Name: 발목-거골하 복합 관절 불안정성의 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 발목-거골하 복합 관절 불안정성의 마우스 모델을 이용한 정형외학 연구 방법입니다. 인대 절단술과 보행 분석을 통해 임상 발 질환의 진단 및 치료 전략을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 장쑤성 정부 장학금 프로그램과 장쑤성 고등 교육 기관(PAPD)의 우선 학술 프로그램 개발의 지원을 받았습니다.

모든 동물 연구는 실험동물의 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 Soochow University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 수술 절차
<ol><li>생후 6주 된 C57BL/6 수컷 마우스 21마리를 횡경부 인대 및 전방 거골 인대 그룹, 횡경부 인대 및 삼각근 인대 그룹, 가짜 수술 그룹의 세 그룹으로 나눕니다. 모든 마우스가 특정 병원균 프리(SPF) 표준을 충족하는 환경에서 사육되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>실험 전 2주 동안 마우스를 새로운 사육 환경(12시간/12시간의 밝음/어둠 주기, 각각 18-22°C 및 40%-70%의 일정한 온도 및 습도)에 적응시킵니다. 실험 1주일 전에 생쥐에게 균형 빔 또는 U자형 파이프의 한쪽 끝에서 멈추지 않고 다른 쪽 끝으로 이동하면서 균형 빔과 보행 훈련을 실시합니다.</li>
	<li>생후 8주가 되면 이소플루란 2mL의 면봉을 적셔 이소플루란 흡입을 사용하여 쥐를 마취하고 완전 휘발을 위해 밀폐 용기에 넣습니다. 마우스의 활동을 모니터링하고 마우스의 활동이 현저히 줄어들 때까지 계속 흡입합니다. 쥐의 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 결정하여 반응을 관찰합니다. 후속 수술 중에 마우스의 마취를 유지하기 위해 안면 마스크를 통해 기화된 이소플루란(2%)을 흡입합니다. 마취 중 동물용 눈 연고를 사용하여 눈이 건조해지는 것을 방지하십시오.</li>
	<li>마취 후 면도기로 쥐의 오른쪽 뒷다리 발목 관절에 있는 털을 제거하고 노출된 피부를 요오드 면봉과 알코올 면봉을 번갈아 가며 3회 소독합니다. 5mg/kg의 카프로펜을 피하주사로 투여한다. 멸균 수술 패드를 사용하여 마우스를 미세 수술 동물 수술실로 옮깁니다.</li>
	<li>횡경 인대와 전방 거골 인대(CL + ATFL) 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절 위 피부에 메스로 7mm 비스듬한 아래쪽 세로 절개를 하고 발목 관절 앞쪽에 미세한 직선 집게로 프로브합니다.</li>
	<li>탐침 후 거골 몸체와 비골의 아래쪽 경계에 ATFL이 노출되도록 하고 메스로 부드럽게 자릅니다. 장섬유힘줄과 단비골힘줄, 신전근 장힘줄을 분리하고 CL을 노출시켜 메스로 자른다.</li>
	<li>횡 CL + 삼각인대 (DL) 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절의 내측 피부를 8mm 수직으로 절개하고 DL과 내측 연골을 뭉툭하게 분리하여 최종적으로 절단합니다. 그런 다음 1.5단계에서 설명한 대로 CL을 자릅니다.</li>
	<li>가짜 그룹(가짜 수술 그룹)의 경우 오른쪽 발목 관절에 가짜 수술을 하되 인대를 자르지 마십시오.</li>
	<li>멸균 생리식염수로 절개 부위를 씻어내고 5-0 수술용 나일론 실로 봉합합니다. 마지막으로 봉합된 절개 부위를 요오드 면봉으로 소독합니다.</li>
	<li>흉골 누움을 유지할 수 있을 때까지 쥐를 관찰하고 완전히 의식이 있을 때까지 감독하십시오. 발목 절개 부위는 요오드 면봉으로 하루 2회 소독하고 카프로펜(5mg/kg, 피하주사제)을 1주일 1일 1회 투여한다. 수술 후 혼자 뒤로 물러나 마우스의 수술 후 상태에 세심한 주의를 기울이십시오.</li>
	<li>수술 후 2주가 지나고 발목 관절 부종이 가라앉으면 마우스 회전식 피로 기계에서 매일 1시간 동안 마우스 운동을 시작합니다.</li>
</ol>2. 밸런스 빔 테스트
<ol><li>Clamp 길이 1m, 직경 20mm의 원형 나무 빔을 사진 삼각대 클립으로 한쪽 끝이 15° 기울어지고 다른 쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결된 작업 표면에 놓습니다.</li>
	<li>수술 1주일 전에 균형 빔 훈련을 수행하여 마우스가 빔의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 이동할 수 있도록 합니다. 마우스가 멈추지 않고 60초 동안 빔을 두 번 통과할 때 테스트를 통과한 것으로 간주합니다.</li>
	<li>각 마우스에 대해 두 번의 연속 시도를 수행하고 각 시도 후 밸런스 빔에 75% 알코올을 분사하여 이전 마우스의 잔여 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 합니다.</li>
	<li>수술 전 3일, 1주, 4주, 8주, 수술 후 12주에 밸런스빔 검사를 시행합니다. 각 마우스가 밸런스 빔을 연속으로 두 번 통과하는 평균 시간과 오른쪽 뒷발이 빔에서 미끄러지는 횟수를 종속 변수로 기록합니다.</li>
</ol>3. 발자국 분석
<ol><li>길이 50cm, 너비 10cm, 높이 10cm의 U자형 플라스틱 채널을 실험 테이블에 놓고 플라스틱 채널의 한쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결합니다.</li>
