Skłonność do oligomeryzacji domeny transbłonowej określona za pomocą testu ToxR

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie skłonności do więzadeł białek, domen transbłonowych lub T MD w naturalnym środowisku błonowym. Osiąga się to poprzez ekspresję domeny transbłonowej będącej przedmiotem zainteresowania u E. coli jako białka chimerycznego z białkiem wiążącym maltozę w celu lokalizacji w osoczu okołobiegunowym i toksynie. R jako reporter transkrypcyjny, ligamentyzacja indukowana domeną transbłonową powoduje dimeryzację toksyny R i aktywację transkrypcji LXi W drugim etapie komórki są lizowane i traktowane ONPG, który jest hydrolizowany przez beta galakto do absorbującego światło gatunku O nitrofolianu lub ONP.

Kolejne poziomy ONP są określane ilościowo, mierząc absorbencję światła na poziomie 405 nanometrów. W celu określenia poziomów domeny transbłonowej, wyniki ligamentacji ujawniają skłonność do ligamentacji domen transbłonowych na podstawie testu reporterowego toksyny R. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami biofizycznymi, takimi jak SDS lub fluorescencja, jest to, że zachowanie domeny transbłonowej jest badane w naturalnej dwuwarstwie fosfolipidowej przez ekspresję w E coli, a nie w systemie mimetycznym błony, takim jak sam detergent.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie białek błonowych, takie jak wyjaśnienie kluczowych cech strukturalnych związanych z transbłonową asocjacją helisy Przed rozpoczęciem tego protokołu z komercyjnie zsyntetyzowanych oligonukleotydów przygotowuje się siedem plazmidów wyrażających wymagane białko chimeryczne, reprezentujące TDS będące przedmiotem zainteresowania, otoczone przez NHE jeden i BMH jeden. Miejsca restrykcyjne po przygotowaniu plazmidów delikatnie rozmrozić kompetentne komórki fhk 12 na lodzie. Po rozmrożeniu przenieś komórki do 15-mililitrowych probówek hodowlanych po 200 nanogramów każdego DNA osocza do oddzielnej probówki i inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut.

Następnie poddać komórki szokowi cieplnemu przez 90 sekund w temperaturze 42 stopni Celsjusza, a następnie inkubować na lodzie przez dwie minuty w 800 mikrolitrach pożywki SOC i inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez godzinę po inkubacji, zaszczepić pięć mililitrów pożywki LB zawierającej chloramfenikol i aozę 50 mikrolitrami mieszaniny transformacyjnej, używając 15 mililitrowych probówek hodowlanych w trzech egzemplarzach dla każdej próbki. Na koniec inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 20 godzin. Aby zmierzyć całą ligamentację TDS, określa się aktywność tazy beta galakto.

Najpierw rozgrzej czytnik płytek do 28 stopni Celsjusza. Użyć zapasu buforowego Z do przygotowania świeżych roztworów buforowych Z zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Przenieść chloroform buforu Z z probówki do zbiornika, upewniając się, że przeprowadzono tylko górną warstwę wodnego chloroformu buforu Z.

Umieścić 96-dołkową płytkę na kartce papieru z narysowaną siatką w celu zapewnienia dokładnego pipetowania, przenieść 100 mikrolitrów chloroformu buforu Z do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce, a następnie pięć mikrolitrów każdej kultury w czwórce. Duplikat pomiń kulturę z czterech studni, które będą służyć jako puste miejsca. Zmierz średnicę zewnętrzną 5 95 płytki, aby określić gęstość komórek.

Dodać 50 mikrolitrów buforu Z SDS do wszystkich dołków płytki. Następnie potrząsać płytką w czytniku płytek przez 10 minut, aby po lizie komórek umieścić komórki w 50 mikrolitrach ZPA dla ONPG do wszystkich studzienek. Włóż płytkę z powrotem do czytnika płytek i mierz OD 4 0 5 co 30 sekund przez 20 minut.

Określ poziom aktywności beta laktosazy poprzez obliczenie jednostek Millera normalizujących się do ślepej próby. Western blot przeprowadza się w celu sprawdzenia równoważnej ekspresji białka między konstruktami. Najpierw połącz 50 mikrolitrów potrójnych kultur, a następnie odwiruj próbki za pomocą mikrowirówki.

Usunąć supernatant przez pipetowanie i reuscytację. Zawiesić pozostałą osadkę w dwóch x próbka ładująca bufor, załadować 7,5 mikrolitra każdej próbki na standardowy 8% żel i przeprowadzić elektroforezę przy napięciu 125 woltów przez godzinę i pięć minut po przeniesieniu. Inkubuj błonę z przeciwciałem sprzężonym anty M-V-P-H-R-P, aby uwidocznić chimeryczne białko obserwuje się przy około 70 kilodaltonach, a niektóre produkty degradacji czasami obserwuje się około 48 kilodaltonów.

Endogenne MVP obserwuje się również przy 45 kilodaltonach. W celu oceny prawidłowego wstawienia błony chimerycznego konstruktu TMD, linię komórkową PD 28 z niedoborem białka wiążącego maltozę stosuje się, gdy jest hodowana w minimalnej pożywce z maltozą jako jedynym źródłem węgla, mogą rosnąć tylko komórki wyrażające produkt ekspresji całki błonowej z białkiem wiążącym maltozę prawidłowo zlokalizowaną w plazmie peri. Przekształć komórki PD 28 zgodnie z opisem dla komórek fhk 12 i zaszczepić dwa mililitry pożywki LB.

Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 300 obr./min przez noc po inkubacji. Granulować komórki przez odwirowanie i przemyć zawiesiną Resus w dwóch mililitrach PBS i delikatnie pipetować dużą końcówką. Po granulowaniu komórki ponownie przemywa się PBS po raz drugi, a następnie przeprowadza końcowe odwirowanie i zawiesinę resusową w jednym mililitrze PBS.

Użyj 25 mikrolitrów zawieszonych komórek, aby zaszczepić pięć mililitrów minimalnej pożywki. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 15 godzin. Przenieś 200 mikrolitrów każdej próbki na 96-dołkową płytkę i dokonaj odczytu OD 5 9 5 za pomocą czytnika płytek.

Powtarzaj ten proces co dwie godziny do 25 godzin. Skłonność do więzałek wszystkich poszczególnych domen transbłonowych z wielu obejmujących błonę integralnego białka utajonego białka błonowego analizowano za pomocą testu reporterowego transkrypcji tox R. Piąta domena transbłonowa wykazuje silną skłonność do wzrostu liga, o czym świadczą wysokie jednostki Millera, co jest porównywalne z dobrze ugruntowaną sekwencją dimeryzującą GPAA kontroli pozytywnej.

Szkodliwa mutacja w domenie transbłonowej pięć D i 50 A zmniejsza zdolność sekwencji do wzrostu wszystkich lig LMP jeden, TM jeden nie powoduje znacznego wzrostu wszystkich lig i wykazuje bardzo niski sygnał jednostki Millera tuż nad sygnałem dla ślepej próby, którą są nieprzekształcone komórki FHK 12. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić, czy interesująca nas helisa transbłonowa ma zdolność tworzenia kompleksów wyższego rzędu w naturalnym środowisku membranowym Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby bardzo ostrożnie pipetować do płytki 96-dołkowej, aby uniknąć dużych błędów i upewnić się, że nie zostaną wprowadzone pęcherzyki powietrza.