태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

이 절차의 목적은 태아 폐 세포의 기계적 전달을 연구하기 위한 실험 시스템을 설명하는 것입니다. 이는 배양판을 세포외 기질 단백질로 코딩하여 수행됩니다. 그런 다음 태아 마우스 폐 2형 상피 세포를 분리한 다음 태아 마우스 섬유아세포를 분리합니다.

마지막 단계는 폐 세포에 기계적 자극을 제공하는 체외 시스템에 대해 설명합니다. 궁극적으로 Real-time PCR, 웨스턴 블롯 및 형광 면역화학 이미지를 통해 유형 2 세포 분화의 증가를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 방법은 태아 폐 발달 및 폐 손상과 같은 메카노 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

절차를 시연하는 것은 Julian Gu, 내 실험실의 기술자가 멸균 상태에서 층류 후드에서 작업하는 동안 플레이트당 120ml의 냉간 멸균 XPBS와 함께 120마이크로그램의 라미닌을 만듭니다. 다른 세포외 기질 단백질이 코팅에 사용될 수 있습니다. 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조한 다음 BioFlex 처리되지 않은 플레이트를 가져와서 각 웰에 2ml의 라미네이트 용액을 제곱센티미터당 2마이크로그램의 최종 농도로 추가합니다.

우물이 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 플라스틱 랩으로 플레이트를 완전히 덮고 라미네이트가 웰 바닥으로 흡수될 수 있도록 하룻밤 동안 섭씨 4도의 평평한 표면에 놓습니다. 코팅된 플레이트는 이러한 조건에서 최소 일주일 동안 보관할 수 있으며 다음 날에도 우수한 ECM 기능을 유지할 수 있습니다.

멸균 상태에서 하나의 XPBS로 웰을 세 번 세척합니다. 그런 다음 XPBS 1개에 1mL의 1%BSA를 각각 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 멤브레인의 비특이적 결합 부위를 차단합니다.

그런 다음 다시 하나의 XPBS로 우물을 세 번 씻습니다. 흡수되지 않은 단백질을 제거하려면 플레이트의 각 웰에 1ml의 DMEM을 추가합니다. 그런 다음 태아 설치류 폐 유형 2 상피 세포가 분리되어 도금할 준비가 될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 보관하십시오.

세포 격리 절차를 시작하기 전날, 130 및 15 미크론 나일론 메쉬로 스크린 컵을 조립하고 고압증기멸균으로 살균합니다. 또한 문화의 날에 동일한 수의 150 밀리리터 유리 피크를 오토 클레이브합니다. 임신 E 17에서 19에 시간이 지정된 임신 마우스로부터 태아 폐를 얻습니다.

DMEA 배지가 들어 있는 50ml 원심분리 튜브에 조직을 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 서면 프로토콜의 레시피에 따라 50ml 원심분리기 튜브에 신선한 소화 버퍼를 만듭니다. 층류 후드 필터에서 작업하는 동안 0.2미크론 주사기 필터를 통해 살균합니다.

이 완충액 10ml는 약 20마리의 마우스 태아에서 얻은 폐 조직에 충분합니다. 소화 완충액이 들어 있는 원뿔형 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣습니다. 태아의 폐 조직이 들어 있는 원뿔형 튜브에서 디움을 추출하고 멸균 가위나 면도날을 사용하여 조직을 멸균 페트리 접시에 옮기고 조직을 1mm 미만의 조각으로 다집니다.

그런 다음 조직을 예열 전 소화 완충액이 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 조리개 크기가 줄어드는 피펫을 사용하여 태아 폐 세포 현탁액을 각각 100회 위아래로 피펫팅하여 조직의 소화를 기계적으로 돕습니다. 분해 과정이 완료된 후 실온에서 5분 동안 1, 300RPM에서 균질액을 원심분리합니다.

그런 다음 흡인에 의해 앙와위를 조심스럽게 제거하고 15ml의 DMEM과 20%FBS에 세포를 포함하는 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 130 및 15 미크론 나일론 메쉬가 있는 스크린 컵을 꺼내 멸균 150ml 비커 위에 놓습니다. 세포를 100 미크론 메쉬에 피펫팅합니다.

여과액을 모아 30미크론 메쉬에 피펫팅합니다. 30미크론 메쉬를 새 DMEM과 10%FBS로 여러 번 세척합니다. 대부분의 제2형 세포는 서로 뭉쳐서 그물망을 통과하지 않습니다.

이러한 세척은 덩어리에 부착될 수 있는 비상피 세포를 제거합니다. 30미크론 메쉬의 여과액을 15미크론 메쉬 스크린 컵에 적용합니다. 다시 말하지만, 이전과 같이 여러 번 씻으십시오.

이 단계는 30미크론 메쉬를 통과했을 수 있는 2형 세포를 모집합니다. 추가 유형 2 세포 농축을 위해 30 및 15 미크론 메시에서 응집된 필터링되지 않은 세포를 수집합니다. 태아 설치류 폐 섬유아세포를 배양해야 하는 경우 15미크론 메쉬에서 여과액을 유지합니다.