	<li>일반 안료 용지를 채널에 평평하게 놓은 다음 양손으로 마우스를 잡고 무독성 빨간색과 녹색 안료로 앞발과 뒷발을 고르게 칠합니다.</li>
	<li>페인트 칠한 마우스를 채널의 한쪽 끝에 부드럽게 놓고 카세트의 다른 쪽 끝으로 이동시킵니다. 발자국이 있는 착색지를 꺼내 표시한 다음 선반에 올려 통풍이 잘되고 그늘진 곳에서 말립니다.</li>
	<li>각 마우스가 지나간 후 U자형 플라스틱 채널에 75% 알코올을 뿌려 이전 마우스의 잔여 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 합니다.</li>
	<li>각 용지에서 세 개의 연속된 투명 마우스 발자국을 선택하고 자를 사용하여 마우스 오른쪽 발자국의 계단 길이와 왼쪽 발자국과 오른쪽 발자국 사이의 계단 너비를 측정합니다.</li>
</ol>4. 열 통각 평가
<ol><li>실험하는 동안 발바닥 테스트를 사용하여 쥐 발의 열 통각 반응 시간과 활동 및 휴식 중 쥐의 반응 시간을 각각 기록합니다. 측정 데이터를 몇 초 만에 기록합니다.</li>
	<li>마우스를 측정기에 놓고 기기를 오른발에 맞춘 다음 온도가 천천히 상승하면서 기기를 가열하기 시작합니다. 마우스의 반응을 관찰합니다. 온도가 허용 오차 이상으로 올라가면 마우스는 오른발을 빠르게 빼거나 핥습니다. 기기를 사용하여 시간을 기록하고 시간을 활동 중 반응 시간으로 정의합니다.</li>
	<li>정지 시 반응 시간을 측정하려면 가열하지 않고 마우스를 나머지 테이블에 30분 동안 앉힌 다음 4.2단계에서 설명한 대로 시간 데이터를 얻습니다. 이렇게 획득한 시계열 데이터를 후속 분석에 사용합니다.</li>
</ol>5. Micro-CT 스캔
<ol><li>수술 후 12주 된 쥐를 이산화탄소로 안락사시키고 오른쪽 발목의 피부를 벗겨낸 다음 수술용 가위로 중간 경골과 비골을 잘라 완전한 발목 표본을 얻습니다. 10% 중성 포르말린이 포함된 표시된 15mL 원심분리 튜브에 검체를 48시간 동안 넣습니다.</li>
	<li>고정 후 micro-CT 스캔을 위해 표본을 배치(배치당 4개의 표본)로 특수 스폰지 탱크에 넣습니다. 기계 매개변수를 전압 = 50kV, 전류 = 200mA, 필터 = 0.5mmAl, 분해능 = 9μm로 설정합니다. micro-CT 스캐너를 실행합니다.</li>
	<li>스캔 후 재구성 소프트웨어를 사용하여 이미지의 범위를 묘사하고 Liu et al.10에 설명된 대로 상용 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 묘사된 이미지의 XYZ 축을 조정한 후 특정 각도 위치를 선택합니다.</li>
	<li>Liu et al.10에 설명된 대로 마이크로 CT 분석 소프트웨어를 사용하여 XYZ 축에 의해 조정된 재구성된 이미지에서 연속적인 10층 관심 영역을 선택하고 필요한 관절을 정량적으로 분석하여 골부피 분율(BV/TV)을 결정합니다.</li>
	<li>마지막으로, Liu et al.10에 설명된 대로 3차원 의료 영상 처리 소프트웨어를 사용하여 마우스 발목 관절의 3차원 CT 영상 처리를 수행합니다. 재건 후 ASCJ에서 골사상물의 마모 및 형성을 관찰합니다.</li>
</ol>6. 관절 연골의 단면 염색
알림: 모든 염색 단계는 흄 후드에서 수행되며 절차 중에는 마스크를 착용합니다.
<ol><li>미세한 핀셋과 가위를 사용하여 발목 검체 주변의 과도한 연조직을 제거한 다음 NaOH 10g, PBS 2팩 및 EDTA-2Na 400g으로 준비된 2% EDTA 석회질 제거 용액이 포함된 원심분리기 튜브에 검체를 넣고 pH를 염산으로 7.35-7.45로 조정하고 다른 그룹을 표시합니다.</li>
	<li>그런 다음 석회질 제거를 위해 원심분리기 튜브를 쉐이킹 테이블(속도 20rpm으로 설정)에 놓고 하루에 한 번 석회질 제거 용액을 교체합니다. 표본의 석회질 제거를 결정합니다.</li>
	<li>석회질 제거 1개월 후 그래디언트 알코올로 표본을 탈수한 다음 투명화 목적으로 n-부탄올을 8시간 동안 사용합니다. 마지막으로, 세척된 표본을 임베딩을 위해 코로나 위치에 파라핀에 담그십시오.</li>
	<li>나중에 사용할 수 있도록 파라핀 표본을 4°C 냉장고에 넣습니다. 절단하기 전에 4°C 냉장고에서 시편을 꺼내 -20°C 냉동고에 약 10분 동안 넣어 전체 평면을 쉽게 절단할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로톰에 표본을 고정하고 6μm 두께로 절단합니다. 동시에 현미경을 사용하여 샘플이 주사기 바늘이 뼈 조직에 쉽게 침투할 수 있는 예상 수준으로 절단되었는지 관찰합니다.</li>
	<li>태블릿 기계의 수온을 미리 40°C로 조정하십시오. 그런 다음 2-3개의 완전한 파라핀 섹션을 연속으로 자르고 완전히 확장되도록 태블릿 기계로 옮깁니다. 그런 다음 유리 슬라이드로 파라핀 부분을 제거하고 물을 배출합니다. 마지막으로 슬라이드를 그룹과 숫자로 표시합니다.</li>
</ol>7. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
<ol><li>현미경으로 온전한 ASCJ 접합 구조를 관찰할 수 있는 방식으로 절편을 60°C 인큐베이터에 넣고 40-50분 동안 절편을 굽습니다. 그런 다음 쉽게 식별할 수 있도록 I, II 및 III로 번호가 매겨진 크실렌 3x로 섹션을 각각 15분, 15분 및 10분 동안 왁스를 제거합니다.</li>
