Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie dorosłych komórek macierzystych z tkanek miękkich układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak mięśnie szkieletowe. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw biopsji tkanki miękkiej, odcięcie jej i drobne posiekanie. Drugim etapem zabiegu jest enzymatyczne trawienie tkanki.

Trzecim etapem procedury jest wyizolowanie komórek macierzystych poprzez wielokrotne etapy wstępnego posiewu. Ostatnim etapem zabiegu jest identyfikacja wyizolowanych komórek macierzystych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zachowania morfologiczne i komórkowe komórek za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii i/lub cytometrii przepływowej.

Cześć, nazywam się y Lee i pracuję w Laboratorium Patologii Molekularnej na Wydziale Chirurgii Ortopedycznej Uniwersytetu w Pittsburghu. Dzisiaj pokażę Ci, jak wyizolować dorosłą komórkę macierzystą z tkanek miękkich układu kostnego Mus, takich jak mięśnie szkieletowe. Cześć, nazywam się Dr. Johnny Ward.

Jestem profesorem na University of Pittsburgh School of Medicine na Wydziale Chirurgii Ortopedycznej. Pracowałem ściśle z doktorem Youngiem Lee i opracowywałem procedury mające na celu odizolowanie różnych typów komórek macierzystych od mięśni szkieletowych i zmianę tkanek, takich jak standardowe. Korzystamy z procedur stosowanych w naszym laboratorium w celu wyizolowania komórek macierzystych do badań naukowych nad zastosowaniami medycyny translacyjnej.

Więc zacznijmy się uczyć. Niech tkanki, z których można wyizolować komórki macierzyste, obejmują ścięgna i mięśnie szkieletowe pobrane z mięśni piszczelowych lub płaszczkowatych kończyny tylnej myszy typu dzikiego. Po usunięciu resztek skóry i kości umieść tkanki w naczyniu zawierającym zimny HBSS uzupełniony o 5%FBS.

Następnie umieść tkankę oddzielnie na naczyniach pokrytych kolagenem zawierających zimny HBSS. Wykorzystamy tkanki mięśni szkieletowych, aby zademonstrować podstawowe procedury dysocjacji i trawienia tkanek. Użyj mikronożyczek i/lub ostrzy skalpela, aby zmielić tkanki szkieletowe na gruboziarnistą zawiesinę, enzymatyczne trawienie tkanek o pH.

Zacznij od przeniesienia zawiesin tkanek MIT do oddzielnych 15-mililitrowych probówek w wirówce z prędkością około 3500 obr./min w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć płukanie SANE przez Resus zawieszając HBSS i powtórzyć wirowanie. Po usunięciu supernatu trawić zawiesiny, dodając 10 mililitrów wstępnie podgrzanej.0,2%kolagenazy.

Inkubować typ 11 przez 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, potrząsając probówkami ręcznie co 10 minut po zakończeniu 60-minutowej inkubacji. Odwirować, a następnie ponownie zawiesić zawiesiny w 10 mililitrach roztworu kosmicznego DYS. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając ręcznie co 10 minut po 45-minutowej wirówce inkubacyjnej i ponownie zawiesić zawiesiny w 10 mililitrach 0,2% ruchu w roztworze HBSS.

Zwykle inkubujemy przez 15 do 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, odwracając probówki co 10 minut, inkubacja jest zakończona. Gdy wystarczająca ilość pojedynczych komórek zostanie uwolniona z tkanek, jak pokazano tutaj, odwiruj powstałe komórki i zreusuj zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach proliferacji. Średni PM dysocjuje zawiesinę komórkową, przepuszczając ekstrakt przez szereg igieł dwa razy przez igłę o rozmiarze 18, następnie raz przez igłę o rozmiarze 23 i wreszcie raz przez igłę o rozmiarze 27.

Na koniec przepuść ekstrakt komórkowy przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów, aby rozpocząć technikę wstępną. Odwiruj właśnie przygotowany ekstrakt komórkowy i ponownie zawieś granulki w proliferacji. Podłoże Umieść pięć mililitrów mieszaniny komórek na kolbie T 25 pokrytej kolagenem i sprzedaj jako PP inkubowany w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny.

Po dwóch godzinach. Przenieś nieprzylegające komórki do nowej kolby T 25 pokrytej kolagenem i sprzedaj jako PP dwa. Dodaj pięć mililitrów PM do poprzedniej kolby T 25 oznaczonej jako PP.

Umieścić obie kolby z powrotem w inkubatorze na 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś nieprzylegające komórki z PP dwa do nowej kolby T 25 pokrytej kolagenem ENC i oznacz ją jako PP trzy. Dodaj pięć mililitrów pożywki proliferacyjnej do kolby oznaczonej PP dwa.

Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze. Procedurę powtarzać co 24 godziny aż do populacji PP sześć. Powstaje populacja komórek macierzystych.

Wyizolowane komórki PP six są bardzo nieliczne i muszą być utrzymywane w pożywce bogatej w FBS. To zmieniało się z dnia na dzień. Chociaż większość komórek w kulturze PP six umrze w ciągu następnego tygodnia od jednego do dwóch tygodni hodowli.

Duża, zdrowa populacja PP six jest zwykle tworzona po dodatkowym tygodniu od jednego do dwóch tygodni ekspansji. Utrzymuj również wszystkie inne grupy zawieszonych komórek, pozwalając im na proliferację i regularnie badając je za pomocą odwróconego mikroskopu. Wczesne przylegające komórki, które przyczepiają się do kolb PP jednej i PP dwóch, są w większości komórkami zwłóknieniowymi.

Komórki, które przylegają do kolb pokrytych kolagenem po dłuższym czasie w ciągu 48 do 96 godzin. PP trzy i PP cztery to głównie mioblasty. Podczas gdy komórki satelitarne mięśni są często obserwowane głównie w PP pięć, późniejsze komórki prepl 96 godzin lub późniejsze PP sześć są uważane za dorosłe komórki macierzyste i wydają się małe, okrągłe i półprzezroczyste.

Na początku ich izolacji można je dalej scharakteryzować za pomocą immunohistochemii pod kątem ekspresji markerów komórek macierzystych, takich jak komórka macierzysta, antygen jeden i CDC 34. Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować komórkę macierzystą z drugiej masy myszy. Kiedy wykonać tę procedurę, Ważne jest, aby pamiętać o utrzymaniu sterydów podczas wszystkich procedur.

Po wyizolowaniu komórek macierzystych należy upewnić się, że hodujesz te komórki o niskiej gęstości, aby zachować cechy komórek macierzystych komórek. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w swoim doświadczeniu I życzę powodzenia w próbie wykorzystania tego w swoim eksperymencie.

Dziękuję.