Name: Wykorzystanie strategii żywienia interferencyjnego za pośrednictwem RNA do badań przesiewowych genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicieni C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj technikę karmienia RNAi do badania genów regulujących wielkość ciała u nicieni C. elegans. Metoda umożliwia dużoskalowe przesiewanie genetyczne i analizę szlaku sygnałowego DBL-1/TGF-β.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jamesowi Clarkowi za udostępnienie zdjęć zwierząt w różnych punktach czasowych rozwoju. Szczepy C. elegans użyte w niniejszym badaniu zostały pozyskane z Caenorhabditis Genetics Center, które jest wspierane przez NIH National Center for Research Resources (NCRR). Praca ta była finansowana z grantu CIRG 1817 z CUNY dla J.L. i C.S.D. oraz z grantów NIH 1R15GM073678-01 i 1R15GM097692-01 dla C.S.D. Dziękujemy dr. Williamowi J. Rice'owi, dr Nathalii Holtzman oraz Melissie Silvestrini za uwagi do manuskryptu. Praca ta została wykonana w ramach częściowej realizacji wymogów dotyczących stopnia doktora (PhD) w Graduate Center of the City University of New York (S. Xiong).

1. Przygotowanie płytek do karmienia RNAi zawierających sekwencję genu docelowego
<ol>
	<li>W przypadku korzystania z komercyjnie dostępnych bibliotek RNAi (np. od Source BioScience LifeSciences), należy przejść do kroku 1.4. Alternatywnie, sekwencje genów docelowych należy sklonować do wektora L4440, powszechnie stosowanego plazmidu do RNAi u nicieni8, zgodnie ze standardowym protokołem klonowania.</li>
	<li>Rekombinowany plazmid należy transformować do szczepu bakteryjnego HT115(DE3), hodować na płytkach z agarem LB z dodatkiem 25 μg/ml karbenicyliny i 12,5 μg/ml tetracykliny, a następnie wybrać pojedynczy klon do dalszego wykorzystania.</li>
	<li>W tym samym czasie pusty wektor L4440 należy transformować do szczepu bakteryjnego HT115, aby służył jako kontrola w eksperymentach.</li>
	<li>Zarówno bakterie niosące rekombinowany wektor L4440, jak i pusty wektor L4440, należy hodować przez noc w 1 ml bulionu LB z 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C. Nie dodaje się tetracykliny, ponieważ obniża ona wydajność RNAi.</li>
	<li>Do hodowli nocnej należy dodać kolejne 5 ml bulionu LB z 100 μg/ml ampicyliny i inkubować przez kolejne 4-6 h w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>0,5 ml kultury bakteryjnej niosącej rekombinowany lub pusty wektor L4440 należy wysiać na płytki RNAi dla nicieni. Wszystkie płytki należy opisać nazwą klonu.</li>
	<li>Płytki należy oznaczyć i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w celu wyhodowania trawnika bakteryjnego; są to płytki RNAi z sekwencją genu docelowego lub bez niej. Dla każdego warunku należy przygotować co najmniej 2 płytki.</li>
</ol>
2. Hodowla nicieni na płytkach do karmienia w metodzie RNAi
<ol>
	<li>Zestrylizuj w płomieniu końcówkę platynowego zgłębnika do nicieni. Za pomocą zgłębnika przenieś od 6 do 10 hermafrodyt w czwartym stadium larwalnym (L4) na każdą płytkę RNAi zawierającą rekombinowany lub pusty wektor L4440; zwierzęta będą wykorzystywać bakterie jako źródło pożywienia.</li>
	<li>Pozostaw hermafrodyty do wzrostu w temperaturze 20 °C (standardowy warunek hodowli dla C. elegans) przez noc; następnego dnia staną się one młodymi osobnikami dorosłymi.</li>
	<li>Przenieś od 6 do 10 młodych osobników dorosłych na nową, odpowiednio opisaną i przygotowaną płytkę RNAi.</li>
