Name: 분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 배우세요 삼투성 스트레스가 chromaffin 세포의 분비 소포 및 exocytosis에 미치는 영향을 전기화학적 방법과 투과전자현미경으로 실시간 모니터링하는 방법을. 이 기법은 신경과학 연구에서 소포 역학과 신경전달물질 방출 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자 소 부 신 땀 샘의 기부에 대 한 Dalsjöfors 살 AB (Dalsjöfors, 스웨덴) 스웨덴 연구 위원회 (349-2007-8680) 자금에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

1. 아드레날린에서 효소 소화에 의해 격리 소 Chromaffin 세포 세포 배양
<ol><li>소 아드레날린에서 수집 chromaffin 세포를 격리 하려면 셀 70% 에탄올 용액으로 소독. 멀리 지방과 결합 조직 메스를 사용 하 여 정돈 하십시오. 씻어 37 ° c.에 thermostated 되었습니다 로크의 솔루션 (NaCl 154 m m, KCl 5.6 m m, NaHCO3 3.6 m m, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.4에 5.6 m m)를 사용 하 여 부 신 정 맥 혈액을 제거 하려면</li>
	<li>조직, 소화 약 2.5 mL 따뜻한 살 균 필터링 0.2% 콜라 P 솔루션의 주사기를 사용 하 여 부 신 정 맥을 통해 주입 하 여 각 동맥을 팽창 시키고 37 ° c.에 20 분에 대 한 조직을 품 어 모 수의 소화 과정을 완료 수 있도록 동맥을 검사 합니다. 조직이 부드럽고 강렬 하지 느껴야 합니다.</li>
	<li>소화 모 snipping 경도 방향에 있는 땀 샘에 의해 수집 합니다. 메스를 사용 하 여 골 수 조직을 말하다. 강 체에 조직 정지를 필터링 하 고 로크의 솔루션 콜라 피 활동을 줄이기 위해 볼륨 약 50ml로 희석</li>
	<li>실 온에서 10 분 원심 분리기에서 300 x g에서 셀 펠 렛을 50 mL의 멸 균 시험관에 수집 합니다. 다시 20 mL 로크의 솔루션에서 얻은 펠 릿을 일시 중단 하 고 튜브로 살 균 100 µ m 나일론 메쉬를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>살 균 Percoll (1:1)와 chromaffin 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 실 온에서 20 분 18600 x g에서 셀 솔루션 원심. 밀도 기울기의 상위 레이어를 수집 하 고 튜브로 100 µ m 나일론 메쉬를 통해 솔루션을 필터링.</li>
	<li>Percoll을 제외 하려면 다시 로크의 솔루션에는 펠 릿을 중단 하기 전에 로크의 솔루션 및 실 온에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액을 희석. 격리 된 세포 현 탁 액의 예상된 셀 밀도 약 4 백만 셀/mL입니다.</li>
	<li>Exocytosis 및 세포내 cytometry 측정의 amperometric 기록에 대 한 콜라겐 4 접시 chromaffin 세포 약 17.5 × 103 셀/c m2 의 조밀도에 60 m m 플라스틱 접시를 코팅 하 고 37 ° c 5% CO2 에서 셀을 품 어 환경입니다. 세포 배양의 1-3 일 이내에 전기 화학 실험을 수행 합니다.</li>
	<li>가장에 대 한 실험, 75 cm2 셀 문화 플라스 크 당 7-8 백만 셀의 밀도에 플라스 크에서 접시 chromaffin 세포 이미징 하 고 1 일 5% CO2 환경에서 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>2. 단일 셀 Exocytosis Amperometry 실험24
<ol><li>이 실험에 대 한 탄소 섬유 microelectrodes 조작 걸릴 유리 전극 홀더에 적합 한 외부 직경 모 세관이 실험에 사용 될 것입니다 머리 단계에서. 붕 규 산 유리 모 세관을 사용 하 여 1.2 m m의 외부 직경 및 0.69 m m 내부 직경.<ol>
<li>물 흡입 관에 모 세관 끝 중 하나를 연결 합니다. 시각화를 향상 시키기 위해 흰 종이의 한 조각 같은 뭔가에 5 µ m 직경 탄소 섬유를 배치 합니다.</li>
		<li>단일 탄소 섬유 식별 고 섬유 탄소 섬유 탄소 섬유의 자유로운 끝에 근접에 있는 열린 모 세관 끝을 위치 하는 동안 유지 하는 손가락으로 한쪽 끝에. 탄소 섬유는 모 세관의 양쪽 끝을 통해 밖으로 찌르는 되도록 부드럽게 유리 모 세관에 탄소 섬유 발음. 포부 강제로 이동 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탄소 섬유와 모 세관 micropipette 끌어당기는 사람에 배치 하 고 두 개의 별도 유리 피 펫 팁으로 유리 모 세관을 당겨. 탄소 섬유 두 유리 끝 사이 연결을 끊으려면가 위를 사용 하 여 탄소 섬유를 잘라내어 두 탄소 섬유 microelectrodes를 얻을.</li>
	<li>현미경, 탄소 섬유는 섬유 유리 모 세관 코팅 메스를 사용 하 여에서 확장은의 가장자리에 탄소 섬유의 수동 절단을 허용 하는 두꺼운 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.</li>
	<li>탄소 섬유, 유리 코팅된 탄소 섬유 팁을 두고 절단 후 에폭시를 올려 고 탄소 섬유와 주변 유리 사이 어떤 가능한 열린 공간 인감 10 분 에폭시 솔루션으로 전극 팁의 몇 mm를 삽입 합니다. 전극 부피 접착제 방울 전극의 끝에 형성에서 방지 하기 위해 에폭시 솔루션에서 천천히 들어올립니다.</li>
	<li>전극 홀더 (예를들면, 나무 편평한 막대기) 2-사이드 스티커 내열성 테이프 전극 장착할 수를 놓습니다. 에폭시 처리 전극 하룻밤 100 ° c.에 오븐에 구워 전극 팁 쉽게 그들이 표면 접촉 중단 되도록 전극 항상 안전 하 게 저장 전극에에서 고정 및 팁에 감동 되 고 위험 하지 않습니다 홀더를 사용 하 여.</li>
