Name: 태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 태아 폐 세포에서 기계적 전도를 연구하는 실험 방법을. 쥐 태아 폐 상피세포와 섬유아세포를 분리하고 체외에서 기계적 자극을 가하여 폐 발달과 손상 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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1. ECM 단백질과 플레이트의 코팅 <ol><li> 멸균 조건에서 플레이트 당 차가운 멸균 1X PBS의 12 ML과 laminin 120 μg을 섞는다. </li><li> Bioflex 치료 접시를 타고 각 잘으로 솔루션의 2ml를 추가 (laminin의 최종 농도 2 μg / cm 2). 또는 다른 ECM 단백질 같은 콜라겐-1로서 사용될 수 [10 μg / cm 2], fibronectin [5 μg / cm 2], vitronectin [0.5 μg / cm 2]이나 엘라스틴 [10 μg / cm 2]. 코팅 기술은 그것이 laminin 코팅에 대해 설명하는 것과 비슷합니다. 우물이 완전히 솔루션이 적용되어 있는지 확인합니다. </li><li> 플라스틱으로 번호판을 정리하고 우물의 바닥에 adsorb로 laminin을 허용하도록 하룻밤 평평한 표면에 4 ° C에 넣어. 여전히 좋은 ECM 기능을 유지하면서 이러한 조건에서는 플레이트는 최소한 1 주일 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 다음날, 무균 조건 하에서, 1X PBS로 우물 3 회 씻는다. </li><li&gt;는 각도에 1X PBS에 1 % BSA의 1ml를 추가하고 37 품어 세포막에서 비 특정 바인딩 사이트를 차단하는 1 시간을위한 ° C에서.에게 </li><li> 접시에게 unadsorbed 단백질을 제거하는 1X PBS로 3 회 씻어. </li><li> 세포 단계 2.14 격리되기 전까지는 37 ° DMEM에서 C에서 번호판을 유지. </li></ol> 2. 태아 쥐 폐 유형 II 상피 세포의 분리 분리하기 전에 하루 autoclaved하고 준비 서로 다른 크기의 나일론 meshes로 화면 컵 있습니다. <ol><li> 태동의 E17-19 마우스 / 쥐 초과 - 임신에서 태아의 폐가를 구합니다. DMEM 매체를 포함하는 50 ML 원뿔 튜브로 조직을 전송하고 얼음에 배치하십시오. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브 소화 버퍼를 만들기 : (10 ML). 이 볼륨의 경우, 마우스 / 쥐에서 약 20 fetuses에서 폐 조직이 사용됩니다. 8.5 ML DMEM 0.5 ML 500mM 산도 7.4 HEPES 5 MG Collagenase 일 5 MG Collagenase 1A 한 ML 치킨 혈청, inactivated 열 </li><li>모든 구성 요소가 무균 후드 내부에 0.2 마이크론 주사기 필터를 통해 해산 및 필터 때까지 잘 섞는다. 37 물 목욕으로 소화 버퍼를 포함하는 원뿔 튜브 ° C를 놓으십시오 </li><li> 2.1 단계에서 원뿔 튜브에서 DMEM 배지를 제거하고 멸균 배양 접시에 조직을 전송합니다. </li><li> 1mm 이상의 조직 조각이 덜하고 단계 2.3에서 미리 예열 소화 버퍼를 포함하는 원뿔 튜브로 조직을 전송할 잘 멸균 가위 또는 면도날과 폐가 말하다. </li><li> 아래로 pipetting 및하여 조직을 소화 : 10 ML 피펫 100 회 5 ML 피펫 100 회 파스퇴르 피펫으로 100 배 </li><li> 상온에서 5 분간 1,300 rpm으로 homogenate를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 펠릿 15 DMEM의 ML 플러스 20% FBS에서 세포를 포함하는 다시 일시 중지합니다. </li><li> 30 - - 100과 함께 화면 컵을 타고 15 마이크론 나일론 meshes 및 장소 일멸균 150 ML의 비커에 내려요. </li><li> 2.8 단계에서 세포 homogenate를 추가하고 순차적으로 100을 통해 필터링 - 30 - 15 - 마이크론 메쉬 스크린 컵. </li><li> 비 상피 세포의 여과를 촉진하는 DMEM 플러스 10% FBS 여러 세차장 후 및 15 마이크론 meshes - clumped 30 일부터 아닌 필터링된 세포를 수집합니다. </li><li> 주로 섬유아 세포를 포함하는 15 마이크론 메쉬에서 여과물 폐기하십시오. </li><li> 30 분 (플라스크 당 세포 현탁액의 approximatelly10 ML) 2 75 cm flasks에서 2.11 단계의 세포는 잠복기에 의해 추가로 2 형 세포를 정화. </li><li> 펠렛 셀 실온에서 5 분간 1,300 rpm으로 뜨는와 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> 조심스럽게 흡인에 의해 뜨는을 제거하고 펠릿의 혈청이없는 DMEM으로 세포를 포함하는 다시 일시 중지합니다. resuspension의 볼륨이 처리 조직의 양에 따라 달라집니다. 약, 우리 음식 세포의 상응은 아치에게 위해 (2 ML) 각 잘 한 태아에서 얻은다음 날 전날 % 60-70 사이 confluency. </li><li> Bioflex 여섯 잘 차량 번호판 플레이트 세포 현탁액은 laminin이나 fibronectin과 precoated. </li></ol> 3. 태아 쥐 폐 섬유아 세포의 분리 <ol><li> 2.11까지 2 형 전지 절연을 위해 위에서 설명한 동일한 단계를 수행하십시오. </li><li> 섬유아 세포가 준수 있도록 30-60 분 37 ° C에서 75 cm 2에와 플레이트, 15 마이크론 메쉬 (대략적인 볼륨이 10-15 ML은 이전의 세척없이)로부터 여과물를 가져가라. </li><li> supernantant을 기음과 하룻밤 혈청이없는 DMEM과 부화로 바꿉니다. </li><li> 다음날, 0.25 % (wt / 권) 0.4 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 fibronectin과 precoated Bioflex 접시에 접시들을에서는 트립신으로 세포를 수확. </li></ol> 4. 폐 세포에 기계적 자극을 제공하는 실험 시스템 <ol><li> 혈청이없는 DMEM (2 ML / 잘)들을 연결하고 spre하자의 Bioflex 문화 판에 씨앗 세포 (50 % 정도 합류)실험을하기 전에 최소한 6h에 대한 광고입니다. 일반적으로 저희 연구실은 기계적 변형을 적용하기 전에 주위를 24 시간 동안 문화의 세포를 유지합니다. 세포의 특정 번호는 실험에 필요한 경우 격리 후, 유형 II 세포는 75 cm 2 flasks 그리고 다음날, 세포, trypsinized 계산 후 놓는되는 혈청이없는 DMEM에 보관됩니다. </li><li> 다음날, 미디어가 신선 혈청이없는 DMEM (2 ML / 음)과 bioflex 플레이트로 대체하고는 Flexcell FX-5000 스트레인 단위에 마운트됩니다. Monolayers는 실험 개시 전에 더 큰 80 % 합류해야합니다. </li><li> Equibiaxial 변형은 세포막에 적용됩니다. 변형의 공표는 (토론 참조) 생체내의 기계적 세력의 시뮬레이션에 따라 다릅니다. </li><li> 병렬로 배양해 아닌 뻗어 세포막에 성장 세포는 컨트롤로 사용됩니다. </li><li> 실험의 끝에서 monolayers는 유전자 발현의 변화 (예 : 계면 활성제 단백질 C)를 분석 처리할 수 있습니다서양 얼룩 등에 의해, 시간 PCR 실제 단백질 풍부하여 또한 monolayers는 immunocytochemistry 실험에 해결할 수 있습니다. 이 기법의 경우 고정 후 silastic 세포막은 접시에서 잘라되며 항체와 permeabilization과 부화하기 전에 장착 요원으로 물의 10-20 μl를 사용하여 유리 슬라이드에 장착. 뜨는 또한 성장 요인 크린 시토킨 등의 존재를 조사하는 데 사용할 수 있습니다 </li></ol> 5. 대표 결과 그림 1과 E18 태아 마우스 타입 II 전지의 그림 2 공연 관계자 위상 콘트라스트 사진이 원고에서 설명한 기법을 사용하여 고정. 그림 3은 기계적인 변형이 마커로서 계면 활성제 단백질-C를 이용하여 태아의 유형 II 상피 세포의 분화를 유도 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig1.jpg" /> 그림 1. 담당자resentative 위상 콘트라스트 사진은 바로 태아의 유형 II 세포의 clumped 모습을 보여주는 격리 후 촬영. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig2.jpg" /> laminin과 코팅 bioflex 접시에 여기와 도금 설명된대로 그림 2. E18 태아 2 형 상피 세포 격리되었다. 비 뻗어 세포를 paraformaldehyde에서 해결 된 뒤에 사진은 다음날 찍은. 세포의 순도은 90로 결정되었다 ± SP-C에 대한 상피 세포 형태학 및 immunostaining의 현미경 분석을 약 5 %. <img src="/files/ftp_upload/3543/3543fig3.jpg" /> 그림 3. 태아 2 형 상피 세포는 40 사이클 / 16h에 대한 분에 5 %의 주기적 변형에 노출되었다. 계면 활성제 단백질 C (SP-C) 그 변형이 다른 ECM 기판을 사용하여 2 형 세포 분화를 유도 보여주는 mRNA의 표현의) 북부 얼룩 . + / - 징후 s의 노출 여부를 나타냅니다각각 양성. 데이터는 뜻으로 나타난 + / - SEM, N = 3, * P &lt;0.05 B)를 기계적 응력으로 SP-C 단백질 노출된 태아의 유형 II 세포의 수준 (녹색) 또는하지 (제어)를 보여주는 형광 immunocytochemistry 이미지.. 핵은 dapi (파란색)과 counterstained되었다. 바, 그 기계 신축성을 보여주는 세 실험에서 10 μm의. C) 서양 얼룩 결과는 SP-C 단백질을 증가시킵니다. N = 3, * P &lt;0.05.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