그렇지 않으면 이 여과액을 버리십시오. 더. 배지를 첨가하고 30 및 15 미크론 메쉬 컵의 여과되지 않은 세포를 75 평방 센티미터 조직 배양 플라스크에 30 분 동안 배양하여 이전과 같이 슈퍼 이름을 원심분리 한 후 30 분 동안 배양하여 2 형 상피 세포 집단을 정제하고, 세포를 펠렛화 한 다음 펠렛을 2 밀리리터의 무혈청 DMEM pro 태아 피펫에 1 밀리리터의 세포 현탁액을 코팅 된 라미네이트의 각 웰에 재현탁시킵니다 이 시점에서 현미경으로 관찰할 때 세포는 덩어리로 나타나며 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다. 24시간 배양이 가장 적합하며 최소 6시간의 배양이 필요합니다.

기계적 변형 실험을 시작하기 전에 15미크론 메쉬에서 여과액을 취하여 섭씨 37도의 75제곱센티미터 조직 배양 플라스크로 30-60분 동안 옮겨 섬유아세포가 염료를 부착, 흡인 및 폐기할 수 있도록 합니다. 그런 다음 플라스크의 부피를 무혈청 DMEM으로 교체하고 밤새 배양합니다. 다음 날, 0.4 밀리몰 EDTA에서 0.25%트립신이 함유된 세포를 채취하여 피브로넥틴으로 코팅된 BioFlex 플레이트에 플레이트화한 후 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정된 조직 배양 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후 기계적 변형 실험을 시작합니다.

실험에 특정 수의 세포가 필요한 경우 최소 6시간의 배양이 필요합니다. 유형 2 세포는 분리 후 무혈청 DMEM 75 평방 센티미터 플라스크에서 유지되며, 다음날 세포는 트립 inized 계수 된 다음 착석 단층은 실험 시작 전에 80 % confluent보다 크지 않아야합니다. 기계적 자극 실험 당일, 세포 배양 배지는 웰당 2ml의 새로운 무혈청 DMEM으로 교체된 다음 플레이트를 플렉스 셀 FX 5, 000 스트레인 유닛에 장착합니다.

다음으로, 멤브레인에 EQU 이축 변형을 적용합니다. 변형률의 요법은 생체 내에서 기계적 힘의 시뮬레이션에 따라 다릅니다. 서면 프로토콜에서 논의된 바와 같이, 비-ST가 늘어난 막에서 자란 세포.

병렬로 배양된 것은 실험의 대조군으로 사용됩니다. 실험이 끝나면 단층을 처리하여 Real-time PCR에 의한 유전자 발현 변화 또는 웨스턴 블롯에 의한 단백질 풍부도 변화를 분석할 수 있습니다. 또한 이 기술에 대한 면역화학 실험을 위해 단층을 고정할 수 있습니다.

고정 후, 플레이트에서 astic membrane을 잘라내어 10-20 마이크로 리터의 물을 장착제로 사용하여 유리 슬라이드에 장착한 후 항체로 침투 및 배양합니다. 실험에서 나온 슈퍼 다틴은 성장 인자 또는 사이토카인과 같은 방출 물질의 존재를 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 이미지는 이 프로토콜에서와 같이 분리되고 라미닌으로 코딩된 BioFlex 플레이트에 도금된 parmal fixed E 18 태아 2형 상피 세포를 보여줍니다.

감방을 고정하고 사진을 찍었습니다. 다음 날, 비 ST 스트레치 셀을 플레이트링했습니다. 세포의 순도는 상피 세포 형태학의 현미경 분석과 계면 활성제 단백질 C.The 다음 그림에 대한 면역 염색의 현미경 분석에 의해 90 플러스 또는 마이너스 5 %로 결정되었다 16 시간 동안 분당 40 사이클로 5 % 고리 변형에 노출 된 태아 유형 2 상피 세포의 데이터를 제시한다.

계면활성제 단백질 C mRNA의 이 북부 얼룩은 균주가 서로 다른 ECM 기질을 사용하여 2형 세포 분화를 유도한다는 것을 보여줍니다. 플러스 마이너스 기호는 각각 스트레인에 대한 노출 또는 스트레인에 대한 노출 없음을 나타냅니다. 표현식 데이터는 히스토그램에 평균 플러스 또는 마이너스 SEM, N은 3과 같고 별표는 P 값이 0.05 미만임을 나타냅니다.

이러한 형광 면역화학 이미지는 계면활성제 단백질 C 단백질 수치를 녹색으로 보여줍니다. 태아의 경우, 2형의 경우, 왼쪽의 기계적 변형에 노출되지 않고 오른쪽 핵의 기계적 변형에 노출된 세포는 파란색으로 보이는 다피로 대조염색되었습니다. 이 히스토그램은 기계적 스트레치가 계면활성제 단백질 C 단백질의 수치를 증가시킨다는 것을 보여주는 세 가지 실험의 웨스턴 블롯 결과를 정량화합니다.

이 실험에서 N은 3이고 별표는 P 값이 0.05 미만임을 나타냅니다. 이 비디오를 시청한 후에는 태아 폐 세포를 가속하고 기계적 스트레칭에 노출시키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.