	<li>평면 디스크 전극 표면을 얻으려면 전극은 microgrinder의 소유자에서 놓고 경사 45 °의 천사에서 각 탄소 섬유 전극. 베벨, 후 나중 exocytosis 측정에 대 한 셀 근처 전극 배치 때 디스크 전극 표면에서 45 ° 각도 찾을 방법을 알고 영구 마커를 사용 하 여 그것의 윗면에 모 세관을 표시 합니다. 참고:이 단계는이 실험에서 중요 한, 타원형 디스크 전극 배양 접시의 표면에는 표면 병렬 셀 위에 평면 배치 될 필요가. 또한, 경사지 전극 실험 한 신선 하 고 깨끗 한 전극 표면을을 같은 날 할 수 있습니다.</li>
	<li>사용 하기 전에 주기적 voltammetry를 사용 하 여 현재 안정 된 상태를 모니터링 하려면 각 탄소 섬유 microelectrode를 테스트 솔루션 (예를 들어, 버퍼 PBS (pH 7.4)에 0.1 m m 도파민)에 놓습니다. 순환 voltammetry 스캔에 대 한 적용 삼각형 잠재적인 파형에서 0.8 V-V 0.2 대 Ag/AgCl 기준 전극에서 좋은 반응 속도 론 데이터를 보장 하기 위해 100 mV/s을 얻을 수 있습니다 5 µ m 직경 디스크에 대 한 이론적으로 계산 된 값과 일치 하 여는 탄소 섬유 microelectrode25.</li>
	<li>Exocytosis의 amperometry 녹음, 거꾸로 현미경에 교양 chromaffin 세포 배양 접시를 놓습니다. 그것은 기록, 측정 되는 아주 작은 전류로 인해 amperometry 동안 전자 노이즈를 제거 하는 패러데이 케이지 설정 현미경을 보호 하는 것이 중요. 난방 단계 현미경을 사용 하 여 셀 실험 동안 37 ° C의 온도 유지.</li>
	<li>저 잡음 패치 클램프 장비를 사용 하 여 700의 끊임 없는 잠재력을 적용 또한 작업 전극에서 페 트리 접시에 배치 된 Ag/AgCl 기준 전극 대 작업 전극에 mV. Chromaffin 세포의 녹음 exocytosis, 10 kHz에서 신호를 디지털화 및 내부 낮은 패스 기록 된 신호를 필터링 하려면 2 kHz에서 베셀 필터 적용.</li>
	<li>Amperometric 단일 셀에서 녹음을 수행 하려면 갓 beveled 및 시험 된 탄소 섬유 디스크 microelectrode에는 potentiostat와 함께 사용 되는 머리 무대의 전극 홀더 탑재 합니다.<ol>
<li>부드럽게 전극은 평평한 타원형 디스크 모양 전극 표면 아래로 향하게 셀의 꼭대기 표면으로와 놓고는 micromanipulator를 사용 하 여 세포 막에 접촉 전극 배치 합니다.</li>
		<li>세포 막 위에 배치 시 전극으로 인 한 세포 변형 모니터링 하 여 셀 전극에서 거리를 조정 하 고 신중 하 게 취소 어디 셀을 원래 셀 모양에 가까운 모양 차릴 거리에 전극 . 운동 하 고 양적 기록 위한 이상적인은 시 냅 스에서 화학 방출의 postsynaptic 검출을 위한 유사한 조건이 전극 및 세포 표면, 분리 하는 백 나노미터의 액체 박막을 만드는 것입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>팁 크기 영향을 피 펫 팁에서 유출 하는 어떤 해결책 든 지 방지 하기 위해 셀에서 20 µ m의 거리에서 5mm BaCl2 솔루션으로 가득 2-3 µ m 직경의 유리 제 micropipette 위치 exocytosis 세포를 자극 하는 실험 하 고 5mm exocytosis 셀을 자극 하는 세포 표면에서 BaCl2 솔루션의 5 s 분사 펄스를 적용 합니다.</li>
	<li>Exocytosis 프로세스에 삼투성 압력의 가역 효과 연구, 310 mOsm/kg iso 삼투성 압력와 조정 하 여 만든 고 버퍼 isotonic 버퍼 솔루션 (150 m m NaCl, KCl, 1.2 m m MgCl2, 포도 당 5 mM, 10 mM HEPES, 5mm pH 7.4) 준비는 730 mOsm/kg에 해당 하는 osmolality isotonic 버퍼 솔루션의 NaCl 농도.</li>
	<li>Isotonic 버퍼에 셀을 놓고 약 3 분 동안 시작된 exocytosis 활동 중 amperometric 전류 과도 특성을 기록 하는 동안 바 륨 주입 펄스를 적용 하 여 exocytosis 셀을 자극 합니다.<ol>
<li>마 조건 isotonic 조건에서 exocytosis 응답을 비교 하 고 버퍼 솔루션에 10 분에 대 한 셀을 품 어 하 고 그 후 exocytosis를 자극 하 고 수행 하는 amperometric 기록의 3 분을 바 륨 주입 펄스를 적용 합니다.</li>
		<li>셀의 가역 반응, 다시 10 분 isotonic 버퍼 솔루션에 대 한 셀을 품 어와 5s를 적용 하 여 세포를 자극 바 륨 주입 맥 박 및 셀 로부터 exocytosis 응답 기록의 3 분을 수행.</li>
	</ol></li>
	<li>여러 바 륨 stimulations 여 exocytosis 활동에 미치는 영향을 결정 하는 제어 실험 수행 3 연속 exocytosis 릴리스의 amperometric 녹음 BaCl2 stimulations 동일한 셀에 배치 isotonic 버퍼와 다른 osmolarity와 연속 세포 배양 실험에 대 한 동일한 시간 프로토콜을 사용 하 여.</li>
</ol>3. 세포내 전기 Cytometry24,26
<ol><li>조작 기 quantal 크기 측정을 위한 전극, 같은 재료를 사용 하 고 직경 2.1과 2.2 amperometric exocytosis 위한 microelectrode 제조의 단원의 설명에 따라 탄소 섬유 전극에 5 µ m를 준비 시작 측량입니다.</li>
	<li>현미경, 메스를 사용 하 여 30에서 100 µ m에 이르는 길이와 탄소 섬유 유리 팁에서 튀어나와 남아 있도록 유리 팁에서 탄소 섬유 확장을.</li>
	<li>탄소 섬유 전극의 불꽃 에칭된 팁을 준비 하려면 부탄 화 염을 사용 합니다. 균등 하 게 에칭 달성, 원통 모양된 전극 팁, 원통형 모양의 탄소 섬유 전극 그것을 회전 하는 동안 누른는 탄소 섬유 확장 유리에서 부탄 불꽃의 파란 가장자리에 탄소 끝 개발 빨간색까지 배치 색. 이 종종 2 미만 소요 s. 성공 하면 (이러한 팁의 SEM 이미지를 그림 5B표시) 직경에서 50-100 nm의 에칭된 전극 팁 크기 결과. 불꽃 에칭, 후 전극 팁을 평가 하는 현미경 전극을 배치 합니다.</li>
	<li>3 분 뒤에 15 s 찍기 전극 팁의 아세톤 솔루션으로 에폭시 솔루션에 원통형 nanotip microelectrode를 삽입 합니다. 아세톤 에폭시 에칭된 탄소 섬유 전극 표면에서 삭제 하는 동안 탄소 섬유와 단 열 유리 모 세관 벽 사이 잠재적인 갭 공간을 밀봉 하기 위하여 에폭시 수 있습니다. 에폭시 치료, 전극 하룻밤 100 ° c.에 오븐에 구워</li>