본 원고에서는 태아의 유형 II 상피 세포 및 섬유아 세포를 분리하고 Flexcell의 위기 장치를 사용하여 기계적인 자극에 노출하는 방법을 설명합니다. 우리는 상피 세포의 분화 1,2을 평가하고 수용체와 스트레치 3-9 활성화 신호 전달 경로를 연구하기 위해이 기술을 사용해 왔습니다. 또한,이 방법은 또한 기계적 손상 10,11 의해 유도된 세포 반응을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 절차는 collagenase와 폐 조직의 소화에 근거한다. 그것은 소화 후에 같이 덩어리로 2 형 세포의 경향을 이용합니다. 이 기법을 수행하는 동안 중요한 단계는 폐의 소화와 비 상피 세포의 여과를 촉진하기 때문에 2 형 세포보다 순결을 달성하기 위해 철저하게 30 15 마이크론 meshes에 비 필터링된 세포를 세척을 용이하게하기 위해 잘 조직 닦지입니다 . 우리 연구소는 m을 사용합니다embranes은 콜라겐이나 지하 점막의 E...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>닭 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>스크린 컵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>시린지 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-754-25</td><td></td></tr><tr><td>100 micron 나일론 메시</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-100-D</td><td></td></tr><tr><td>30 micron 메시</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CMN-30-D</td><td></td></tr><tr><td>15 micron 메시</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX15</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Collagen-1</td><td>Collagen Biomed</td><td>PC0701</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0132</td><td></td></tr><tr><td>Elastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6402</td><td></td></tr><tr><td>Bioflex 플레이트</td><td>Flexcell International</td><td>BF-3001U</td><td>코팅되지 않음</td></tr><tr><td>Flexcell Strain Unit</td><td>Flexcell International</td><td>FX-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