	<li>쉽게 식별할 수 있도록 I 및 II로 번호가 매겨진 100% 에탄올 2x, 90% 에탄올 및 80% 에탄올을 각각 3분, 3분, 5분 및 5분 동안 넣습니다. 다음으로 이중 증류수(ddH2O)로 섹션을 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>헤마톡실린을 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 ddH2O로 절편을 씻습니다. 섹션을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 ddH2O로 1분 동안 3번 세척합니다. 그 후, 1 % 암모니아 용액으로 1 분 동안 섹션을 염색 한 다음 ddH2O로 각각 1 분 동안 3 번 세척합니다.</li>
	<li>다음으로, 샘플을 에오신 염색 용액으로 1분 동안 염색한 다음 95% 에탄올과 100% 에탄올에 각각 1분 동안 연속적으로 넣습니다. 마지막으로 절편을 크실렌 IV로 1분 동안 처리합니다.</li>
	<li>섹션을 자연 건조하고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙이고 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 명시야에서 5x 및 20x로 이미지를 촬영합니다.</li>
</ol>8. 사프라닌 O-fast 녹색 염색
<ol><li>선택한 섹션을 60°C 인큐베이터에 넣고 40-50분 동안 굽습니다. 그런 다음 크실렌 I, II 및 III로 섹션을 각각 15분, 15분, 10분 동안 왁스를 제거합니다.</li>
	<li>탈랍된 부분을 100% 에탄올 I, II, 90% 에탄올 및 80% 에탄올에 각각 3분, 3분, 5분 및 5분 동안 넣습니다. 그런 다음 ddH2O로 섹션을 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>헤마톡실린을 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 ddH2O로 절편을 씻습니다. 섹션을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 ddH2O로 1분 동안 3번 세척합니다. 그런 다음 1 % 암모니아 용액으로 1 분 동안 섹션을 염색하고 ddH2O로 각각 1 분 동안 3 번 세척합니다.</li>
	<li>절편을 0.05% 빠른 녹색에 2분 동안 담근 다음 절편을 1% 아세트산 용액에 30초 동안 담그고 0.1% 사프라닌에 5분 동안 담근다. 염색된 샘플을 95% 에탄올과 100% 에탄올에 1분 동안 차례로 넣습니다.</li>
	<li>마지막으로 절편을 크실렌 IV로 1분 동안 처리합니다. 섹션을 자연 건조하고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙이고 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 명시야에서 5x 및 20x로 이미지를 촬영합니다.</li>
</ol>9. 면역조직화학
<ol><li>1일차: 선택한 섹션을 60°C 인큐베이터에 넣고 섹션을 40-50분 동안 구운 다음 각각 15분, 15분, 10분 동안 크실렌 I, II 및 III으로 왁스를 제거합니다. 탈랍된 부분을 100% 에탄올 I, II, 90% 에탄올 및 80% 에탄올에 각각 3분, 3분, 5분 및 5분 동안 넣습니다. 그런 다음 ddH2O로 절편을 5분 동안 세척하고 조직화학 펜을 사용하여 검체 영역을 동그라미로 표시한 다음 어두운 상자에 넣습니다.</li>
	<li>항원 회수: 0.25% 트립신 20-50μL를 원으로 표시된 검체 영역에 떨어뜨리고 37°C 인큐베이터에서 60분 동안 배양한 다음 PBS로 검체를 각각 2분 동안 3회 세척합니다. 3 % H 2 O 2 를 첨가하여 내인성 과산화 효소를 차단하고 어두운 곳에서 실온에서 10 분 동안 표본을 배양 한 다음 PBS로 각각2분 동안 3 회 세척합니다. 염소 혈청 10%를 실온에서 20분 동안 첨가하여 혈청 차단을 수행한 후 1차 항체(마우스 항마우스 II형 콜라겐, 1,000배 희석)를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>2일차: 실온에서 30분 동안 섹션을 다시 데웁니다. 1차 항체를 회수하고 PBS로 절편을 각각 2분 동안 3회 세척합니다. 37°C의 인큐베이터에서 2차 항체로 40분 동안 배양한 후 PBS로 절편을 각각 2분 동안 3회 세척합니다.</li>
	<li>DAB 발색: ddH2O 5mL, 완충액 2방울, DAB 4방울 및H2O22방울을 첨가하여 DAB 시약을 준비합니다. 절편에 20-50 μL의 시약을 첨가하고, 샘플을 5분 동안 빛으로부터 보호한 다음, ddH 2 O로 절편을2분 동안 세척합니다.</li>
	<li>헤마톡실린을 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 ddH2O로 절편을 씻습니다. 단면을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 ddH2O로 각각 1분 동안 3번 세척합니다. 1% 암모니아 용액으로 단면을 1분 동안 염색한 다음 ddH2O로 각각 1분 동안 3번 세척합니다.</li>
	<li>다음으로, 섹션을 각각 95% 에탄올과 100% 에탄올에 각각 1분 동안 넣습니다. 마지막으로 절편을 크실렌 IV로 1분 동안 배양합니다. 섹션을 자연 건조하고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙이고 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 명시야에서 5x 및 20x로 이미지를 촬영합니다.</li>
</ol>