	<li>2.7 섹션에 설명 된 대로 테스트 각 탄소 섬유 microelectrode의 정상 상태 전류를 사용 하기 전에 주기적 voltammetry를 사용 하 여. 실험, 고원 주위 현재 표시 전극 사용 1.5-2.5 나27.</li>
	<li>세포 amperometry 측정을 위해 셀 현미경에서 2.8에 설명 된 대로 놓고 2.9에 설명 된 대로 potentiostat의 동일한 실험 설정을 사용 합니다.</li>
	<li>세포내 amperometric 측정을 수행 하 고 셀에 상당한 물리적 손상을 방지 하기 위해 삽입 nanotip 원통형 microelectrode 셀 추가 하 여 부드러운 기계를 강제로, 충분히 밀어 셀 플라즈마를 통해 전극 막 한 micromanipulator를 사용 하 여 세포 세포질에.</li>
	<li>삽입 후 봉인 원통형 전극 주위 세포 막으로 라이브 셀에서 원래의 장소에 amperometric 녹음을 시작 합니다. 산화 전극에 적용 되는 잠재적인, 소포 전극 표면에 흡착 하 고 확률론 파열.  따라서,이 과정을 시작 하는 자극의 어떤 종류에 대 한 필요가 있다.</li>
	<li>기 quantal 크기에 삼 투 효과 확인 하려면 섹션 2.13에에서 설명 된 대로 실험 상태를 사용 하 고 버퍼와 isotonic에서 incubated 되었습니다 셀의 그룹에서 세포내 cytometry 측정을 수집 합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석 Amperometry 기록의
<ol><li>Exocytosis 및 세포내 소포 quantal 크기 분석에서 기록 된 amperometry 데이터를 분석 하려면 시간 추적 대 기록된 전류에서 그래서 그 운동 전류 과도 특성의 분석을 허용 하는 소프트웨어 프로그램을 사용 피크 매개 변수 및 개별 현재 피크에 대 한 통합된 총 요금을 확인할 수 있습니다. 데이터 분석을 위해 데이터 분석 프로그램 이고르28작성 된 슐 실험실에서 개발 된 소프트웨어를 사용 했습니다.</li>
	<li>스파이크는 amperometric를 분석 하는 경우 세 번 루트-평균 제곱 (RMS)의 표준 편차 각 기록에 대 한 잡음의 봉우리에 대 한 임계값 제한을 선택 합니다.</li>
	<li>Amperometric 스파이크 거짓 스파이크를 가우스 모양에 따라, 두 번 병합된 exocytosis 이벤트의 결과 고만 세 번의 임계값과 가우스 모양된 스파이크를 받아들일 수 있는 스파이크를 방지 하기 위해 수동으로 각 셀 녹음에서 수집 RMS 잡음 보다는 높이.</li>
	<li>단일 amperometric 당 총 비용에 대 한 데이터 수집에 피크 하 고 Faradays 법을 사용 하 여 (N = QnF) 카 테 콜 아민 신경 전달 물질 exocytosis 또는 세포내 단일 기 파열 이벤트, 여기서 N은의 두더지 당 감지의 어 금 니 금액을 계산 하 Q, 전극 표면에서 산화 환 원 반응을 통해 신경 전달 물질 각 스파이크, n에서 감지 하는 총 충전 = = 산화 환 원 반응에 전송 하는 전자의 수 (n = 2 catecholamines에 대 한), 및 Faraday´s 상수 F = 96485 C/mol.</li>
	<li>첫 번째 검색 각 셀에 대 한 이벤트 당 평균 요금을 계산 하 여 수집 된 데이터의 통계 분석을 수행 합니다. 다음 셀 사이의 차이 대 한 셀 사이의 평균 요금을 계산 하 고 불평등 분산 가정 셀 사이의 스튜던트 t-검정을 사용 하 여 키를 누릅니다. 이 연구는 통계 분석을 위한 MATLAB 프로그램을 사용.</li>
</ol>5. 가장 이미지 소포 크기 분석
<ol><li>다른 삼 투 조건에서 셀의 TEM 이미지를 수행 하려면 먼저 셀 셀의 화학 정착 하기 전에 5% CO2 환경에서 37 ° C에서 10 분 동안 isotonic 또는 마 버퍼에 품 어.</li>
	<li>셀 고정29Karnovsky 통 메서드 사용 하 여 수행 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 셀 알을 품고 0.01% 나트륨 아 지 드, 1% 포름알데히드 및 1.25%도 샘플 4 ° c.에 저장 될 수 있는 포함 하는 솔루션</li>
	<li>고정, 후 0.15 M 나트륨 cacodylate 버퍼와 셀을 씻어.</li>
	<li>셀 얼룩 샘플 고정, 게시 하 고 가장 이미징에 대 한 준비, 어둠 속에서 실 온에서 0.5 %uranyl 아세테이트 솔루션 부 화 1 h 뒤에 4 ° C에서 2 시간에 대 한 1% 오스뮴 tetroxide 솔루션 셀을 품 어.</li>
	<li>마지막 정착 단계에서 100% 에탄올에 셀을 rinsing 하 여 먼저 셀을 탈수 하 고 후 아세톤과 셀 린스.</li>
	<li>Epoxyresin에 셀 샘플을 포함 그 후 30-40 분 4000 x g에서 원심 분리를 수행 하 고 15 h 48 h 60 ° c.에 외피 다음 40 ° C에서 유해를 셀 샘플 허용</li>
	<li>이미징에 대 한 준비, 섹션 셀 샘플에에서 포함 된 한 천 100 수 지 조각으로 두께가 60 nm는 ultramicrotome를 사용 하 여.</li>
	<li>4 분 뒤에 20 4% uranyl acetate/25% 에탄올 솔루션 셀 주제 물으로 rinsing의 s. 셀 3 분, 다음 20 레이놀즈 리드 시트르산을 씻고 물으로 헹 궈의 s.</li>
	<li>전송 전자 현미경 이미징의 셀 샘플을 수행 합니다. 우리의 실험에서 우리가 운영 하 고 있다 전송 전자 현미경에서 사용 120 kV.</li>
	<li>세포 세포질에는 소포의 인구를 표시 하는 세포 열 대권 외 먼저 셀 섹션 설명의 각 기록 된 이미지에서 픽셀 각 가장 이미지에 기록 된 눈금 막대와 연결 함으로써 이미지 픽셀 크기 보정. Isotonic 또는 마 조건에 노출 하는 셀의 각 이미지에 소포 크기를 확인 하려면 이미징 소프트웨어를 사용 합니다. 우리의 실험에서 우리는 이미지 분석을 위한 소프트웨어 ImageJ를 사용. 그것은 그 세포 열 대권 외의 TEM 이미지 셀의 이미지 분석, 크기 조정 셀 섹션의 두께에 따라 이러한 측정의 필요가 간주 하 고 이전에 Almers´s 실험실30설명한 지적 가치가 있다.</li>
</ol>

