Mysi model aktywacji limfocytów B CD40

Cześć, nazywam się Tanya Wig i jestem doktorantką i pracuję w laboratorium immunologii nowotworów i immunologii transplantacyjnej w Szpitalu Uniwersyteckim w Kolonii. Moje badania koncentrują się głównie na morskich limfocytach B aktywowanych CD 40 i ich zdolności do indukowania odpowiedzi immunologicznych in vivo. Pierwotnie, ludzkie komórki B CD 40 były generowane jako alternatywne komórki prezentujące antygen dla komórek dendrytycznych.

Komórki te są przeznaczone do wykorzystania w celach immunoterapeutycznych W warunkach klinicznych komórki B CD 40 są generowane pod wpływem sygnalizacji i stymulacji CD 40 za pomocą IL cztery. Zgodnie z tym systemem można je rozbudowywać przez kilka tygodni. Po zoptymalizowaniu generacji ludzkich limfocytów B CD 40 z PBMC w naszym laboratorium, z powodzeniem przenieśliśmy tę zasadę na myszy i to właśnie chcę Wam dzisiaj pokazać.

Zaczynając od śledziony, generujemy morskie limfocyty B aktywowane CD 40 w ciągu 14 dni od hodowli komórkowej. Głównymi etapami są przygotowanie komórek zasilających, dlatego używamy morskiej linii komórkowej transfekowanej ligandem CD 40, która przylega i jest napromieniowywana 78 szarym i powlekana na płytkach sześciodołkowych. Po drugie, rozpoczynamy hodowlę morską CD 40 DB przy użyciu świeżo oczyszczonych cytów SPOC od sześciu czarnych myszy, które są traktowane interleukiną morską 4 beta macab do etanolu i cyklosporyny A. Komórki te są następnie przenoszone na napromieniowane komórki fety na sześciodołkowych płytkach.

Procedurę tę powtarza się co trzy do czterech dni do 14 dnia hodowli komórkowej. Aby uzyskać wysoce czyste morskie limfocyty B aktywowane CD 40, rozpoczynamy wytwarzanie morskich komórek B aktywowanych CD 40 przy użyciu świeżo oczyszczonych myszy LXi z zakrzepem w cytach SP. Najpierw myjemy cyty SP za pomocą Resus, zawieszając komórki w 50 mililitrach morskiego medium myjącego CD 40 B.

Następnie wiruj ogniwa przez siedem minut z prędkością 1300 obr./min, co odpowiada 260 5G, w celu określenia liczby komórek. Dokładnie zawieś cyty w 10 mililitrach morskiego podłoża myjącego CD 40 B, a na koniec wymieszaj komórki przez wirowanie. Następnie określ liczbę komórek.

Obracaj wymaganą ilość cytów przez siedem minut przy 1300 obr./min, co odpowiada 260 5G, używając płytki sześciodołkowej. Potrzebujesz pięć razy 10 do sześciu komórek na studzienkę, a więc 30 razy 10 do sześciu komórek na płytkę. Wydaj wymaganą ilość w jednym punkcie 25 razy 10 z sześciu komórek na mililitr w morskich pożywkach hodowlanych CD 40 B.

Następnie świeżo uzupełnij zawiesinę komórkową morskim IL four w stężeniu jednej jednostki na mililitr do stymulacji cyklosporyny A w stężeniu oh 0,63 mikrograma na mililitr w celu zahamowania wzrostu limfocytów T i 100 mikromolowym etanolem Beamer CAPTA . Teraz zawiesina komórkowa jest gotowa do stymulacji komórkami feer. Używamy morskich transfekowanych komórek leczniczych ligandu CD 40 w celu stymulowania przeżywalności, różnicowania i proliferacji komórek, ponieważ linia komórkowa heer może przetrwać w hodowli przez kilka miesięcy.

Lis musi regularnie wykluczać utratę ekspresji nóg morskich CD 40. Transfekowany uzdrowiciel ligandu CD 40 to przylegająca linia komórkowa hodowana w temperaturze 37 stopni z 5% CO2 w pożywce selekcyjnej uzupełnionej lukrem B w stężeniu O 0,2 miligrama na mililitr. Do selekcji ta przylegająca linia komórek nabłonkowych nigdy nie powinna stać się całkowicie zlewająca i powinna być dzielona dwa razy w tygodniu w celu rozszczepienia przylegających komórek.