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<li>Pritzker, K. P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+cartilage+histopathology%3A+Grading+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).</li>
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<li>Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Guderian, S., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ankle+sprain+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%26+Science+in+Sports+%26+Exercise%22%5BJournal%5D)">Acute ankle sprain in a mouse model.</a> Medicine & Science in Sports & Exercise. 45 (8), 1623-1628 (2013).</li>
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</ol>

저자 중 누구도 상충되는 이해관계를 가지고 있지 않습니다.

이 연구에서는 CL + ATFL 또는 CL + DL을 transecting하여 ASCJ 불안정성의 두 마우스 모델을 성공적으로 구축했습니다. 마우스가 밸런스 빔을 통과하는 시간은 수술 후 8 주 및 12 주에 크게 증가했으며, 이는 Hubbard-Turner 팀이 발목 관절의 측면 인대를 절단하여 얻은 결과와 유사합니다23,24. 오른발 슬라이딩 테스트에서 인대가 절단된 두 그룹의 쥐의 슬라이딩 시간이 가짜 그룹의 마우스보다 유의하게 높았고, 수술 후 12주에 슬라이딩 시간이 최대에 도달하여 인대가 절단된 두 그룹의 마우스가 ASCJ의 불안정성으로 고통받았을 수 있음을 시사했습니다. 보행 테스트 결과, 마우스의 보행 길이는 나이가 들면서 점차 증가했지만, 인대가 절단된 두 그룹의 마우스의 12주 보행 길이는 가짜 그룹보다 낮았고, CL+ATFL 그룹의 보행 길이는 가짜 그룹보다 7.2% 짧았다. 종합하면, 위의 결과는 인대 ...

