Name: Mysi model aktywacji limfocytów B CD40 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę aktywacji limfocytów B CD40 z splenocytów myszy C57BL/6. Technika ta umożliwia generowanie komórek prezentujących antygeny do badań immunologicznych i zastosowań immunoterapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy dr. Clemensowi Wendtnerowi za udostępnienie linii komórkowej tmuCD40-Ligand-HeLa.

Protokół generowania mysich limfocytów B aktywowanych CD40 (mCD40B) ze splenocytów podzielony jest na dwie części: Część A przedstawia przygotowanie komórek HeLa wykazujących ekspresję ligandu CD40 mysiego (tmuCD40L HeLa), które zostaną wykorzystane jako komórki pokarmowe unieruchomione na płytce. Część B opisuje właściwą hodowlę mysich mCD40-B.
A. Przygotowanie komórek karmicielskich (tmuCD40L HeLa)
tmuCD40L HeLa to adherentna ludzka linia komórek nabłonkowych, która nigdy nie powinna osiągnąć pełnej konfluencji. W związku z tym komórki są pasażowane dwa razy w tygodniu. Nie zaleca się hodowania ich przez okres dłuższy niż 6 tygodni.
<ol>
 <li>Usuń stare pożywkę z kultury pierwotnej za pomocą sterylnej pipety i przemyj komórki 10 mL 1x PBS. Po przemyciu odessij PBS.</li>
 <li>Dodaj 4 mL 1x Trypsyny/EDTA do kolby 75 cm2 i inkubuj przez 10-15 minut w 37°C. Delikatnie opukaj kolbę, aby odczepić komórki.</li>
 <li>Dodaj 10 mL pożywki typu dzikiego i delikatnie zamieszaj, aby zatrzymać trawienie trypsyną.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 50 mL sterylną pipetą i odwiruj komórki przy 265 x g przez 7 minut.</li>
 <li>Usuń nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 10 mL pożywki typu dzikiego. Policz liczbę komórek w aliquocie zawiesiny komórkowej i przygotuj trzy probówki 50 mL z odpowiednią liczbą komórek:
 <ol>
 <li>2.5 x 106 komórek do pasażowania</li>
 <li>0.4 x 106 komórek/dołek do napromieniowania wykorzystywanego do hodowli mysich komórek B CD40</li>
 <li>pozostała część do zamrożenia (jeśli jest wymagane).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Odwiruj komórki przy 265 x g przez 7 minut.</li>
 <li>Usuń nadsącz.
 <ol>
 <li>Do pasażowania: resuspenduj 2.5 x 106 komórek w 10 mL pożywki selekcyjnej w kolbie do hodowli komórkowej 75 cm2 (gęstość komórek 2.5 x 105 komórek/mL) i inkubuj komórki w 37°C z 5 % CO2. Wykonuj pasaż komórek dwa razy w tygodniu.</li>
 <li>Do hodowli mysich komórek B CD40: potrzebne jest 2.4 x 106 komórek na jedną płytkę 6-dołkową. Resuspenduj komórki tmuCD40L HeLa w pożywce typu dzikiego przy gęstości 0.2 x 106 komórek/mL i napromieniuj je dawką 78 Gy. Rozlej 2 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka i inkubuj w 37°C z 5 % CO2. Użyj przygotowanych płytek do stymulacji komórek B, gdy komórki tmuCD40L HeLa będą przylegać (minimum 4 godziny: sprawdź przyleganie pod mikroskopem; nie czekaj dłużej niż 24 h przed rozpoczęciem stymulacji komórek B). (Kontynuuj z sekcją B).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
B. Hodowla mysich limfocytów B CD40
I. Przygotowanie splenocytów do stymulacji CD40 (dzień 0):
Uwaga: przed kontynuacją należy upewnić się, że komórki karmionki przylegają do podłoża. Zawsze należy dodawać świeże roztwory mysiej interleukiny-4, β-merkaptoetanolu i cyklosporyny A do pożywki wzrostowej bezpośrednio przed użyciem.
<ol>
