Name: Mysi model aktywacji limfocytów B CD40 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę aktywacji limfocytów B CD40 z splenocytów myszy C57BL/6. Technika ta umożliwia generowanie komórek prezentujących antygeny do badań immunologicznych i zastosowań immunoterapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy dr. Clemensowi Wendtnerowi za udostępnienie linii komórkowej tmuCD40-Ligand-HeLa.

Protokół generowania mysich limfocytów B aktywowanych CD40 (mCD40B) ze splenocytów podzielony jest na dwie części: Część A przedstawia przygotowanie komórek HeLa wykazujących ekspresję ligandu CD40 mysiego (tmuCD40L HeLa), które zostaną wykorzystane jako komórki pokarmowe unieruchomione na płytce. Część B opisuje właściwą hodowlę mysich mCD40-B.
A. Przygotowanie komórek karmicielskich (tmuCD40L HeLa)
tmuCD40L HeLa to adherentna ludzka linia komórek nabłonkowych, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki są pasażowane dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowania ich przez okres dłuższy niż 6 tygodni.
<ol>
 <li>Usuń stare pożywkę z kultury pierwotnej za pomocą sterylnej pipety i przemyj komórki 10 mL 1x PBS. Po przemyciu odessij PBS.</li>
 <li>Dodaj 4 mL 1x Trypsyny/EDTA do kolby 75 cm2 i inkubuj przez 10-15 minut w 37°C. Delikatnie opukaj kolbę, aby odczepić komórki.</li>
 <li>Dodaj 10 mL pożywki typu dzikiego i delikatnie zamieszaj, aby zatrzymać trawienie trypsyną.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 50 mL sterylną pipetą i odwiruj komórki przy 265 x g przez 7 minut.</li>
 <li>Usuń nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL pożywki typu dzikiego. Policz liczbę komórek w aliquocie zawiesiny komórkowej i przygotuj trzy probówki 50 mL z odpowiednią liczbą komórek:
 <ol>
 <li>2.5 x 106 komórek do pasażowania</li>
 <li>0.4 x 106 komórek/dołek do napromieniowania wykorzystywanego do hodowli mysich komórek B CD40</li>
 <li>pozostała część do zamrożenia (jeśli jest wymagane).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Odwiruj komórki przy 265 x g przez 7 minut.</li>
 <li>Usuń nadsącz.
 <ol>
 <li>Do pasażowania: resuspenduj 2.5 x 106 komórek w 10 mL pożywki selekcyjnej w kolbie do hodowli komórkowej 75 cm2 (gęstość komórek 2.5 x 105 komórek/mL) i inkubuj komórki w 37°C z 5 % CO2. Wykonuj pasaż komórek dwa razy w tygodniu.</li>
 <li>Do hodowli mysich komórek B CD40: potrzebne jest 2.4 x 106 komórek na jedną płytkę 6-dołkową. Resuspenduj komórki tmuCD40L HeLa w pożywce typu dzikiego przy gęstości 0.2 x 106 komórek/mL i napromieniuj je dawką 78 Gy. Rozlej 2 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka i inkubuj w 37°C z 5 % CO2. Użyj przygotowanych płytek do stymulacji komórek B, gdy komórki tmuCD40L HeLa będą przylegać (minimum 4 godziny: sprawdź przyleganie pod mikroskopem; nie czekaj dłużej niż 24 h przed rozpoczęciem stymulacji komórek B). (Kontynuuj z sekcją B).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
B. Hodowla mysich limfocytów B CD40
I. Przygotowanie splenocytów do stymulacji CD40 (dzień 0):
Uwaga: przed kontynuacją należy upewnić się, że komórki karmionki przylegają do podłoża. Zawsze należy dodawać świeże roztwory mysiej interleukiny-4, β-merkaptoetanolu i cyklosporyny A do pożywki wzrostowej bezpośrednio przed użyciem.
<ol>
