Spektrometria mas ruchliwości jonów fali T: podstawowe procedury eksperymentalne do analizy kompleksu białek

Mobilność jonów-spektrometria mas to nowa technologia rozdzielania jonów na podstawie ich przekroju poprzecznego i masy. Metoda dostarcza trójwymiarowych informacji na temat ogólnej topologii i kształtu kompleksów białkowych. W tym miejscu przedstawiamy podstawową procedurę ustawiania i optymalizacji przyrządów, kalibracji czasów dryftu i interpretacji danych.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie ogólnego kształtu kompleksów białkowych. Osiąga się to poprzez pozyskanie danych dotyczących ruchliwości żelaza w spektrometrii mas dla jonów kompleksu białkowego i pomiar wartości czasu dryftu każdego stanu ładunku. Drugim etapem jest walidacja warunków eksperymentalnych w celu zapewnienia pomiarów mobilności natywnych struktur białkowych.

Następnie zmierzone wartości czasu dryftu są skorelowane z polami przekroju poprzecznego. Wyniki wyznaczają wartości przekroju czynnego zderzeń białek lub kompleksów białkowych o nieznanych strukturach trójwymiarowych. Informacje te dostarczają wskazówek na temat ich ogólnego kształtu, upakowania podjednostek i topologii.

Cześć, nazywam się Isaac Leski z Laboratorium Mikrofonu, wydziału chemii biologicznej w Instytucie Nauk Wisemana, i nazywam się Naam Kirschenbaum, również z laboratorium mi. Dzisiaj pokażemy procedurę pomiaru przekroju poprzecznego kompleksów białkowych zderzeń za pomocą hybrydowej spektrometrii mas i przyrządów do mobilności żelaza. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ogólnego kształtu i organizacji kompleksów białkowych.

Więc zacznijmy. Procedura ta koncentruje się na ruchliwości żelaza, spektrometrii mas lub analizie IMM MS kompleksów białkowych. Etapy przygotowania próbki, kalibracji przyrządu oraz procedury optymalizacji MS i tandemu MS są demonstrowane w powiązanym protokole JO.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten obejmuje niskie mikromolowe stężenia kompleksu w lotnym buforze, takim jak octan amonu. Biorąc pod uwagę, że na kapilarnę nanoprzepływową zużywa się od jednego do dwóch mikrolitrów, należy przygotować od 10 do 20 mikrolitrów jako minimalną objętość, aby umożliwić optymalizację warunków stwardnienia rozsianego. Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw falę biegnącą lub synapę fali T IMMS na następujące tryby pracy ruchliwość to, w którym fala tri i ciśnienia są automatycznie ustawiane zarówno dla IM, jak i czasu lotu, separacji jonów, akwizycji jonów dodatnich i trybu V, ustawiając ścieżkę jonów przez rurkę przelotową i odbicie włącz tutaj wszystkie gazy.

Azot jest używany do separacji IM, a argon do regionów pułapki i transferu. Zalecane wartości początkowe to przepływ gazu 24 mililitry na minutę dla urządzenia IMS i 1,5 mililitra na minutę dla obszaru pułapki. Następnie ustaw zakres akwizycji współczynnika ładunku mastu dla nieznanego kompleksu białkowego.

Na początku należy zastosować szeroki zakres mas, który następnie można zredukować do żądanych wartości, odpowiednio dostosować profil MS. Aby uzyskać maksymalną wydajność transmisji dla dużych kompleksów, zakres masy akwizycji powinien być ustawiony od 1030 2000 MA współczynnik naładowania, a profil MS na auto. W przeciwnym razie profil można ustawić zgodnie z pokazanym wykresem.

Sprawdź ustawienie RF i, jeśli to konieczne, dostosuj do wartości odpowiednich dla dużych kompleksów białkowych, jak pokazano. Następnie załaduj próbkę, zastosuj napięcie kapilarne i niskie ciśnienie przepływu nano. Po rozpoczęciu natryskiwania spróbuj zmniejszyć ciśnienie przepływu nano do minimalnej wartości.

Ponadto dostosuj położenie kapilary w stosunku do stożka, dostosuj parametry akwizycji MS w celu uzyskania dobrze rozdzielczego widma MS. Zoptymalizuj gradient ciśnienia wzdłuż przyrządu i stożka do pobierania próbek, a także potencjalne ustawienia pułapki polaryzacji i transferu stożka ekstrakcyjnego, zgodnie z opisem w powiązanym protokole JoVE. Chociaż parametry te są pokazane w zależności od próbki, oto warunki stosowane do pozyskiwania widm MS różnych mas żelaza od kompleksów peptydowych do białkowych.

