Name: Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego, w tym mięśni szkieletowych. Technika obejmuje biopsję, trawienie enzymatyczne i wielokrotne przepłukiwanie, umożliwiając badania w medycynie regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają ogromną wdzięczność pani Haiying Pan i panu Ianowi Bellayrowi za pomoc techniczną przy izolacji komórek do niniejszych filmów oraz panu Kyle'owi Holdenowi i panu Jonathanowi Lucasowi za pomoc w edycji slajdów. Serdeczne podziękowania kierujemy do następujących osób, które w ostatnich latach brały udział w opracowywaniu zmodyfikowanych technik przedsiewania (preplate): drów Burhan Gharaibeh, BaoHong Cao, Deasy Bridget, Thomas R. Payne, Aiping Lu, Hairong Peng, Hideki Oshima, Bo Zeng, Xiaodong Mu, Kimimasa Tobita, Ron Jankowski, Makato Ikezawa. Jesteśmy wdzięczni za pomoc techniczną Jamesowi H. Cumminsowi, Ryanowi Pruchnicowi, Josephowi Fedusce, Rebeccy C. Schugar, Haiying Pan oraz Jessice Tebbets. Autor chciałby również podziękować za wsparcie finansowe tej pracy Muscular Dystrophy Association (MDA), National Institutes of Health (NIH), Department of Defense (DOD), Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, Department of Orthopaedic Surgery oraz University of Pittsburgh.

