분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

이 결합된 분석 방법론의 전반적인 목표는 세포의 분비 소포가 세포 외 삼투압과 같은 물리적 힘에 어떻게 반응하는지, 그리고 이러한 세포 소기관의 조정이 세포외이입 과정에 어떤 영향을 미치는지에 대한 정보를 제공하는 것입니다. 이 방법은 분비 소포가 세포 외 환경의 변화나 약물 치료에 어떻게 직접 반응하는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 살아있는 세포의 소포 함량에 대한 직접적인 영향을 모니터링하고 엑소사이토시스를 치료하기 전과 후의 reh-chemical-ed 방출의 변화를 구별하는 것입니다.

평평한 디스크 전극 표면을 얻으려면 전극을 마이크로 그라인더의 홀더에 놓고 각 탄소 섬유 전극을 45도 각도로 경사지게 만듭니다. 그런 다음, 세포외이입 측정을 위해 세포 근처에 전극을 배치할 때 디스크 전극 표면을 45도 각도로 배치하는 방법에 대한 향후 참조를 위해 모세관을 표시합니다. 단일 세포에서 전류 측정 기록을 수행하려면 포텐시오 스타트와 함께 사용되는 헤드 스테이지의 전극 홀더에 새로 베벨 및 테스트된 탄소 섬유 디스크 미세 전극을 장착합니다.

사용하기 전에 각 탄소 섬유 미세 전극을 테스트 용액에 넣고 순환 전압 전류계를 사용하여 연구 상태 전류를 모니터링합니다. 순환 전압주사법 스캔의 경우, 양호한 반응 역학을 보장하기 위해 초당 100밀리볼트의 속도로 은-은 염화물 기준 전극에 대해 음의 0.2볼트에서 양의 0.8볼트까지의 삼각 전위 파형을 적용합니다. 엑세포작용(exocytosis)의 암페로메트리 기록을 위해 배양된 크로마핀 세포와 함께 페트리 접시를 패러데이 케이지의 도립 현미경에 등장성 완충액에 놓습니다.

현미경 가열 스테이지를 사용하여 세포 실험 중에 섭씨 37도의 온도를 유지합니다. 다음으로, 저잡음 패치 클램프 기기를 사용하여 작업 전극에 양의 700밀리볼트의 일정한 전위를 적용합니다. 크로마핀 세포의 엑소사이토시스를 기록하려면 10킬로헤르츠에서 신호를 디지털화하고 2킬로헤르츠에서 내부 저역 통과 베셀 필터를 적용하여 기록된 신호를 필터링합니다.

타원형 디스크 전극은 셀 위에 평평하게 배치하고 페트리 접시 표면과 평행하게 배치해야 합니다. 또한 전극은 깨끗한 전극 표면을 보장하기 위해 실험과 같은 날 베벨 처리됩니다. 세포 엑소사이토시스(exocytosis)를 자극하기 위해, 5밀리몰 염화바륨 용액으로 채워진 유리 마이크로피펫을 세포에서 최소 20마이크로미터 떨어진 곳에 배치합니다.

그런 다음 세포 표면에 5밀리몰 염화바륨 용액을 5초 동안 주입하여 세포 엑소사이토시스를 자극합니다. 줄기 피펫을 용액에 넣고 바륨 주입 펄스를 가하여 세포 엑소사이토시스를 자극하는 동시에 약 3분 동안 전류 과도 전류를 기록합니다. 등장성 조건과 긴장성 조건에서의 외세포반응(exocytotic response)을 비교하기 위해, 긴장성 완충 용액에서 세포를 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 바륨 주입 펄스를 적용하여 엑소사이토시스를 자극하고 3분 동안 전류 측정 기록을 수행합니다. 세포의 가역적 반응을 위해 등장성 완충 용액에서 세포를 10분 동안 다시 배양합니다. 바륨 주입 펄스를 적용하여 세포를 자극하고 외세포성 반응을 3분 동안 기록합니다.