Duże jony wymagają wyższych energii zderzeń i napięcia polaryzacji. Zaleca się również zwiększenie ciśnienia wstecznego do analizy dużych kompleksów białkowych w celu zminimalizowania aktywacji kompleksu. Staraj się stopniowo zmniejszać, w krokach co około 10 woltów, ekstrakcję stożka próbki, pułapkę stożkową i napięcia polaryzacji bez zmiany położenia piku.

Po uzyskaniu optymalnego widma masowego, czas dryftu lub profil IM należy dostosować podczas analizy zespołów białek. Optymalne warunki zarówno dla pomiarów masy, jak i mobilności są często niezgodne. Dlatego ważne jest, aby zachować odpowiednią równowagę między tymi dwoma.

Ogólnie rzecz biorąc, wykres ruchliwości żelaza powinien być zoptymalizowany w taki sposób, aby piki były rozłożone w całym zakresie czasu dryfu, a profil piku był gładki. Zbliżanie się do rozkładu giana Znacząca asymetria pików może być związana ze słabą separacją wielu konformacji, prędkość fali T, wysokość fali T i natężenie przepływu gazu IMS można dostroić w celu optymalizacji separacji ruchliwości. Zwiększenie prędkości fali T poszerza profil rozkładu czasu dryftu.

Podczas gdy zwiększone wartości wysokości fali T zwężają się, podobnie zwiększając przepływ gazu IMS, zaczynając od minimum 10 mililitrów na minutę, przesuwa profil czasu dryfu w kierunku wyższych wartości, pracując nad optymalizacją spektrum ruchliwości żelaza. Ustalając dwie z trzech zmiennych i optymalizując trzecią, ustaw prędkość fali T na 250 metrów na sekundę, a przepływ gazu na 24 mililitry na minutę. Następnie jako punkt wyjścia ustaw wysokość na trzy wolty i stopniowo zwiększaj ją w krokach co jeden wolt.

W przypadku stosowania wysokich napięć polaryzacji zaleca się zmniejszenie ciśnienia gazu IMS i umożliwienie w ten sposób obniżenia napięcia polaryzacji. W konsekwencji złożona aktywacja i dysocjacja zostaną zmniejszone. Efekt przewrócenia może pojawić się, gdy warunki nie są zoptymalizowane, obserwowany jako identyczny pik w pierwszej części widma czasów dryfu i krawędzi ogona.

Gdy jony nie przechodzą przez urządzenie IAM, ich podróż może trwać dłużej niż czas potrzebny do uwolnienia następnego pakietu żelaza do komórki mobilności. W rezultacie, nowa wiązka jonów jest uwalniana z obszaru pułapki, zanim poprzedni pakiet zostanie dostarczony do obszaru popychacza. Aby wyeliminować ten artefakt, zwiększ wysokość fali T i zmniejsz prędkość fali T oraz ciśnienie IMS.

Ponadto czas zwalniania pułapki można regulować. Ponadto ważne jest, aby sprawdzić, czy wysokość fali T transferu jest ustawiona na co najmniej pięć woltów. Również w celu zapobieżenia wyciekowi jonów w kierunku ogniwa IMS.

Wysokość pułapki ruchomej powinna być utrzymywana na maksymalnym poziomie. Niska prędkość i duża amplituda przenoszenia fal T mogą prowadzić do falowania profilu rozkładu dryfu w czasie. Ten artefakt występuje, gdy separacja ruchliwości jonów nie jest utrzymywana przez obszary transferowe i twarde z powodu częściowej synchronizacji między częstotliwością pusha a prędkością fali T.

Aby wyeliminować ten efekt, należy dostosować czas popychania lub prędkość fali T przenoszenia. Ponieważ częstotliwość pusha jest związana z zakresem masy, ten artefakt może pojawić się ponownie. Gdy ten parametr zostanie zmieniony.

Wysokość fali T wywiera niewielki wpływ. Chociaż jego redukcja może również pomóc w wyeliminowaniu zmarszczek. Po zoptymalizowaniu wyżej wymienionych parametrów można uzyskać dane IMMS w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości.

Ms. Kompleksy białkowe pików są często aktywowane w spektrometrze mas, aby ułatwić usuwanie resztkowej wody i składników buforowych. Jeśli jednak energia aktywacji wzrośnie powyżej wartości progowej, może dojść do częściowego rozwinięcia, tworząc wiele stanów pośrednich, które prawdopodobnie nie będą odpowiadać natywnej strukturze stanu roztworu. W rezultacie, pik czasowy dryfu może być przesuwany i poszerzany, co odzwierciedla populację wodorową rozwiniętych struktur.