Odessać pożywkę raz za pomocą 10 mililitrów PBS. Delikatnie obróć i dodaj cztery mililitry trypsyny EDTA w płatku o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych. Inkubować kolbę przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni w inkubatorze.

Ponownie wyjąć kolbę. Użyj delikatnego stukania, aby odłączyć komórki od plastiku. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki biotype, delikatnie obróć i przenieś komórki do 50-mililitrowej probówki.

Obracaj komórki zasilające przez siedem minut z prędkością 1300 obr./min, co odpowiada 260 5G. Ostrożnie ponownie zawieś granulowane komórki w 10 mililitrach pożywki typu dzikiego, aby określić liczbę komórek dla subkultury, RESO wydało 2,5 razy 10 do sześciu komórek w 10-mililitrowej pożywce selekcyjnej i przenieść je do kolby o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych i inkubować komórki zasilające w temperaturze 37 stopni w 5% CO2 w celu stymulacji CD 40. Weź resztę komórek heer i śmiertelnie napromieniuj je stopniem 78, aby powstrzymać ich proliferację.

Rozcieńczyć komórki zasilające w pożywce typu dzikiego o gęstości komórek O 0,2 razy 10 do sześciu komórek na litr i poszczepić dwa mililitry na studzienkę na płytce sześciodołkowej. Pozwól komórkom ponownie przylgnąć przed użyciem ich jako komórek stymulujących, inkubując je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni i 5% CO2 do stymulacji cytów za pomocą ligandu bliskiego CD 40. Sprawdź pod mikroskopem, czy ogniwa podajnika posiane dzień wcześniej przylegają.

Jeśli komórki zasilające przylegają, ostrożnie wyjmij natynę SUP z każdej studzienki, a następnie delikatnie przenieś cztery mililitry zawiesiny bocznej SPOC, która została dostosowana do jednego punktu 25 razy 10 do sześciu komórek na mililitr krótko przed rozpoczęciem do każdej studzienki w celu stymulacji i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni i 5% CO2 w czwartym dniu subkultury morskich komórek CD 40 B ponownie dla pierwszej subkultury morskiej CD 40 B dla pierwszej subkultury morskiej CD 40, aktywowane limfocyty B w czwartym dniu i kolejne subkultury co trzy do czterech dni. Delikatnie zbierz skupione komórki z sześciodołkowej płytki, wydając ponownie za pomocą 10-mililitrowej rury. Połącz morskie ogniwa CD 40 B w 50-mililitrowej tubie i wiruj ogniwa przez siedem minut z prędkością 1300 obr./min, co odpowiada 260 5G, całkowicie wymieniłeś medium na morski środek myjący CD 40 B.

Aby określić liczbę komórek morskich komórek B CD 40, zawieszamy morskie komórki B CD 40 B przy gęstości komórek punktu oh 75 razy 10 do sześciu komórek na mililitr w morskiej pożywce hodowlanej CD 40 B. Następnie ponownie uzupełnij zawiesinę komórkową świeżą morską IL four w stężeniu jednej jednostki na mililitr, cyklosporyną A w stężeniu punktu OH 63 mikrogramy na mililitr i wiązką 100 mikromolową do etanolu. Oczywiście napromieniowane ogniwa zasilające muszą być ponownie sprawdzone pod kątem przylegania pod mikroskopem bezpośrednio przed użyciem.

Jeśli ogniwa zasilające przylegają, ostrożnie wyjmij z każdej z nich natynkę SUP. Następnie przenieś morską zawiesinę CD 40 B przygotowaną na krótko przed nią do każdej studzienki w celu stymulacji. Subkultura jest powtarzana identycznie po trzech do czterech dniach dwa razy w tygodniu, aby zakończyć się wysoce czystymi morskimi komórkami B aktywowanymi CD 40 w 14 dniu hodowli.

W tym momencie morskie komórki B CD 40 wyrażają cząsteczki kostymulujące, takie jak cząsteczki CD 80, CD 86 i MHC oraz jeden i dwa, które mogą być sprawdzane przez Fox podczas wytwarzania. Komórki, które obecnie wygenerowaliśmy, mogą być wykorzystane do badań nad aktywacją, różnicowaniem i funkcją komórek B, na przykład w celu zbadania ich potencjalnego zastosowania w celach immunoterapeutycznych.