<ol><li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>Dunevall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+Catecholamine+Content+of+Single+Mammalian+Vesicles+by+Collision-Adsorption+Events+at+an+Electrode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode.</a> J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).</li>
<li>Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromaffin+vesicle%3A+advances+in+understanding+the+composition+of+a+versatile%2C+multifunctional+secretory+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle.</a> Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).</li>
<li>Morris, S., Schultens, H., Schober, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+osmometer+model+for+changes+in+the+buoyant+density+of+chromaffin+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules.</a> Biophys J. 20 (1), 33(1977).</li>
<li>Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinkler%2C+H+%22Handbook+of+Physiology%22">Handbook of Physiology</a>. 6 (7), 321-399 (1975).</li>
<li>Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+calcium%2C+magnesium%2C+copper+and+iron+in+the+bovine+adrenal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla.</a> Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).</li>
<li>Estévez-Herrera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP%3A+The+crucial+component+of+secretory+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">ATP: The crucial component of secretory vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).</li>
<li>Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+intravesicular+calcium+in+the+motion+and+exocytosis+of+secretory+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+integr+biol%22%5BJournal%5D)">On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles.</a> Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).</li>
<li>Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).</li>
<li>Terland, O., Flatmark, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+as+a+natural+constituent+of+chromaffin+granules+from+the+bovine+adrenal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla.</a> FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).</li>
<li>Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragranular+pH+rapidly+modulates+exocytosis+in+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells.</a> J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).</li>
<li>Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+characteristics+of+quantal+secretion+of+catecholamines+from+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).</li>
<li>Daniels, A., Williams, R., Wright, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+character+of+the+stored+molecules+in+chromaffin+granules+of+the+adrenal+medulla%3A+a+nuclear+magnetic+resonance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study.</a> Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).</li>
<li>Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+external+osmotic+pressure+on+vesicular+secretion+from+bovine+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells.</a> J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).</li>
<li>Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+vesicle+fusion+and+exocytosis+in+hypertonic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions.</a> Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).</li>
<li>Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+osmotic+stress+on+mast+cell+vesicles+of+the+beige+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse.</a> J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).</li>
<li>Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+exocytosis+under+hypotonic+conditions+shows+two+distinct+populations+of+dense+core+vesicles+in+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells.</a> Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).</li>
<li>Hampton, R. Y., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+osmolality+on+the+stability+and+function+of+cultured+chromaffin+cells+and+the+possible+role+of+osmotic+forces+in+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis.</a> J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).</li>
<li>Troyer, K. P., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+separation+of+vesicle+release+from+vesicle+fusion+during+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis.</a> J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).</li>
<li>Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+release+from+individual+granules+exhibits+similar+properties+at+mast+and+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells.</a> Biophys J. 71 (3), 1633(1996).</li>
<li>Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ionic+composition+alters+kinetics+of+vesicular+release+of+catecholamines+and+quantal+size+during+exocytosis+at+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells.</a> J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).</li>
<li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+receptor-mediated+catecholamine+secretion+from+individual+chromaffin+cells.+Chemical+evidence+for+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis.</a> J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).</li>
<li>Wightman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+resolved+catecholamine+spikes+correspond+to+single+vesicle+release+from+individual+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells.</a> P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).</li>
<li>Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+osmotic+stress+reduces+the+vesicle+size+while+keeping+a+constant+neurotransmitter+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration.</a> ACS Chemical Neuroscience. , (2017).</li>
<li>Bath, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsecond+adsorption+and+desorption+of+dopamine+at+carbon-fiber+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes.</a> Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).</li>
<li>Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurement+of+Transmitters+in+Individual+Vesicles+in+the+Cytoplasm+of+Single+Cells+with+Nanotip+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes.</a> Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).</li>
<li>Zoski, C. G., Mirkin, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+limiting+currents+at+finite+conical+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes.</a> Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).</li>
<li>Mosharov, E. V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+exocytotic+events+recorded+by+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of exocytotic events recorded by amperometry.</a> Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).</li>
<li>Morris, J. K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244955881_A_Formaldehyde-Glutaraldehyde_Fixative_of_High_Osmolality_for_Use_in_Electron_Microscopy">A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).</li>
<li>Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docked+granules%2C+the+exocytic+burst%2C+and+the+need+for+ATP+hydrolysis+in+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells.</a> Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리는 여기 프로토콜과 결합 분 비 소포 및 삼투성 압력 등 물리적 힘 분 비 소포에 영향을 미칠 방법의 더 나은 이해를 얻기 위하여 exocytosis 프로세스 분석 3 보완 분석 방법의 장점을 제시합니다 그리고 분 비 세포에서 exocytosis 프로세스입니다. 이러한 방법은 exocytosis 활동, 세포내 전기 cytometry 소포 그들의 네이티브 환경에서의 quantal 크기를 결정 하는 데 사용 되는 기록에 대 한 설립 방법은 탄소 섬유 microelectrode amperometry를 포함 하 고 전송 전자 현미경 이미지 분석 분 비 소포 볼륨을 모니터링. 이 작품에는 isotonic 고 extracellular 환경에 노출 chromaffin 세포에서 단일 기 exocytosis 이벤트의 amperometry 녹음에서 양적 데이터를 수집 하 여 우리 확인 그 삼투성 충격을 현저히 감소 하는 금액 신경 전달 물질 exocytosis 동안 발표 하 고이 세포 수 역 복구 하 고 원래 수량 놓습니다 isotonic 환...