발목 염좌는 전 세계적으로 가장 흔한 스포츠 부상 중 하나입니다. 미국에서는 매일 10,000명이 부상을 입는 것으로 추정되며1 그 중 스포츠 관련 부상이 15%-45%2를 차지합니다. 미국에서 발목 염좌 치료와 관련된 의료 비용은 연간 42억 달러에 달합니다 3,4,5. 만성 발 불안정은 발목 염좌 후 흔히 발생하는 문제로, 발목 염좌의 약 74%에서 발생하며, 발목 또는 거골하 불안정성을 포함한다6. 그러나 임상적 증상 및 징후가 유사하기 때문에 의료진은 클리닉에서 만성 발목 불안정성이 만성 거골하 관절 불안정을 동반하는지 여부를 구별하기 어렵고, 그 결과 만성 거골하 불안정성을 쉽게 놓칠 수 있습니다. 따라서 만성 발목-거골하 복합 관절(ASCJ) 불안정성(만성 발목 불안정성과 만성 거골하 불안정성을 모두 포함하는 특정 유형의 만성 발 불안정성)의 실제 발생률은 보고된 것보다 높을 수 있습니다 7,8,9. 치료하지 않고 방치하면 만성 발목-거골하 복합 관절 불안정이 반복되어 발목 염좌와 만성 발목-거골하 복합 불안정성의 악순환으로 이어질 수 있습니다. 장기간의 만성 발목-거골하 복합체 불안정은 ASCJ의 퇴행과 외상 후 골관절염으로 이어질 수 있으며, 심한 경우 인접 관절에 영향을 미칠 수 있다10. 이러한 질환에 대한 현재의 임상적 치료는 주로 보존적 치료이며, 인대 재건 및 인대 재건과 같은 수술적 치료 방법11,12.
ASCJ는 발의 핵심 구조이며 동작13 동안 신체의 균형을 유지합니다. 발목 관절과 거골하 관절의 구조에 대한 광범위한 연구가 수행되었습니다14,15,16,17. 그러나 발목-거골하 관절 전체에 대한 연구는 드뭅니다. 발목 부상의 약 1/4은 거골하 관절 손상과 관련이 있다18. ASCJ 불안정성의 복잡한 손상 메커니즘으로 인해 임상 환경에서 진단 및 치료에 대한 합의가 이루어지지 않았습니다. 현재 임상에서 발목 부상의 현황을 고려할 때, 발목과 거골하 관절을 전체적으로 연구하여 발 질환 연구에 대한 새로운 이해를 제공하기 위해서는 보다 과학적인 방법이 필요합니다.
근골격계 수준에서 쥐 뒷발의 해부학적 구조는 인간의 발과 비슷하기 때문에19 여러 연구에서 발/발목 연구를 위한 마우스 모델이 이미 구현되었다10,19. Chang et al.19은 발목 골관절염에 대한 세 가지 다른 마우스 모델을 성공적으로 개발했습니다. 마우스 모델에서 발목 불안정성을 성공적으로 확립한 것에서 영감을 받아 발목-거골하 복합 불안정성에 대한 마우스 모델을 확립하여 마우스 뒷발의 부분 인대 절개가 ASCJ의 기계적 불안정성을 초래하여 ASCJ의 외상 후 골관절염(PTOA)으로 이어질 것이라는 가설을 세웠습니다. ASCJ 불안정성 동물모델은 발목 불안정성과 거골하 불안정성 모두에 사용될 수 있으며, 이는 현재 사용되는 단순 발목 불안정성 모델 7,8,9,19보다 실제 임상 상황에 더 부합합니다. 이 가설을 테스트하기 위해 ASCJ의 인대 절개로 인한 불안정성의 두 마우스 모델을 설계했습니다. 균형 빔 테스트, 발자국 분석 및 열 통각 평가와 같은 감각 운동 기능 결과는 모델의 타당성을 평가하는 데 사용되었으며 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 조직학적 염색은 마우스 관절 연골의 손상 및 변성을 평가하는 데 사용되었습니다. ASCJ 불안정성 마우스 모델의 성공적인 확립은 발 질환 연구에 대한 새로운 이해를 제공할 뿐만 아니라 부상 관련 메커니즘에 대한 임상 연구에 귀중한 참고 자료를 제공하고 발목 염좌에 대한 더 나은 치료 옵션을 제공하며 질병에 대한 추가 연구에 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>5-0 외과용 나일론 봉합</td>사 <td>Ningbo Medical Needle Co., Ltd.</td><td></td><td></td>191104</tr><tr><td>산성 에탄올 분화 용액 (1%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20778</td><td></td></tr><tr><td>접착 슬라이드</td><td>Jiangsu Shitai Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>암모니아 용액 (1 %)</td> <td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20788</td><td></td></tr><tr><td>무수 에탄올</td><td>상하이 Sinopharm 그룹 화학 시약 Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수성 아세트산 (1%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20773</td><td></td></tr><tr><td>블랙 큐브 카세트</td><td>Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 15ml</td><td>Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.</td><td>YA0476</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 50ml</td><td>Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.</td><td>YA0472</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Jiangsu Shitai Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CTAn 소프트웨어</td><td>Blue Scientific</td><td></td><td>micro-CT 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Dataview 소프트웨어</td><td>AEMC 기기</td><td></td><td>상용 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA-2Na)</td> <td>Beijing Soleibo Technology Co., Ltd.</td><td>E8490</td><td></td></tr><tr><td>전기 인큐베이터</td><td>쑤저우 Huamei 장비 공장</td><td></td><td></td></tr><tr><td>임베딩 파라핀</td><td>라이카, 독일</td><td>39001006</td><td></td></tr><tr><td>에오신 염색 용액(알코올 용해성, 1%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R30117</td><td></td></tr><tr><td>빠른 녹색 염색 용액</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td>F7275</td><td></td></tr><tr><td>보행 종이</td><td>보정 Huarong 종이 공장</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0</td><td>Graphpad 소프트웨어</td><td></td><td>온라인 통계 분석 도구</td></tr><tr><td>요오드 면봉</td><td>Qingdao Hainuo Bioengineering Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 818 블레이드</td><td>라이카, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Skyscan, 벨기에</td><td>SkyScan 1176</td><td></td></tr><tr><td>미세 조작 현미경</td><td>Suzhou Omet Optoelectronics Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미믹 소프트웨어</td><td>Materialise&nbsp;</td><td></td><td>3D 의료 이미지 처리 소프트웨어&nbsp;</td></tr><tr><td>수정된 해리스 Hematoxylin 얼룩</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R20566</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 마우스 II 형 콜라겐</td><td>American Abcam Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-부탄올</td><td>Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>중성 포르말린 고정제 (10%)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>중성 수지</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nrecon 재조정 소프트웨어&nbsp;</td><td>마이크로 포토닉스 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오크스 이발기</td><td>Oaks Group Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라핀 임베딩 기계</td><td>라이카, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH 측정기</td><td>Shanghai Leitz Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>American Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생리식염수(포유류, 멸균용)</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>R22172</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O 염색 해결책</td><td>시그마 Aldrich, 미국</td><td>HT90432</td><td></td></tr><tr><td>염분 (0.9%)</td><td>Shanghai Baxter Medical Drug Co., Ltd.</td><td></td><td></td>309107</tr><tr><td>셰이커</td><td>Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.</td><td></td><td></td>2008779</tr><tr><td>SPSS 23</td><td>IBM</td><td></td><td>온라인 통계 분석 도구</td></tr><tr><td>태블릿 기계</td><td>Leica, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 슬라이서</td><td>Leica, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ugo Basile</td><td>Ugo Basile Biological Research Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright 형광 현미경</td><td>Zeiss Axiovert, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U자형 플라스틱 채널</td><td>Shanghai Yizhe Instrument Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수의학 눈 연고</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Shanghai Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>YLS-10B 휠 피로 시험기</td><td>Jinan Yiyan Technology Development Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

