Name: Skłonność do oligomeryzacji domeny transbłonowej określona za pomocą testu ToxR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj metodę oceny skłonności do oligomeryzacji domen transbłonowych przy użyciu testu ToxR w komórkach E. coli. Technika ta pozwala ilościowo określić interakcje białek w naturalnym środowisku błonowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy National Institutes of Health (1R21CA138373) oraz Stand Up to Cancer (SU2C) za wsparcie finansowe niniejszej pracy. H.Y. jest wdzięczny za przyznanie nagrody Elion Award 2009 przez American Association of Cancer Research, nagrody Kimmel Scholar Award z Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research (SKF-08-101) oraz National Science Foundation Faculty Early Career Award (NSF0954819).

1. Uwagi dotyczące klonowania
<ol>
 <li>Komercyjnie przygotowane oligonukleotydy reprezentujące interesującą domenę TMD, flankowane miejscami restrykcyjnymi NheI oraz BamHI i 5'-fosforylowane, mogą zostać ligowane do pTox7 (zmodyfikowanego w naszym laboratorium poprzez wstawienie jednej pary zasad bezpośrednio po miejscu restrykcyjnym BamHI14) (Rysunek 3) po sekwencyjnym trawieniu BamHI i NheI. Poniżej przedstawiono przykład oligonukleotydu: 
 5'ctagcTMDSEQUENCEg3' 
 3' gTMDSEQUENCEcctag5'</li>
</ol>
Sekwencja TMD powinna składać się z 12-24 reszt (krótsze sekwencje zostaną prawdopodobnie wydłużone przez zakodowane w wektorze reszty hydrofobowe). W celu zbadania interfejsu należy stworzyć cztery warianty projektu TMD, w których sekwencyjne insercje reszt i towarzyszące im delecje reszt spowodują rotację TMD względem ToxR.15,16 Na koniec należy zróżnicować stężenie arabinozy w zakresie od 0,01 do 0,01% (w/v), aby zidentyfikować stężenie, przy którym obserwuje się maksymalne różnice w sygnałach β-galaktosydazy pomiędzy różnymi sekwencjami TMD; zaleca się testowanie różnych poziomów ekspresji w celu ustalenia warunków, w których najlepiej można rozróżnić różne powinowactwa. Oprócz arabinozy i antybiotyków można zastosować 0,4 mM IPTG, aby zwiększyć różnice w powinowactwach pomiędzy różnymi TMD. Pomiar ToxR powinien zostać przeprowadzony co najmniej w czterech powtórzeniach. Cała procedura powinna zostać powtórzona co najmniej trzykrotnie z użyciem różnych transformacji plazmidowych.
2. Hodowla kultur bakteryjnych
<ol>
 <li>Powoli rozmrozić kompetentne komórki FHK12 (20 μl) na lodzie i przenieść je do probówki do hodowli o pojemności 15 ml. Dodać plazmidowe DNA (20 ng) i inkubować komórki na lodzie przez 30 min.</li>
 <li>Przeprowadzić szok termiczny poprzez inkubację przez 90 s w temperaturze 42 °C, a następnie inkubację na lodzie przez 2 min.</li>
 <li>Dodać pożywkę SOC (80 μl) i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm) przez jedną godzinę.</li>
 <li>Zaszczepić 5 ml pożywki LB z chloramfenikolem (30 μg/ml) i arabinozą (0,025% w/v), dodając 50 μl mieszaniny transformacyjnej do probówek do hodowli o pojemności 15 ml w trzech powtórzeniach. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm) przez 20 h. (Alternatywnie można użyć 5 μl hodowli do zaszczepienia 10 μl pożywki w płytce 96-dołkowej. Metoda ta jest przydatna przy pracy z dużą liczbą próbek, choć błędy będą nieco wyższe. Aby uniknąć parowania, które mogłoby prowadzić do błędów, należy wypełnić zewnętrzne dołki pożywką, nie wykorzystując ich do próbek. Na koniec miejsce styku pokrywki z płytką należy dwukrotnie owinąć parafilmem).</li>
</ol>
3. Pomiar aktywności β-galaktozydazy
<ol>
 <li>Podgrzej czytnik płytek do 28 °C.</li>
 <li>Przenieś bufor Z do zbiornika za pomocą końcówki do pipety o dużej objętości, upewniając się, że pobierana jest tylko górna (wodna) warstwa. Przenieś 100 μl świeżo przygotowanego buforu Z/chloroformu dołków płytki 96-dołkowej. Przenieś 5 μl każdą kulturę dołków płytki w czterech powtórzeniach. Pomiń kulturę w czterech dołkach, które będą służyć jako próba ślepa.</li>
 <li>Zmierz OD595 płytki w celu określenia gęstości komórek.</li>
 <li>Dodaj 50 μl buforu Z-buffer/SDS do wszystkich studni płytki. Wstrząsać płytkę w czytniku płytek przez 10 min w celu lizy komórek. Upewnić się, że po lizie zawiesiny komórkowe są klarowne; w razie potrzeby powtórzyć etap wstrząsania. Niepełna liza sugeruje, że bufor Z-buffer/chloroform nie został przygotowany na świeżo.</li>
 <li>Dodaj 50 μl do wszystkich dołków dodać świeżo przygotowany bufor Z/ONPG, ponownie umieścić płytkę w czytniku i zmierzyć OD405 co 30 s przez 20 min.</li>
 <li>Obliczyć aktywność β-galaktazydazy, korzystając z poniższego równania (pamiętając o odjęciu wartości tła). Stosunek OD405Wartość /min należy obliczyć, wykorzystując wszystkie punkty danych w OD.405 zakres od 0,0 do 1,0 przy użyciu dopasowania modelu liniowego.
 
