Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare topi adulti da cellule staminali pluripotenti indotte, o I PSCs mediante complementazione di embrioni tetraploidi. Questo si ottiene arrivando per primo. I PSC da fibroblasti embrionali di topo che utilizzano lentivirus, che trasportano OCT quattro, SOX due, KLA quattro e cmic e integrano i terreni con acido valproico o VPA.

Una volta generate, le IPC sono caratterizzate dall'immunocolorazione, dal conteggio dei cromosomi e dalla formazione del corpo embrionale. Il passo successivo consiste nel generare l'assistenza blastica tetraploide ricevente tramite fusione e coltura in vitro. Successivamente, le IPSC vengono iniettate nell'assistenza blastica tetraploide e l'assistenza blastica integrata viene trapiantata nelle femmine riceventi per la gestazione.

Nella fase finale, gli animali a termine vengono consegnati con taglio cesareo e alle madri surrogate. In questo modo lo sviluppo postnatale può essere monitorato. In definitiva, se vengono generati animali vitali a termine a termine.

La linea di test IPSC è considerata completamente pluripotente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi di generazione di PSC I è che il nostro metodo genera in modo riproducibile linee cellulari IPS completamente pluripotenti Le linee cellulari IPS generate da questi metodi possono essere utili ad altri ricercatori che desiderano confrontare la pluripotenza delle loro cellule IPS o stabilire l'equivalenza di altri metodi di riprogrammazione. Questi metodi saranno utili per i ricercatori che desiderano generare linee cellulari IPS completamente pluripotenti per applicazioni specifiche a valle, come i saggi di differenziazione in vitro.

Ulteriore la generazione di tutti i mouse IPSC. L'uso della complementazione telo può servire come mezzo utile per determinare la stabilità genetica ed epigenetica di varie linee cellulari. Le manipolazioni dei microm coinvolte nella complementazione dell'embrione tetraploide sono tecnicamente impegnative.

Potrebbero essere necessari diversi mesi prima che qualcuno diventi esperto Alle tecniche IPSC è sviluppato da questa tecnica richiede condizioni di coltura simili a quelle utilizzate nei tradizionali esperimenti di targeting genico ESL. 24 ore dopo la trasfezione di cellule HEC 2 9 3 T con lentivirus. Rimuovi il terreno di coltura e sostituiscilo con 25 millilitri di tecnologia preriscaldata fresca.

Ritorno del terreno TRANSFECTED hex all'incubatore per 24 ore, 48 ore dopo la trasfezione delle cellule HEC 2 9 3 T con lentivirus raccolgono il terreno di crescita contenente particelle lentivirali dalle cellule trasfettate. Rimuovere i detriti di particolato dal terreno contenente il virus mediante centrifugazione a 3000 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, concentrare il virus mediante ultracentrifugazione attraverso un cuscinetto di saccarosio al 20% per due ore a 112.000 g a quattro gradi Celsius.

Decantare accuratamente il liquido in un contenitore per rifiuti per la decontaminazione senza disturbare il pellet virale. Risospendere il pellet virale in 0,4 millilitri di terreno di fibroblasti embrionali di topo e sigillare la provetta. Quindi scuoterlo delicatamente a quattro gradi Celsius per 15-30 minuti.

Conservare le particelle virali e le aliquote monouso a meno 80 gradi Celsius.IPSC. Le linee derivano da fibroblasti embrionali di topo, o cellule di metanfetamina. Una volta che le colonie di IPSC possiedono un bordo rifrangente brillante e ben definito e contengono da 30 a 50 cellule, sono pronte per essere prelevate manualmente ed espanse come linee IPSC indipendenti.

Prelevare singole colonie con un puntale per pipetta di caricamento in gel e trasferire ogni colonia direttamente in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U contenente 20 microlitri di tripsina allo 0,25% EDTA, incubare le colonie prelevate e la tripsina per circa otto minuti a 37 gradi Celsius o fino a quando le colonie non si dissociano in singole cellule. Monitorare l'andamento della dissociazione mediante microscopia ottica. Potrebbe essere necessaria una delicata terapia.