Ogólnie rzecz biorąc, pełna zmodyfikowana procedura preplatowania wymaga 1-2 dni przygotowania, 1 tygodnia przeprowadzenia procedury technicznej, 2-3 dni identyfikacji komórek metodą immunocytochemii oraz dodatkowych 2-3 tygodni ekspansji populacji komórek macierzystych. Wyposażenie niezbędne do hodowli komórek macierzystych jest analogiczne do stosowanego w innych systemach hodowli komórkowych i obejmuje wirówkę laboratoryjną, inkubator CO2, komorę z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek oraz mikroskop odwrócony wyposażony w moduł fluorescencyjny i kamerę cyfrową. Wyizolowane komórki macierzyste można również klonować i przechowywać długoterminowo w ciekłym azocie na potrzeby bieżących lub przyszłych badań 1,2. Wszystkie odczynniki i materiały użyte w tej procedurze muszą być sterylne i obsługiwane aseptycznie. Krok 1: Przygotowanie <ol> <li>Powlekanie kolagenem naczyń i kolb do hodowli tkankowej: kolagen typu I pochodzący ze skóry cielęcej (0,1 g w 1 litrze; Sigma-Aldrich). Wyposażenie plastikowe do powlekania obejmuje: kolby T-25, płytki 6- lub 12-dołkowe, szalki (60 i 100 mm, BD Falcon), zgodnie z wcześniejszym opisem 1,2. Delikatnie wstrząsać naczyniami co pół godziny przez 4 godziny, aby zapewnić równomierne powlekanie kolagenem. Następnie należy usunąć roztwór kolagenu. Powlekone naczynia pozostawia się do wyschnięcia w komorze do hodowli tkankowej przy włączonym świetle UV i wentylacji komory w celu zapewnienia sterylności, a na koniec zamyka się je lub przykrywa do późniejszego użycia.</li> <li>Przygotowanie pożywki do hodowli komórkowej: 400 mL DMEM (DMEM, high glucose; Invitrogen), 50 mL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Invitrogen), 50 mL surowicy konia (HS, Invitrogen) oraz 5 mL ekstraktu z zarodka kurczaka (CEE; Accurate Chemical Co.) należy przefiltrować próżniowo przy użyciu jednorazowego sterylnego systemu filtracyjnego 0,22-μm o pojemności 500 ml (Corning). Na koniec należy dodać sterylną sólę penicyliny/streptomyciny (Invitrogen) w stężeniu 100 Units/mL. Przygotowane roztwory można przechowywać w temperaturze 4°C przez co najmniej miesiąc. Roztwór ten służy do odrywania komórek od ścianek kolby podczas pasażowania kultur lub przygotowywania komórek do transplantacji.</li> <li>Podgrzewanie roztworów do izolacji komórek: następujące odczynniki należy podgrzać do 37°C przed użyciem do izolacji komórek: zbuforowany roztwór soli Hanksa (HBSS, Invitrogen); 0,2% (masa/objętość) kolagenazy typu XI (Sigma-Aldrich), ze średnią aktywnością 3 200 jednostek trawienia kolagenu na mL HBSS; dyspazę 2,4 units/1mL (Invitrogen); 0,5% (masa/objętość) trypsynę (Invitrogen).</li> <li>Sterylizacja sprzętu chirurgicznego w ramach przygotowań: procedura chirurgiczna wymaga sterylnych narzędzi chirurgicznych, w tym: pęset o różnych rozmiarach, mikronożyczek, nożyczek irydowych i/lub ostrzy skalpela. Dodatkowo: polipropylenowe probówki do wirowania o pojemności 15 i 50 mL (BD Falcon); sitko do komórek (rozmiar oczek 70 m) (BD Falcon); igły o rozmiarach 18, 23 i 27 G (BD PrecisionGlide) oraz sterylne strzykawki 10- lub 20-ml (BD).</li> </ol> Krok 2: Biopsje tkanek, izolacja i dysocjacja mechaniczna1-4 Biopsje tkanek wykonuje się pod sterylną komorą z laminarnym przepływem powietrza; obejmują one świeżo pobrane ścięgna i mięśnie szkieletowe uzyskane z piszczeli lub mięśnia płaszczowatego kończyny tylnej myszy typu dzikiego (samice C57BL/6J, w wieku 4-5 tygodni lub młodsze, Jackson Laboratory). Następnie z próbek biopsji usuwa się wszelką widoczną tkankę łączną, naczynia krwionośne oraz tkankę tłuszczową. Tkanki ścięgna i mięśnia są następnie starannie identyfikowane pod chirurgicznym mikroskopem dissectingowym w celu usunięcia resztek skóry i kości, a następnie umieszczane w naczyniu zawierającym zimny (4°C) HBSS (uzupełniony o 5 % FBS). Wyizolowane tkanki umieszcza się osobno na pokrytych kolagenem płytkach zawierających zimny HBSS, po czym rozdrabnia się je (&lt;1x1 mm3) do postaci grubej zawiesiny za pomocą mikronożyczek i/lub ostrzy skalpela. Krok 3: Trawienie enzymatyczne tkanek: Rozdrobnioną tkankę poddaje się następnie dysocjacji enzymatycznej w serii etapów2,4,5 <ol> <li>Przenieść rozdrobnione zawiesiny tkankowe do oddzielnych probówek 15-ml i wirować przy ~3500 rpm w temperaturze 4 °C przez 5 mins.</li> <li>Odlać nadosad, przemyć HBSS i powtórzyć wirowanie.