아드레날린에 있는 chromaffin 세포는 혈 류로 신경 전달 물질 분자를 풀어 신경 내 분 비 세포. 이 도킹을 포함 하는 세포질 프로세스 및 신경 전달 물질 채워진 소포, exocytosis를 불리는 과정에서 세포 외 공간에 콘텐츠 자료 소포에서 결과의 융합을 통해 발생 합니다. 신경 전달 물질 (아드레날린과 더욱) chromaffin 세포에서 적극적으로 큰 밀도 코어 소포 (LDCVs)으로 막 단백질에 의해 수송 하 고 높은 농도 (~0.5-1 M)1,2에 저장. LDCVs 내의 신경 전달 물질의 축적은 chromogranin 단백질 (~ 169 mg/mL)3,4,5의 구성 intravesicular 밀도 핵심 단백질을 카 테 콜 아민 분자에의 선호도 의해 수행 ,6, 그리고 ATP (125-300 m m)7, 캘리포니아2 + 등 기도 카 테 콜 아민 로드 및 저장을 위한 주요 구성 요소를 포함 하는 intravesicular 칵테일 솔루션 (솔루션 ~ 40 mM에서 50-100 µ M에 바인딩된는 단백질 매트릭스)8, Mg2 + (5mm)9, 하는데 (10-30 m m)10, 그리고 ~5.511,12의 pH. 비록 이론적인 용 질 농도 소포 안에 이상의 750 m m까지 합계는 LDCVs 세포 세포질 (310 mOsm/kg)13, iso 삼투성 조건을 유지 합니다. Intravesicular 부품의 구성만 로드 하 고 저장 용액의 집계 뿐만 아니라 catecholamines의 밀도 핵심 단백질 매트릭스에 필수적입니다. 이 현저히 감소 하는 소포의 osmolarity은 크게 감소 되 고 금액 카 테 콜 아민 exocytosis5,6중 출시에 영향을 미칠 수 있습니다.
그 높은 extracellular 삼투성 압력 exocytosis 활동을 억제 하 고 단일에서 분 비 하는 신경 전달 물질의 수를 감소 amperometric 기록에 의해 exocytosis 프로세스에 extracellular 삼투성 압력의 효과 대 한 연구 보고 기 구획4,14,15,,1617,18,19. 이 관측의 설명 셀 세포질의 억제 기 퓨전 이벤트에 막 생물 속성의 수에 영향을 미치는 변경 고분자 군집의 가능한 향상에 사색 신경 전달 물질 exocytosis 동안 발표입니다. 이러한 생각 생각 높은 extracellular 삼투성 스트레스 트리거된 exocytosis14, 의 이전 단계에서 소포에 저장 하는 신경 전달 물질 분자의 수를 정의 하는 소포 quantal 크기에는 영향을 미치지 않습니다. 15 , 17 , 19 , 20 , 21. 단일 셀에 exocytosis 릴리스의 amperometric 측정, 탄소 섬유 디스크 microelectrode 긴밀 한 접촉 냅 구성을 흉내 낸를 실험 세트를 만드는 세포 표면에에서 배치 됩니다 어디에 amperometric 전극 postsynaptic 검출기 (그림 1)22,23역할을 합니다. Exocytosis 세포를 자극 하 여 하나의 신경 전달 물질 채워진 소포 세포 원형질 막으로 융합 및 세포 외 공간으로 일부 또는 전체 소포 콘텐츠 릴리스를 유도할 수 있다. 경우는 신경 전달 물질 (예, catecholamines) electroactive Ag/AgCl 기준 전극의 700 mV 대 산화 환 원 잠재력을 적용 하 여 이러한 신경 전달 물질 분자는 전극의 표면에 화학적 검출 될 수 있다 . 따라서, 현재 스파이크의 일련 표시 개별 exocytosis 이벤트의 검출. Amperometric 녹음에서 시간 추적 대 전류에서 각 단일 amperometric 스파이크 밑 지역 충전 exocytosis 이벤트 당 감지 나타내고 발표, 패러데이 방정식을 사용 하 여 신경 전달 물질의 몰에 변환할 수 있습니다. 따라서, amperometric 녹음 단일 exocytosis 이벤트에서 추방 금액 신경 전달 물질에 정량적 인 정보를 제공 및 exocytosis 이벤트의 빈도에 보고 하지만 분 비 소포에 정량적 인 정보를 선물 하지 않는다 소포 융해 및 신경 전달 물질 방출 하기 전에 콘텐츠 시작 되었습니다.
따라서, 셀에 어떻게 분 비 소포의 더 나은 이해를 얻으려면 세포질 응답 extracellular 삼투성 긴장에 셀 exocytosis, 받아야 트리거되기 전에 다른 상호 보완적인 분석 방법을이 정보를 풍부 하 게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 조사 하기 위하여 삼투성 스트레스 소포 볼륨을 변경 하는 경우, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 분석 화학 고정 후 세포의 소포 크기를 측정 하 사용할 수 있습니다. 에 분 비 소포에서 소포 신경 전달 물질 콘텐츠의 정량화 삼투성 스트레스에 영향을 미치는 기 quantal 크기 검사, 세포내 전기 cytometry 이라는 최근에 개발 된 amperometric 기법을 적용할 수 있습니다 그들의 아직26라이브 세포 세포질에 거주 하는 경우 기본 상태입니다. 세포내 전기 cytometry 기술에서 nanotip 원통형 탄소 섬유 전극 부드럽게 삽입이 전극에 700 mV 잠재력을 적용 하 여, 그리고 라이브 세포의 세포질 (vs Ag/AgCl 전극 참조)는 소포에서 카 테 콜 아민 콘텐츠 단일 소포 충돌, adsorbing, 그리고 전극 표면에 파열 이후 확률론 및 그로 인하여 그들의 내용에 대 한 발표에서 산화 환 원 현재 스파이크의 탐지에 의해 정해질 수는 전극 표면26. 따라서, 시간 추적 대 현재 amperometric에 각 단일 소포 rupturing 이벤트 현재 과도 귀 착될 수 있다 하 고, 각 현재 스파이크의 영역을 통합 하 여 소포 quantal 크기 산출 될 수 있다 Faraday´s 법을 사용 하 여.
따라서 세포내 전기 cytometry 기준으로 기록 소포 quantal 크기 분석, 함께 가장 이미지를 사용 하 여 소포 크기 측정에서 얻은 정량적 인 정보를 연결 하 여 소포 신경 전달 물질 농도 또한 할 수 있다 결정 될. 이 셀은 다른 삼투성 조건에 노출 되 면 소포 특성을 허용 하 고 어떻게 소포는 응답할 exocytosis 이전 단계에서 세포 외 삼투성 스트레스에 더 나은 보기를 제공 합니다. 이러한 방법 결합에서 결과 나타났습니다 그 높은 삼투성 압력 extracellular 존재 소포 축소 하 고 그들의 quantal 크기 조정 보여줍니다 이러한 측정에서 상대적 변화에 정량적 인 정보를 비교 축소 하는 동안 소포 그들의 내용 및 크기는 일정 한 신경 전달 물질 농도24유지를 조정 합니다. 따라서,이 이해는 삼투성 스트레스에 노출 된 세포에서 신경 전달 물질 방출에는 관측에 연결에 유용 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 extracellular osmolality 그들의 네이티브 환경 대응에 어떻게 분 비 소포의 특성화 고는 exocytosis에이 응답의 효과 수 있는이 세 가지 보완 방법론의 사용 프로세스입니다. 우리의 이전 관측 효과 관한 exocytosis24에 높은 삼투성 압력의, 뿐만 아니라 삼투성 충격 및 chromaffin에 여러 바 륨 stimulations의 효과 후 세포 복구를 설명 하는 추가 실험 소개 셀입니다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>시그마 알드리치</td><td>M-2670</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마 알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche, 스웨덴</td><td>11 213 857 001</td><td></td></tr><tr><td>100-&마이크로; M 나일론 메쉬</td><td>Fisher Sientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1677</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV 코팅 60mm 플라스틱 접시</td><td>VWR</td><td>354416</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>셔터 기기 Co., Novato, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 풀러</td><td>Narishing Inc., 일본</td><td>PE-21</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 용액 (A 및 B)</td> <td>에폭시 기술, Billerica, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beveller</td><td>Narishing Inc.</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 기기</td><td>분자 장치, Sunnyvale, CA</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Burleigh Instrument Inc., USA</td><td>PCS-5000</td><td></td></tr><tr><td>부탄 화염</td><td>Multiflame AB, H&auml; sselholm, 스웨덴</td><td></td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Omega</td><td>Leo 912 AB</td><td></td></tr></tbody></table>