 <li>Wykonać sekcję śledziony myszy C57BL/6 (haplotyp H-2b) i wypłukać ją dwukrotnie w 10-20 mL DMEM uzupełnionego Gentamycyną [15μg/mL], przenosząc organ końcówką pipety 10mL z jednej probówki do drugiej. Należy unikać przenoszenia zanieczyszczeń (np. sierści) myszy. Rozdrobić śledzionę, przeciskając ją przez sitko komórkowe (100μm), a następnie wypłukać sitko kolejnymi 10 mL medium. Splenocyty odwirować przy 265 x g przez 7 min w temperaturze pokojowej, resuspender w 7mL medium do komórek muCD40-B i wyizolować limfocyty za pomocą centryfugacji gęstościowej w Ficollu. W tym celu nanieść komórki na 5 mL Mouse-Pancollu (podgrzanego do temperatury pokojowej) w probówce 15 mL i wirować przy 450 x g przez 30 min bez hamowania w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Odessać większość górnej warstwy, pozostawiając nienaruszoną warstwę limfocytów na granicy faz. Przenieść warstwę limfocytów do nowej probówki 50 mL, wypłukać raz w 30mL DMEM z Gentamycyną [15μg/mL], wirowując przy 265 x g przez 7 min w celu usunięcia pozostałych komórek. Odrzucić nadsącz i resuspender komórki w 10 mL medium płuczącego mCD40-B. Określić liczbę komórek w alikwocie zawiesiny komórkowej poprzez ich policzenie.</li>
 <li>Odwirować wymaganą liczbę komórek przy 265 x g przez 7 minut. Dla płytki 6-dołkowej wymagane jest 5 x 106 komórek/dołek, czyli 30 x 106 komórek na płytkę.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspender limfocyty w stężeniu 1,25 x 106 komórek/mL w medium hodowlanym mCD40-B, świeżo uzupełnionym o 1 U/mL interleukiny-4 jako czynnik wzrostu, 100 μM β-merkaptoetanolu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A w celu zapobiegania namnażaniu się limfocytów T (podane stężenia odnoszą się do jednego mL medium hodowlanego!).</li>
 <li>Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, w której wcześniej inkubowano komórki tmuCD40L HeLa.</li>
 <li>Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny limfocytów (1,25 x 106 komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Inkubować płytkę w temperaturze 37°C w atmosferze 5 % CO2.</li>
 <li>W 3. dniu przeprowadzić repasaż komórek (kontynuować zgodnie z sekcją II.1.).</li>
</ol>
II. Subkultura komórek mCD40B (dzień 3, a następnie dwa razy w tygodniu):
<ol>
 <li>Zebrać skupiska komórek mCD40B poprzez energiczne pipetowanie w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL, a następnie przenieść je do probówki 50 mL.</li>
 <li>Wirować przy 265 x g przez 7 minut i całkowicie zastąpić nadsącz medium płuczącym mCD40-B. Podczas zliczania liczby komórek w alikwocie, odwirować komórki przy 265 x g przez 7 minut. Resuspendować komórki mCD40B w medium hodowlanym mCD40-B do stężenia 0,75 x 106 komórek/mL.</li>
 <li>Do medium dodać świeże roztwory mysiej interleukiny-4 w stężeniu 1 U/mL, 100 μM β-merkaptoetanolu oraz 0,63 μg/mL cyklosporyny A.</li>
 <li>Usunąć nadsącz z płytki 6-dołkowej, która była wcześniej inkubowana z napromieniowanymi komórkami tmuCD40L HeLa.</li>
 <li>Ostrożnie dodać 4 mL zawiesiny komórek mCD40B (0,75 x 106 komórek/mL) do każdego dołka płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Inkubować płytki w temperaturze 37°C w atmosferze 5 % CO2.</li>
 <li>Ponownie pasażować komórki co 3-4 dni, aby po łącznie 14 dniach uzyskać wysoko oczyszczone mysie limfocyty B aktywowane CD40.</li>
</ol>
C. Rozwiązywanie problemów: Co zrobić, jeśli komórki CD40-B nie rosną?
<ol>
 <li>Czy sprawdzono ekspresję ligandu CD40 w komórkach karmicielskich?</li>
 <li>Czy unieruchomione na płytce komórki karmicielskie użyte do stymulacji mają więcej niż 24h?</li>
 <li>Czy występuje zanieczyszczenie mycoplasma?</li>
 <li>Czy roztwór interleukiny-4 użyty do suplementacji był świeżo rozmrożony i czy posiadał odpowiednią aktywność biologiczną?</li>
 <li>Czy β-Mercaptoethanol oraz cyklosporyna A zostały dodane w prawidłowym stężeniu?</li>
</ol>