 <li>Wykonać sekcję śledziony myszy C57BL/6 (haplotyp H-2b) i wypłukać ją dwukrotnie w 10-20 mL DMEM uzupełnionego Gentamycyną [15μg/mL], przenosząc organ końcówką pipety 10mL z jednej probówki do drugiej. Należy unikać przenoszenia zanieczyszczeń (np. sierści) myszy. Rozdrobić śledzionę, przeciskając ją przez sitko komórkowe (100μm), a następnie wypłukać sitko kolejnymi 10 mL medium. Splenocyty odwirować przy 265 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej, resuspender w 7mL medium do komórek muCD40-B i wyizolować limfocyty za pomocą centryfugacji gęstościowej w Ficollu. W tym celu nanieść komórki na 5 mL Mouse-Pancollu (podgrzanego do temperatury pokojowej) w probówce 15 mL i wirować przy 450 x g przez 30 min bez hamowania w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Odessać większość górnej warstwy, pozostawiając nienaruszoną warstwę limfocytów na granicy faz. Przenieść warstwę limfocytów do nowej probówki 50 mL, wypłukać raz w 30mL DMEM z Gentamycyną [15μg/mL], wirowując przy 265 x g przez 7 min w celu usunięcia pozostałych komórek. Odrzucić nadsącz i resuspender komórki w 10 mL medium płuczącego mCD40-B. Określić liczbę komórek w alikwocie zawiesiny komórkowej poprzez ich policzenie.</li>
 <li>Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 265 x g przez 7 minut. Dla płytki 6-dołkowej wymagane jest 5 x 106 komórek/dołek, czyli 30 x 106 komórek na płytkę.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspender limfocyty w stężeniu 1,25 x 106 komórek/mL w medium hodowlanym mCD40-B, świeżo uzupełnionym o 1 U/mL interleukiny-4 jako czynnik wzrostu, 100 μM β-merkaptoetanolu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A w celu zapobiegania namnażaniu się limfocytów T (podane stężenia odnoszą się do jednego mL medium hodowlanego!).</li>
 <li>Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tmuCD40L HeLa.</li>
 <li>Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny limfocytów (1,25 x 106 komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Inkubować płytkę w temperaturze 37°C w atmosferze 5 % CO2.</li>
 <li>W 3. dniu przeprowadzić repasaż komórek (kontynuować zgodnie z sekcją II.1.).</li>
</ol>
II. Subkultura komórek mCD40B (dzień 3, a następnie dwa razy w tygodniu):
<ol>
 <li>Zebrać skupiska komórek mCD40B poprzez energiczne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL, a następnie przenieść je do probówki 50 mL.</li>
 <li>Wirować przy 265 x g przez 7 minut i całkowicie zastąpić nadsącz medium płuczącym mCD40-B. Podczas zliczania liczby komórek w alikwocie, odwirować komórki przy 265 x g przez 7 minut. Resuspendować komórki mCD40B w medium hodowlanym mCD40-B do stężenia 0,75 x 106 komórek/mL.</li>
 <li>Do medium dodać świeże roztwory mysiej interleukiny-4 w stężeniu 1 U/mL, 100 μM β-merkaptoetanolu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A.</li>
 <li>Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, która była wcześniej inkubowana z napromieniowanymi komórkami tmuCD40L HeLa.</li>
 <li>Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny komórek mCD40B (0,75 x 106 komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Inkubować płytki w temperaturze 37°C w atmosferze 5 % CO2.</li>
 <li>Ponownie pasażować komórki co 3-4 dni, aby po łącznie 14 dniach uzyskać wysoko oczyszczone mysie limfocyty B aktywowane CD40.</li>
</ol>
C. Rozwiązywanie problemów: Co zrobić, jeśli komórki CD40-B nie rosną?
<ol>
 <li>Czy sprawdzono ekspresję ligandu CD40 w komórkach karmicielskich?</li>
 <li>Czy unieruchomione na płytce komórki karmicielskie użyte do stymulacji mają więcej niż 24h?</li>
 <li>Czy występuje zanieczyszczenie mycoplasma?</li>
 <li>Czy roztwór interleukiny-4 użyty do suplementacji był świeżo rozmrożony i czy posiadał odpowiednią aktywność biologiczną?</li>
 <li>Czy β-Mercaptoethanol oraz cyklosporyna A zostały dodane w prawidłowym stężeniu?</li>
</ol>