분 비 소포 및 exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Amperometry 셀 exocytosis 활동 및 단일 exocytosis 이벤트에 소포에서 발표 하는 신경 전달 물질의 양을 줄여이 물리적 스트레스에 응답 하는 분 비 세포는 삼투성 충격 쇼 대상의 기록. 그것은 추방 하는 신경 전달 물질의 감소 그 셀 축소 삼투성 스트레스에 대응에서 하 고 그 가정으로 분 비 소포 세포 세포질에 영향을 받지 않습니다 막 생물 속성에 변경 예정 이다 제안 되었습니다. 의해 세포 외 삼투성 긴장. Amperometry 녹음 exocytosis의 어떤 순간을 소포 플라즈마 막으로 퓨즈 하지만 소포 융해 트리거되기 전에 기 내용에 정보를 제공 하지 않습니다 세포에서 출시 모니터링 합니다. 따라서, amperometry를 결합 하 여 세포 exocytosis 트리거되기 전에 분 비 소포를 특성화 할 수 있다 다른 보완 분석 방법으로 녹음 어떻게 분 비 소포 검사에 대 한 광범위 한 개요를 제공 하 고는 exocytosis 프로세스 삼투성 충격에 의해 영향을 받습니다. 우리는 여기 amperometry 세포내 전기 cytometry 및 전송 전자 현미경 (TEM) 영상 기록 보완 사용 하는 방법을에 분 비 소포 크기와 신경 전달 물질 콘텐츠 변경 하 설명 삼투성 스트레스에 노출 전후 exocytosis 활동에 관하여 chromaffin 세포. 모든 세 가지 분석 방법을 사용 하 여 실험에서 얻은 정량적 인 정보를 연결 하 여 결론 이전에 수행 된 분 비 소포 크기에서 긴축 하 고 소포 quantal 크기를 감소 하 여 세포 외 삼투성 긴장에 응답 일정 한 소포 신경 전달 물질 농도 유지 합니다. 따라서,이 왜 삼투성 스트레스에 대 한 응답에 소포 exocytosis 릴리스 동안 발표 금액 신경 전달 물질 감소에 관한 몇 가지 설명을 제공 합니다. Amperometric 녹음 여기 이것은 가역 과정과 그 기 후 배치 셀 isotonic 환경으로 되돌려 때 삼투성 충격 신경 전달 물질과 리필 됩니다 나타냅니다.