발목-거골하 복합 관절 불안정성의 마우스 모델

A Mouse Model of Ankle-Subtalar Complex Joint Instability

발목 염좌는 아마도 일상 생활에서 가장 흔한 스포츠 부상일 것이며, 종종 발목-거골하 복합 관절(ASCJ)의 불안정성을 초래하고 결국 장기적으로 외상 후 골관절염(PTOA)으로 이어질 수 있습니다. 그러나 부상 메커니즘의 복잡성과 외측 발의 반상출혈, 혈종 또는 압통과 같은 임상 증상으로 인해 ASCJ 불안정성을 진단하고 치료하는 것에 대한 임상적 합의는 없습니다. 쥐 뒷발의 뼈와 인대의 근골격계 구조가 인간과 비슷하기 때문에 ASCJ 주변의 인대 횡단에 의해 마우스의 ASCJ 불안정성에 대한 동물 모델이 확립되었습니다. 이 모델은 균형 빔 테스트, 발자국 분석(생쥐의 운동 수준 및 균형 능력 평가), 열 통각 평가(생쥐의 발 감각 기능 평가), 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔 및 관절 연골 단면 염색(생쥐의 관절 연골 손상 및 퇴행 평가)을 포함한 일련의 행동 테스트 및 조직학적 분석을 통해 잘 검증되었습니다. ASCJ 불안정성의 마우스 모델을 성공적으로 확립하면 부상 메커니즘에 대한 임상 연구에 귀중한 참고 자료를 제공하고 발목 염좌에 대한 더 나은 치료 옵션을 제공할 것입니다.

상관관계 데이터의 통계적 분석은 온라인 통계 분석 도구를 사용하여 수행되었습니다. 정규 분포 및 분산의 동질성에 대한 두 가지 검정을 충족하는 데이터는 일원 분산 분석을 통한 추가 통계 분석에 사용되었습니다. 데이터가 두 검정을 충족하지 않는 경우 통계 분석에 Kruskal-Wallis 검정을 사용했습니다. 데이터는 평균± 표준편차(SD)로 표현되며, p &lt; 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
밸런스 빔 테스트 각 마우스가 각 단계에서 밸런스 빔을 두 번 통과하는 데 필요한 평균 시간을 통계적으로 분석한 결과, 수술 전 각 마우스 그룹이 밸런스 빔을 통과하는 데 필요한 시간에는 통계적 차이가 없는 것으로 나타났다(p =0.73). 수술 3일 후, CL+ATFL 및 CL+DL 그룹의 마우스는 가짜 그룹의 마우스에 비해 밸런스 빔을 통과하는 데 더 오랜 시간이 걸렸으며, 그 차이는 통계적으로 유...

발목-거골하 복합 관절(ASCJ)은 발의 핵심이며 일상 활동에서 균형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 스포츠 부상은 종종 이 관절의 불안정성을 초래합니다. 여기에서는 ASCJ의 인대 절개로 인한 불안정성의 마우스 모델을 설명합니다.

Ankle sprains are perhaps the most common sports injuries in daily life, often resulting in instability of the ankle-subtalar complex joint (ASCJ), and ...