<img src="/files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="Równanie wzoru na jednostki Millera dla analizy aktywności enzymatycznej, przedstawiające obliczanie stosunku OD405/OD595." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">
 
 Jednostki Millera mogą się czasami różnić w zależności od dnia pomiaru. Dlatego w każdym teście należy zmierzyć konstrukt referencyjny, taki jak GpA. Jego wartości mogą zostać wykorzystane do normalizacji wartości ToxR.</li>
</ol>
4. Kontrola ekspresji białka
<ol>
 <li>Przeprowadź analizę Western blot, aby zweryfikować jednolitość ekspresji białek pomiędzy konstruktami. Połącz 50 μl z trzech kultur i odwiruj (200 rpm, 4 min) w mikrocentry fudze. Usuń nadsącz za pomocą pipety i resuspenduj pozostały osad w buforze do ładowania próbek 2 x.</li>
 <li>Nałóż 7,5 μl na standardowy żel 8% i przeprowadź elektroforezę przy napięciu 125 V przez 1 godzinę i 5 minut. Po transferze inkubuj z przeciwciałem anty-MBP sprzężonym z HRP i przeprowadź wizualizację; białko chimeryczne jest widoczne przy około 70 kDa, a czasami obserwuje się produkty degradacji w okolicach 48 kDa. Endogenne MBP jest również widoczne przy 45 kDa (patrz Rysunek 5).</li>
</ol>
5. Kontrola prawidłowej insercji w błonę
Do oceny prawidłowej insercji błonowej chimerycznego konstruktu TMD wykorzystuje się linię komórkową z niedoborem białka wiążącego maltozę. Podczas hodowli na podłożu minimalnym, w którym jedynym źródłem węgla jest maltoza, zdolność do wzrostu wykazują jedynie komórki wykazujące ekspresję produktu integralnego z błoną, w którym białko wiążące maltozę jest prawidłowo zlokalizowane w periplazmie.
<ol>
 <li>Przeprowadzić transformację komórek PD28 (zgodnie z opisem dla komórek FHK12) i zaszczepić 2 ml pożywki LB. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm).</li>
 <li>Odwirować komórki przy 350 rpm przez 10 min w temperaturze 4 °C i przemyć poprzez resuspensję w PBS (2 ml), delikatnie pipetując szeroką końcówką lub stosując delikatne mieszanie wortexie. Ponownie odwirować komórki (jak powyżej), przemyć PBS po raz drugi, odwirować i ostatecznie resuspendować w PBS (1 ml).</li>
 <li>Wykorzystać 25 μl resuspendowanych komórek do zaszczepienia 5 ml pożywki minimalnej w trzech powtórzeniach i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu (30 rpm). Pomiary OD595 wykonywać między 15. a 25. godziną, w przybliżeniu co 2 godziny, przenosząc 20 μl każdej próbki do płytki 96-dołkowej i odczytując wartości za pomocą czytnika płytek.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Przykład zastosowania testu reporterowego transkrypcyjnego ToxR do analizy skłonności do oligomeryzacji domen transbłonowych przedstawiono na Rysunku 4. Wcześniej badaliśmy oligomeryzację domen transbłonowych wieloprzeponowego białka integralnego błony – białka latentnego błonowego-1 (LMP-1) za pomocą różnych technik, w tym ToxR.14 Wykazano, że domena transbłonowa pięć (TM5) wykazuje silną skłonność do oligomeryzacji; potwierdzają to wysokie jednostki Millera, porównywalne z kontrolą pozytywną, GpA, która jest dobrze znaną sekwencją dimeryzującą. Szkodliwa mutacja w TM5, D150A, zmniejsza zdolność sekwencji do oligomeryzacji. LMP-1 TM1 nie oligomeryzuje w stopniu znaczącym i wykazuje bardzo niski sygnał w jednostkach Millera, znajdujący się tuż powyżej sygnału dla pustych, nieprzetransformowanych komórek FHK12.
<img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="Schemat transportu bakteryjnych białek błonowych, regulacja ToxR, inicjacja transkrypcji LacZ." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Schemat przedstawiający assay reporterowy ToxR. Oligomeryzacja indukowana przez domenę transbłonową (TMD) prowadzi do dimeryzacji ToxR i aktywacji LacZ transkrypcja. Produkt genu LacZ, aktywność β-galaktosydazy można określić ilościowo jako miarę tendencji domeny transbłonowej (TMD) do oligomeryzacji.
<img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="Kataliza enzymatyczna, reakcja β-galaktazydazy z ONPG, schemat struktury chemicznej, powstawanie produktu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Hydrolityczne rozszczepienie ONPG przez β-galaktosydazę prowadzi do powstania związku absorbującego światło o-nitrofenolan (ONP).
<img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="Schemat mapy plazmidu pToxR7 przedstawiający otwarte ramki odczytu, promotory i miejsca restrykcyjne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mapa plazmidu pToxR7.
<img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający aktywność białka w jednostkach Millera: TM5, TM5 D150A, TM1, GpA, kontrola ujemna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Reprezentatywny test reporterowy transkrypcji ToxR analizujący skłonność do oligomeryzacji domen transbłonowych latentnego białka błonowego 1. Domena transbłonowa 5 (TM5) wykazuje silną oligomeryzację, podczas gdy domena transbłonowa 1 (TM1) wykazuje jedynie słabą interakcję. Mutacja D150A w TM5 znacznie zmniejsza jej zdolność do oligomeryzacji. GpA został dołączony jako sekwencja kontrolna dodatnia dla silnej dimeryzacji. Próba blank reprezentuje nieprzetransformowane komórki FHK12.
<img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="Wyniki elektroforezy białek; schemat przedstawiający prążki białka chimerycznego i MBP; analiza porównawcza." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5. Western blot w badaniu ekspresji białek.
<img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="Wykres wzrostu bakterii przedstawiający OD595 w funkcji czasu; pTox7 TM5, pTox7 TM5 D150A; dołączono kontrolę." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Test komplementacji PD28 w celu kontroli prawidłowej insercji do periplazmy. Kontrola negatywna stanowi konstrukt pozbawiony białka wiążącego maltozę.