</li> <li>Odlać nadosad, a następnie poddać zawiesiny trawieniu, dodając 10 ml podgrzanej wcześniej 0,2% kolagenazy typu XI (Sigma). Inkubować przez 60 mins w 37 °C, stale i delikatnie kołysząc probówkami. Alternatywnie mieszać ręcznie co 10 min.</li> <li>Odwirować i resuspender zawiesiny w 10 ml roztworu dispazy (2,4 Units/mL, Gibco). Inkubować przez 45 mins w 37 °C, mieszając ręcznie lub delikatnie kołysząc co 10 min.</li> <li>Odwirować i resuspender zawiesiny w 10 ml 0,2% roztworu trypsyny w HBSS. Czas inkubacji zależy od stopnia uwalniania pojedynczych komórek z tkanek, co można kontrolować, obserwując zawiesinę pod mikroskopem. Nie zaleca się przekraczania 30 mins w 37 °C, odwracając probówki lub delikatnie kołysząc nimi co 10 min.</li> <li>Odwirować otrzymane komórki i resuspender osad komórkowy w 10 ml Pożywki do Proliferacji (PM).</li> <li>Rozdzielić zawiesinę komórkową, przepuszczając ekstrakt przez serię igieł. Komórki należy przepuścić 2 razy przez igłę 18G, następnie 23G i na koniec 27G.</li> <li>Przepuścić ekstrakt komórkowy przez sitko komórkowe 70-μm.</li> </ol> Krok 4: Preplating w celu wyizolowania różnych populacji komórek na podstawie szybkości adhezji komórkowej1-3 <ol> <li>Odwirować i resuspendować osady komórkowe w podłożu do proliferacji (Proliferation Medium).</li> <li>Wysiać mieszaniny komórek do kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub naczynia 60 mm) i oznaczyć ją jako PP1. Pod mikroskopem w zawiesinie komórkowej powinna być widoczna duża liczba refrakcyjnych jąder oraz inne szczątki.</li> <li>Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 przez 2 godziny.</li> <li>Przenieść komórki nieprzylegające do nowej kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub naczynia 60 mm) i oznaczyć ją jako PP2. Do naczynia oznaczonego jako PP1 dodać 5 ml PM. Komórki przylegające wczesnym etapie, które przytwierdzają się do kolby, to w większości miofibroblasty3.</li> <li>Wrócić kolby do inkubatora na kolejne 24 godziny, przenieść komórki nieprzylegające do nowej kolby T-25 pokrytej kolagenem (lub naczynia) i oznaczyć ją jako PP3. Do naczynia oznaczonego jako PP2 dodać 5 ml podłoża do proliferacji (Proliferation Medium). Komórki przylegające, które przytwierdzają się do tej kolby, to w większości fibroblasty2,3.</li> <li>Wrócić kolby do inkubatora i powtarzać procedurę co 24 godziny, aż do uzyskania populacji PP6. Hodować każdą grupę zawieszonych komórek, pozwalając im na proliferację i regularnie badając je pod mikroskopem odwróconym. PP3-PP4 to w większości mioblasty, natomiast komórki satelitarne mięśni często obserwuje się głównie w PP5 2.</li> <li>Większość powoli przylegających komórek zazwyczaj przytwierdza się do etapu PP6. Na tym etapie komórki wydają się małe, okrągłe, lekko refrakcyjne i występują w bardzo małej liczbie; są one uznawane za populację komórek macierzystych 1,2.</li> </ol> Krok 5: Identyfikacja i ekspansja wyizolowanych komórek macierzystych <ol> <li>Izolowane komórki PP6 występują w bardzo niewielkiej liczbie i muszą być utrzymywane w bogatym w FBS Medium do Proliferacji (20% FBS w DMEM), które należy wymieniać codziennie. Większość komórek obecnych w kulturze PP6 obumiera podczas kolejnych 1-2 tygodni hodowli, jednak po dodatkowych 1-2 tygodniach ekspansji zazwyczaj tworzy się duża, zdrowa populacja PP6. Komórki macierzyste izolowane z myszy wykazują wysoką ekspresję antygenu komórek macierzystych 1 (Sca1), CD34, fetal liver kinase 1 (Flk1) oraz innych markerów komórek macierzystych1,2,6,7, co można zwizualizować za pomocą barwienia immunocytochemicznego. Komórki macierzyste te wykazują również wielokierunkowe zdolności różnicowania3,6,8.</li> <li>Izolowane komórki są utrzymywane i powielane przy niskiej gęstości komórkowej w kulturze (płytki 12-dołkowe przy 50-100 komórkach/dołku lub &lt;20-30% konfluencji w kolbie lub płytce), aby uniknąć różnicowania 1,2. Podczas ekspansji bardzo niewielu komórek tworzy klony, a te sklonowane komórki macierzyste mogą przechodzić długotrwałą proliferację (LTP) na potrzeby innych badań kompetencji. Sklonowane komórki macierzyste można również przechowywać w ciekłym azocie, stosując ogólne procedury przechowywania komórek, np. w medium PM z 10% DMSO. Należy przygotować kilka zapasowych linii komórek macierzystych o niskim numerze pasażu do dalszych badań pomocniczych.</li> </ol>