	<li>Pozostaw osobniki dorosłe do składania jaj przez 4-6 hr, a następnie usuń wszystkie dorosłe zwierzęta z płytki; krok ten służy synchronizacji potomstwa. Po usunięciu matek rozpocznij odliczanie czasu. Jest to czas zero.</li>
	<li>Inkubuj płytki w temperaturze 20 °C, aby zwierzęta osiągnęły określony etap rozwoju; w niniejszym protokole do analizy fenotypowej wybraliśmy młode osobniki dorosłe. W przypadku wyciszenia genów, które przebiega w normalnym tempie, inkubacja przez 72 hr jest wystarczająca, aby zwierzęta stały się młodymi osobnikami dorosłymi. Jednak różne geny w różny sposób wpływają na rozwój zwierząt. Jeśli RNAi powoduje wzrost zwierząt w innym tempie, młode osobniki dorosłe można zidentyfikować jako te, które nie przekroczyły 24 hr od stadium L4, mają w pełni rozwiniętą wulwę i 2-6 embrionów w macicy (jeśli są płodne). Aby zidentyfikować inne etapy rozwoju, badacz powinien kierować się stopniem rozwoju gonad i wulwy.</li>
</ol>
3. Ocena fenotypów wielkości ciała nicieni poddanych RNAi
<ol>
	<li>Na szkiełku przedmiotowym umieść dwie warstwy kolorowej taśmy etykietującej. Przygotuj dwa takie szkiełka. Następnie umieść nowe szkiełko przedmiotowe pomiędzy tymi dwoma szkiełkami z taśmą. Rozpuść 2% agarozę w wodzie; nanieś jedną kroplę na środek nowego szkiełka, a następnie dociśnij od góry drugie szkiełko, aby utworzyć cienką warstwę 2% agarozy, jak opisano wcześniej9.</li>
	<li>Po zestaleniu agarozy zdejmij górne szkiełko; szkiełko z podkładką agarową jest gotowe do naniesienia nicieni. Oznacz szkiełko nazwą klonu.</li>
	<li>Do podkładki agarowej dodaj 10 μl 25 mM NaN3; przenieś 30-40 osobników do roztworu NaN3, aby je unieruchomić, a następnie nałóż od góry szkiełko nakrywkowe; powtórz czynność zarówno dla osobników traktowanych RNAi z rekombinantem, jak i z pustym wektorem L4440.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia nicieni pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu obiektywu 2,5x; w tej procedurze wykorzystano cyfrową kamerę Leica z oprogramowaniem wspierającym Qcapture.</li>
	<li>W celu kalibracji wykonaj najpierw zdjęcie standardowej podziałki mikrometrycznej. Następnie otwórz obraz w oprogramowaniu Image-Pro, kliknij „measure” i wybierz „calibration”, a następnie wybierz „spatial calibration wizard”. Po zaznaczeniu opcji „calibrate the active image” kliknij „next”. Wprowadź nazwę kalibracji i upewnij się, że jednostki odniesienia przestrzennego są ustawione na mikrometr. Następnie zaznacz przycisk „create a reference calibration” i kliknij „next”. Kliknij „draw reference line”. Pojawi się pasek skali odniesienia. Przesuń pasek skali tak, aby pokrywał się z końcami mikrometru, a następnie wskaż, że odniesienie to odpowiada 1 000 jednostkom. Kliknij „OK”, „Next” i „Finish”.</li>
	<li>Po skalibrowaniu oprogramowania otwórz zdjęcie nicienia. Następnie w menu „measure” wybierz „calibration”, a potem kliknij „select spatial”. Z menu rozwijanego wybierz nazwę pliku utworzoną podczas kalibracji mikrometru. Następnie w menu „measure” wybierz „measurements”. W otwartym oknie wybierz narzędzie do swobodnego rysowania i za pomocą myszy komputerowej wykreśl linię przechodzącą przez środek ciała zwierzęcia od głowy do ogona (Rycina 1). Długość zostanie wyświetlona w oknie. W ten sposób uzyskasz dwie grupy danych: długość ciała osobników traktowanych RNAi przeciwko genowi docelowemu oraz zwierząt kontrolnych traktowanych pustym wektorem L4440.</li>
	<li>Wyeksportuj pomiary długości do pliku Microsoft Excel lub innego odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Następnie porównaj próbki za pomocą testu t Studenta.</li>
</ol>

