Name: Niebieska natywna elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj metodę BN-PAGE do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych. Technika ta zachowuje natywne interakcje białkowe i umożliwia identyfikację składników kompleksów poprzez dwuwymiarową elektroforezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Michaelowi Rethowi, Hermannowi Schäggerowi oraz Margaricie Camacho-Carvajal za wsparcie naukowe. Praca ta była finansowana przez FORSYS z Bundesministerium fuer Bildung and Forschung (BMBF), przez BIOSS z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) oraz częściowo wspierana przez Excellence Initiative rządów federalnego i krajowych Niemiec (GSC-4, Spemann Graduate School).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

W niniejszym badaniu opisujemy analizę MPC za pomocą BN-PAGE. Zastosowano podejście 2D, aby najpierw rozdzielić MPC w warunkach natywnych, a następnie dalej podzielić je na poszczególne komponenty w drugim wymiarze za pomocą SDS-PAGE.
Próbki przygotowuje się z lizatów komórkowych. Do solubilizacji wielu MPC niezbędny jest odpowiedni detergent, który zachowuje strukturę kompleksów białkowych. W tym przypadku stosujemy 0,1% Triton X-100. Należy jednak empirycznie określić optymalny detergent i jego odpowiednie stężenie dla każdego MPC. W przypadku Triton X-100 zgłaszano na przykład, że niskie stężenia detergentu umożliwiają identyfikację dimeru kompleksu F1F0-ATPase (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Wyższe stężenia Triton X-100 prowadzą jednak do dysocjacji dimeru i odpowiadającego temu wzrostu ilości monomeru kompleksu F1F0-ATPase. Jest to zgodne z jednym z naszych wcześniejszych badań, w którym wykazaliśmy, że wielowartościowy kompleks receptora limfocytów T (TCR) zostaje zachowany podczas ekstrakcji niskimi stężeniami Brij 96, podczas gdy zastosowanie wyższego stężenia lub innego detergentu, zwanego digitoniną, skutkuje ekstrakcją monomerów TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Do powszechnie stosowanych detergentów, które można przetestować, należą digitonina (0,5 do 1%), Triton X-100 (0,1 do 0,5%), Brij 96 (0,1 do 0,5%) lub dodecylmaltosid (0,1 do 0,5%). Odczynniki te są detergentami niejonowymi, które zazwyczaj najlepiej zapewniają stabilność MPC. Należy pamiętać, że należy unikać kontaktu z SDS i innymi silnymi detergentami (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004).
Dializa lizatów jest niezbędna do uzyskania rozdzielenia MPC w żelu BN (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004); (Heiss, Junkes et al. 2005). Wydaje się, że dostosowanie stężenia soli lub usunięcie zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej ma kluczowe znaczenie dla wysokiej rozdzielczości. Warto zauważyć, że do BN-PAGE nadają się również preparaty błon oraz MPC, które zostały oczyszczone immunologicznie, a następnie eluowane z przeciwciał (Swamy, Siegers et al. 2006). W obu przypadkach próbki nie muszą być poddawane dializie przed rozdziałem BN-PAGE, jeśli liza błon lub elucja są przeprowadzane w buforze do lizy BN.
Do rozdziału białek metodą BN-PAGE niezbędny jest barwnik Coomassie blue, który wiąże się nieswoiście z białkami i nadaje im ładunki ujemne. Dzięki temu Coomassie blue umożliwia ruch elektroforetyczny białek w kierunku katody przy neutralnym pH (Schägger and von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al. 1994). Ponadto Coomassie blue zapobiega agregacji białek w żelu koncentrującym podczas elektroforezy. Do BN-PAGE należy stosować Coomassie G250 zamiast Coomassie blue R250 lub koloidalnych form Coomassie blue.
Przed przeprowadzeniem elektroforezy BN-gel należy upewnić się, że stężenie żelu jest odpowiednie dla oczekiwanego rozmiaru badanego MPC. Gotowe żele BN-gel o różnych gradientach wraz z odpowiednimi buforami są dostępne w sprzedaży od firmy Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Żele BN-gel można jednak przygotować również samodzielnie, używając mieszalnika gradientowego wraz z pompą perystaltyczną. Aby zagwarantować nienaruszony gradient, ciecz powinna płynąć stale podczas wlewania, a należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Zalecamy nakładanie na żel próbek o różnych rozcieńczeniach, ponieważ zbyt duże obciążenie może prowadzić do precypitacji białek w trakcie procesu elektroforezy. Ponadto elektroforezę BN-gel należy prowadzić w temperaturze 4°C, aby zapobiec degradacji białek i zachować nienaruszoną strukturę MPC.