<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Fenotypowy diagram FACS, analiza komórek CD19⁺ mCD40B, stymulacja CD40, immunofenotypowanie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1 a"> Rycina 1a.
<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej; analiza klastrowania mCD40B w limfocytach z markerami CD19 i CD3; agregacja komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1 b"> Rycina 1b.
<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Ilościowe określenie wzrostu komórek mCD40B; wykres wzrostu kultur limfocytów B i T w ciągu 14 dni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1 d"> Rycina 1d.
<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej; wykres kropkowy SSC vs. FSC oraz histogram CD154 dla analizy bramkowania komórek HeLa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z krajowymi i europejskimi wytycznymi dotyczącymi hodowli zwierząt laboratoryjnych. Zgodnie z niemiecką ustawą o dobrostanie zwierząt, zwierzęta były regularnie kontrolowane przez odpowiednie organy nadzorcze.

Modyfikacje niniejszego protokołu są możliwe, zwłaszcza w odniesieniu do pochodzenia stymulatora CD40 oraz rodzaju użytego szczepu myszy, co również pozwala na wydajne generowanie aktywowanych przez CD40 limfocytów B myszy. Ahmadi i wsp. wykazali podobne wyniki dla fibroblastów mysich przetransfekowanych mysim ligandem CD40. W tym kontekście można z pewnością wykluczyć prezentację ksenoantygenu, a intensywne badania dotyczące bezpieczeństwa i toksyczności in vivo nie wykazały oznak stanu zapalnego ani reakcji au...

<table><tbody><tr><td colspan="4">A. Przygotowanie pożywek:</td></tr><tr><td colspan="4">1. Pożywka dla komórek feeder typu dzikiego</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 300 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS, 10%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Pożywka selekcyjna dla komórek feeder</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 300 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS, 10%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B, 0,2 mg/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Pożywka do płukania mCD40-B</td></tr><tr><td>D-MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 580 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, 4,5 mg/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Pożywka hodowlana mCD40-B</td></tr><tr><td>D-MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 580 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, 4,5 mg/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM, 0,1mM (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS, 10%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">B. Różne odczynniki:</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>REF 21875</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>REF 41965</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco&amp;rsquo;s (10x)</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No H15-011</td><td></td></tr><tr><td>Gencin&amp;#174;</td><td>Delta Select</td><td>Art No 7395800</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza Inc.</td><td>Cat No DE14-802C</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No S11-001</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>REF 11140</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No P02-015</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia interleukina-4</td><td>Immunotools</td><td>Cat No 12340045</td><td></td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>Novartis AG</td><td>Cat No NDC 0078-0109-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>REF 15400-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">C. Różne materiały:</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>Cat No 140675</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat No 352070</td><td></td></tr><tr><td>Flask do hodowli tkankowych</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>Cat No 83.1813.002</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model aktywacji limfocytów b przez cd40