<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Fenotypowy diagram FACS, analiza komórek CD19⁺ mCD40B, stymulacja CD40, immunofenotypowanie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1 a"> Rycina 1a.
<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Wykres cytometrii przepływowej; analiza klastrowania mCD40B w limfocytach z markerami CD19 i CD3; agregacja komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1 b"> Rycina 1b.
<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Ilościowe określenie wzrostu komórek mCD40B; wykres wzrostu kultur limfocytów B i T w ciągu 14 dni." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1 d"> Rycina 1d.
<img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Schemat cytometrii przepływowej; wykres kropkowy SSC vs. FSC oraz histogram CD154 dla analizy bramkowania komórek HeLa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z krajowymi i europejskimi wytycznymi dotyczącymi hodowli zwierząt laboratoryjnych. Zgodnie z niemiecką ustawą o dobrostanie zwierząt, zwierzęta były regularnie kontrolowane przez odpowiednie organy nadzorcze.

Modyfikacje niniejszego protokołu są możliwe, zwłaszcza w odniesieniu do pochodzenia stymulatora CD40 oraz rodzaju użytego szczepu myszy, co również pozwala na wydajne generowanie aktywowanych przez CD40 limfocytów B myszy. Ahmadi i wsp. wykazali podobne wyniki dla fibroblastów mysich przetransfekowanych mysim ligandem CD40. W tym kontekście można z pewnością wykluczyć prezentację ksenoantygenu, a intensywne badania dotyczące bezpieczeństwa i toksyczności in vivo nie wykazały oznak stanu zapalnego ani reakcji au...

<table><tbody><tr><td colspan="4">A. Przygotowanie pożywek:</td></tr><tr><td colspan="4">1. Pożywka dla komórek feeder typu dzikiego</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 300 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS, 10%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Pożywka selekcyjna dla komórek feeder</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 300 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS, 10%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B, 0,2 mg/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Pożywka do płukania mCD40-B</td></tr><tr><td>D-MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 580 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, 4,5 mg/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Pożywka hodowlana mCD40-B</td></tr><tr><td>D-MEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina, 580 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, 4,5 mg/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna, 15 &amp;mu;g/mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM, 0,1mM (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS, 10%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">B. Różne odczynniki:</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>REF 21875</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>REF 41965</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco&amp;rsquo;s (10x)</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No H15-011</td><td></td></tr><tr><td>Gencin&amp;#174;</td><td>Delta Select</td><td>Art No 7395800</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza Inc.</td><td>Cat No DE14-802C</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No S11-001</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>REF 11140</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>PAA Laboratories</td><td>Cat No P02-015</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia interleukina-4</td><td>Immunotools</td><td>Cat No 12340045</td><td></td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>Novartis AG</td><td>Cat No NDC 0078-0109-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>REF 15400-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">C. Różne materiały:</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet</td><td>Sarstedt Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>Cat No 140675</td><td></td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat No 352070</td><td></td></tr><tr><td>Flask do hodowli tkankowych</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>Cat No 83.1813.002</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model aktywacji limfocytów b przez cd40