Po wykonaniu BN-PAGE wizualizację MPC można przeprowadzić za pomocą barwienia błękitem Coomassie, barwienia srebrem lub immunoblottingu. Prążki białkowe uwidocznione po barwieniu błękitem Coomassie lub srebrem nadają się do dalszej analizy metodą spektrometrii mas (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). W przypadku immunoblottingu optymalne warunki transferu dla analizowanych MPC należy określić empirycznie. Należy pamiętać, że podczas transferu z żelu BN błękit Coomassie również ulega przeniesieniu. W związku z tym po pomyślnym transferze żel stanie się bezbarwny, natomiast membrana przybierze niebieski kolor. Ponadto ważne jest zaznaczenie, że nie każde przeciwciało pierwszorzędowe, które sprawdza się w detekcji po SDS-PAGE, nadaje się do immunoblottingu po BN-PAGE. Może się zdarzyć, że przeciwciała nie rozpoznają analizowanego MPC, ponieważ jego epitop jest ukryty w natywnej konformacji białek. Aby rozwiązać ten problem, można zdenaturować białka w żelu BN przed transferem, krótko gotując żel w 1x buforze do próbek SDS.
W naszym przykładzie nie poddaliśmy żelu BN bezpośrednio detekcji prążków białkowych. Zamiast tego, lizat rozdzielony za pomocą BN-PAGE podzieliliśmy dalej w drugim wymiarze za pomocą SDS-PAGE. W żelu SDS drugiego wymiaru białka monomerowe migrują wzdłuż hiperbolicznej przekątnej ze względu na zastosowanie żelu gradientowego w pierwszym wymiarze i żelu liniowego w drugim wymiarze (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Pozwala to na łatwą identyfikację MPC, ponieważ znajdują się one poniżej tej hiperbolicznej przekątnej. Subkomponenty jednego, wyraźnego MPC są rozdzielone w linii pionowej w SDS-PAGE drugiego wymiaru. Komponenty będące składnikami kilku różnych MPC można zidentyfikować w linii poziomej, zgodnie z wielkością MPC. Należy jednak wziąć pod uwagę, że kilka plamek białkowych pojawiających się w jednej linii pionowej może również być częścią osobnych kompleksów, które migrują w tej samej pozycji w BN-PAGE. Ostateczny dowód na to, że znajdują się one w tym samym MPC, można uzyskać za pomocą testu przesunięcia w żelu z użyciem przeciwciał (antibody-based gel shift assay). W tym teście lizat komórkowy przed BN-PAGE inkubuje się z przeciwciałem przeciwko białku reprezentowanemu przez jedną z zidentyfikowanych plamek. Skutkuje to przesunięciem wszystkich MPC zawierających to białko w stronę wyższej masy cząsteczkowej w pierwszym wymiarze. Inne białka, które również są częścią tych MPC, ulegną temu specyficznemu dla kompleksu przesunięciu i są zatem łatwe do zidentyfikowania w żelu SDS drugiego wymiaru.
BN-PAGE umożliwia nie tylko analizę składu MPC, ale także określenie ich stechiometrii (Schamel and Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al. 2007). W tym celu można przeprowadzić test NAMOS (natywny test przesunięcia ruchliwości oparty na przeciwciałach). Podobnie jak w żelowym teście przesunięcia opartym na przeciwciałach, lizaty komórkowe inkubuje się z monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi dla poszczególnych podjednostek. Prowadzi to do indukcji elektroforetycznych przesunięć immunologicznych w żelach BN, co pozwala wywnioskować stechiometrię MPC na podstawie zakresu przesunięcia
Podsumowując, metoda BN-PAGE nadaje się do identyfikacji MPC oraz określania ich wielkości, składu, a także względnej obfitości. Wykonana jako analiza NAMOS, oferuje ona również możliwość wyznaczenia stechiometrii konkretnego MPC. Biorąc pod uwagę jej ogólną stosowalność, technika ta stanowi bardzo użyteczne narzędzie do charakteryzacji MPC (Dekker, Müller et al. 1996); (Wittig and Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al. 2009); (Wittig and Schägger 2009).

błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (bn-page) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Kompleksy wielobiałkowe (MPCs) odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej, ponieważ większość białek występuje w funkcjonalnych lub regulacyjnych kompleksach z innymi białkami (Sali, Glaeser et al. 2003). Zatem badanie sieci oddziaływań białko-białko wymaga szczegółowej charakterystyki MPCs w celu uzyskania zintegrowanego zrozumienia funkcji i regulacji białek. Do identyfikacji i analizy MPCs muszą zostać rozdzielone w warunkach natywnych. W tym filmie opisujemy analizę MPCs za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). BN-PAGE jest techniką, która pozwala na rozdzielanie MPCs w konformacji natywnej z wyższą rozdzielczością niż oferuje filtracja żelowa lub ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy, i jest zatem użyteczna do określania wielkości, składu i względnej zawartości MPCs (Schägger and von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al. 1994). Metodą tą białka są rozdzielane w matrycy poliakrylamidowej zgodnie z ich rozmiarem hydrodynamicznym i kształtem. Tutaj demonstrujemy analizę MPCs w całkowitych lizatach komórkowych, wskazując, że dializa lizatu jest kluczowym krokiem umożliwiającym zastosowanie BN-PAGE do tych próbek biologicznych. Stosując kombinację BN-PAGE w pierwszym wymiarze i SDS-PAGE w drugim wymiarze, pokazujemy, że MPCs rozdzielone za pomocą BN-PAGE mogą być dalej dzielone na poszczególne składniki za pomocą SDS-PAGE. Wizualizacja komponentów MPCs po rozdzieleniu w żelu jest wykonywana za pomocą standardowego immunoblottingu. Jako przykład analizy MPCs metodą BN-PAGE wybraliśmy dobrze scharakteryzowane eukariotyczne proteasomy 19S, 20S i 26S.