Murine Model of CD40-activation of B cells

Badania nad limfocytami B wykazały, że aktywacja CD40 poprawia ich zdolność do prezentacji antygenu. Po stymulacji interleukiny-4 i ligandu CD40 (CD40L), ludzkie limfocyty B mogą zostać bez trudności namnożone z niewielkich ilości krwi obwodowej w ciągu 14 dni do bardzo dużych ilości wysoko oczyszczonych limfocytów CD40-B (&gt;109komórek na pacjenta) od zdrowych dawców, jak i od pacjentów onkologicznych1-4Komórki CD40-B wykazują ekspresję istotnych cząsteczek odpowiedzialnych za homing do węzłów chłonnych i mogą przyciągać limfocyty Tin vitro5Ponadto wydajnie pobierają, przetwarzają i prezentują antygeny limfocytom T6,7Wykazano, że komórki CD40-B nie tylko aktywują naiwne, ale również powiększają pulę pamięciowych limfocytów T8,9W związku z tym komórki B aktywowane przez CD40 (komórki CD40-B) były badane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w immunoterapii komórkowej1,5,10. Aby dalej zbadać, czy komórki CD40-B indukują skuteczną odpowiedź limfocytów T in vivo oraz aby przeanalizować leżący u podstaw ten mechanizm, opracowaliśmy system hodowli komórkowych do generowania mysich komórek B aktywowanych przez CD40. Wykorzystując splenocyty lub oczyszczone komórki B od myszy C57BL/6 do aktywacji CD40, zidentyfikowano następujące optymalne warunki: rozpoczynając od splenocytów myszy C57BL/6 (haplotyp H-2b), limfocyty są oczyszczane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i hodowane wspólnie z komórkami HeLa wykazującymi ekspresję rekombinowanego mysiego ligandu CD40 (tmuCD40L HeLa)11Komórki są przesiewane co 3-4 dni, a kluczowe komponenty, takie jak CD40L, interleukina-4, 2-merkaptoetanol i cyklosporyna A, są uzupełniane. W niniejszym protokole demonstrujemy, jak uzyskać w pełni aktywowane mysie komórki B aktywowane przez CD40 (mCD40B) o fenotypie APC podobnym do ludzkich komórek CD40-B (Ryc. 1a,b). Stymulacja CD40 prowadzi do szybkiego wzrostu i ekspansji wysoce czystych (&gt;90%) komórek B CD19+ w ciągu 14 dni hodowli komórkowej (Ryc. 1c,d). Aby uniknąć kontaminacji komórkami nietransfekowanymi, ekspresja mysiego ligandu CD40 na transfektantach musi być regularnie kontrolowana (Ryc. 2). Mysie komórki B aktywowane przez CD40 mogą być wykorzystywane do badania aktywacji i różnicowania komórek B, a także do badania ich potencjału do pełnienia funkcji APC in vitro i in vivo. Ponadto stanowią one obiecujące narzędzie do opracowania terapeutycznych lub profilaktycznych szczepionek przeciwnowotworowych i pomogą w odpowiedzi na pytania dotyczące bezpieczeństwa i immunogenności tego podejścia.12Empty source HTML. No content to translate.

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Badania nad limfocytami B wykazały, że aktywacja CD40 poprawia ich zdolność do prezentacji antygenu. Po stymulacji interleukiną-4 i ligandem CD40 ...