우리 여기 어떻게 상승의 효과에 암시는 광범위 한 보기는 정보를 제공할 수 두 전기 방법론, 탄소 섬유 amperometry와 세포내 전기 cytometry 함께 가장 영상 결합 프로토콜 설명 분 비 소포 및 exocytosis 프로세스에 extracellular 삼투성 압력. 비교 실험 설정 ( 그림1에서 참조)를 사용 하 여 단일 chromaffin 세포 exocytosis 릴리스의 대표 amperometric 녹음, exocytotic 활동에 있는 뜻깊은 감소 했다 표시 셀 삼투성에 노출 됐다 isotonic 조건 셀에 비해 스트레스 (그림 2A)24. 이 녹음에서와 Faraday´s 법을 사용 하 여, 총에 의해 감지 각 개별 amperometric 현재 스파이크 셀에 서로 다른 노출에서 단일 기 exocytosis 이벤트에서 추방 하는 분자의 수를 계산 하는 데 사용 되었...

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

이 결합된 분석 방법론의 전반적인 목표는 세포의 분비 소포가 세포 외 삼투압과 같은 물리적 힘에 어떻게 반응하는지, 그리고 이러한 세포 소기관의 조정이 세포외이입 과정에 어떤 영향을 미치는지에 대한 정보를 제공하는 것입니다. 이 방법은 분비 소포가 세포 외 환경의 변화나 약물 치료에 어떻게 직접 반응하는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 살아있는 세포의 소포 함량에 대한 직접적인 영향을 모니터링하고 엑소사이토시스를 치료하기 전과 후의 reh-chemical-ed 방출의 변화를 구별하는 것입니다.평평한 디스크 전극 표면을 얻으려면 전극을 마이크로 그라인더의 홀더에 놓고 각 탄소 섬유 전극을 45도 각도로 경사지게 만듭니다. 그런 다음, 세포외이입 측정을 위해 세포 근처에 전극을 배치할 때 디스크 전극 표면을 45도 각도로 배치하는 방법에 대한 향후 참조를 위해 모세관을 표시합니다. 단일 세포에서 전류 측정 기록을 수행하려면 포텐시오 스타트와 함께 사용되는 헤드 스테이지의 전극 홀더에 새로 베벨 및 테스트된 탄소 섬유 디스크 미세 전극을 장착합니다.사용하기 전에 각 탄소 섬유 미세 전극을 테스트 용액에 넣고 순환 전압 전류계를 사용하여 연구 상태 전류를 모니터링합니다. 순환 전압주사법 스캔의 경우, 양호한 반응 역학을 보장하기 위해 초당 100밀리볼트의 속도로 은-은 염화물 기준 전극에 대해 음의 0.2볼트에서 양의 0.8볼트까지의 삼각 전위 파형을 적용합니다. 엑세포작용(exocytosis)의 암페로메트리 기록을 위해 배양된 크로마핀 세포와 함께 페트리 접시를 패러데이 케이지의 도립 현미경에 등장성 완충액에 놓습니다.현미경 가열 스테이지를 사용하여 세포 실험 중에 섭씨 37도의 온도를 유지합니다. 다음으로, 저잡음 패치 클램프 기기를 사용하여 작업 전극에 양의 700밀리볼트의 일정한 전위를 적용합니다. 크로마핀 세포의 엑소사이토시스를 기록하려면 10킬로헤르츠에서 신호를 디지털화하고 2킬로헤르츠에서 내부 저역 통과 베셀 필터를 적용하여 기록된 신호를 필터링합니다.타원형 디스크 전극은 셀 위에 평평하게 배치하고 페트리 접시 표면과 평행하게 배치해야 합니다. 또한 전극은 깨끗한 전극 표면을 보장하기 위해 실험과 같은 날 베벨 처리됩니다. 세포 엑소사이토시스(exocytosis)를 자극하기 위해, 5밀리몰 염화바륨 용액으로 채워진 유리 마이크로피펫을 세포에서 최소 20마이크로미터 떨어진 곳에 배치합니다.그런 다음 세포 표면에 5밀리몰 염화바륨 용액을 5초 동안 주입하여 세포 엑소사이토시스를 자극합니다. 줄기 피펫을 용액에 넣고 바륨 주입 펄스를 가하여 세포 엑소사이토시스를 자극하는 동시에 약 3분 동안 전류 과도 전류를 기록합니다. 등장성 조건과 긴장성 조건에서의 외세포반응(exocytotic response)을 비교하기 위해, 긴장성 완충 용액에서 세포를 10분 동안 배양합니다.그런 다음 바륨 주입 펄스를 적용하여 엑소사이토시스를 자극하고 3분 동안 전류 측정 기록을 수행합니다. 세포의 가역적 반응을 위해 등장성 완충 용액에서 세포를 10분 동안 다시 배양합니다. 바륨 주입 펄스를 적용하여 세포를 자극하고 외세포성 반응을 3분 동안 기록합니다.소포 양자 크기 측정을 위한 전극을 제작하려면 직경이 5마이크로미터인 탄소 섬유 전극을 준비합니다. 현미경으로 메스를 사용하여 유리 끝에서 뻗어있는 탄소 섬유를 잘라 30-100 마이크로 미터 만 남도록합니다. 부탄 화염을 사용하여 탄소 섬유 전극의 화염 에칭 팁을 준비합니다.균일하게 에칭된 원통형 전극 팁을 얻으려면 원통형 탄소 섬유 전극을 회전시키면서 잡습니다. 그리고 유리에서 뻗어 나온 탄소 섬유를 탄소 끝이 붉은색이 될 때까지 부탄 불꽃의 파란색 가장자리에 놓습니다. 화염 에칭 후 전극을 현미경 아래에 놓고 전극 팁을 평가합니다.에칭된 전극 팁 크기는 직경이 약 50-100나노미터여야 합니다. 다음으로, 원통형 나노팁 미세전극을 에폭시 용액에 3분 동안 삽입한 다음 전극 팁을 아세톤 용액에 15초 동안 담궈냅니다. 이를 통해 에폭시는 탄소 섬유와 절연 가스 모세관 벽 사이의 잠재적인 갭 공간을 밀봉할 수 있습니다.아세톤은 에칭된 탄소 섬유 전극 표면에서 에폭시를 제거합니다. 에폭시를 경화시키려면 전극을 섭씨 100도의 오븐에서 밤새 굽습니다. 사용하기 전에 순환 전압전류법을 사용하여 각 탄소 섬유 미세 전극의 정상 상태 전류를 테스트하십시오.실험의 경우 약 1.5-2.5 나노 암페어의 안정 전류를 표시하는 전극 만 사용하십시오. 세포 내 전류 측정 방법의 경우, 세포를 현미경 아래에 놓고 potentiostat와 동일한 실험 설정을 사용합니다. 세포에 대한 심각한 물리적 손상을 방지합니다.부드러운 기계적 힘을 가하여 나노팁 원통형 미세 전극을 셀에 삽입합니다. micromanipulator를 사용하여 전극을 세포 원형질막을 통해 세포 세포질로 밀어 넣을 수 있을 정도입니다. 삽입 후 원통형 전극 주위에 세포막을 밀봉한 상태에서 라이브 셀에서 현장 전류 측정 기록을 시작합니다.전극에 적용된 산화 전위에서 소포는 전극 표면에 흡착되어 확률적으로 파열됩니다. 따라서 이 과정을 시작하기 위해 어떤 종류의 자극도 필요하지 않습니다. 소포 양자 크기에 대한 삼투압 효과를 측정하려면 실험 조건을 사용하여 등장성 및 고긴장성 완충액에서 배양된 세포 그룹에서 세포 내 세포 분석 측정값을 수집합니다.세포외삼투압(extracellular osmolality)이 세포외세포작용(exocytosis) 활성에 미치는 영향은 염색체(chromaffin cell)가 바륨 용액으로 isotonic(등장성), hypertonenic(긴장성), 그리고 최종적으로 isotonic 조건에서 자극될 때 exocytosis(외세포작용) 발생의 빈도로 제시됩니다. 이 데이터는 삼투압 스트레스를 경험하는 세포에서 엑소사이토시스 활성이 억제되고 세포가 등장성 환경으로 돌아간 후 부분적인 회복이 달성될 수 있음을 보여줍니다. 대조군 실험은 등장성 조건의 크로마핀 세포에서 3회 연속 바륨 자극 후 엑소사이토시스 이벤트의 빈도를 보여줍니다.이는 이러한 실험에 사용된 시간 프레임 내에서 여러 번의 바륨 자극이 연속적인 세포 자극에 의한 엑소사이토시스 활성의 감소를 유발하고 있음을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분비 소포체와 외포작용 과정이 세포 외 환경의 변화에 의해 어떻게 영향을 받는지 비교할 수 있는 이러한 무료 분석 방법을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