<ol><li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li>
<li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA%3A+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li>
<li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+movement+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li>
<li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Febs.+J%22%5BJournal%5D)">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li>
<li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF%CE%B2+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo%3A+variations+on+ancestral+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole opisujemy naszą metodę identyfikacji mutantów z defektem wielkości ciała u C. elegans za pomocą karmienia RNAi. Metoda ta ma zastosowanie w identyfikacji komponentów szlaku sygnałowego TGF-β. Ponieważ komponenty te są wysoce konserwatywne ewolucyjnie15, takie przesiewy są istotne dla wyjaśnienia molekularnych mechanizmów sygnalizacji TGF-β u wszystkich metazoa. Ważnym aspektem przy projektowaniu takiego przesiewu jest wybór szczepu wyjściowego. Wykazaliśmy, że zarówno eri-1;...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Płytki RNAi dla nicieni&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 17,7 g mieszaniny pożywki dla nicieni (Worm Medium Mix)&lt;br/&gt; 60 g agaru&lt;br/&gt; Dodać H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Dodać do 3 litrów. Autoklawować. &lt;br/&gt; Dodać 3 ml 1M IPTG (sterylnego) oraz 3 ml karbenicyliny o stężeniu 25 mg/ml (sterylnej), a następnie przelać do szalek Petriego o średnicy 60 mm. &lt;strong&gt;&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; Szkałeczki z nicieniami&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 17,7 g mieszaniny pożywki dla nicieni (Worm Medium Mix)&lt;br/&gt; 0,6 g siarczanu streptomycyny&lt;br/&gt; 60 g agaru&lt;br/&gt; Dodać H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Przygotować 3 litry. Autoklawować. Wylać do szalek Petriego o średnicy 60 mm. &lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;Mieszanka pożywki dla nicieni&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 55 g Tris-Cl &lt;br/&gt; 24 g Tris-OH &lt;br/&gt; 310 g peptonu Bacto &lt;br/&gt; 800 mg cholesterolu &lt;br/&gt; 200 g NaCl&lt;br/&gt; Wymieszać dokładnie, upewniając się, że nie powstały grudki; taką mieszaninę w proszku można przechowywać przez wiele miesięcy przed użyciem.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;2% agaroza &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 0,5 g agarozy&lt;br/&gt; Dodać 25 ml dH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Podgrzewać w kuchence mikrofalowej do czasu rozpuszczenia.&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1M izopropylu &amp;#946;1-deoksy-1-tiogalaktopiranoza (IPTG)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 2 g IPTG&lt;br/&gt; Rozpuścić w 10 ml dH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;1M NaN₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 6,5 g NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; Dodać dH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;strong&gt;25 mM NaN3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 2,5 ml 1M NaN3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; Dodać dH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 100 ml&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &lt;em&gt;Caenorhabditis elegans &lt;/em&gt;z Caenorhabditis Genetics Center&lt;br/&gt; Plazmid L4440 (zawiera gen oporności na ampicylinę)&lt;br/&gt; Szczep bakterii HT115 (DE3) (zawiera indukowaną przez IPTG polimerazę T7; jest deficyjny w genie RNAzy III (dsRNAzy), posiada również gen oporności na tetracyklinę)&lt;sup&gt;16&lt;/sup&gt; &lt;br/&gt; szalki Petriego 60 mm&lt;br/&gt; szalki Petriego 100 mm&lt;br/&gt; probówki hodowlane Falcon o dnie okrągłym o pojemności 14 ml&lt;br/&gt; laminki szklane&lt;br/&gt; szkiełka podstawowe&lt;br/&gt; 1-20 &amp;mu;pipeta automatyczna&lt;br/&gt; 20-200 &amp;mu;pipeta automatyczna&lt;br/&gt; 200-1000 &amp;mu;pipetka automatyczna&lt;br/&gt; 1-200 &amp;mu;końcówki do pipet&lt;br/&gt; 200-1000 &amp;mu;końcówki do pipet&lt;br/&gt; probówki Eppendorf 1,5 ml &lt;br/&gt; platynowy drut do przenoszenia nicieni </td></tr></tbody></table>

wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji rna do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia c. elegans