Murine Model of CD40-activation of B cells

Badania nad limfocytami B wykazały, że aktywacja CD40 poprawia ich zdolność do prezentacji antygenu. Po stymulacji interleukiny-4 i ligandu CD40 (CD40L), ludzkie limfocyty B mogą zostać bez trudności namnożone z niewielkich ilości krwi obwodowej w ciągu 14 dni do bardzo dużych ilości wysoko oczyszczonych limfocytów CD40-B (&gt;109komórek na pacjenta) od zdrowych dawców, jak i od pacjentów onkologicznych1-4Komórki CD40-B wykazują ekspresję istotnych cząsteczek odpowiedzialnych za homing do węzłów chłonnych i mogą przyciągać limfocyty Tin vitro5Ponadto wydajnie pobierają, przetwarzają i prezentują antygeny limfocytom T6,7Wykazano, że komórki CD40-B nie tylko aktywują naiwne, ale również powiększają pulę pamięciowych limfocytów T8,9W związku z tym komórki B aktywowane przez CD40 (komórki CD40-B) były badane jako alternatywne źródło immunostymulujących komórek prezentujących antygen (APC) w immunoterapii komórkowej1,5,10. Aby dalej zbadać, czy komórki CD40-B indukują skuteczną odpowiedź limfocytów T in vivo oraz aby przeanalizować leżący u podstaw ten mechanizm, opracowaliśmy system hodowli komórkowych do generowania mysich komórek B aktywowanych przez CD40. Wykorzystując splenocyty lub oczyszczone komórki B od myszy C57BL/6 do aktywacji CD40, zidentyfikowano następujące optymalne warunki: rozpoczynając od splenocytów myszy C57BL/6 (haplotyp H-2b), limfocyty są oczyszczane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i hodowane wspólnie z komórkami HeLa wykazującymi ekspresję rekombinowanego mysiego ligandu CD40 (tmuCD40L HeLa)11Komórki są przesiewane co 3-4 dni, a kluczowe komponenty, takie jak CD40L, interleukina-4, 2-merkaptoetanol i cyklosporyna A, są uzupełniane. W niniejszym protokole demonstrujemy, jak uzyskać w pełni aktywowane mysie komórki B aktywowane przez CD40 (mCD40B) o fenotypie APC podobnym do ludzkich komórek CD40-B (Ryc. 1a,b). Stymulacja CD40 prowadzi do szybkiego wzrostu i ekspansji wysoce czystych (&gt;90%) komórek B CD19+ w ciągu 14 dni hodowli komórkowej (Ryc. 1c,d). Aby uniknąć kontaminacji komórkami nietransfekowanymi, ekspresja mysiego ligandu CD40 na transfektantach musi być regularnie kontrolowana (Ryc. 2). Mysie komórki B aktywowane przez CD40 mogą być wykorzystywane do badania aktywacji i różnicowania komórek B, a także do badania ich potencjału do pełnienia funkcji APC in vitro i in vivo. Ponadto stanowią one obiecujące narzędzie do opracowania terapeutycznych lub profilaktycznych szczepionek przeciwnowotworowych i pomogą w odpowiedzi na pytania dotyczące bezpieczeństwa i immunogenności tego podejścia.12Empty source HTML. No content to translate.

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Badania nad limfocytami B wykazały, że aktywacja CD40 poprawia ich zdolność do prezentacji antygenu. Po stymulacji interleukiną-4 i ligandem CD40 ...

Cześć, nazywam się Tanya Wig, jestem doktorantką i pracuję w laboratorium immunologii nowotworów i immunologii transplantacji przy Uniwersytecie w Kolonii. Moje badania koncentrują się głównie na aktywowanych CD 40 limfocytach B i ich zdolności do indukowania odpowiedzi immunologicznych in vivo. Pierwotnie ludzkie limfocyty B CD 40 były generowane jako alternatywne komórki prezentujące antygen w zamian dla komórek dendrytycznych.Komórki te mają być wykorzystywane w celach immunoterapeutycznych. W warunkach klinicznych komórki B CD40 generuje się poprzez sygnalizację CD40 i stymulację IL-4. Zgodnie z tym systemem mogą one być namnażane przez kilka tygodni. Po zoptymalizowaniu w naszym laboratorium procesu generowania ludzkich komórek B CD40 z PBMC, z powodzeniem przenieśliśmy tę zasadę na myszy i to właśnie chcę Państwu dzisiaj zaprezentować.Wychodząc od śledziony, generujemy aktywowane przez CD 40 limfocyty B myszy w ciągu 14 dni hodowli komórkowej. Głównym etapem jest przygotowanie komórek zasilających; w tym celu wykorzystujemy linię komórkową feeder transfekowaną ligandem CD 40 myszy, która jest adherentna, zostaje poddana napromieniowaniu dawką 78 gray i wysiana na płytki sześc

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Model muryny aktywacji komórek B przez CD40

W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

W tym filmie pokazujemy aktywację makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w odpowiedzi na bakteryjny lipopolisacharyd i dożylną immunoglobulinę.

Aktywacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy w odpowiedzi na przeciwciała

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Protokół szczegółowo opisuje model raka mysiego in vitro o niegenetycznym wadliwym wydłużeniu transkrypcji. W tym przypadku przewlekłe hamowanie CDK9 jest wykorzystywane do tłumienia produktywnego wydłużania RNA Pol II wzdłuż genów odpowiedzi prozapalnej w celu naśladowania i badania klinicznie obserwowanego zjawiska zdecydowanie TE, obecnego w około 20% wszystkich typów raka.

Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Poznaj metodę aktywacji limfocytów B CD40 z splenocytów myszy C57BL/6. Technika ta umożliwia generowanie komórek prezentujących antygeny do badań immunologicznych i zastosowań immunoterapeutycznych.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Przeglądaj więcej filmów