Cześć, nazywam się Tanya Wig, jestem doktorantką i pracuję w laboratorium immunologii nowotworów i immunologii transplantacji przy Uniwersytecie w Kolonii. Moje badania koncentrują się głównie na aktywowanych CD 40 limfocytach B i ich zdolności do indukowania odpowiedzi immunologicznych in vivo. Pierwotnie ludzkie limfocyty B CD 40 były generowane jako alternatywne komórki prezentujące antygen w zamian dla komórek dendrytycznych.Komórki te mają być wykorzystywane w celach immunoterapeutycznych. W warunkach klinicznych komórki B CD40 generuje się poprzez sygnalizację CD40 i stymulację IL-4. Zgodnie z tym systemem mogą one być namnażane przez kilka tygodni. Po zoptymalizowaniu w naszym laboratorium procesu generowania ludzkich komórek B CD40 z PBMC, z powodzeniem przenieśliśmy tę zasadę na myszy i to właśnie chcę Państwu dzisiaj zaprezentować.Wychodząc od śledziony, generujemy aktywowane przez CD 40 limfocyty B myszy w ciągu 14 dni hodowli komórkowej. Głównym etapem jest przygotowanie komórek zasilających; w tym celu wykorzystujemy linię komórkową feeder transfekowaną ligandem CD 40 myszy, która jest adherentna, zostaje poddana napromieniowaniu dawką 78 gray i wysiana na płytki sześciodołkowe. Następnie rozpoczynamy hodowlę limfocytów B CD 40 myszy, wykorzystując świeżo oczyszczone splenocyty od myszy C57BL/6, które są traktowane przeciwciałem przeciwko interleukinie 4 beta myszy, amfoteryciną B i cyklosporyną A. Komórki te są następnie przenoszone na napromieniowane komórki feeder na płytkach sześciodołkowych.Procedurę tę powtarza się co trzy do czterech dni aż do 14. dnia hodowli komórkowej. Aby uzyskać wysoką czystość aktywowanych CD 40 limfocytów B myszy, generowanie aktywowanych CD 40 limfocytów B myszy rozpoczynamy od wykorzystania świeżo oczyszczonych splenocytów myszy thromb LXi. Najpierw przemywamy splenocyty, resuspendując komórki w 50 ml medium do przemywania limfocytów B CD 40 myszy.Następnie odwiruj komórki przez siedem minut przy 1300 RPM, co odpowiada 260 5G, w celu oznaczenia liczby komórek. Dokładnie resuspenduj komórki w 10 mililitrach medium piorącego marine CD 40 B, a na koniec wymieszaj komórki za pomocą wortexa. Następnie określ liczbę komórek.Odwiruj wymaganą ilość komórek przez siedem minut przy 1300 RPM, co odpowiada 260 5G, wykorzystując płytkę 6-dołkową. Wymagane jest 5 × 10⁶ komórek na dołek, zatem 30 × 10⁶ komórek na płytkę. Odmierz wymaganą ilość przy stężeniu 1,25 × 10⁶ komórek na ml w pośrodku hodowlanym marine CD 40 B.Następnie do zawiesiny komórkowej dodaj świeżo przygotowane marine IL-4 w stężeniu 1 U/mL w celu stymulacji, cyklosporynę A w stężeniu 0,63 µg/mL, aby zahamować namnażanie się limfocytów T, oraz 100 µM EGTA w etanolu. Zawiesina komórkowa jest teraz gotowa do stymulacji komórkami feeder. Wykorzystujemy linie komórkowe HeLa przetransfekowane marine CD40L, aby stymulować przeżycie, różnicowanie i proliferację komórek, ponieważ linia HeLa może przeżyć w hodowli przez kilka miesięcy.Utratę ekspresji liganda CD 40 musi być regularnie wykluczana. Linia komórkowa z transfekcją liganda CD 40 to przylegająca linia komórkowa hodowana w temperaturze 37°C przy 5% CO2 w medium selekcyjnym uzupełnionym o G418 w stężeniu 0,2 mg/mL. W celu selekcji ta przylegająca linia komórek nabłonkowych nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji i powinna być pasażowana dwa razy w tygodniu w celu rozdzielenia przylegających komórek.Odsajć pożywkę i wypłucz raz 10 ml PBS. Delikatnie zakręć kolbą i dodaj 4 ml trypsyny z EDTA do kolby o powierzchni 75 cm². Inkubuj kolbę przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze.Ponownie wyjmij kolbę. Delikatnie opukaj ścianki, aby oddzielić komórki od plastiku. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki biotype, delikatnie zamieszaj i przenieś komórki do probówki o pojemności 50 mililitrów.Odwiruj komórki pokarmowe przez siedem minut przy 1300 RPM, co odpowiada 260 5G. Ostrożnie resuspenduj osad komórkowy w 10 mililitrach medium typu dzikiego, aby określić liczbę komórek do subkultury; odlicz 2,5 × 10⁶ komórek w 10 mililitrach medium selekcyjnego, przenieś je do kolby o powierzchni 75 cm² i inkubuj komórki pokarmowe w temperaturze 37 °C w 5% CO2 w celu stymulacji CD 40. Pozostałe komórki pokarmowe poddaj letalnemu naświetlaniu dawką 78 Gy, aby zatrzymać ich proliferację.Rozcieńcz komórki karmidła w podłożu typu dzikiego do gęstości komórkowej 0,2 × 10⁶ komórek/ml i nanieś po 2 ml na każdą studzienkę płytki 6-studzienkowej. Przed wykorzystaniem komórek jako stymulatorów do stymulacji cytów ligando-CD40, pozwól im ponownie przywrzeć, inkubując je przez 24 godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki karmidła wysiane dzień wcześniej są przytwierdzone do podłoża.Jeśli komórki pokarmowe są adherentne, ostrożnie usuń supernatant z każdej studni, a następnie delikatnie przenieś cztery mililitry zawiesiny SPOC, którą bezpośrednio przed tym dostosowano do stężenia 1,25 × 10⁶ komórek na mililitr, do każdej studni w celu stymulacji i inkubuj płytkę w temperaturze 37°C i 5% CO2. W czwartym dniu ponownie pasażuj morskie komórki B CD40; pierwszy pasaż aktywowanych morskich komórek B CD40 wykonaj w czwartym dniu, a kolejne pasażowania powtarzaj co trzy do czterech dni. Delikatnie zbierz zagregowane komórki z płytki sześciodołkowej, resuspendTime je za pomocą pipety 10 ml. Zbierz morskie komórki B CD40 do probówki 50 ml i odwiruj komórki przez siedem minut przy 1300 RPM, co odpowiada 260 ×g. Całkowicie wymień medium na medium piorące do morskich komórek B CD40.W celu oznaczenia liczby komórek morskich limfocytów B CD40, zawieszamy morskie limfocyty B CD40 w pożywce hodowlanej dla morskich limfocytów B CD40, osiągając gęstość komórek 0,75 × 10⁶ komórek/ml. Następnie zawiesinę komórkową ponownie uzupełniamy świeżym morskim IL-4 w stężeniu 1 unit/ml, cyklosporyną A w stężeniu 0,63 µg/ml oraz 100 µM etanolu. Oczywiście bezpośrednio przed użyciem należy ponownie sprawdzić pod mikroskopem adhezję napromieniowanych komórek odżywczych.Jeśli komórki karmione są adherentne, należy ostrożnie usunąć SUP natin z każdej studni, a następnie przenieść do każdej z nich przygotowaną krótko wcześniej zawiesinę morskich komórek B CD40 w celu stymulacji. Subkulturę powtarza się w ten sam sposób po trzech lub czterech dniach, dwa razy w tygodniu, aby w 14. dniu hodowli uzyskać wysoką czystość morskich komórek B aktywowanych przez CD40.Na tym etapie komórki B CD 40 z organizmów morskich wykazują ekspresję cząsteczek kostymulujących, takich jak CD 80, CD 86 oraz cząsteczek MHC klasy I i II, co można sprawdzić za pomocą analizy przepływowej (Fox) podczas generowania. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być wykorzystane do badań nad aktywacją, różnicowaniem i funkcją komórek B, na przykład w celu zbadania możliwości ich zastosowania w celach immunoterapeutycznych.

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model muryny aktywacji komórek B przez CD40

W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

W tym filmie pokazujemy aktywację makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w odpowiedzi na bakteryjny lipopolisacharyd i dożylną immunoglobulinę.

Aktywacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy w odpowiedzi na przeciwciała

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Protokół szczegółowo opisuje model raka mysiego in vitro o niegenetycznym wadliwym wydłużeniu transkrypcji. W tym przypadku przewlekłe hamowanie CDK9 jest wykorzystywane do tłumienia produktywnego wydłużania RNA Pol II wzdłuż genów odpowiedzi prozapalnej w celu naśladowania i badania klinicznie obserwowanego zjawiska zdecydowanie TE, obecnego w około 20% wszystkich typów raka.

Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Poznaj metodę aktywacji limfocytów B CD40 z splenocytów myszy C57BL/6. Technika ta umożliwia generowanie komórek prezentujących antygeny do badań immunologicznych i zastosowań immunoterapeutycznych.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Przeglądaj więcej filmów