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Interferencja RNA (RNAi) oparta na dwuniciowym RNA jest skuteczną strategią wyciszania ekspresji genów docelowych1-3. Została ona zastosowana w wielu systemach modelowych, w tym u roślin, bezkręgowców i kręgowców. Istnieje wiele metod wywoływania RNAi in vivo4,5. Na przykład gen docelowy można wprowadzić do wektora RNAi, a następnie trwale lub przejściowo przetransformować linie komórkowe lub komórki pierwotne w celu uzyskania efektu wyciszenia genu; alternatywnie, syntetyczne dwuniciowe oligonukleotydy z konkretnych genów docelowych (oligo RNAi) mogą być przejściowo wprowadzane do linii komórkowych lub komórek pierwotnych w celu wyciszenia genów docelowych; lub syntetyczne cząsteczki dwuniciowego RNA mogą być mikroiniekcyjne do organizmu. Ponieważ nicień C. elegans wykorzystuje bakterie jako źródło pożywienia, karmienie zwierząt bakteriami ekspresującymi dwuniciowe RNA przeciwko genom docelowym stanowi praktyczną strategię6. Przedstawiamy tutaj metodę karmienia w celu wywołania RNAi do oceny fenotypu wielkości ciała. Wielkość ciała u C. elegans jest regulowana głównie przez ligand podobny do TGF-β, DBL-1, dlatego test ten jest odpowiedni do identyfikacji komponentów sygnalizacji TGF-β7. Użyliśmy różnych szczepów, w tym dwóch szczepów nadwrażliwych na RNAi, aby powtórzyć eksperymenty z karmieniem RNAi. Nasze wyniki wykazały, że szczep rrf-3 zapewnił najlepszy oczekiwany fenotyp RNAi. Metoda ta jest łatwa w wykonaniu, powtarzalna i łatwo poddaje się kwantyfikacji. Co więcej, nasz protokół minimalizuje użycie specjalistycznego sprzętu, dzięki czemu jest odpowiedni dla mniejszych laboratoriów lub tych w instytucjach prowadzących głównie studia licencjackie.

W naszych badaniach skupiamy się na regulacji wielkości ciała przez szlak DBL-1/TGF-β. Utrata funkcji szlaku DBL-1 skutkuje małą wielkością ciała, w tym krótszą długością ciała w porównaniu z osobnikami typu dzikiego7,10,11. Zatem przesiewy mutantów wielkości ciała C. elegans pozwalają na identyfikację komponentów i modyfikatorów sygnalizacji TGF-β. Sygnalizacja DBL-1 jest przekazywana przez konserwatywny szlak transdukcji sygnału TGF-β, który obejmuje receptory powierzchniowe komórek oraz wewnątrzkom...

Prezentujemy sposób wykorzystania techniki karmienia RNAi do wyciszania genów docelowych oraz oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może zostać zastosowana w szeroko zakrojonych badaniach przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnych, interesujących komponentów genetycznych, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała poprzez sygnalizację DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Interferencja RNA (RNAi) oparta na dwuniciowym RNA jest skuteczną strategią wyciszania ekspresji genów docelowych1-3. Została ona zastosowana w wielu systemach modelowych ...

