심근 국소 빈혈 및 Reperfusion의 Murine 폐쇄 가슴 모델

이 절차의 전반적인 목표는 시간, 지연성 심근허혈 및 재관류에 대한 무른 폐쇄 흉부 모델을 수행하여 재관류 손상 조절 및 외과적 외상 자체에 의한 염증 반응을 줄이는 것입니다. 이것은 먼저 왼쪽 네 번째 늑간 공간에서 둔기 개흉술을 시행함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 좌측 전방 하행 동맥 또는 LAD 주위에 폐색 장치가 있는 결찰을 배치하는 것입니다.

다음으로, 결찰 말단을 매듭으로 고리를 형성하고 흉부를 닫고 마우스가 5일 동안 회복되도록 한 후 피하 조직에 삽입합니다. 매달린 추는 ECG가 기록되는 동안 통제된 허혈 및 재관류를 생성하는 데 사용됩니다. 궁극적으로 TC 염색 또는 조직학은 경색 크기를 나타내는 데 사용됩니다.

심근허혈 및 재관류의 개흉 모델과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 수술 외상 자체에 의한 염증 반응이 무뎌진다는 것입니다. 진정 효과를 확인한 후 마우스의 목과 왼쪽 가슴에 제모 크림을 바르는 것으로 절차를 시작합니다. 1분 후 크림을 닦아내고 포비돈 요오드를 바르면 국소 피부 소독이 가능합니다.

그런 다음 통증 완화를 위해 부프레노르핀을 피하로 주사합니다. 그런 다음 작은 가위를 사용하여 목 정중선 피부를 절개한 다음 기관을 덮고 있는 땀샘과 근육을 무디게 절개합니다. 그런 다음 인공호흡기를 켜고 호흡수를 분당 105회로 설정하고 일회 호흡량을 200마이크로리터로 설정합니다.

이제 한 쌍의 집게를 사용하여 동물의 혀를 당긴 다음 22 게이지 금속 튜브를 동물의 입에 부드럽게 삽입합니다. 기관 내부의 튜브를 직접 시각화하고 흉부 움직임을 통해 삽관을 확인합니다. 마지막으로, 실험실 공간의 오염을 방지하기 위해 폐가스 튜브로 전환하여 인덕션 박스를 우회합니다.

삽관된 마우스의 왼쪽 쇄골 중간 라인을 절개하는 것으로 시작한 다음 뭉툭하게 피하 조직을 겨드랑이 쪽으로 절개합니다. 이제 주요 흉근의 경계를 확인한 다음 아래의 작은 흉근에서 무뎌서 해부합니다. 작은 흉근을 오른쪽으로 당겨 흉곽을 직접 볼 수 있습니다.

네 번째 늑간 공간을 확인한 다음 한 쌍의 집게의 끝을 사용하여 늑간 공간을 뭉툭하게 관통하고 가로질러 견인기를 삽입할 수 있습니다. 왼쪽 오라클을 포함한 심장이 명확하게 보일 때까지 수술대에 부착된 고무 밴드로 견인기를 조정합니다. 그런 다음 심장을 손상시키지 않고 심낭을 부드럽게 잡아당깁니다.

마지막으로, 좌심실의 전벽에서 좌심방 오라클을 들어 올려 LAD를 식별합니다. 8 T 프롤린 봉합사의 테이퍼 바늘 끝을 U자형으로 구부리는 것으로 시작합니다. 그런 다음 바늘이 조직을 통해 보이지 않도록 LAD 아래 충분히 깊은 심근을 통해 바늘을 통과시킵니다.

이제 봉합사의 바늘 끝을 잘라 양쪽에 1cm의 봉합사가 보이도록 합니다. 두 개의 프로판올과 같은 알코올 소독제에 PE 10 튜브를 최소 2분 동안 담그십시오. 그런 다음 튜브의 1mm 부분을 잡아 유방을 만들었습니다.

마지막으로 양쪽 봉합사 끝을 유방을 통해 끼웁니다. 그런 다음 3 사이즈 컬트 봉합사 바늘 가이드를 사용하여 두 봉합사 모두 상부 늑간 공간에서 끝납니다. 먼저 6개의 aut prolene 봉합사를 사용하여 동물의 열린 늑간 공간에서 위쪽 갈비뼈와 아래쪽 갈비뼈를 모두 묶습니다.

그런 다음 흉부를 닫기 전에 호기관을 조여 확장부를 열어 몇 번의 호흡 주기 동안 폐를 과팽창시킵니다. 인공호흡기의 일회 호흡량을 다시 200마이크로리터로 설정합니다. 이제 8개의 TLAD 결찰 봉합사의 양쪽 끝을 묶어 다음 훅업을 형성하도록 합니다.

ECG는 마우스로 연결됩니다. 8개의 OTT 루프에 무게추를 걸어 조심스럽게 매달아 놓습니다. 몇 번의 심장 박동 이내에 상당한 ST 상승이 있어야 합니다.

그런 다음 무게를 풀고 고리를 피하 주머니에 넣습니다. 6개의 단일 매듭 봉합사로 피부를 닫습니다. 마지막으로, 생쥐가 발관 후 온난화 램프 아래에서 회복하도록 합니다.