monitoring-effect-osmotic-stress-on-secretory-vesicles

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

우리는 지역화 된 칼슘 이온 기울기를 사용 하 여 소포의 비접촉 식 micromanipulation 위한 기술 제시. 주변에 거 대 한 지질 기 칼슘 이온 솔루션의 microinjection는 막 관 돌출의 생산의 결과로 지질 막 개장 하기 위하여 이용 된다.

막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

여기 우리는 규제 exocytosis의 라이브 셀 이미징 방법 선발. 이 메서드는 기자로 서 FITC-dextran, 리소좀과 관련 된 세포에 축적을 활용 합니다. 이 간단한 메서드는 또한 유전자 조작 하기 어려운 셀에 규제 exocytosis의 다른 모드 사이 구별 수 있습니다.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.

마이크로 패턴 세포에서 세포 외세포증의 주당 측량 파라미터를 정량화

pH 에 민감한 형광 프로브로 표시된 외식 이벤트를 감지하기 위해 자동화된 컴퓨터 비전 소프트웨어를 개발했습니다. 여기서는 그래픽 사용자 인터페이스와 RStudio를 사용하여 융합 이벤트를 감지하고, 융합의 현면 파라미터를 분석하고 표시하며, 이벤트를 고유한 융합 모드로 분류합니다.

엑소시토시스의 자동 검출 및 분석

내재적 무질서 영역(IDR)은 환경 변화에 대응하여 형태를 수정하는 유연한 단백질 도메인입니다. 앙상블 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 다양한 조건에서 단백질 치수를 추정할 수 있습니다. 우리는 고삼투압 스트레스 하에서 살아있는 맥주효모균 세레비지애 세포의 IDR 구조적 민감도를 평가하기 위한 FRET 접근법을 제시합니다.

FRET를 사용한 살아있는 세포의 고삼투압 스트레스에 대한 반응으로 본질적으로 무질서한 영역의 구조적 민감도 추정

이 프로토콜은 수동 endolysomal patch-clamp system을 사용하여 세포 내 소포의 이온 채널 활성을 직접 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 엔도리소좀(endolysosome)을 확대하고 이러한 소포를 수동으로 분리하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 절차를 정확하게 복제하고 적용할 수 있습니다.

단일 Endolysosomal 소포 분석을 위한 Patch-Clamp 기법

이 문서는 뇌의 노화 및 알츠하이머 질환 같은 나이와 관련된 neurodegenerative 질병와 관련된 시냅스 변경의 연구를위한 유전자 변형 쥐 및 생쥐에서 hippocampal 조각 준비 절차를 설명합니다.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

배우세요 삼투성 스트레스가 chromaffin 세포의 분비 소포 및 exocytosis에 미치는 영향을 전기화학적 방법과 투과전자현미경으로 실시간 모니터링하는 방법을. 이 기법은 신경과학 연구에서 소포 역학과 신경전달물질 방출 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.

분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

더 많은 동영상 탐색