Niniejszy film prezentuje procedurę identyfikacji genów regulujących wzrost i wielkość ciała u C. elegans. W celu inaktywacji genów kandydackich za pomocą interferencji RNA (RNAi), w pierwszej kolejności przygotowuje się płytki zawierające bakterie ekspresyjne dwuniciowego RNA, który jest skierowany przeciwko badanym genom. Następnie hermafrodyty w czwartym stadium larwalnym są przenoszone na płytki RNAi.Po osiągnięciu stadium młodego dorosłego osobniki są przenoszone na nowe płytki RNAI w celu zniesienia jaj. Po kilku godzinach są one usuwane, co pozwala na uzyskanie zsynchronizowanych populacji embrionów. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo jest zbierane i mocowane na szkiełkach przedmiotowych.Na koniec pozyskuje się obrazy mikroskopowe nicieni. Analiza obrazu wykazuje zmiany w wielkości ciała spowodowane inaktywacją genów. Choć metodę tę można wykorzystać do identyfikacji regulatorów szlaku sygnalizacyjnego TGF beta, można ją również zastosować do innych szlaków regulujących rozwój pozazarodkowy u C. elegans, takich jak szlak sygnalizacyjny insuliny.Procedurę rozpoczyna się od sklonowania docelowych sekwencji genów do wektora L 4 4 4 0 A, będącego powszechnie stosowanym plazmidem do RNAi u nicieni, a następnie transformacji rekombinowanego plazmidu do szczepu bakteryjnego HT one 15 DE three. Przekształcone bakterie wysiewamy na płytki z agarem LB zawierającym 25 µg/mL karbenicyliny i 12,5 µg/mL tetracykliny, po czym wybieramy pojedynczy klon do dalszego wykorzystania.W międzyczasie należy wprowadzić pusty wektor L 4 4 4 0 do szczepu bakteryjnego HT one 15. Aby wykorzystać go jako kontrolę do eksperymentów, bakterie po transformacji należy hodować przez noc w 1 ml bulionu LB z dodatkiem 100 µg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C.Tetracykliny nie dodaje się, ponieważ obniża ona wydajność RNAI. Do hodowli nocnej dodaje się kolejne 5 ml bulionu LB z 100 µg/ml ampicyliny, a następnie inkubuje przez kolejne 4–6 godzin w temperaturze 37 °C. Po przygotowaniu hodowli, 0,5 ml bakterii doświadczalnych lub kontrolnych wysiewa się na płytki z nicieniami RNAI oznakowane odpowiednią nazwą klonu.Dla każdego wariantu należy przygotować co najmniej dwie płytki. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia.Należy przygotować trawnik bakterii wykazujących ekspresję RNAi z sekwencją genu docelowego lub bez niej. Zwierzęta będą wykorzystywać bakterie jako źródło pożywienia. Po przygotowaniu płytek do karmienia RNAi, końcówkę drutu platynowego należy wysterylizować w płomieniu.Następnie za pomocą platynowej igły przenieś od sześciu do dziesięciu hermafrodyt *C. elegans* w czwartym stadium larwalnym (L4) na każdą płytkę z RNAi. Pozostaw hermafrodyty do wzrostu w temperaturze 20°C przez noc. Następnego dnia zwierzęta będą w stadium młodych osobników dorosłych.Przenieś je na nową, odpowiednio opisaną i przygotowaną płytkę RNAI. Inkubuj płytki w temperaturze 20 °C przez cztery do sześciu godzin, aby umożliwić osobnikom dorosłym zniesienie jaj. Po inkubacji usuń wszystkie osobniki dorosłe z płytki w celu synchronizacji potomstwa.Po usunięciu osobników dorosłych należy rozpocząć pomiar czasu. Jest to moment zero. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C, aby zwierzęta osiągnęły interesujący nas stopień rozwoju.W tym etapie do analizy fenotypowej zostaną wybrane młode dorosłe osobniki. W przypadku wyciszeń genów, w których rozwój przebiega w normalnym tempie, wymagana jest 72-godzinna inkubacja. Należy pamiętać, że różne geny w odmienny sposób wpływają na rozwój zwierząt, dlatego czasy inkubacji mogą wymagać dostosowania.Jeśli RNAi powoduje, że zwierzęta rosną w innym tempie, młode osobniki dorosłe można zidentyfikować jako te, które nie przekroczyły 24 godzin od stadium L4, z zakończonym rozwojem VUL oraz od dwóch do sześciu embrionów w macicy, jak pokazano tutaj. W celu identyfikacji innych etapów rozwojowych badacz powinien kierować się rozwojem gonad i VUL. Po osiągnięciu przez zwierzęta odpowiedniego stadium należy przygotować się do oceny fenotypów wielkości ciała nicieni poddanych działaniu RNAi.Następnie naklej dwie warstwy kolorowej taśmy etykietującej na szklany przedmiot szkiełko o grubości jednego milimetra, jak pokazano tutaj. Przygotuj dwa takie szkiełka. Następnie