הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז
September 10th, 2020
הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.
הפרוטוקול שלנו מאפשר לזהות ולנתח אינטראקציות בין חלבונים טרנסממברניים מרובים של הרטיקולום האנדופלזמי וקומפלקס גולגי בתאים חיים ברמות ביטוי נמוכות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרגישות המיוחדת, המאפשרת להימנע מרמות ביטוי יתר גבוהות שלעתים קרובות מזיקות לבריאות התא ועלולות להפריע ללוקליזציה התת-תאית של החלבון. קצרו את תרבית תאי ה-T HEK293 על ידי טריפסיניזציה והשעו מחדש את התאים במצע גידול מלא ייעודי.
צלחת את התאים על צלחת תחתית שקופה, צד לבן 96 בארות. התאימו את המספר הכולל של הבארות כך שיתאימו לכל השילובים והבקרות שנבדקו, כולל שכפולים. לאחר מכן, תרבית התאים למשך הלילה בתנאים סטנדרטיים.
למחרת, העבירו את התאים עם השילובים הרצויים של פלסמידים לביטוי. מדללים את הפלסמידים במדיום נטול סרום ל-6.25 ננוגרם למיקרוליטר עבור כל מבנה ומוסיפים את מגיב הטרנספקציה מבוסס השומנים. הוסף יחס שומנים ל-DNA מתאים.
דגרו את הפלסמידים לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, הוסף שמונה מיקרוליטרים מתערובת ה-DNA השומני לבארות המיועדות לכך. מערבבים את תכולת הצלחת בסיבוב עדין ומתרביים את התאים למשך 20, 24 שעות בתנאים סטנדרטיים.
למחרת, החלף את המדיום המותנה בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום, וודא שהתאים לא יתנתקו בעת החלפת המדיום. רגע לפני מדידת הזוהר, ערבבו נפח אחד של פורימזין עם 19 נפחים של מאגר דילול. הוסף 25 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של הפורימזין לכל באר, וערבב בעדינות את הצלחת ביד או עם שייקר מסלולי.
הכנס את הצלחת לקורא מיקרו צלחות זוהר ויזן את הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס למשך 10 15 דקות. בחר את הבארות לניתוח וקרא זוהר עם זמן אינטגרציה של 0.3 שניות. המשך לעקוב אחר הזוהר עד שעתיים בעת הצורך.
פרוטוקול זה נבדק על שני מובילי סוכר נוקלאוטידים, SLC35A2 ו-SLC35A3, שהם חלבוני ממברנה מסוג שלושה תושבים גולגי עם טרמיני N ו-C הפונים לציטופלזמה. היו שמונה אפשרויות תיוג אפשריות וניתן היה להגדיר את חלבוני ההיתוך שהתקבלו בשמונה דרכים אפשריות. יחידות זוהר יחסיות ממוצעות או ערכי RLU המתאימים לכל שילובי הבקרה שנבדקו מוצגים כאן.
ערכי ה-RLU שהתקבלו עבור שלושה מהשילובים היו גבוהים משמעותית מאלה שהתקבלו עבור שילוב הבקרה המקביל. כדי להשיג ערכי יחס עבור שילובי העניין, ערכי ה-RLU חולקו בערכי ה-RLU שהתקבלו עבור הבקרות המתאימות. יחסים בין 10 ל-1000 מעידים מאוד על אינטראקציות ספציפיות.
היו שני שילובים כאלה שתמכו ברעיון ש-SLC35A2 ו-SLC35A3 מתקשרים. כדי לאשר נתונים אלה, SLC35A2 או SLC35A3 מתויגים HA באו לידי ביטוי במשותף עם השילוב שהביא לזוהר היחסי הגבוה ביותר. כמויות משתנות של הפלסמידים וגרסאות NST מתויגות HA מקודדות שימשו לטרנספקציה משותפת, וכתוצאה מכך ירידה תלוית מינון מובהקת סטטיסטית בערכי RLU.
הדבר הקריטי ביותר הוא להתמודד עם האינטרס העצמי של החלבון שלך בכל הדרכים האפשריות ולבחון את כל השילוב האפשרי, מכיוון שאוריינטציה מסוימת של תיוג עלולה לייצר תוצאות שליליות כוזבות. לאחר שנבחר השילוב בעל הביצועים הטובים ביותר, ניתן לנטר את הדינמיקה של האינטראקציה המתאימה, למשל לזהות סוכנים או תנאים המשבשים את מכלול העניין שלך לאורך זמן.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
הפרוטוקול הזה מדגים את התרחשות האינטראקציות ההטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III תושבי הגולגי עם סופים חשופים בציטופלזמה בתאים יונקים חיים באמצעות מבחן השלמה של לוסריאז מפוצל רגיש. הוא מאפשר זיהוי אינטראקציות ברמות ביטוי נמוכות, תוך צמצום הפרעות לבריאות התא.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- ביולוגיה תאית
- אינטראקציות חלבונים
- ביולוגיה של קרום
רקע
- התמקדות באינטראקציות בין חלבוני קרום רב-טרנסממברניים.
- מטרה להעריך אינטראקציות חלבוניות ללא השפעות מזיקות של ביטוי יתר.
- שימוש במתחם הגולגי וברשתית התוך-פלזמית כמערכות ביולוגיות.
שיטות בשימוש
- מבחן השלמה של לוסריאז מפוצל
- תרבית תאי HEK293 T אנושית
- טרנספקציה של פלסמידים לביטוי
תוצאות עיקריות
- זיהוי אינטראקציות משמעותיות בין SLC35A2 ו-SLC35A3.
- ערכי RLU הצביעו על אינטראקציות ספציפיות, עם יחסים בין 10 ל-1000 המרמזים על אינטראקציות חזקות.
- מאשר אינטראקציות באמצעות ביטוי משותף עם תג HA ומבחני תלות במינון.
מסקנות
- המחקר מבהיר בהצלחה את האינטראקציות של חלבוני קרום בתאים חיים.
- הוא מספק שיטה חשובה לחקר יחסי חלבונים בביולוגיה תאית.