<ol><li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li>
<li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice%3A+potential+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li>
<li>Li, Y. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li>
<li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &amp, Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li>
<li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li>
<li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li>
<li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+differentiate+into+haematopoietic+lineages+but+retain+myogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential.</a> Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).</li>
<li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Musculoskelet+Neuronal+Interact%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li>
<li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &amp, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Orthop+Surg%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Uznano, że niektóre tkanki dorosłych zawierają liczne komórki macierzyste. W ciągu ostatnich kilku lat badań komórki macierzyste wykryto w miękkich tkankach mięśniowo-szkieletowych, w tym w mięśniach szkieletowych i ścięgnach. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę, znaną jako zmodyfikowana technika preplatowania (modified preplate technique), która była z powodzeniem stosowana w naszym laboratorium do izolowania dorosłych komórek macierzystych ze ścięgien i mięśni szkieletowych. Stosując opisaną powyżej zmodyf...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>#11995-073</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska inaktywowana termicznie</td><td>Invitrogen</td><td>#26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z zarodka kurczego</td><td>Accurate Chemical</td><td>#CE650T-10</td><td></td></tr><tr><td>100U ml penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco</td><td>Invitrogen</td><td>#14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Zbuforowany roztwór soli Hanksa</td><td>Invitrogen</td><td>#24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu XI 0.2%(wt/vol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C7657</td><td></td></tr><tr><td>Dispaza 2.4U ml</td><td>Invitrogen</td><td>#17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0.5%(wt/vol) (10x; 5g liter trypsyny (1:250)</td><td>Invitrogen</td><td>#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen do powlekania kolby: kolagen typu I pochodzący ze skóry cielęcej 0.1 g liter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C-9791</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>#D-2650</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Dorosłe komórki macierzyste od dawna są przedmiotem dyskusji w kontekście ich zastosowania w medycynie regeneracyjnej. Dorosłe komórki macierzyste wzbudziły ogromne zainteresowanie w leczeniu uszkodzonych i chorych tkanek ze względu na ich imponującą zdolność do różnicowania wieloliniowego oraz zdolność do samoodnowy. Co najważniejsze, cechy te sprawiły, że są one korzystne do zastosowania w terapiach autologicznego przeszczepiania komórek. Niniejszy protokół przybliży czytelnikom zmodyfikowaną technikę preplate, w której tkanki miękkie układu mięśniowo-szkieletowego, np. ścięgno i mięsień, są 1stenzymatycznie dysocjowane, a następnie umieszczone w kolbach powlekanych kolagenem z pożywką. Nadpływ, składający się z pożywki i pozostałych pływających komórek, jest codziennie przenoszony seryjnie do nowych kolb. Komórki macierzyste przylegają do kolb najwolniej, co zazwyczaj zajmuje 5-7 dni (przeniesienia seryjne lub wysiew wstępny). Dzięki zastosowaniu tej techniki, dorosłe komórki macierzyste obecne w tych tkankach mogą być łatwo pozyskiwane za pomocą dość nieinwazyjnych procedur.

