Niebieska natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest scharakteryzowanie kompleksu MultiPro z lizatów komórkowych przy użyciu niebieskiej natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, która w przeciwieństwie do strony SDS umożliwia separację białek w warunkach natywnych i zachowuje interakcje białek białkowych. Osiąga się to poprzez dializację lizatu komórkowego w celu usunięcia nadmiaru soli, dzięki czemu próbka ma zastosowanie do separacji za pomocą niebieskiej natywnej strony jako drugiego etapu. Lizat nakłada się na pierwszą niebieską stronę natywną, która oddziela kompleksy białkowe w warunkach natywnych zgodnie z ich wielkością i kształtem.

Następnie, drugi wymiar. Strona denaturacji SDS jest wykonywana w celu podziału kompleksów na poszczególne ich składniki. Białka można uwidocznić za pomocą barwienia srebrem lub kumasi lub western blotting.

Tutaj oddzielone białka zostały wykryte przez barwienie srebra w poniższej demonstracji, jednak zostanie zastosowany western blot. Cześć, nazywam się Brita Bloom i pracuję w laboratorium Wolfganga Sharmela na Wydziale Immunologii Molekularnej w Instytucie Immunobiologii im. Maxa Planka w Frybergu w Niemczech. Cześć, nazywam się Dina Fiala.

Ja też jestem z Sham Lab. Dziś pokażemy Państwu procedurę analizy kompleksów MultiPro z lizatów komórkowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania składu wielojednojednostkowych receptorów błonowych.

Jednak w tym filmie używamy proteasomu tic jako przykładu. Więc zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury przygotuj wszystkie zgodnie z opisem w pisemnym protokole i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zbierz 10 milionów komórek HEC 2 9 3 i otul je przez odwirowanie w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj granulki komórek jednym mililitrem lodowatego PBS i użyj wirówki, aby osadzać umyte komórki. Powtórz to pranie dwukrotnie, a następnie ponownie zawieś umyte osady komórkowe w 250 mikrolitrach lodu.

Zimny błękit, natywna liza, bufor i inkubacja zawiesiny na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji odwirować żywe komórki w temperaturze 13 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć nierozpuszczalny materiał. W międzyczasie rozpuść otwór w nasadce 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej za pomocą podgrzanej strony pipety do makaronu o dużej średnicy.

Następnie umieść rurkę na lodzie, aby ostygła do czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania przenieść lizat do probówki w celu usunięcia soli za pomocą dializy. Umieść membranę dializacyjną o mocy 10 kilodaltonów na wierzchu otwartej probówki.

Zamknij nakrętkę i usuń nadmiar membrany dializacyjnej, która wystaje. Następnie ostrożnie uszczelnij bok nakrętki paramem po uszczelnieniu, odwróć rurkę i umieść ją do góry nogami w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Odwirować próbkę z najniższą możliwą prędkością przez 10 sekund.

W wirówce do hodowli komórkowych przygotować 100-mililitrową zlewkę z zimnym niebieskim natywnym buforem do dializy i mieszadłem magnetycznym, używając co najmniej 10 mililitrów niebieskiego natywnego buforu dializacyjnego na 100 mikrolitrów próbki. Następnie wyjmij odwróconą rurkę ze stożkowej rurki za pomocą pęsety. Aby uniknąć obracania rurki prawą stroną do góry.

Umieść probówkę taśmą do góry nogami wewnątrz zlewki i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z otworu pod nakrętką. Za pomocą wygiętej pipety przełączyć na mieszadło magnetyczne i pozostawić próbkę na sześć godzin lub na noc w chłodni w celu dializy. Od czasu do czasu sprawdzaj próbkę, aby upewnić się, że mieszanie nie powoduje powstawania pęcherzyków powietrza na membranie dializy.

Po inkubacji przenieś lizat komórek dializy do nowej schłodzonej mikroprobówki wirówkowej i pozostaw na lodzie do momentu obciążenia gradientu żelu. Nalewanie żelu odbywa się w temperaturze pokojowej za pomocą miksera gradientowego. Umieść mikser gradientowy na płycie mieszającej i przymocuj go do kawałka elastycznej rurki.

Zamknij kanał mieszalnika gradientowego za pomocą zaworu i zamknij rurkę za pomocą zacisku. Umieść mieszadło magnetyczne w cylindrze podłączonym do rurki. Następnie wkręć elastyczną rurkę do pompy perystaltycznej i przymocuj igłę strzykawki do jej końca.

Następnie umieść igłę między dwiema szklanymi płytkami w górnej części aparatu żelowego. Przygotować 4% i 15% roztwory żelu rozdzielającego tak, aby łączna objętość była równa objętości żelu rozdzielającego. Dodaj PS i TM mnie bezpośrednio przed.

Użyj i wlej roztwory żelu do odpowiednich cylindrów mieszalnika gradientowego. Następnie włącz i otwórz zawór. Naciśnij lewy cylinder, aby wypchnąć pęcherzyk powietrza z kanału łączącego dwa zbiorniki żelu.