W celu uzyskania danych dotyczących czasu dryftu zgodnych ze strukturami fazowymi roztworu, konieczne jest dokładne kontrolowanie napięć używanych do przyspieszania jonów przed separacją IM, a tym samym zwiększanie napięcia kapilary i stożka w sposób stopniowy, jednocześnie monitorując wpływ na widmo czasu dryftu. Co więcej, w przypadku wysokiej rozdzielczości MS lepiej jest zwiększyć transfer niż napięcie pułapki. Najpierw umieszczane jest urządzenie IM, a następnie region transferu i analizator TOF.

Ponieważ aktywacja następuje po pomiarze IM, pozostaje nienaruszona dla IM, podczas gdy dokładność MS można zwiększyć, aby zapewnić, że akwizycja danych odbywa się w warunkach, które utrzymują natywną strukturę kompleksu, ważne jest, aby zbierać dane w zakresie warunków eksperymentalnych i roztworowych, a nie przestrzegać jednego zoptymalizowanego zestawu parametrów. Z tego powodu należy zwiększać napięcie zderzenia pułapki w sposób stopniowy i zbierać dane w odstępach 10 woltów, jednocześnie monitorując wpływ na profil ruchliwości żelaza. Na koniec, w celu zidentyfikowania rozwiniętych potwierdzeń i ręcznej oceny uzyskanych danych, należy wywołać dysocjację kompleksu białkowego poprzez miareczkowanie próbki kwasem octowym w zakresie pH od dwóch do siedmiu i zarejestrować dane, przystępować do analizy danych w systemie IMS załamka T, pola przekroju poprzecznego określone metodą kalibracji czasu dryftu, przy użyciu białek Cain o znanych wartościach przekroju czynnego.

Najpierw przygotuj roztwory białek denaturowanego kalibru po 10 mikromolów każdy. Użyj końskiego cytochromu C, mioglobiny serca i bydlęcej ubikwityny w 49, 49 0,2 stosunku objętości wody, metanolu, kwasu octowego. Następnie należy pozyskać dane IMMS dla białek kalibru w dokładnie tych samych warunkach przyrządu, które są używane dla docelowego białka lub kompleksu białkowego, utrzymując wszystkie wartości napięć i ciśnienia na tym samym poziomie, aby zachować ustawienia separacji IM.

Po uzyskaniu danych wyodrębnij eksperymentalną wartość czasu dryfu dla każdego ładunku. Stan białek Cain koryguje każdy z czasów dryfu kalibru T prime D za pomocą następującego równania, gdzie MOVZ jest stosunkiem ładunku głównego obserwowanego jonu, a C jest współczynnikiem opóźnienia EDC o zwiększonym cyklu pracy. Jego wartość zwykle od 1,4 do 1,6 jest zależna od instrumentu.

Wartość EDC jest wskazywana w systemie w jednej zakładce ustawień akwizycji, koryguje każdy z przekrojów kalibru zarówno dla stanu ładunku żelaza, jak i zredukowanej masy. Gdzie omega C jest skorygowanym przekrojem czynnym, omega jest przekrojem literaturowym, a Z jest ładunkiem żelaza. Stan M to masa cząsteczkowa jonu kainy, a MG to masa cząsteczkowa żelaza.

Gaz tła, którym jest zazwyczaj azot, pluje thelan z T prime D z thelanem omega C. Otrzymana krzywa odpowiada następującemu równaniu. Parametry X i A można wyodrębnić, dopasowując wykres do zależności liniowej. Nachylenie X odpowiada wykładniczemu współczynnikowi proporcji, a A reprezentuje stałą wyznaczoną przez pasowanie.

Oblicz współczynnik korelacji dopasowania R do kwadratu. Dopuszczalne wartości dla R kwadrat są większe niż 0,95. Niższa wartość współczynnika korelacji może wynikać z niepełnego rozwinięcia białka, starzenia się próbki.

Odmienne warunki eksperymentalne stosowane dla białek różnego kalibru, zaszumione widmo i niepełne przetwarzanie danych lub błąd obliczeniowy. Skoryguj czas dryftu ca za pomocą wyznaczonego współczynnika wykładniczego X i zweryfikuj swoje obliczenia, zmieniając wartość omega C w stosunku do liczby pierwszej T D. Zdefiniuj ponownie współczynnik korelacji. Należy oczekiwać wartości wyższych niż 0,95 podobnie jak w krokach opisanych powyżej, skorygować zmierzony czas dryftu docelowego białka lub kompleksu białkowego i skalibrować czas dryftu docelowego białka lub kompleksu białkowego przy użyciu obliczonego współczynnika wykładniczego X. Obliczyć omega docelowego białka lub kompleksu białkowego, stosując stałą wyznaczoną przez dopasowanie A, gdzie omega jest równa TD. Powtórz te kroki dla każdego warunku eksperymentalnego.

