 전달(mechanical transduction)을 연구하기 위한 실험 시스템을 설명하는 것입니다. 이는 세포 배양 플레이트를 세포외 기질 단백질로 코팅함으로써 수행됩니다. 이후 태아 생쥐 폐 2형 상피 세포를 분리하고, 이어서 태아 생쥐 섬유아세포를 분리합니다.

마지막 단계에서는 폐 세포에 기계적 자극을 제공하는 인 비트로(in vitro) 시스템에 대해 설명합니다. 궁극적으로 실시간 PCR, 웨스턴 블롯 및 형광 면역화학 이미지를 통해 2형 세포 분화의 증가를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 방법은 태아 폐 발달 및 폐 손상과 같은 기계적 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

제 실험실의 기술자인 Julian gu가 해당 절차를 시연하겠습니다. 멸균 조건의 라미나 플로우 후드 내에서 작업하며, 플레이트당 12 mL의 차가운 멸균 1X PBS에 120 µg의 laminin을 녹여 준비합니다. 코팅을 위해 다른 세포외 기질 단백질을 사용할 수도 있습니다. 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 그런 다음 처리되지 않은 BioFlex 플레이트를 준비하고, 각 웰에 laminin 용액 2 mL를 첨가하여 최종 농도가 2 µg/cm²가 되도록 합니다.

웰이 용액으로 완전히 덮였는지 확인하십시오. 플레이트를 플라스틱 랩으로 완전히 감싸고 4 °C 환경의 평평한 표면에 놓아 밤새 라미네이트가 웰 바닥에 흡수되도록 합니다. 코팅된 플레이트는 이러한 조건에서 최소 일주일 동안 보관할 수 있으며, 다음 날에도 양호한 ECM 기능을 유지합니다.

멸균 조건 하에서, 웰을 1×PBS로 3회 세척합니다. 그 다음, 각 웰에 1×PBS에 희석한 1% BSA 1mL를 첨가합니다. 멤브레인의 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.

그 다음, XPBS로 웰을 세 번 더 세척합니다. 흡수되지 않은 단백질을 제거하기 위해 플레이트의 각 웰에 DMEM 1 mL를 첨가합니다. 이후 태아 설치류 폐 2형 상피세포의 분리가 완료되어 플레이팅 준비가 될 때까지 플레이트를 37 °C에서 보관합니다.

세포 분리 절차를 시작하기 전날, 130 및 15 micron 나일론 메쉬가 장착된 스크린 컵을 조립하고 오토클레이브로 멸균합니다. 또한 배양 당일에 동일한 수의 150 milliliter 유리 픽을 오토클레이브로 멸균합니다. 임신 E 17에서 19 사이의 시기 맞춤 임신 마우스로부터 태아 폐를 적출합니다.

조직을 DMEA 배지가 담긴 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮기고 얼음 위에 둡니다. 서면 프로토콜의 레시피에 따라 50 milliliter 원심분리 튜브에 신선한 소화 완충액(digestion buffer)을 제조합니다. 그리고 층류 정화 작업대(laminar flow hood)에서 작업하며 0.2 micron 시린지 필터로 멸균 여과합니다.

이 완충액 10 milliliters는 약 20마리의 생쥐 태아로부터 얻은 폐 조직에 충분한 양입니다. 소화 완충액이 담긴 원추형 튜브를 37 °C 워터배스에 넣습니다. 태아 폐 조직이 담긴 원추형 튜브에서 조직을 꺼내 멸균 가위나 면도날을 사용하여 멸균 페트리 접시에 옮기고, 조직을 1 millimeter 미만 크기로 잘게 다집니다.

그런 다음 조직을 미리 데워둔 소화 버퍼가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 구경이 점차 작은 파이펫을 사용하여 태아 폐 세포 현탁액을 각각 100회씩 파이펫팅함으로써 조직의 소화를 기계적으로 돕습니다. 소화 과정이 완료되면, 균질액을 상온에서 1,300 RPM으로 5분 동안 원심 분리합니다.

그런 다음 흡입법으로 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포가 포함된 펠릿을 20% FBS가 첨가된 DMEM 15 milliliters에 다시 현탁합니다. 다음으로 130 및 15 micron 나일론 메쉬가 있는 스크린 컵을 꺼내 멸균된 150 milliliter 비커 위에 올립니다. 세포 균질액을 100 micron 메쉬 위에 피펫으로 분주합니다.

여과액을 수집하여 30 micron 메쉬 위에 피펫으로 분주합니다. 10% FBS가 첨가된 신선한 DMEM으로 30 micron 메쉬를 여러 번 세척합니다. 대부분의 type two cell은 서로 뭉쳐 메쉬를 통과하지 않습니다.

이 세척 과정은 덩어리에 부착되어 있을 수 있는 비상피세포를 제거합니다. 30 micron 메쉬의 여과액을 15 micron 메쉬 스크린 컵에 도포합니다. 이전과 마찬가지로 여러 번 세척합니다.

이 단계에서는 30 µm 메쉬를 통과했을 수 있는 type two 세포를 수집합니다. type two 세포를 추가로 농축하기 위해 30 µm 및 15 µm 메쉬에서 뭉쳐진 비여과 세포를 수집하십시오. 태아 설치류 폐 섬유아세포를 배양하려는 경우 15 µm 메쉬의 여과액을 보관하십시오.