Trasferire la sospensione cellulare dissociata in una piastra a 96 pozzetti contenente uno strato di alimentazione e 150 microlitri di terreno ESC integrato con doxiciclina e VPA When IPSC, le colonie riappaiono in ciascun pozzetto, suddivise in pozzetti più grandi per l'analisi e la conservazione delle cellule, utilizzando le procedure standard di derivazione ESC e coltura cellulare per iniziare la procedura di generazione dell'assistenza blastica tetraploide. Gli embrioni di una cellula raccolti da topi femmina vengono coltivati in embrioni di due cellule durante la notte in KSOM a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica il giorno successivo. Posizionare un micro vetrino BTX in una capsula di Petri di 10 centimetri.

Versare una quantità sufficiente di elettro per elettrofusione a temperatura ambiente da immergere il vetrino nella soluzione, ma non così tanto da immergere completamente i poli dell'elettrodo. Accendere l'elettromanipolatore BTX ECM 2001 e il BTX enhancer 400. Collegare i cavi dell'ECM all'elettrodo dei micro vetrini e fissare i cavi al lato della capsula di Petri per evitare movimenti involontari del vetrino.

Eseguire un impulso manuale per ottenere una lettura sul potenziatore BTX e annotare la tensione delle correnti CC applicate. La corrente alternata controllerà la velocità con cui gli embrioni si allineano tra gli elettrodi. La corrente continua fonderà i blasfemi e il tempo dell'impulso imposterà la lunghezza dell'impulso CC.

Un buon punto di partenza è l'AC tre volt, l'DC 100 volt e i tempi di 0,05 millisecondi. La CC ottimale varia nell'intervallo da 90 a 150 volt. Utilizzando una pipetta per la bocca.

Prelevare da 30 a 42 embrioni cellulari dalla coltura KSOM e trasferirli in una goccia di elettrofusione. Lavaggio medio attraverso diverse gocce di mezzo di elettrofusione. Quindi, aspirare il terreno di elettrofusione fresco dal piatto per microvetrini nella pipetta per bocca.

Prendi gli embrioni lavati e posizionali nello spazio di un millimetro tra gli elettrodi sul micro vetrino. Fai attenzione che gli embrioni siano allineati al centro della fessura e non siano in contatto tra loro. Applicare la corrente alternata premendo il pulsante di avvio manuale.

Gli embrioni ruoteranno nel campo CA fino a quando il piano di contatto di Blasier sarà parallelo agli elettrodi. Se gli embrioni non vengono allineati entro pochi secondi, aumentare l'impostazione AC. Dopo che gli embrioni si sono allineati, premere nuovamente il pulsante di avvio manuale per applicare l'impulso CC con il mezzo di elettrofusione nella pipetta.

Raccogliere gli embrioni dal micro vetrino attraverso diverse gocce di terreno KSOM e quindi coltivare gli embrioni in KSOM sotto olio minerale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. La fusione del blaster dovrebbe essere completata in meno di 30 minuti. In coltura, monitorare e selezionare con successo gli embrioni con blastomeri fusi.

Gli embrioni fusi sembreranno essere allo stadio di una cellula, scartare gli embrioni lisati e due cellule dopo 30 minuti in coltura, continuare a coltivare gli embrioni fusi in micro gocce di KSOM sotto olio minerale a 37 gradi Celsius. 5% di anidride carbonica per preparare gli IPC per l'iniezione blastica, scongelare gli IPC precedentemente conservati e piastrarli su alimentatori in mezzo ESC passaggio alle cellule almeno una volta sugli alimentatori. Dopo lo scongelamento prima dell'uso per l'iniezione.

Un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente dal 70 all'80% di IPC confluenti fornirà un numero più che sufficiente di cellule per l'iniezione, aspirerà il terreno di crescita e laverà le cellule con tre millilitri di PBS senza calcio o magnesio a 0,5 millilitri di preriscaldamento, 0,05% di tripsina EDTA alle cellule e incuberà a 37 gradi Celsius per 10 minuti con oscillazione occasionale a 3,0 millilitri di terreno ESC e itererà per ottenere un singolo sospensione cellulare. Osservare le cellule al microscopio ottico per assicurarsi che una singola sospensione cellulare, colonie o aggregati cellulari ostruiscano la pipetta per iniezione. Una volta ottenuta una sospensione a singola cellula, aggiungere un millilitro di terreno ESC al pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius.