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Kompleksy wielobiałkowe (MPC) odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej, ponieważ większość białek występuje w formie funkcjonalnych lub regulacyjnych kompleksów z innymi ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest charakterystyka kompleksu MultiPro z lizatów komórkowych przy użyciu elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w warunkach natywnych z użyciem barwnika Blue Native (BN-PAGE), która w przeciwieństwie do SDS-PAGE pozwala na rozdzielanie białek w warunkach natywnych i zachowuje oddziaływania białko-białko. Osiąga się to poprzez dializę lizatu komórkowego w celu usunięcia nadmiaru soli, co w drugim kroku umożliwia rozdzielenie próbki za pomocą BN-PAGE. Lizat nanosi się na pierwszą wymiarowość BN-PAGE, która rozdziela kompleksy białkowe w warunkach natywnych w zależności od ich wielkości i kształtu.Następnie wykonuje się drugi wymiar. Denaturująca elektroforeza SDS-PAGE jest przeprowadzana w celu rozdzielenia kompleksów na ich poszczególne składniki. Białka można zwizualizować za pomocą barwienia srebrem, barwienia Coomassie lub techniki western blotting.W poniższej prezentacji do wykrywania rozdzielonych białek wykorzystano barwienie srebrem, jednak w rzeczywistości zastosowany zostanie western blotting. Cześć, jestem Brita Bloom z laboratorium Wolfganga Sharmela w Katedrze Immunologii Molekularnej w Instytucie Immunobiologii Maxa Plancka we Frybergu w Niemczech. Cześć, jestem Dina Fiala.Również pochodzę z laboratorium Sham. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy kompleksów MultiPro z lizatów komórkowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania składu wielopodjednostkowych receptorów błonowych.W tym filmie jako przykład posłuży nam proteasom tic. Zatem zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować wszystkie bufory zgodnie z opisem w protokole pisemnym i przechowywać je w temperaturze 4 °C.Zebrać 10 milionów komórek HEC 2 9 3 i osadzić je poprzez wirowanie przy 350 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Następnie przemyć osad komórkowy 1 mL lodowatego PBS i ponownie odwirować, aby uzyskać osad z przemytych komórek. Powtórzyć to przemywanie dwukrotnie, a następnie zawiesić przemyty osad komórkowy w 250 µl lodu.Dodaj zimny bufor do lizy natywnej i inkubuj zawiesinę na lodzie przez 15 minut. Po inkubacji odwiruj lizat z prędkością 13 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć materiały nierozpuszczalne. W międzyczasie wykonaj otwór w zakrętce probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, używając rozgrzanego, szerokiego końca pipety Pasteura.Następnie umieścić probówkę w lodzie, aby schłodzić ją do 4 °C. Po zakończeniu wirowania przenieść lizat do probówki przeznaczonej do usuwania soli poprzez dializę. Na wierzchu otwartej probówki umieścić membranę dializacyjną z granicą odcięcia 10 kDa.Zakręć nakrętkę i odetnij nadmiar membrany dializacyjnej wystający poza nią. Następnie ostrożnie uszczelnij boki nakrętki parafiny; po uszczelnieniu odwróć probówkę i umieść ją dnem do góry w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wirowarkuj próbkę z najniższą możliwą prędkością przez 10 sekund.W wirówce do hodowli komórkowych przygotować zlewkę o pojemności 100 ml z zimnym buforem do dializy blue native oraz mieszadłem magnetycznym, stosując co najmniej 10 ml buforu do dializy blue native na każde 100 µl próbki. Następnie za pomocą pęsety wyjąć odwróconą probówkę z probówki stożkowej. Należy unikać ustawiania probówki w pozycji pionowej.Przymocuj probówkę taśmą do dna zlewki w pozycji odwróconej i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z otworu pod zakrętką. Za pomocą zakrzywionej pipety Pasteura włącz mieszadło magnetyczne i pozostaw próbkę na sześć godzin lub na noc w pomieszczeniu chłodniczym w celu dializy. Okazjonalnie sprawdzaj próbkę, aby upewnić się, że mieszanie nie powoduje powstawania pęcherzyków powietrza przy membranie dializacyjnej.Po inkubacji przenieś dializowany lizat komórkowy do nowej, schłodzonej probówki do mikrocentryfugi i pozostaw go na lodzie do czasu załadunku na żel gradientowy. Odlewanie żelu przeprowadza się w temperaturze pokojowej przy użyciu mieszalnika do gradientów. Umieść mieszalnik do gradientów na mieszadle magnetycznym i podłącz go do odcinka elastycznego wężyka.Zamknij kanał mieszalnika gradientowego za pomocą zaworu i zaciskaj przewodzik zaciskiem. Umieść mieszadło magnetyczne w cylindrze połączonym z przewodzikiem. Następnie przełóż elastyczny przewód przez pompę perystaltyczną i przymocuj do jego końca igłę strzykawki.Następnie umieść igłę pomiędzy dwiema szklanymi płytkami u góry aparatu do elektroforezy. Przygotuj roztwory żelu rozdzielczego o stężeniu 4% i 15%, tak aby ich łączna objętość była równa objętości żelu rozdzielczego. Bezpośrednio przed tym dodaj PS i TM.Należy użyć i wlać roztwory żelu do odpowiednich cylindrów mieszalnika gradientowego. Następnie