Włącz pompę z prędkością pięciu mililitrów na minutę. Zdejmij zacisk i pozwól żelowi powoli przepływać między szklanymi płytkami. Powoli podnoś igłę, gdy żel się zatrzymuje, upewniając się, że igła zawsze znajduje się nad płynem.

Pozwól, aby cała ciecz dostała się do aparatu żelowego. Następnie delikatnie pokryj płyn izopropanolem i przepłucz aparat wodą destylowaną. Pozostaw żel do polimeryzacji przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przygotuj 3,2% żel do układania, dodając PS i TM mnie bezpośrednio przed użyciem. Wlej żel do układania na wierzch żelu separującego i wprowadź grzebień między szklane płytki, unikając pęcherzyków. Po polimeryzacji żelu do układania w stos należy schłodzić żel do czterech stopni Celsjusza bezpośrednio przed załadowaniem próbki.

Zdejmij grzebień, powoli wyciągając go pod kątem do płaszczyzny żelu. Pozwala to na szybkie przedostawanie się powietrza do kieszeni, co poprawia jakość studzienek w celu oddzielenia lizatu komórek dializowych przez niebieskie natywne obciążenie strony 20 mikrolitrów znacznika ferrytyny i 40 mikrolitrów lizatu dializy do suchych studzienek W temperaturze czterech stopni Celsjusza puste pasy są wypełnione równymi objętościami buforu dializacyjnego. Następnie nałóż próbki do każdej studzienki buforem z zimną katodą.

Napełnij komorę wewnętrzną buforem zimnej katody, a komorę alsa buforem zimnej anody. Pracuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza i stosuj napięcie 100 woltów, aż próbki dostaną się do żelu rozdzielającego. Następnie zwiększ napięcie do 180 woltów i uruchom żel, aż przód matrycy dotrze do końca żelu.

Bieg trwa od trzech do czterech godzin. Dla drugiej strony SDS przygotuj standardowy żel 10% SDS z jednym dużym pasem. Jeden pas dla znacznika masy cząsteczkowej i jeden pas dla podwielokrotności dializowanego lizatu kontrolnego, który został zmieszany z buforem próbki SDS i gotowany przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza, usuń niebieski żel natywny z płytek z aparatu do elektroforezy i delikatnie podważ jedną płytkę.

Usuń żel do układania w stos i wytnij pas niebieskiego żelu natywnej strony zawierającego interesujące Cię białka. Umieść niebieski plasterek żelu natywnej strony w próbce SDS, buforuj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce po inkubacji. Gotuj krótko plasterek żelu w kuchence mikrofalowej, a następnie inkubuj przez kolejne 15 minut.

W buforze próbki SDS na wytrząsarce usuń grzebień żelu SDS i napełnij trochę bufora SDS do studzienki, załaduj niebieski plasterek żelu natywnej strony do dużego dołka żelu SDS. Unikanie pęcherzyków powietrza. Możesz użyć pęsety, aby uzyskać pomoc, ponieważ plasterek żelu musi znajdować się dokładnie na żelu do układania.

Pokryj wycinek buforem próbki SDS, a następnie załaduj znacznik i kontrolę lizatu. Wykonaj elektroforezę i transfer białek zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby zinterpretować wyniki, ważne jest, aby wiedzieć, że pozycja białka na drugiej stronie niebieskiego natywnego SDS w drugim wymiarze świadczy o tym, czy białko jest częścią kompleksu MultiPro, czy nie.

Białka monomeryczne będą migrować po przekątnej hiperbolicznej ze względu na żel gradientowy w pierwszym wymiarze, a jako żel liniowy w drugim wymiarze, podjednostki kompleksów MultiPro znajdą się poniżej przekątnej, tworząc pionową linię. Jeśli określone białko jest częścią odrębnych kompleksów, w linii poziomej wykrywa się kilka plam. Podsumowując, dwuwymiarowe podejście do strony SDS z niebieską stroną natywną pozwala na określenie rozmiaru złożonej kompozycji MultiPro i względnej obfitości.

W tej demonstracji kilka proteasomu lub podjednostek zostało wykrytych przez western blot. Podjednostki beta two i MCP 21 mogą być wykryte jako pojedyncze plamki, które są ułożone pionowo, co wskazuje, że są częścią tych samych kompleksów. PA 28 znajduje się w jednej linii pionowej z beta dwa i CP 21, a zatem jest częścią tego samego kompleksu.

Patrząc na poziome linie, można zauważyć, że beta two i MCP 21 są częścią trzech odrębnych kompleksów. PA 28 występuje tylko w jednym z tych kompleksów. Dlatego te kompleksy MultiPro można zidentyfikować jako proteasom sukcesu 20 s proteasom.

Wraz z samym P 28 i samym proteasomem 20 S, właśnie pokazaliśmy, jak oddzielić i scharakteryzować natywne kompleksy MultiPro z lizatu komórkowego za pomocą niebieskiej natywnej strony. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym dializie próbki. Aby uniknąć kontaktu z SDS i zawsze pracować na czterech stopniach, zalecamy porównanie różnych detergentów do lizy komórkowej, aby uzyskać zarówno integralność silnika, ładne kompleksy, jak i najlepszą rozpuszczalność.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach. Wejdę.