<ol><li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors%3A+a+case+for+association+using+transmembrane+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Rev+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li>
<li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li>
<li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg%282%2B%29-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg%282%2B%29+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li>
<li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li>
<li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+into+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li>
<li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li>
<li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li>
<li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOXCAT%3A+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li>
<li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li>
<li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li>
<li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains%3A+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li>
<li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene%2C+latent+membrane+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li>
<li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li>
<li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Analiza reporterowa transkrypcji ToxR jest prostym sposobem identyfikacji sekwencji transbłonowych o potencjale do oligomeryzacji. Ponieważ oddziaływania te zachodzą w obrębie wewnętrznej błony bakteryjnej, analiza ta pozwala uniknąć problemów związanych z wiarygodnością badania systemów w środowiskach mimetycznych do błony. Biorąc pod uwagę, że klonowanie wielu TMD do jednego plazmidu można łatwo przeprowadzić równolegle, a cały test może być wykonany w formacie płytki 96-dołkowej, analiza ta może być wykorzystana do wy...

<table><tbody><tr><td>enzym restrykcyjny BamHI</td><td>Invitrogen</td><td>15201023</td><td>Stwierdzono, że enzymy firmy Invitrogen są bardziej wydajne niż produkty alternatywnych dostawców</td></tr><tr><td>enzym restrykcyjny NheI</td><td>Invitrogen</td><td>15444011</td><td>Stwierdzono, że enzymy firmy Invitrogen są bardziej wydajne niż produkty alternatywnych dostawców</td></tr><tr><td>probówki do hodowli o pojemności 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1J</td><td></td></tr><tr><td>Media społecznościowe</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>S0225</td><td>Dopełnić do odpowiedniej objętości i wysterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>podłoże LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7275</td><td>Dopełnić do odpowiedniej objętości i wysterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;78</td><td>Roztwór zapasowy o stężeniu 30 mg/ml w etanolu przechowywany w zamrażarce</td></tr><tr><td>Arabinoza</td><td>Fluka</td><td>10839</td><td>Roztwór zapasowy o stężeniu 2,5% (m/v) w wodzie, przechowywany w zamrażarce</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6858-06</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>2-nitrofenyl &amp;#946;-D-galaktopiranozyd (ONPG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73660</td><td></td></tr><tr><td>bufor Z</td><td></td><td></td><td>16,1 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;5,5 g NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,75 g KCl&lt;br/&gt;0,246 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;Dopełnić do 1 l, pH 7,0</td></tr><tr><td>bufor Z/chloroform</td><td></td><td></td><td>200 ml &amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol, 2 ml chloroformu, uzupełnić buforem Z do objętości 20 ml. Mieszać w wirówce (vortex) przez 1 min, odwirować przez 1 min przy 800 obr./min. Przygotowywać świeżą porcję dla każdej płytki.