태아의 폐 세포에 mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

반복적인 호흡과 같은 움직임 의해 유체 팽만에 의한 utero에서 생성된 기계적 세력은 정상 폐 개발을위한 중요합니다. 폐 개발의 핵심 구성 요소는 폐포 유형 II 상피 세포, 폐 계면 활성제의 주요 소스의 차별화입니다. 이러한 세포는 폐포 루멘, 호스트 방어 및 부상 수리에 유체 항상성에 참여합니다. 또한, 말초 폐 실질 조직 세포를 직접 출산 후 기계적 환기 중 과장 확대 해석에 노출됩니다. 그러나 폐암 세포가 폐 발달에 영향을 미치는하고 폐 손상을 촉진하기 위해 기계적인 자극을 감지하는 정확한 분자 및 세포 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 여기서는 쥐 태아의 폐가에서 2 형 세포와 섬유아 세포를 분리하기위한 간단하고 고순도 방법을 제공합니다. 그렇다면, 우리는에 기계적 힘을 시뮬레이션, 태아 세포에 기계적 자극을 제공하기 위해, 체외 시스템, Flexcell 스트레인 단위에 대해 설명태아의 폐 발달이나 폐 부상. 이 실험 시스템은 신축에 노출 태아의 폐 세포에서 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 이 방법을 사용, 저희 연구실은 태아의 폐 발달과 폐 부상 mechanotransduction에 참여하는 여러 수용체 및 신호 전달 단백질을 찾아냈습니다.

기계 군은 폐 개발 및 폐 부상에서 핵심적인 역할을한다. 여기서는 쥐 태아의 폐 유형 II 상피 세포 및 섬유아 세포를 분리하고 사용하여 기계적인 자극에 노출하는 방법을 설명<em&gt; 체외에서</em&gt; 시스템.

태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

자궁 내에서 반복적인 호흡 유사 운동과 액체 팽창에 의해 생성되는 기계적 힘은 정상적인 폐 발달에 매우 중요합니다. 핵심적인...

본 절차의 목적은 태아 폐 세포의 기계적 신호 전달(mechanical transduction)을 연구하기 위한 실험 시스템을 설명하는 것입니다. 이는 세포 배양 플레이트를 세포외 기질 단백질로 코팅함으로써 수행됩니다. 이후 태아 생쥐 폐 2형 상피 세포를 분리하고, 이어서 태아 생쥐 섬유아세포를 분리합니다.마지막 단계에서는 폐 세포에 기계적 자극을 제공하는 인 비트로(in vitro) 시스템에 대해 설명합니다. 궁극적으로 실시간 PCR, 웨스턴 블롯 및 형광 면역화학 이미지를 통해 2형 세포 분화의 증가를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이러한 방법은 태아 폐 발달 및 폐 손상과 같은 기계적 신호 전달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.제 실험실의 기술자인 Julian gu가 해당 절차를 시연하겠습니다. 멸균 조건의 라미나 플로우 후드 내에서 작업하며, 플레이트당 12 mL의 차가운 멸균 1X PBS에 120 µg의 laminin을 녹여 준비합니다. 코팅을 위해 다른 세포외 기질 단백질을 사용할 수도 있습니다. 자세한 내용은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 그런 다음 처리되지 않은 BioFlex 플레이트를 준비하고, 각 웰에 laminin 용액 2 mL를 첨가하여 최종 농도가 2 µg/cm²가 되도록 합니다.웰이 용액으로 완전히 덮였는지 확인하십시오. 플레이트를 플라스틱 랩으로 완전히 감싸고 4 °C 환경의 평평한 표면에 놓아 밤새 라미네이트가 웰 바닥에 흡수되도록 합니다. 코팅된 플레이트는 이러한 조건에서 최소 일주일 동안 보관할 수 있으며, 다음 날에도 양호한 ECM 기능을 유지합니다.멸균 조건 하에서, 웰을 1×PBS로 3회 세척합니다. 그 다음, 각 웰에 1×PBS에 희석한 1% BSA 1mL를 첨가합니다. 멤브레인의 비특이적 결합 부위를 차단하기 위해 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.그 다음, XPBS로 웰을 세 번 더 세척합니다. 흡수되지 않은 단백질을 제거하기 위해 플레이트의 각 웰에 DMEM 1 mL를 첨가합니다. 이후 태아 설치류 폐 2형 상피세포의 분리가 완료되어 플레이팅 준비가 될 때까지 플레이트를 37 °C에서 보관합니다.세포 분리 절차를 시작하기 전날, 130 및 15 micron 나일론 메쉬가 장착된 스크린 컵을 조립하고 오토클레이브로 멸균합니다. 또한 배양 당일에 동일한 수의 150 milliliter 유리 픽을 오토클레이브로 멸균합니다. 임신 E 17에서

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

초기 배아 폐 기관의 문화는 상피 - mesenchymal 상호 작용을 연구하기 위해 매우 유용한 시스템입니다. 쉽게이 시스템에서 조작할 수있는 구체적인 조건 하에서 상피와 mesenchymal 모두 morphogenesis 진행.

마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템 전의 VIVO 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

많은 포유류 세포는 듀로타시스를 통해 더 단단한 기질 또는 기질로 우선적으로 이동합니다. 이 프로토콜의 목표는 유리 커버슬립과 인터페이스하여 정의된 강성의 폴리디메틸실록산(PDMS) 기질을 통합하여 세포 듀로타시스 거동을 연구하고 조작하는 데 사용할 수 있는 간단한 체외 시스템을 제공하는 것입니다.

평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템<em&gt; 체외</em

이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

이 연구는 중증 대동맥 협착증 또는 저형성 좌심 증후군과 같은 선천성 심장 결함에서 볼 수 있는 내피에서 중간엽으로의 전이 유도 섬유증의 동물 모델을 제시하여 상세한 조직학적 조직 평가, 조절 신호 경로 식별 및 치료 옵션 테스트를 가능하게 합니다.

내피에서 중간엽으로의 전환 연구를 위한 신생아 이종성 쥐 심장 이식 모델

여기에는 내피 세포와 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 간단한 워크플로우와 기계적 자극에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이를 통해 내피 세포의 발달 역학을 연구할 수 있습니다. 이 접근법은 기계적 자극 후 배양 칩에서 수집된 살아있는 세포의 다운스트림 분석과 호환됩니다.

In Vitro (시험관내) 발달 기계생물학을 연구하기 위한 태아 인간 혈관 온칩 모델

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

독특한 조직 공학 방법은 축삭 스트레치 성장을 recapitulating하여 문화의 수많은 신경 섬유를 길어지다하기 위해 개발되었다; 신경이 확대 본체의 성장과 함께 길어지다 약자 신경계의 성장의 한 형태.

액슨 스트레치 성장의 연결을 성장의 Mechanotransduction

배우세요 태아 폐 세포에서 기계적 전도를 연구하는 실험 방법을. 쥐 태아 폐 상피세포와 섬유아세포를 분리하고 체외에서 기계적 자극을 가하여 폐 발달과 손상 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

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