ASCJ 무능력 마우스 모델의 성공적인 확립은 단순한 발목 무능력 동물 모델을 확장하고 임상 발 질환 연구를 위한 새로운 개념을 제공합니다. 실제 임상 상황에 더 부합하는 동물 모델을 구축하여 발 질환의 진단 및 치료에 대한 추가 연구에 사용할 수 있습니다. 실험 일주일 전에 쥐에게 균형 빔 또는 U자형 파이프의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 멈추지 않고 이동하면서 균형 빔과 보행 훈련을 실시합니다.쥐의 오른쪽 뒷다리 발목 관절에 있는 털을 마취하고 제거한 후 노출된 피부를 요오드 면봉으로 소독합니다. 멸균 수술 패드를 사용하여 마우스를 미세 수술 동물 수술실로 옮깁니다. 횡경추 및 전방 거골 인대 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절 위의 피부에 메스를 사용하여 7mm 비스듬한 아래쪽 세로 절개를 합니다.그리고 발목 관절 앞쪽에 미세한 직선 집게가 있는 프로브. 거골 몸체와 비골의 아래쪽 경계에 있는 전방 거골 인대가 노출되도록 메스로 부드럽게 자릅니다. 긴 비골 힘줄과 짧은 비골 힘줄, 그리고 신근 digitorum longus 힘줄을 분리합니다.경추 인대를 노출시키고 메스로 자릅니다. 경추 횡인대와 삼각인대 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절의 내측 피부를 8mm 수직으로 절개하고 내측 연골과 DL을 뭉툭하게 분리하여 절단합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 경추 인대를 자릅니다.가짜 그룹의 경우 오른쪽 발목 관절에 가짜 수술을 수행합니다. 멸균 생리식염수로 절개 부위를 씻어낸 후 5-0 수술용 나일론 실로 봉합한 후 봉합된 절개 부위를 요오드 면봉으로 소독합니다. 수술 후 2주가 지나 관절 각부종이 가라앉으면 매일 1시간씩 마우스 회전식 피로 기계에서 마우스를 운동시킵니다.밸런스 빔 테스트를 위해 clamp 사진 삼각대 클립으로 한쪽 끝이 15도 기울어진 원형 나무 빔을 놓고 다른 쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결된 작업 표면에 놓습니다. 수술 일주일 전에 균형 빔 훈련을 수행하여 마우스가 빔의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 이동할 수 있도록 합니다. 마우스가 일시 중지하지 않고 60초 동안 빔을 두 번 통과하면 테스트를 통과한 것으로 간주합니다.각 시도 후 밸런스 빔에 75% 알코올을 분사하여 이전 마우스의 잔류 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 합니다. 밸런스 빔 테스트를 수행하고 밸런스 빔을 두 번 연속으로 통과하는 각 마우스의 평균 시간을 기록합니다. 그리고 오른쪽 뒷발이 빔에서 미끄러지는 횟수를 종속 변수로 사용합니다.발자국 분석을 위해 실험 테이블에 U자형 플라스틱 채널을 놓고 플라스틱 채널의 한쪽 끝을 닫힌 카세트에 연결합니다. 채널에 일반 안료 용지를 평평하게 놓습니다. 그런 다음 양손으로 마우스를 잡고 무독성 빨간색과 녹색 안료로 앞발과 뒷발을 고르게 칠합니다.이제 페인팅된 마우스를 채널의 한쪽 끝에 놓고 카세트의 다른 쪽 끝으로 이동하도록 합니다. 발자국이 있는 착색지를 가져다가 표시하고 통풍이 잘되고 그늘진 곳에서 말리십시오. 이전 마우스의 잔여 냄새가 다음 마우스에 영향을 미치지 않도록 각 마우스가 지나간 후 U자형 플라스틱 채널에 75% 알코올을 뿌립니다.각 용지에서 세 개의 연속된 투명 마우스 발자국을 선택합니다. 눈금자를 사용하여 왼쪽 발자국과 오른쪽 발자국 사이의 계단 너비로 마우스 오른쪽 발 발자국의 계단 길이를 측정합니다. 미세한 핀셋과 가위를 사용하여 발목 표본 주변의 과도한 연조직을 제거합니다.그런 다음 10% EDTA 석회질 제거 용액이 포함된 원심분리기 튜브에 표본을 넣고 다른 그룹을 표시합니다. 그런 다음 석회질 제거를 위해 원심분리기 튜브를 쉐이킹 테이블 위에 놓습니다. 하루에 한 번 석회질 제거 용액을 교체하고 검체의 석회질 제거를 결정합니다.석회질 제거 1개월 후 그래디언트 알코올로 표본을 탈수한 다음 투명화 목적으로 N-부탄올을 8시간 동안 사용합니다. 마지막으로, 세척된 표본을 임베딩을 위해 코로나 위치에 파라핀에 담그십시오. 절단하기 전에 표본을 섭씨 4도의 냉장고에서 섭씨 영하 20도의 냉동고로 약 10분 동안 옮겨 완전한 평면 절단을 용이하게 합니다.마이크로톰에 표본을 고정하고 6마이크로미터 두께로 절단합니다. 동시에 현미경을 사용하여 주사기 바늘이 뼈 조직에 쉽게 침투할 수 있도록 샘플이 예상 수준으로 절단되었는지 관찰합니다. 2개 또는 3개의 완전한 파라핀 섹션을 연속으로 절단한 후 섭씨 40도로 설정된 정제 기계로 옮겨 완전히 팽창시킵니다.그런 다음 유리 슬라이드로 파라핀 섹션을 제거합니다. 마지막으로 슬라이드를 그룹과 숫자로 표시합니다. 현미경으로 온전한 ASCJ 관절 구조를 관찰합니다.섭씨 60도에서 40-50분 동안 인큐베이터에 절편을 넣습니다. 그런 다음 원고에 설명 된대로 크실렌으로 섹션을 세 번 왁스를 제거합니다. 왁스를 제거한 부분을 100% 에탄올에 3분 동안 두 번 넣은 다음 90% 및 80% 에탄올을 각각 5분 동안 넣습니다.그런 다음 이중 증류수로 5분 동안 섹션을 세척합니다. 헤마톡실린에 1분 동안 담근 후 무색이 될 때까지 이중 증류수로 절편을 씻습니다. 단면을 1% 산성 에탄올 분화 용액에 30초 동안 담그고 이중 증류수로 세척합니다.절편을 1% 암모니아 용액으로 염색하고 이중 증류수로 세척한 후 에오신 염색 용액으로 1분 동안 샘플을 염색합니다. 그런 다음 95 % 및 100 % 에탄올에 각각 1 분 동안 연속적으로 넣으십시오. 마지막으로 1분 동안 크실렌 4개로 절편을 처리합니다.섹션을 공기 중에서 건조시키고 슬라이드의 표본에 중성 수지 한 방울을 붙인 후 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 정립 형광 현미경으로 5배와 20배의 명시야에서 이미지를 촬영합니다. 헤마톡실린과 암모니아로 얼룩진 부분을 0.05%의 빠른 녹색에 2분 동안 담그십시오.이어서 절편을 1% 아세트산 용액에 30초 동안 담그고, 0.1% 사프라닌을 5분 동안 담근다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 에탄올과 자일렌으로 슬라이드를 처리합니다. 정립 형광 현미경으로 5X 및 20X의 명시야에서 이미지를 촬영합니다.수술 3일, 8주, 12주 후, 절단된 인대 그룹은 가짜 그룹보다 밸런스 빔을 통과하는 데 훨씬 더 오래 걸렸습니다. 수술 전, 오른쪽 뒷발 걸음 길이는 세 쥐 그룹 간에 비슷했다. 그러나 수술 후 12주가 지나자 인대 절단군이 가짜 군보다 보폭 길이가 짧았다.수술 전, 활동 중 쥐 발의 열 통각 반응 시간은 세 그룹의 쥐 간에 유사합니다. 수술 후 인대 절단 그룹의 마우스는 가짜 그룹에 비해 더 긴 반응 시간을 보였습니다. 절단된 인대 그룹에서 오른쪽 뒷발의 ASCJ는 거친 표면, 골사상균 축적, 퇴행성 변화를 보였습니다.그리고 가짜 그룹보다 훨씬 더 높은 골량 분율. 인대 절단군에서 ASCJ의 연골층은 불연속성을 보였고, 연골세포의 수가 감소했다. 또한, 인대 절단 수술을 받은 쥐의 Malkin and Osteoarthritis Research Society International 점수는 가짜 그룹보다 유의하게 높았다.가짜 그룹의 오른쪽 뒷발 ASCJ 관절 연골층에 있는 제2형 콜라겐은 인대가 절단된 두 그룹의 쥐보다 더 균일하고 높았습니다. 이 연구는 발목 불안정성의 진단 및 치료에 사용될 수 있으며 이 질병의 임상 치료를 위한 실험적 참고 자료를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐 모델에서 보조제 유발 관절염을 생성하는 방법을 보여줍니다. Complete Freund's adjuvant(CFA)는 마우스의 발목 관절과 관절 주위 부위에 주입됩니다. CFA는 면역 체계를 활성화하여 호중구 침투와 과장된 염증을 유발합니다.