소포 양자 크기 측정을 위한 전극을 제작하려면 직경이 5마이크로미터인 탄소 섬유 전극을 준비합니다. 현미경으로 메스를 사용하여 유리 끝에서 뻗어있는 탄소 섬유를 잘라 30-100 마이크로 미터 만 남도록합니다. 부탄 화염을 사용하여 탄소 섬유 전극의 화염 에칭 팁을 준비합니다.

균일하게 에칭된 원통형 전극 팁을 얻으려면 원통형 탄소 섬유 전극을 회전시키면서 잡습니다. 그리고 유리에서 뻗어 나온 탄소 섬유를 탄소 끝이 붉은색이 될 때까지 부탄 불꽃의 파란색 가장자리에 놓습니다. 화염 에칭 후 전극을 현미경 아래에 놓고 전극 팁을 평가합니다.

에칭된 전극 팁 크기는 직경이 약 50-100나노미터여야 합니다. 다음으로, 원통형 나노팁 미세전극을 에폭시 용액에 3분 동안 삽입한 다음 전극 팁을 아세톤 용액에 15초 동안 담궈냅니다. 이를 통해 에폭시는 탄소 섬유와 절연 가스 모세관 벽 사이의 잠재적인 갭 공간을 밀봉할 수 있습니다.

아세톤은 에칭된 탄소 섬유 전극 표면에서 에폭시를 제거합니다. 에폭시를 경화시키려면 전극을 섭씨 100도의 오븐에서 밤새 굽습니다. 사용하기 전에 순환 전압전류법을 사용하여 각 탄소 섬유 미세 전극의 정상 상태 전류를 테스트하십시오.

실험의 경우 약 1.5-2.5 나노 암페어의 안정 전류를 표시하는 전극 만 사용하십시오. 세포 내 전류 측정 방법의 경우, 세포를 현미경 아래에 놓고 potentiostat와 동일한 실험 설정을 사용합니다. 세포에 대한 심각한 물리적 손상을 방지합니다.

부드러운 기계적 힘을 가하여 나노팁 원통형 미세 전극을 셀에 삽입합니다. micromanipulator를 사용하여 전극을 세포 원형질막을 통해 세포 세포질로 밀어 넣을 수 있을 정도입니다. 삽입 후 원통형 전극 주위에 세포막을 밀봉한 상태에서 라이브 셀에서 현장 전류 측정 기록을 시작합니다.

전극에 적용된 산화 전위에서 소포는 전극 표면에 흡착되어 확률적으로 파열됩니다. 따라서 이 과정을 시작하기 위해 어떤 종류의 자극도 필요하지 않습니다. 소포 양자 크기에 대한 삼투압 효과를 측정하려면 실험 조건을 사용하여 등장성 및 고긴장성 완충액에서 배양된 세포 그룹에서 세포 내 세포 분석 측정값을 수집합니다.

세포외삼투압(extracellular osmolality)이 세포외세포작용(exocytosis) 활성에 미치는 영향은 염색체(chromaffin cell)가 바륨 용액으로 isotonic(등장성), hypertonenic(긴장성), 그리고 최종적으로 isotonic 조건에서 자극될 때 exocytosis(외세포작용) 발생의 빈도로 제시됩니다. 이 데이터는 삼투압 스트레스를 경험하는 세포에서 엑소사이토시스 활성이 억제되고 세포가 등장성 환경으로 돌아간 후 부분적인 회복이 달성될 수 있음을 보여줍니다. 대조군 실험은 등장성 조건의 크로마핀 세포에서 3회 연속 바륨 자극 후 엑소사이토시스 이벤트의 빈도를 보여줍니다.

이는 이러한 실험에 사용된 시간 프레임 내에서 여러 번의 바륨 자극이 연속적인 세포 자극에 의한 엑소사이토시스 활성의 감소를 유발하고 있음을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분비 소포체와 외포작용 과정이 세포 외 환경의 변화에 의해 어떻게 영향을 받는지 비교할 수 있는 이러한 무료 분석 방법을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.