Definiując pole przekroju poprzecznego nieznanego białka lub kompleksu białkowego, zalecamy, aby każde doświadczenie powtórzyć co najmniej trzy razy, a odchylenie standardowe tych potrójnych pomiarów określić po ustaleniu wartości przekroju poprzecznego zderzenia. Podejścia modelowania są stosowane w celu przewidywania topologii lub układów kompleksu. Odbywa się to poprzez dopasowanie eksperymentalnych wartości przekrojów zderzenia do wartości krzemu Omega obliczonych na podstawie wygenerowanych struktur modelowych w całości, dziedzina ta jest wciąż w początkowym okresie i wymagany jest dalszy rozwój, aby podejście to było ogólne i możliwe do zastosowania w szerokim zakresie kompleksów.

Przedstawiono tutaj reprezentację powierzchniową tetramerycznej formy hemoglobiny bydlęcej. Kompleks hemoglobiny transportującej tlen może służyć jako przykład dla wyżej wymienionego podejścia. Hemoglobina to tetrameryczny kompleks białkowy składający się z dwóch podjednostek alfa i dwóch beta, pokolorowanych odpowiednio na niebiesko i czerwono, które tworzą dimer dimerów alfa beta.

Widmo hemoglobiny IMMS pokazano tutaj. Uzyskane widmo IM ms kompleksu ujawnia rozkład głównych szeregów ładunków odpowiadający nienaruszonemu kompleksowi i mniejszym seriom ładunków, który pasuje do mas dimeru alfa beta oraz podjednostek alfa i beta monomerycznych. Przedstawiono tutaj teoretyczne i zmierzone CCS różnych form hemoglobiny.

Do obliczenia wartości omega wykorzystano wartości czasu dryftu uzyskane dla kilku stanów naładowania postaci dimerycznej i tetramerycznej. Porównano je z wartościami teoretycznymi. Biorąc pod uwagę, że kompleks tetrameryczny ma trzy możliwości asocjacji: albo cykliczne dwuścienne, albo łańcuchowe wypełnienia.

Obliczając wzrost omega podczas przechodzenia od dimeru do tetrameru, można przewidzieć organizację strukturalną. Wcześniejsze badania i nasze własne eksperymenty wykazały silną korelację między zmierzonymi ccss a powierzchniami białek pochodzącymi z danych o strukturze kryształów. Korelację tę można wykorzystać do obliczenia oczekiwanego wzrostu powierzchni tetrameru w porównaniu z dimerem dla różnych form upakowania.

Odbywa się to poprzez uwzględnienie każdego podjednostki obiektu asferycznego. Montaż podobny do łańcucha zwiększy tetramer CCS około dwukrotnie, podczas gdy upakowanie C cztery lub D dwa spowoduje wzrost odpowiednio o około 1,5 i 1,67. Obliczony stosunek między zmierzonymi wartościami CCS tetramerycznej i DME hemoglobiny wynosił 1,57 plus minus 0,03.

Liczba ta ilustruje, że struktura natywna nie jest zorganizowana liniowo, ale jest ułożona w bardziej zwartą formę, jako tetramer cykliczny lub dwuścienny. Powtarzając te same obliczenia dotyczące rozdzielczej struktury krystalicznej hemoglobiny, stosunek powierzchni form tetramerycznych do DME wynosił 1,63, co odpowiada symetrii D dwa. Oczywiście ten model geometryczny został uproszczony, a podjednostki białkowe nie są jedynie sferyczne.

Obliczenia te pokazują jednak ekscytujący potencjał, jaki posiada IMMS w zakresie ujawniania upakowania kompleksów o nieznanych strukturach o wysokiej rozdzielczości. Właśnie pokazałem, jak zmierzyć czas dryftu białka i kompleksów białkowych, jak obliczyć wartości ich przekroju zderzenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uzyskać dane IMMS dla białek kalibru przy użyciu dokładnie tych samych warunków, które są stosowane dla docelowego białka lub kompleksów białkowych.

Co więcej, zdecydowanie zalecamy powtórzenie co najmniej trzech razy tych eksperymentów i określenie odchylenia standardowego tych potrójnych pomiarów. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.