Het Stroke Preclinical Assessment Network Multi-laboratoriummodel van trombo-embolische beroerte met trombolyse: TE-MCAo

De scope van ons onderzoek is het ontwikkelen van een trombo-embolisch beroertemodel met gecontroleerde trombolyse voor gebruik in rigoureuze multi-laboratorium preklinische therapeutische tests. Ons protocol pakt de afwezigheid aan van een eenvoudig reproduceerbaar trombo-embolisch beroertemodel dat klinische trombolyse nabootst en multicentere preklinische onderzoeken ondersteunt. Om te beginnen maak je een PE-50 buis bot door het uiteinde onder een afgeschuinde hoek te snijden.

Knip de uiterste punt van de afschuiningspunt af met een microschaar. Na het voorbereiden van de verdoofde rat op de operatie, maakt u een verticale incisie op de binnenkant van het dijbeen, ongeveer 1,5 tot twee centimeter lang, langs de natuurlijke plooi van de lieskruising met het been. De incisie moet orthogonaal zijn op het verwachte anatomische verloop van de femurslagader.

Met een stomp dissectie ontleed je voorzichtig tot aan de femorale vaten. Daarna scheid je de arteria femoralis van de ader en zenuw die in hetzelfde bundel lopen. Skelettiseer de arteria femoralis zo proximal mogelijk, waarbij de arterie wordt gevolgd naar de retroperitoneale oorsprong.

Plaats losjes een lus van 5-0 zijde rond de arteria femoralis en gebruik de staarten om zachte spanning te leggen aan het proximale uiteinde van de slagader. Sluit vervolgens distaal de arteria femoralis af met een 5-0 zijden ligatuur, en gebruik de uitten van de hechting om distaal lichte spanning te geven met hemostatische klemmen. Ongeveer tweederde van de afstand vanaf de proximale hechtinglus plaats je een stuk zijden hechting onder de slagader en maak je een kleine arteriotomie distaal van de losse hechting met een microschaar.

Met scherpe pincetten tilt u de bovenste opening van de arteriotomie op en breng de stompe afgeschuinde PE-50 katheter in de opening. Schuif de katheter zo ver mogelijk naar voren, zodat de losse lus, wanneer aangedraaid, de katheter omvat. Draai de hechting voorzichtig aan, zodat deze de katheter niet blokkeert of op de afschuining blijft zitten.

Maak de rubberen bekoepelde klem los. De katheter moet onmiddellijk gevuld worden met bloed. Vul drie centrifugebuizen van 1,5 milliliter en bewaar ze op vier graden Celsius.

Zodra de buisjes gevuld zijn, verwijder je de PE-50 katheter uit de arteria femoralis, ligateer je het proximale uiteinde en sluit je de incisie met onderbroken 5-0 Prolene hechtingen. Om de trombus te bereiden, breng je 500 microliter vers ontnomen of opgeslagen donorbloed over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg je één milliliter calciumchloride toe voor antistollingsomkering. Vervolgens aspireert u onmiddellijk het bloed uit de microcentrifugebuis in een 100 centimeter PE-50 buis, met zachte zuiging, en incubeert de opgerolde buis in vooropgewarmde PBS bij 37 graden Celsius gedurende twee uur in een tafeloven.

Na het uitstoten van de trombus in een petrischaaltje met PBS, snijd je het in secties van ongeveer zes centimeter met een scheermesje. Trek elke trombus voorzichtig in een PE-50 katheter en laat hem vijf keer volledig uitstoten om hem te wassen. Spoel de trombus opnieuw door hem voorzichtig in een PE-10 katheter te trekken en hem 15 keer volledig uit te stoten.

Voeg 200 microliter 4%Evans blue toe aan een petrischaal met 10 milliliter PBS om verdunning nummer 1 te creëren. Vervolgens pipetteer je 400 microliter verdunning nummer 1 in een aparte petrischaal met 20 milliliter PBS om verdunning nummer 2 te creëren. Doe het stolsel één seconde in de meer geconcentreerde Evans blauwe petrischaaloplossing en doe het dan over in de verdunde Evans blauwe petrischaal.

Laad één gewassen trombus in geprefabriceerde microkatheters zonder luchtemboli, met de nat-naar-natte methode. Zodra de trombus volledig is geladen, extrudeer je genoeg trombus zodat er precies vijf centimeter in de microkatheter overblijft. Knip het overtollige met een scheermesje.

Markeer de microkatheter 16 millimeter vanaf de punt om de omvang van de katheter die intraluminaal moet worden verplaatst, aan te geven. De voorgeladen tromboemboli werden geïnjecteerd in de interne halsslagader van 135 proefpersonen verspreid over zes onderzoekslaboratoria om de haalbaarheid van het trombo-embolische occlusiemodel van de midden-cerebrale arterie te testen. Magnetische resonantiebeeldvorming werd na drie dagen uitgevoerd bij 102 dieren, wat een scanvoltooiingspercentage van 75% aangeeft.

Het verlies van dieren vóór beeldvorming was consistent in alle zes laboratoria. Het gemiddelde laesievolume op alle locaties was 13% van de ipsilaterale hemisfeer, met enige variatie tussen de zes laboratoria. Ons protocol bootst menselijke trombus en trombolyse na, vermindert het gebruik van dieren, standaardiseert de chirurgie en bereikt betrouwbare multicentere reproduceerbaarheid.

Als belangrijk resultaat van ons onderzoek hebben we een schaalbaar, reproduceerbaar TE-MCAo-model ontwikkeld dat bruikbaar is in meerdere laboratoria met consistente uitkomsten en gestructureerde kwaliteitscontrole. Dit model kan consequent worden gebruikt in zowel enkelvoudige als multi-laboratorium beroertestudies, waarbij het therapeutische screening verbetert en de translatatie van kandidaat-cerebrale beschermingsbehandelingen versnelt.