</td></tr><tr><td>Bufor Z/SDS</td><td></td><td></td><td>160 mg SDS rozpuszczonych w 10 ml buforu Z</td></tr><tr><td>Bufor Z/ONPG</td><td></td><td></td><td>40 mg ONPG w 10 ml buforu Z. Przygotować świeżą porcję dla każdej płytki</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-MBP (sprzężone z HRP)</td><td>New England Biolabs</td><td>E8038S</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka minimalna z maltozą</td><td></td><td></td><td>1 x sole M9, 0,4% maltozy, 1 mg/ml tiaminy, 2 mM MgSO4&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>płytka 96-dołkowa o płaskim dnie</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>83.1835.300</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Detektor wielomodalny DTX880</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>VWR international</td><td>89032-204</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wytrząsowy</td><td>Forma Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu toxr

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Zbyt uproszczony pogląd na domeny transbłonowe białek, traktujące je jedynie jako kotwice w dwuwarstwach fosfolipidowych, został dawno obalony. W wielu przypadkach białka przechodzące przez błonę wyewoluowały wysoce zaawansowane mechanizmy działania.1-3 Jednym ze sposobów, w jaki białka błonowe mogą modulować swoje struktury i funkcje, jest bezpośredni i specyficzny kontakt hydrofobowych helis, tworzących ustrukturyzowane oligomery transbłonowe.4,5 Wiele ostatnich prac skupiło się na rozkładzie aminokwasów występujących preferencyjnie w środowisku błonowym w porównaniu z roztworem wodnym oraz na różnych siłach międzycząsteczkowych napędzających asocjację białek.6,7 Niemniej jednak badania nad rozpoznawaniem molekularnym w domenach transbłonowych białek wciąż pozostają w tyle za badaniami nad regionami rozpuszczalnymi w wodzie. Główną przeszkodą pozostaje fakt, że mimo niezwykłej specyficzności i powinowactwa, jakie może osiągnąć oligomeryzacja transbłonowa,8 bezpośredni pomiar ich asocjacji jest trudny. Tradycyjne metodologie stosowane w badaniu funkcji integralnych białek błonowych mogą być utrudnione przez immanentną nierozpuszczalność badanych sekwencji. Wglądy biofizyczne uzyskane z badania syntetycznych peptydów reprezentujących domeny transbłonowe mogą dostarczyć cennych informacji strukturalnych. Jednakże często kwestionuje się biologiczną istotność systemów miceli detergentowych lub liposomów stosowanych w tych badaniach w celu naśladowania błon komórkowych; czy peptydy przyjmują strukturę zbliżoną do natywnej w tych warunkach i czy ich zachowanie funkcjonalne naprawdę odzwierciedla sposób działania w błonie natywnej? Aby zbadać oddziaływania sekwencji transbłonowych w naturalnych dwuwarstwach fosfolipidowych, laboratorium Langoscha opracowało testy reporterowe transkrypcyjne ToxR.9 Badana domena transbłonowa jest ekspresowana jako białko chimeryczne z białkiem wiążącym maltozę w celu lokalizacji w periplazmie oraz z białkiem ToxR, aby zapewnić raport o poziomie oligomeryzacji (Rysunek 1).
W ciągu ostatniej dekady kilka innych grup (np. Engelman, DeGrado, Shai) dodatkowo zoptymalizowało i zastosowało ten test reporterowy ToxR.10-13 Różne warianty testów ToxR stały się złotym standardem w badaniu oddziaływań białko-białko w błonach komórkowych. Przedstawiamy tutaj typowy przebieg eksperymentu przeprowadzanego w naszym laboratorium, który opiera się głównie na protokołach opracowanych przez Langoscha. Ta powszechnie stosowana metoda jest użyteczna do analizy samoasocjacji domen transbłonowych w E. coli, gdzie produkcja β-galaktozydazy służy do oceny skłonności TMD do oligomeryzacji. W wyniku indukowanej przez TMD dimeryzacji, ToxR wiąże się z promotorem ctx, powodując upregulację genu LacZ kodującego β-galaktozydazę. Odczyt kolorymetryczny uzyskuje się poprzez dodanie ONPG do lizowanych komórek. Hydrolityczne rozszczepienie ONPG przez β-galaktozydazę prowadzi do powstania absorbującego światło o-nitrofenolanu (ONP) (Rycina 2).