Izolacja dorosłych komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie szybkości przylegania komórek do kolby.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Komórki macierzyste dorosłych od dawna są przedmiotem dyskusji w kontekście ich zastosowania w medycynie regeneracyjnej. Komórki macierzyste dorosłych wzbudziły ogromne...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja dorosłych komórek macierzystych z tkanek miękkich układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak mięśnie szkieletowe. Cel ten osiąga się poprzez pobranie biopsji tkanki miękkiej, jej oczyszczenie i drobne posiekanie. Drugim etapem procedury jest enzymatyczne trawienie tkanki.Trzecim krokiem procedury jest izolacja komórek macierzystych poprzez powtarzane etapy wstępnego wysiewu. Ostatnim krokiem procedury jest identyfikacja wyizolowanych komórek macierzystych. Ostatecznie można uzyskać wyniki obrazujące morfologię i zachowanie komórkowe za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii oraz/lub cytometrii przepływowej.Witajcie, jestem y Lee z Laboratorium Patologii Molekularnej w Katedrze Chirurgii Ortopedycznej na Uniwersytecie w Pittsburghu. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wyizolować dorosłą komórkę macierzystą z tkanek miękkich układu Mus skeletal, takich jak mięsień szkieletowy. Dzień dobry, jestem dr Johnny Ward.Jestem profesorem w School of Medicine Uniwersytetu w Pittsburghu w Departamencie Chirurgii Ortopedycznej. Ściśle współpracuję z dr Young Lee nad procedurami izolacji różnych typów komórek macierzystych z mięśni szkieletowych i innych tkanek, takich jak tkanka tłuszczowa. Wykorzystujemy te procedury w naszym laboratorium do izolacji komórek macierzystych, głównie na potrzeby badań nad zastosowaniami w medycynie translacyjnej.Przejdźmy do części praktycznej. Tkankami, z których można wyizolować komórki macierzyste, mogą być ścięgna oraz mięśnie szkieletowe pobrane z kości piszczelowej lub mięśni płaszczowatych kończyny tylnej myszy typu dzikiego. Po usunięciu resztek skóry i kości, umieść tkanki w naczyniu zawierającym zimny HBSS uzupełniony o 5%FBS.Następnie umieść tkanki osobno w naczyniach powlekanych kolagenem zawierających zimny HBSS. Do zaprezentowania podstawowych procedur dysocjacji i trawienia tkanek wykorzystamy tkankę mięśnia szkieletowego. Za pomocą mikronozycerzy i/lub ostrzy skalpela posiekaj tkankę szkieletową na grubą papkę przed trawieniem enzymatycznym tkanek.Zacznij od przeniesienia zawiesin tkankowych MIT do oddzielnych probówek o pojemności 15 mililitrów i wirowania przy prędkości około 3 500 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Usuń płukanie SANE, resuspendując w HBSS, i powtórz wirowanie. Po usunięciu supernatantu poddaj zawiesiny trawieniu, dodając 10 mililitrów podgrzanej wcześniej 0,2% kolagenazy.Inkubuj typ 11 przez 60 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając probówkami ręcznie co 10 minut. Po zakończeniu 60-minutowej inkubacji odwiruj próbki, a następnie ponownie zawieś osady w 10 ml roztworu DYS space. Inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając ręcznie co 10 minut. Po zakończeniu 45-minutowej inkubacji odwiruj i ponownie zawieś osady w 10 ml 0,2% roztworu trypsyny w buforze HBSS.Zazwyczaj inkubujemy przez 15 do 20 minut w temperaturze 37°C, odwracając probówki co 10 minut, aż inkubacja zostanie zakończona. Gdy z tkanek uwolni się odpowiednia liczba pojedynczych komórek, jak pokazano tutaj, odwiruj otrzymane komórki i ponownie zawieś osad komórkowy w 5 mL pożywki do proliferacji PM. Rozbij zawiesinę komórkową, przepuszczając ekstrakt dwukrotnie przez igłę o rozmiarze 18 G, następnie raz przez igłę o rozmiarze 23 G i na koniec raz przez igłę o rozmiarze 27 G.Na koniec przepuść ekstrakt komórkowy przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm, aby rozpocząć technikę prepl. Odwiruj przygotowany właśnie ekstrakt komórkowy i resuspenduj osad w medium proliferacyjnym. Przenieś 5 mL mieszaniny komórek na flask T 25 pokryte kolagenem i oznacz jako PP1; inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i nawilżoną atmosferą przez dwie godziny.Po dwóch godzinach przenieść komórki nieprzylegające do nowej kolby T 25 powlekanej kolagenem i oznaczyć ją jako PP dwa. Do poprzedniej kolby T 25 oznaczonej jako PP jeden dodać 5 mL medium PM.Obie kolby należy zwrócić do inkubatora na 24 godziny. Po 24 godzinach przenieść komórki nieprzytwierdzalne z kolby PP two do nowej kolby T 25 powleczonej kolagenem ENC i oznaczyć ją jako PP three. Do kolby oznaczonej jako PP two dodać pięć mililitrów pożywki proliferacyjnej.Przenieś kolby z powrotem do inkubatora. Powtarzaj tę procedurę co 24 godziny aż do populacji PP sześć. Populacja komórek macierzystych zostaje utworzona.Izolowane komórki PP six występują w bardzo małej liczbie i muszą być utrzymywane w bogatej w FBS pożywce proliferacyjnej. Pożywka ta musi być wymieniana codziennie. Należy jednak pamiętać, że większość komórek w hodowli PP six obumrze w ciągu kolejnych jednego do dwóch tygodni hodowli.Duża, zdrowa populacja PP six jest zazwyczaj tworzona po dodatkowych jednym do dwóch tygodniach ekspansji. Należy również utrzymywać wszystkie pozostałe grupy komórek w zawiesinie, umożliwiając im proliferację i regularnie badając je za pomocą mikroskopu odwróconego. Wczesne komórki przylegające, które przytwierdzają się do kolb PP one oraz PP two, to głównie komórki włókniste.Komórki, które przylegają do kolagenowanych kolb po dłuższym czasie, od 48 do 96 godzin. Pasaże PP3 i PP4 to głównie mioblasty. Podczas gdy komórki satelitarne mięśni są często obserwowane głównie w PP5, późniejsze komórki prepl po 96 godzinach lub później (PP6) są uznawane za dorosłe komórki macierzyste i wydają się małe, okrągłe i półprzezroczyste.Na początku procesu izolacji można je dodatkowo scharakteryzować za pomocą immunohistochemii w celu oceny ekspresji markerów komórek macierzystych, takich jak antygen komórek macierzystych 1 oraz CDC 34. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób izolacji komórek macierzystych z szpiku kostnego myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały czas zachowywać sterylność.Po wyizolowaniu komórek macierzystych należy pamiętać o ich hodowli przy niskiej gęstości, aby zachować ich charakter charakterystyczny dla komórek macierzystych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w pracy oraz sukcesów w zastosowaniu tej metody w Państwa eksperymentach.Dziękujemy.