5일간의 회복 후, 원하는 재관류 시간이 끝날 때 서면 텍스트에 설명된 대로 심근허혈 프로토콜을 수행하고 마취된 삽관된 동물의 흉부 피부를 xiphoid의 정중선에서 절단합니다. 그런 다음 복부를 열고 흉곽 아래의 횡격막을 잘라 쇄골 중간선의 양쪽에서 가슴을 잘라냅니다. 이제 펄럭이는 전방 흉벽을 봉합사로 고정하여 심장 결찰에 방해받지 않고 접근할 수 있습니다.

LAD는 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 소근육 운동 기술과 꾸준한 손이 필요합니다. 여덟 개의 자동 봉합 루프를 조심스럽게 준비합니다.

루프를 자르고 매듭을 묶어 LAD를 접합합니다. 그런 다음 10% 휴경 파란색을 왼쪽 심방에 천천히 주입하고 때때로 흡인합니다. 위험 지역의 표면도 여기에서 파란색으로 변했는데, 이는 드문 경우에 발생합니다.

다음으로, 좌심방에 염화칼륨을 주입하여 동일한 경색 크기 평가를 위해 이완기 심장을 정지시킨 다음 장기의 해부를 용이하게 하기 위해 가능한 한 많은 여분의 심장 조직을 남기고 심장을 잘라냅니다. 절제된 심장을 PBS로 세척한 다음 isop pentane 및 액체 질소로 동결합니다. 또는 심장을 살짝 얼 때까지 냉동실에 넣을 수 있습니다.

심장이 완전히 얼면 심장의 긴 축에 수직으로 절단되도록 조직을 정렬한 다음 조직을 1mm 조각으로 자릅니다. 각 슬라이스를 96웰 플레이트의 개별 웰에 넣은 다음 슬라이스를 섭씨 37도에서 1.5% TTC에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 4% 포름알데히드로 조각을 밤새 고정합니다.

다음 날, 현미경 슬라이드에 슬라이스를 놓고 다른 슬라이드로 슬라이스를 덮습니다. 각 슬라이드의 끝에 1mm 금속 스페이서를 사용하여 두 개의 슬라이드를 클립으로 함께 고정합니다. 마지막으로 각 슬라이스의 양쪽에서 디지털 이미지를 가져옵니다.

그림과 같이 마취된 삽관된 동물의 가슴을 쇄골 중선의 양쪽으로 연 후 P 원격 측정에 대해 Image J와 같은 소프트웨어 프로그램을 사용합니다. 여분의 심장 조직을 제거하고 대동맥 뿌리를 덮고 있는 흉선을 뭉툭하게 절개합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 상행 대동맥을 잡고 심장 조직을 최대한 적게 남겨 심장을 잘라냅니다.

다음으로, 심장을 씻고 심정지 용액으로 부드럽게 짜낸 다음 심장을 더 많은 심정지 용액으로 채워진 P 35 접시에 심장을 넣습니다. 24 게이지 IV 라인을 아연 공식으로 채우고 고정제는 이제 상행 대동맥을 캐뉘레이션 한 다음 왼쪽 오라클과 왼쪽 심방 사이에 구멍을 뚫습니다. 26cm 길이의 튜브가 부착된 왼쪽 심방에 16게이지 카테터를 삽입합니다.

마지막으로, 아연 포멀 및 고정제로 심장을 관류합니다. 10분 후, 섭씨 7도에서 최대 24시간 동안 고정액이 채워진 튜브에 심장을 넣습니다. 이 그림에서는 30분의 허혈을 겪은 마우스에 대해 Y축을 따라 표시된 경색 크기와 위험 영역의 백분율을 비교한 다음, 30분의 허혈을 겪은 마우스와 검은색 막대로 표시되는 120분의 재관류, 20초의 3회 주기를 비교합니다.

빨간색 막대로 표시되는 재관류 및 폐색 또는 허혈성 사후 상태 각각은 IPC 마우스보다 허혈 재관류 그룹에서 경색 크기의 비율이 훨씬 더 높다는 점에 유의하십시오. 이 그림은 흰색 경색 영역이 빨간색 위험 영역 및 파란색 밀폐되지 않은 영역과 어떻게 구별되는지 보여줍니다. 여기에는 생존 가능한 myo card를 위한 빨간색 TTC 염색이 있는 흰색 경색 영역의 대표적인 조각이 표시됩니다.

정점에 가까운 좌심실의 원뿔 모양으로 인해 별표로 표시된 분홍색과 파란색 바깥쪽 영역의 epi myocardi는 일반 영역으로 나타나며 평면 측정에 고려되어서는 안 됩니다. 가장 중요한 것은 심근경색을 겪은 동물과 비교했을 때, 허혈과 재관류를 제외한 모든 수술을 받은 가짜 수술을 받은 동물은 사이토카인 RNA의 발현이 낮았다는 것입니다. 예를 들어, 이 막대에서 볼 수 있듯이 30분의 허혈과 120분의 재관류를 거친 그래프 동물은 상당한 수준의 IL one beta를 발현합니다.

그러나 통제 중인 동물과 가짜 운영 동물 단체는 그렇지 않았다. 마찬가지로, 허혈성 재관류를 받은 동물은 대조군 및 가짜 수술 그룹의 동물에 비해 상당한 수준의 IL 6을 나타냈습니다. 마지막으로, 발달 후 대조군 가짜 수술 또는 허혈 재관류된 동물에 대해 심근 TNF 알파 mRNA 발현의 유의미한 생산이 관찰되지 않았습니다.

이 기술은 심혈관 면역학 분야의 연구자들이 생쥐의 심혈관 질환에서 선천성 면역 반응을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.