umieść nowe szkiełko pomiędzy dwiema płytkami z taśmą i nanieś kroplę 2% Agros rozpuszczonego w wodzie.Na środek nowej szkiełka przedmiotowego dociśnij drugie szkiełko, aby utworzyć cienką podkładkę z agarozy. Po zestaleniu się agarozy zdejmij górne szkiełko. Szkiełko z podkładką z agarozy jest gotowe do naniesienia nicieni.Oznacz preparat nazwą klonu. Do podkładki aros dodaj 10 µL 25 mM azydku sodu. Następnie, używając platynowej igły jak poprzednio, przenieś od 30 do 40 osobników do roztworu azydku sodu.Aby je unieruchomić, nałóż na wierzch szkiełko zakrywkowe. Powtórz tę czynność zarówno w przypadku zwierząt rekombinowanych, jak i zwierząt z pustym wektorem L 4 4 4 0 poddanych działaniu RNAi. Następnie umieść preparat z mikrometrem pod mikroskopem stereoskopowym z obiektywem 2,5 x.Używając oprogramowania Q Capture lub podobnego, należy wykonać zdjęcie mikrometru i zapisać je. Następnie należy umieścić nicienie pod mikroskopem i wykonać ich zdjęcia. Aby zmierzyć długość ciała, należy w pierwszej kolejności otworzyć zdjęcie mikrometru w oprogramowaniu Image Pro.Następnie kliknij „measure” i wybierz „calibration”. Następnie wybierz „spatial Calibration wizard”, zaznaczając opcję „calibrate the active image”. Kliknij „next”.Wprowadź nazwę kalibracji i upewnij się, że jednostki odniesienia przestrzennej są ustawione na mikrony. Następnie zaznacz przycisk Utwórz kalibrację referencyjną i kliknij Dalej. Kliknij przycisk narysuj linię referencyjną.Pojawi się referencyjny pasek skali. Przesuń pasek skali tak, aby odpowiadał końcom mikrometru. Następnie wskaż, że referencja odpowiada 1000 jednostkom.Kliknij OK. Następnie wybierz „Dalej” i „Zakończ”. Po skalibrowaniu oprogramowania otwórz obraz nicienia.Następnie w menu Measure wybierz opcję Calibration, a potem kliknij Select Spatial. Z menu rozwijanego wybierz nazwę pliku utworzonego podczas kalibracji mikrometrem. Następnie w menu Measure, w otwierającym się oknie, wybierz opcję Measurements.Wybierz narzędzie rysowania swobodnego i za pomocą myszy komputerowej poprowadź linię przez środek ciała zwierzęcia, od głowy do ogona. Długość zostanie wyświetlona w oknie. Powtórz ten proces dla wszystkich zwierząt w polu widzenia.Wyeksportuj pomiary długości do pliku Microsoft Excel lub innego odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią oraz odchylenie standardowe dla każdej próbki. Następnie porównaj wyniki dla każdej grupy, stosując test t Studenta.Białko DBL1 z superrodziny czynnika wzrostu transformującego beta (TGF beta) jest niezbędne do aktywacji szlaku TGF beta. W odpowiedzi na aktywację sygnału wewnątrzkomórkowe transduktory sygnału smad przemieszczają się do jądra komórkowego i inicjują transkrypcję genów. U osobników, u których szlak TGF beta jest zaburzony, obserwuje się mniejszy rozmiar ciała, w tym krótszą długość ciała w porównaniu z osobnikami typu dzikiego.W ten sposób przeprowadzono przesiewy u C. elegans. Mutanty wielkości ciała pozwalają na identyfikację komponentów i modyfikatorów szlaku sygnałowego TGF-beta w celu przetestowania skuteczności RNAi poprzez karmienie w celu identyfikacji mutantów wielkości ciała. RNAi wykorzystano do wyciszenia komponentów szlaku DBL-1, SMA-3 oraz SMA-6 w czterech różnych szczepach C. elegans.Przetestowane szczepy C. elegans obejmowały dwa nadwrażliwe na RNAi: Lin 15 B oraz RF 3, a także standardowy szczep typu dzikiego N 2 oraz szczep LIN 36, którego wrażliwość na RNAi jest podobna do N 2, jak pokazano tutaj. W przypadku zakłócenia ekspresji SMA 3 lub SMA 6 zwierzęta wykazywały znacznie krótszy rozmiar ciała niż zwierzęta kontrolne, z wyjątkiem RNAi SMA 6 w Lin 36. Tło w RF 3.Długości ciał osobników młodych dorosłych w grupie kontrolnej po traktowaniu RNAi stanowiły od 84 do 95% długości osobników traktowanych samym wektorem. W przypadku szczepu A one Lin 15 B długości ciał osobników młodych dorosłych po RNAi stanowiły od 68 do 86% długości zwierząt kontrolnych. Jednakże szczep A one lin 15 B daje mniej potomstwa.To sprawia, że nie nadają się one do przesiewania na szeroką skalę. Dlatego do tych technik sugerowane jest użycie szczepu RF three. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak identyfikować geny regulujące wzrost i wielkość ciała przy użyciu techniki interferencji RNI.