należy włączyć urządzenie i otworzyć zawór. Należy nacisnąć lewy cylinder, aby wypchnąć pęcherzyk powietrza znajdujący się w kanale łączącym dwa zbiorniki z żelem.Włącz pompę, ustawiając przepływ na pięć mililitrów na minutę. Zdejmij zacisk i pozwól, aby żel powoli przepływał między płytkami szklanymi. Powoli podnoś igłę w przerwach w przepływie żelu, upewniając się, że igła zawsze znajduje się powyżej cieczy.Pozostaw całą ciecz w aparaturze do żelowania. Następnie delikatnie przykryj ciecz izopropanolem i wypłucz aparaturę wodą destylowaną. Pozostaw żel do polimeryzacji na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy przygotować 3,2% żel koncentrujący, dodając PS i TM bezpośrednio przed użyciem. Wylać żel koncentrujący na wierzch żelu rozdzielającego i umieścić grzebień pomiędzy płytkami szklanymi, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Po spolimeryzowaniu żelu koncentrującego należy go schłodzić do 4 °C bezpośrednio przed naniesieniem próbek.Powoli wyjmij grzebień, wyciągając go pod kątem do płaszczyzny żelu. Pozwala to na szybkie dostanie się powietrza do wgłębień, co poprawia jakość studzienek. Aby rozdzielić dializowany lizat komórkowy metodą blue native PAGE, nanieś 20 µL markera ferrytyny oraz 40 µL dializowanego lizatu do suchych studzienek w temperaturze 4 °C. Puste ścieżki wypełnij równymi objętościami buforu do dializy. Następnie przykryj próbki w każdej studience zimnym buforem katodowym.Wypełnij komorę wewnętrzną zimnym buforem katodowym, a komorę alsa zimnym buforem anodowym. Pracuj w temperaturze 4 °C i przyłóż napięcie 100 V, aż próbki wejdą w żel rozdzielający. Następnie zwiększ napięcie do 180 V i prowadź elektroforezę do momentu, aż front barwnika dotrze do końca żelu.Przebieg procesu trwa od trzech do czterech godzin. Do elektroforezy SDS-PAGE w drugim wymiarze należy przygotować standardowy żel SDS 10% z jedną szeroką ścieżką. Jedna ścieżka służy do naniesienia markera masy cząsteczkowej, a druga do naniesienia alikwotu kontrolnego dializowanego lizatu, który został zmieszany z buforem do próbek SDS i gotowany przez pięć minut w 95 °C; należy wyjąć żel do Blue Native PAGE wraz z płytkami z aparatury elektroforetycznej i ostrożnie podważyć jedną z płytek.Usuń żel koncentrujący i wytnij ścieżkę z żelu BN-PAGE zawierającą białka będące przedmiotem zainteresowania. Umieść wycinek żelu BN-PAGE w buforze do próbek SDS i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Krótko zagotuj wycinek żelu w kuchence mikrofalowej, a następnie inkubuj przez kolejne 15 minut.W buforze do próbek SDS na wytrząsarce należy wyjąć grzebień z żelu SDS i wlać niewielką ilość buforu SDS do studzienki, a następnie załadować wycinek żelu Blue Native PAGE do dużej studzienki żelu SDS, unikając pęcherzyków powietrza. W celu ułatwienia procesu można posłużyć się pęsetą, ponieważ wycinek żelu musi znajdować się dokładnie na żelu zgrupowującym.Przykryj plasterek buforem do próbek SDS, a następnie nanieś marker i kontrolę lizatu. Przeprowadź elektroforezę oraz transfer białek zgodnie ze standardowymi protokołami. Aby zinterpretować wyniki, należy wiedzieć, że pozycja białka w drugim wymiarze dwuwymiarowej elektroforezy BN-SDS-PAGE pozwala określić, czy białko jest częścią kompleksu MultiPro.Białka monomeryczne będą migrować po hiperbolicznej przekątnej ze względu na żel gradientowy w pierwszym wymiarze, a w drugim wymiarze w postaci żelu liniowego; podjednostki kompleksów MultiPro będą znajdować się poniżej przekątnej, tworząc linię pionową. Jeśli dane białko wchodzi w skład różnych kompleksów, wykryte zostaną kilka plamek w linii poziomej. Podsumowując, dwuwymiarowe podejście z wykorzystaniem techniki BN-PAGE i SDS-PAGE pozwala na określenie składu, wielkości oraz względnej zawartości kompleksów MultiPro.W niniejszym pokazie metodą western blotting wykryto kilka proteasomów lub ich podjednostek. Podjednostki beta dwa oraz MCP 21 zostały wykryte jako pojedyncze plamki ułożone pionowo, co wskazuje, że stanowią one część tych samych kompleksów. PA 28 znajduje się w jednej linii pionowej z beta dwa i CP 21, co oznacza, że jest częścią tego samego kompleksu.Analizując linie poziome, można zauważyć, że beta dwa oraz MCP 21 są częścią trzech odrębnych kompleksów. PA 28 występuje tylko w jednym z tych kompleksów. Zatem te kompleksy MultiPro można zidentyfikować jako proteasom 20s, proteasom 20s.Wraz z P 28 oraz samym proteasomem 20 S pokazaliśmy właśnie, jak wyizolować i scharakteryzować natywne kompleksy MultiPro z lizatu komórkowego przy użyciu nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (blue native PAGE). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o dokładnej dializie próbki. Aby uniknąć kontaktu z SDS i zawsze pracować w temperaturze 4°C, zalecamy porównanie różnych detergentów do lizy komórkowej w celu zapewnienia zarówno integralności kompleksów MultiPro, jak i optymalnej solubilizacji.To już wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów. Do zobaczenia.