Opisano wydajną procedurę oceny tendencji do oligomeryzacji pojedynczych domen transbłonowych (TMD). Białka chimeryczne, składające się z TMD połączonej z ToxR, są eksprymowane w szczepie reporterowym E. coli. Indukowana przez TMD oligomeryzacja powoduje dimeryzację ToxR, aktywację transkrypcji i produkcję białka reporterowego, -galaktozydazy.

Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR

Zbyt uproszczony pogląd na domeny transbłonowe białek, traktujący je jedynie jako kotwice w dwuwarstwach fosfolipidowych, został dawno obalony. W wielu przypadkach ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie tendencji do ligamentyzacji białek, domen transbłonowych lub TMD w naturalnym środowisku błonowym. Jest to osiągane poprzez ekspresję interesującej domeny transbłonowej w e coli jako białka chimerycznego z białkiem wiążącym maltozę w celu lokalizacji w periplazmie oraz tox R jako reportera transkrypcyjnego; indukowana domeną transbłonową ligamentyzacja prowadzi do dimeryzacji tox R i aktywacji transkrypcji LXi. W drugim kroku komórki są lizowane i traktowane ONPG, który jest hydrolizowany przez beta galacto do absorbującego światło o-nitrofenolu lub ONP.Następnie poziomy ONP są kwantyfikowane poprzez pomiar absorbancji światła przy 405 nanometrach. W celu określenia poziomów domeny transbłonowej, wyniki ligantyzacji wykazują skłonność do ligantyzacji domen transbłonowych na podstawie testu reporterowego tox R. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod biofizycznych, takich jak SDS-PAGE lub fluorescencja, jest to, że zachowanie domeny transbłonowej jest badane w naturalnej dwuwarstwie fosfolipidowej poprzez ekspresję w E. coli, a nie w systemie naśladującym błonę, takim jak detergenty.Ta metoda może pomóc w uzy

transmembrane-domain-oligomerization-propensity-determined-toxr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skłonność oligomeryzacji domeny transbłonowej określona za pomocą testu ToxR

W niniejszym raporcie opisujemy, w jaki sposób rezonans plazmonów powierzchniowych jest wykorzystywany do wykrywania przenikania toksyn do cytozolu gospodarza. Ta wysokoczuła metoda pozwala na uzyskanie ilościowych danych dotyczących zawartości toksyn w cytozolu i może być zastosowana w przypadku wielu rodzajów toksyn.

Wykrywanie translokacji toksyny do cytozolu gospodarza przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach.

Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący najnowszą wersję narzędzia Agencji Ochrony Środowiska USA do przewidywania podatności gatunków (SeqAPASS). Protokół ten demonstruje zastosowanie narzędzia online do szybkiej analizy konserwacji białek i dostarczania konfigurowalnych i łatwych do interpretacji prognoz podatności chemicznej u różnych gatunków.

Demonstracja narzędzia do dopasowywania sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków w celu szybkiej oceny zachowania białek

Prezentowany tutaj jest protokół wykorzystujący główne promastigoty Leishmania do określenia wiązania, cytotoksyczności i sygnalizacji indukowanej przez toksyny tworzące pory. Dostarczony jest dowód słuszności koncepcji ze streptolizyną O. Inne toksyny mogą być również wykorzystane do wykorzystania mutantów genetycznych dostępnych w L. major do zdefiniowania nowych mechanizmów oporności na toksyny.

Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego i funkcji toksyn tworzących pory za pomocą Leishmania major

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN).  Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

Poznaj metodę oceny skłonności do oligomeryzacji domen transbłonowych przy użyciu testu ToxR w komórkach E. coli. Technika ta pozwala ilościowo określić interakcje białek w naturalnym środowisku błonowym.

Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR

Przeglądaj więcej filmów