Incubare per circa 15 minuti o fino a quando la maggior parte delle cellule di alimentazione ha iniziato ad aderire, rimuovere delicatamente il terreno contenente gli IPC. Facendo attenzione a non spostare le celle di alimentazione aderenti settimanalmente. Mettere gli IPC in una provetta conica da 15 millilitri contenente cinque millilitri di centrifuga media ESC a 200 Gs per cinque minuti.

Aspirare il surnatante e rimuovere il resto del terreno ESC con una micropipetta. Picchiettare il tubo per rimuovere il pellet e risospendere delicatamente le celle in 0,2-0,5 millilitri di terreno FHM pre-raffreddato. Conservare le cellule in ghiaccio fino e durante l'iniezione in tetraploide Blast assists Per il protocollo per l'iniezione blast assist, fare riferimento al manoscritto che accompagna questo articolo e a un articolo di Strove precedentemente pubblicato, di cui un estratto viene mostrato sullo schermo qui.

In queste immagini sono mostrati esempi della progressione morfologica da colonie di fibroblasti a colonie di IPSC nel corso di un esperimento di riprogrammazione. L'eterogeneità morfologica e la formazione di colonie di IPSC parzialmente riprogrammate devono essere osservate a partire da quattro o cinque giorni dopo l'edizione di doxiciclina VPA, come mostrato nei pannelli B dell'ECES. Come le colonie IPSC, dovrebbero apparire tra i sette e i 10 giorni, come mostrato nel pannello F. La produzione di embrioni di telo a una cellula mediante elettrofusione di embrioni diploidi a due cellule è altamente efficiente.

È routine osservare fino al 95% degli embrioni a due cellule trattati fusi con successo per produrre embrioni tetraploidi a una cellula. Il protocollo utilizzato in questo esperimento per l'iniezione di IPSC nell'assistenza blastica tetraploide è simile al protocollo per l'iniezione di E SES nell'assistenza blastica diploide per generare topi chimerici per escludere facilmente la generazione di chimere diploidi, la pigmentazione dei ceppi di topo utilizzati per generare IPS ed embrioni tetraploidi viene scelta con cura quando possibile. In questo esempio, gli embrioni tetraploidi sono prodotti da un ceppo albino e gli IPSC sono generati da un ceppo pigmentato.

Così i topi IPSC neonati mostrano occhi pigmentati e un colore del mantello uniformemente pigmentato in età adulta, mentre i kyra diploidi mostrerebbero una colorazione mista albina e pigmentata. Il numero di cuccioli vivi nati dipende dalla linea cellulare come mostrato in questa tabella. Per una linea IPSC mediamente buona, gli sperimentatori dovrebbero aspettarsi tra l'1% e il 10% di blast assist iniettato per produrre cuccioli appena nati vivi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come derivare cellule IPS completamente pluripotenti e anche di come convalidare il loro potenziale di sviluppo. Utilizzo del test di complementazione tetraploide Una volta padroneggiata questa tecnica dalla derivazione della MES all'IPSC neonatale, i topi possono essere completati da due a tre mesi. Lo sviluppo e il mantenimento delle PSC richiedono un alto livello di tecnica di coltura cellulare.

Una precedente esperienza con la cultura ESL è essenziale. Non dimenticare di lavorare con il lentivirus, in particolare il lentivirus concentrato può essere estremamente pericoloso. Si dovrebbe sempre indossare i dispositivi di protezione individuale richiesti dal proprio istituto e assicurarsi di trattare tutto ciò che è entrato in contatto con il virus, con candeggina al 10% per almeno 20 minuti Dopo questa procedura.

Tutti i topi IPSC e i loro tessuti possono essere analizzati per fenotipi fisiologici, patologici e comportamentali.