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Elektroforeza żelowa na niebieskim natywnym poliakrylamidowym żelu (BN-PAGE) do analizy kompleksów wieloproteinowych z lizatów komórkowych

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy technikę elektroforetyczną, zwaną niebieską natywną STRONĄ, do analizy mitochondrialnych kompleksów białkowych układu oddechowego w ich natywnie złożonym i funkcjonalnie aktywnym stanie. Anionowy niebieski barwnik Coomassie powoduje, że kompleksy białkowe stają się naładowane ujemnie, co umożliwia separację na podstawie wielkości i struktury.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym niebieskim: technika separacji bez denaturacji do analizy nienaruszonych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Ten film opisuje multimeryczną STRONĘ do oddzielania natywnych kompleksów białkowych od homogenatów tkankowych. Technika ta jest hybrydą niebieskich technik native-page i SDS-PAGE. Oddzielone kompleksy można scharakteryzować i zbadać pod kątem ich roli w funkcjonowaniu komórki.

Multimer-PAGE do separacji natywnych kompleksów białkowych: hybrydowa technika separacji składająca się z Blue native-PAGE i SDS-PAGE w celu oddzielenia nienaruszonych białek multimerycznych od lizatu tkankowego

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Ten protokół opisuje, jak przygotować i przeprowadzić przezroczystą elektroforezę uwięzienia frakcji płynnej z natywną żelową (CN-GELFrEE), natywną technikę separacji niekowalencyjnych zespołów biomolekularnych i białek z heterogenicznych próbek, która jest kompatybilna z różnymi technikami analizy białek.

CN-GELFrEE - Przezroczysta, natywna, eluowana w żelu, elektroforeza z uwięzieniem frakcji cieczy

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Tutaj prezentujemy protokół do analizy składu białkowego dużych natywnych kompleksów białko:białko i białko:kwasy nukleinowe z łyka rzepakowego (B. napus) przy użyciu metody elektroforezy 3D w żelu poliakrylamidowym (PAGE) łączącej niebieski natywny (BN) z dwoma denaturującymi PAGE, a następnie identyfikacją spektrometryczną mas.

Pobieranie próbek soku łyka z Brassica napus do 3D-PAGE kompleksów białkowych i rybonukleoproteinowych

Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Poznaj metodę BN-PAGE do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych. Technika ta zachowuje natywne interakcje białkowe i umożliwia identyfikację składników kompleksów poprzez dwuwymiarową elektroforezę.

Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Przeglądaj więcej filmów