using-rna-mediated-interference-feeding-strategy-to-screen-for-genes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zastosowanie strategii żywienia opartego na interferencji RNA do przesiewania genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

RNAi to potężne narzędzie genetyczne dostępne dla badaczy C. elegans. W tym filmie przedstawiono metodę leczenia większej liczby robaków RNAi niż karmienie płytkami przy użyciu płynnych warunków hodowli.

Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans

Podczas gdy karmienie dsRNA u C. elegans jest potężnym narzędziem do oceny funkcji genów, obecne protokoły dla dużych ekranów żywieniowych skutkują zmienną skutecznością eliminacji. Opisujemy ulepszony protokół wykonywania badań przesiewowych karmienia RNAi na dużą skalę, który skutkuje wysoce skutecznym i powtarzalnym obniżeniem ekspresji genów.

Wielkoskalowy knockdown genów u C. elegans przy użyciu bibliotek zasilających dsRNA do generowania odpornych fenotypów utraty funkcji

C. elegans pojawił się jako nowy model genetyczny do badania interakcji gospodarz-patogen. Tutaj opisujemy protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium w połączeniu z techniką interferencji dwuniciowego RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą.

Protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Caenorhabditis elegans służy jako doskonały system modelowy z solidnymi i tanimi metodami badania zdrowia, długości życia i odporności na stres.

Badanie tanich metod pomiaru długości życia i długości zdrowia u Caenorhabditis elegans

Poznaj technikę karmienia RNAi do badania genów regulujących wielkość ciała u nicieni C. elegans. Metoda umożliwia dużoskalowe przesiewanie genetyczne i analizę szlaku sygnałowego DBL-1/TGF-β.

Wykorzystanie strategii żywienia interferencyjnego za pośrednictwem RNA do badań przesiewowych genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicieni C. elegans (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie strategii karmienia w celu indukowania interferencji RNA do przesiewowej analizy genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicienia C. elegans

Przeglądaj więcej filmów