보조 유도 관절염 마우스 모델을 생성하는 기술

출처: Brakkee, E. M., et al. Surgery and Behavioral Testing in the Tibial Neuroma Transposition Model in Rats. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 쥐 경골 신경종 전위(TNT) 모델을 생성하는 절차를 보여줍니다. 마취된 쥐의 뒷다리에 있는 경골 신경을 노출시킨 후 신경을 절제합니다. 다음으로, 피하 터널을 만들고 절단된 신경을 터널에 꿰매어 제자리에 봉합합니다. 재신경 형성을 위한 표적이 없는 경우, 절단된 신경에서 무질서하게 형성된 축삭 파생물이 신경종을 형성하며, 이는 통각(유해) 수용기를 자극하여 신경병성 통증을 유발합니다.

경골 신경종 전위의 쥐 모델 생성

Neuropathic 동물 모델에서 고통 응답의 정확한 평가 통증 질환의 병 태 생리학을 조사 하 고 새로운 진통제 개발에 중요 한. 우리는 뒷 다리 발 자동된 보 행 분석 시스템에 의해 설치류의 감각 기능을 결정 하는 과민 하 고 객관적인 방법을 제시.

만성 수축 부상으로 쥐에 있는 자동화 된 걸음 걸이 분석

이 프로토콜의 정형 외과 수술 후 neuroinflammation 및 행동 변화, 그리고 노화 중 조직 재생 연구 parabiosis와 결합 메커니즘을 연구 하는 데 사용 되었습니다 마우스 모델을 설명 합니다.

정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구의 마우스 모델

우리는 주문 품 선택 항목을 사용 하 여 개발 마우스 tibial 산만 골 모델 제시. 분석 대상으로는 마우스를 사용 하 여 연구 발전에 유리 하다.

마우스 산만 골 모델

현재 프로토콜은 골관절염을 동반하는 형태학적 관절 변화를 정량화하기 위한 엄격하고 재현 가능한 방법을 확립합니다. 이 프로토콜의 적용은 질병 진행을 모니터링하고 골관절염의 치료 적 개입을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다.

외과 마우스 모형에 있는 골관절염의 표준화한 조직 형측정 평가

우리는 L3-L5 가시 과정의 절제술에 의해 요추 추간판 변성 마우스 모델을 개발했으며, 초라 및 간 척추 인대 및 패러시러스 근육의 분리와 함께.

요추 척추 불안정의 마우스 모델

본 프로토콜은 시뮬레이션된 불사용 환경에 노출된 후 쥐의 보행 동작 변화를 묘사하기 위한 3차원 동작 추적/평가를 설명합니다.

설치류의 비활동으로 인한 보행 변화에 대한 포괄적인 이해

이 프로토콜은 골절 치유 연구를 위해 골수 내 와이어로 안정화된 마우스의 대퇴골에 골절 골절을 확립하기 위한 수술 절차를 설명합니다.

마우스에서 Diaphyseal 대퇴골 골절 모델 확립

우리는 미국의 바닷가재의 뱃속에서 stomatogastric 신경계의 미세 절개를 설명...

Homarus Americanus Stomatogastric 신경계의 해부

배우세요 발목-거골하 복합 관절 불안정성의 마우스 모델을 이용한 정형외학 연구 방법입니다. 인대 절단술과 보행 분석을 통해 임상 발 질환의 진단 및 치료 전략을 연구하는 데 활용됩니다.

발목-거골하 복합 관절 불안정성의 마우스 모델

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