그렇지 않은 경우, 이 여과액은 폐기하십시오. 이어서, 30 및 15 micron 메쉬 컵에서 여과되지 않은 세포들에 배지를 추가하고 75 square centimeter 조직 배양 플라스크에서 30분 동안 배양하여 유형 2 상피세포 집단을 정제합니다. 배양 후 이전과 동일하게 상층액을 원심 분리하고, 세포 펠릿을 얻은 다음 2 mL의 무혈청 DMEM에 펠릿을 다시 현탁합니다. 라미닌이 코팅된 BioFlex 6-well 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 1 mL를 피펫으로 분주합니다. 이 시점에서 현미경으로 관찰하면 세포가 덩어리진 형태로 나타납니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂로 설정된 조직 배양 인큐베이터에서 배양하십시오. 24시간 배양이 가장 이상적이며, 최소 6시간의 배양이 필요합니다.

기계적 변형 실험을 시작하기 전, 15 micron 메쉬의 여과액을 취해 37 °C의 75 cm² 조직 배양 플라스크로 옮겨 섬유아세포가 부착될 수 있도록 30~60분 동안 둡니다. 그 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 플라스크의 부피만큼 무혈청 DMEM으로 교체하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 0.25% trypsin 및 0.4 mM EDTA로 세포를 회수하여 피브로넥틴이 코팅된 BioFlex 플레이트에 분주합니다. 기계적 변형 실험을 시작하기 전, 37 °C 및 5% CO2로 설정된 조직 배양 인큐베이터에서 이상적으로 24시간 동안 배양합니다.

실험에 특정 수의 세포가 필요한 경우 최소 6시간의 배양이 필요합니다. 제2형 세포는 분리 후 혈청이 없는 DMEM이 담긴 75 square centimeter 플라스크에서 유지하며, 다음 날 세포를 트립신 처리하여 수를 센 후 파종합니다. 실험 시작 전 단층 세포의 합류도는 80% 이하로 유지해야 합니다. 기계적 자극 실험 당일, 세포 배양액을 웰당 2 mL의 신선한 혈청 제거 DMEM으로 교체한 후, 플레이트를 flex cell FX 5,000 strain unit에 장착합니다.

다음으로, 막에 EQU 이축 변형(biaxial strain)을 가합니다. 변형 요법은 생체 내 기계적 힘의 시뮬레이션 방식에 따라 달라집니다. 서면 프로토콜에서 논의한 바와 같이, 비-ST 신전 막에서 배양된 세포들을 사용합니다.

병행 배양된 세포는 실험의 대조군으로 사용됩니다. 실험 종료 후, 단층 세포를 처리하여 실시간 PCR로 유전자 발현의 변화를 분석하거나 웨스턴 블롯으로 단백질 양의 변화를 분석할 수 있습니다. 또한, 이 기술을 위해 단층 세포를 고정하여 면역화학 실험에 사용할 수 있습니다.

고정 후, 투과화 및 항체 반응 전, 10~20 µL의 물을 마운팅제로 사용하여 플레이트에서 astic 막을 절단하여 유리 슬라이드에 부착합니다. 실험에서 얻은 상층액은 성장 인자나 사이토카인과 같은 방출 물질의 존재를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 이미지는 본 프로토콜에 따라 분리하여 라미닌이 코팅된 BioFlex 플레이트에 배양한 파라포름알데히드로 고정된 E 18 태아 2형 상피세포를 보여줍니다.

세포를 고정하고 사진을 촬영하였습니다. 비-ST 신축(non-ST stretch) 처리 다음 날 세포를 플레이팅하였습니다. 상피 세포의 형태학적 현미경 분석과 계면활성제 단백질 C(surfactrant protein C) 면역 염색을 통해 세포 순도가 90 ± 5%인 것으로 확인되었습니다. 다음 그림들은 분당 40주기의 5% 주기적 변형(cyclic strain)에 16시간 동안 노출된 태아 2형 상피 세포의 데이터를 나타냅니다.

계면활성제 단백질 C mRNA 발현의 이 노던 블롯은 변형(strain)이 서로 다른 ECM 기질을 사용하여 제2형 세포 분화를 유도함을 보여줍니다. 플러스(+)와 마이너스(-) 기호는 각각 변형에 노출되었음과 노출되지 않았음을 나타냅니다. 발현 데이터는 히스토그램에 평균 ± SEM으로 표시되었으며, N=3이고, 별표(*)는 P value가 0.05 미만임을 나타냅니다.

이 형광 면역화학 이미지는 surfactant protein C 단백질 수준을 녹색으로 보여줍니다. 왼쪽의 기계적 변형에 노출되지 않은 태아 2형 세포와 오른쪽의 기계적 변형에 노출된 세포에서 핵은 파란색으로 나타나는 dapi로 대조 염색되었습니다. 이 히스토그램은 세 차례의 실험에서 얻은 western blot 결과를 정량화한 것으로, 기계적 신장이 surfactant protein C 단백질 수준을 증가시킨다는 것을 보여줍니다.

본 실험에서 N은 3이며, 별표(*)는 P 값이 0.05 미만임을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 태아 폐 세포를 배양하고 기계적 신장(mechanical stretch)에 노출시키는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.