isolating-stem-cells-from-soft-musculoskeletal-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek narządów ruchu

W tym filmie pokazano, jak przeprowadzić mikrodysekcję pęcherzyka żółtkowego oraz regionu aorta-gonady-metanefrosy z embrionów i wykorzystać cytometrię przepływową do sortowania hematopoetycznych komórek macierzystych.

Izolacja wczesnych hematopoetycznych komórek macierzystych z worka żółtkowego i obszaru AGM myszy

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Naczynia krwionośne w ludzkich mięśniach szkieletowych zawierają kilka wieloliniowych populacji prekursorów, które są idealne do zastosowań regeneracyjnych. Ta metoda izolacji pozwala na jednoczesne oczyszczanie trzech multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych odpowiednio z trzech warstw strukturalnych naczyń krwionośnych: miogennych komórek śródbłonka z błony wewnętrznej, perycytów z pożywki i komórek przybyszowych z przydanki.

Izolacja multipotencjalnych prekursorów pochodzących z naczyń krwionośnych z ludzkich mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji długoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych (LT-HSC) i krótkoterminowych komórek macierzystych (ST-HSC) za pomocą systemu reporterowego Hoxb5.

Metoda izolacji długotrwałych i krótkoterminowych hematopoetycznych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych mięśni i fibro-adipogennych komórek progenitorowych z indywidualnych mięśni szkieletowych u myszy. Protokół obejmuje rozwarstwienie pojedynczego mięśnia, izolację komórek macierzystych przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją, ocenę czystości za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego oraz ilościowy pomiar wejścia w fazę S za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny.

Izolacja spoczynkowych populacji komórek macierzystych od poszczególnych mięśni szkieletowych

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj metodę izolacji komórek macierzystych z miękkich tkanek układu mięśniowo-szkieletowego, w tym mięśni szkieletowych. Technika obejmuje biopsję, trawienie enzymatyczne i wielokrotne przepłukiwanie, umożliwiając badania w medycynie regeneracyjnej.

Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów