Wykorzystanie strategii żywienia interferencyjnego za pośrednictwem RNA do badań przesiewowych genów zaangażowanych w regulację wielkości ciała u nicieni C. elegans

Pokazujemy, jak używać techniki karmienia RNAi do niszczenia docelowych genów i oceny fenotypu wielkości ciała u C. elegans. Metoda ta może być wykorzystana do badań przesiewowych na dużą skalę w celu identyfikacji potencjalnych składników genetycznych będących przedmiotem zainteresowania, takich jak te zaangażowane w regulację wielkości ciała za pomocą sygnalizacji DBL-1/TGF-β.

Ten film pokazuje procedurę identyfikacji genów, które regulują, patrz wzrost Elgana i wielkość ciała. Wykorzystując interferencję RNA lub oko RNA do inaktywacji genów kandydujących, przygotowuje się pierwsze płytki zawierające bakterie, które wyrażały dwuniciowy RNA, które celują w geny będące przedmiotem zainteresowania. Hermafrodyty w czwartym stadium larwalnym są przenoszone na płytki RNAi.

Gdy osiągną stadium młodego dorosłego osobnika, są przenoszone na nowe płytki RNAI w celu złożenia jaj. Po kilku godzinach są one usuwane, pozostawiając zsynchronizowane populacje zarodków. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo zbierane i montowane na szkiełkach.

Na koniec uzyskuje się mikroskopijne obrazy robaków. Analiza obrazu pokazuje zmiany w wielkości ciała spowodowane inaktywacją genów. Chociaż metoda ta może być stosowana do identyfikacji regulatorów szlaku sygnałowego TGF beta, można ją również zastosować do innych szlaków, które regulują rozwój poembrionalny w elegancji morskiej, takich jak szlak sygnalizacji insuliny.

Rozpocznij tę procedurę od sklonowania docelowych sekwencji genów do wektora L 4 4 4 0 Powszechnie stosowany plazmid RNAi robaka przekształca rekombinowany plazmid w szczep bakteryjny. HT jeden 15 DE trzy kultury. Przekształcone bakterie na płytkach agarowych LB z 25 mikrogramami na mililitr węgla i 12,5 mikrogramami na mililitr tetracykliny, a następnie wybierz pojedynczy klon do wykorzystania w przyszłości.

W międzyczasie przekształć pusty wektor L 4 4 4 0 w szczep bakteryjny. HT jeden 15. Aby użyć jako kontroli dla hodowli eksperymentalnej, przekształcone bakterie w jednym mililitrze bulionu LB ze 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Tetracyklina nie jest dodawana, ponieważ zmniejsza wydajność RNAI. Dodaj kolejne pięć mililitrów bulionu LB ze 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny do nocnej kultury, a następnie inkubuj przez kolejne cztery do sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy hodowla jest gotowa, wysiew 0,5 mililitra bakterii eksperymentalnych lub kontrolnych na płytkach robaków RNAI oznaczonych odpowiednią nazwą klonu.

Dla każdego warunku należy przygotować co najmniej dwie płytki. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia.

Powinien być obecny trawnik bakterii, które wyrażają RNAi z docelową sekwencją genu lub bez niej. Zwierzęta będą wykorzystywać bakterie jako źródło pożywienia. Gdy płytki podające RNAI są gotowe, płomienie sterylizują końcówkę drutu platynowego.

Następnie użyj platynowego drutu, aby przenieść od sześciu do dziesięciu czwartych stadiów larwalnych lub L czterech hermafrodytów C elgana na każdą płytkę RNAi. Pozwól hermafrodytom rosnąć w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zwierzęta będą młodymi dorosłymi.

Przenieś je na nową, odpowiednio oznakowaną i przygotowaną płytkę RNAI. Inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez cztery do sześciu godzin, aby umożliwić dorosłym osobnikom złożenie jaj. Po inkubacji usuń wszystkie dorosłe osobniki z płytki, aby zsynchronizować potomstwo.

Po usunięciu dorosłych osób zacznij liczyć czas. To jest czas zerowy. Inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby zwierzęta mogły dorosnąć do interesującego ich etapu rozwoju.

Tutaj młodzi dorośli zostaną wybrani do analizy fenotypowej. W przypadku knockdownów, które rozwijają się w normalnym tempie, wymagana jest 72-godzinna inkubacja. Należy pamiętać, że różne geny wpływają w różny sposób na rozwój zwierząt, więc może być konieczne dostosowanie czasu inkubacji.

Jeśli RNAi powoduje, że zwierzęta rosną w różnym tempie, młode dorosłe osobniki można zidentyfikować jako te, które nie są starsze niż 24 godziny po L czterech, z zakończonym rozwojem VUL i dwoma do sześciu zarodków w macicy, jak pokazano tutaj. Aby zidentyfikować inne etapy rozwoju, badacz powinien kierować się badaniami nad gonadami i VUL jako wskazówką. Gdy zwierzęta osiągną odpowiedni etap, przygotuj się do oceny fenotypów wielkości ciała robaków traktowanych RNAi.

Następnie umieść dwie warstwy kolorowej taśmy etykietowej na szklanym szkiełku o grubości jednego milimetra, jak pokazano tutaj. Zrób dwa z tych szklanych szkiełek. Następnie umieść nowe szkiełko podstawowe między dwoma szkiełkami z taśmą i nałóż kroplę 2%Agros rozpuszczoną w wodzie.

Do środka nowego szkiełka dociśnij drugi szklany szkiełko na górze, aby zrobić cienką podkładkę agrosową. Gdy agros zastygnie, zdejmij górną szybę. Przesuń zjeżdżalnię z podkładką agros, która jest gotowa do załadowania robaków.

Oznacz slajd nazwą klonu. Dodaj 10 mikrolitrów 25-milimolowego azydku sodu do podkładki aros. Następnie, używając drutu platynowego, jak poprzednio, przenieś 30 do 40 zwierząt do roztworu azydu sodu.

Aby je unieruchomić, połóż szkiełko nakrywkowe na górze. Zrobić to zarówno dla zwierząt rekombinowanych, jak i pustych L 4 4 4 0 będących nosicielami RNAi. Następnie umieść szkiełko mikrometryczne pod mikroskopem preparacyjnym z soczewką obiektywu 2,5x.

Za pomocą Q Capture lub podobnego oprogramowania uchwyć obraz linijki mikrometrycznej i zapisz go. Następnie umieść robaki pod lunetą i zrób obrazy. Aby najpierw zmierzyć długość ciała, otwórz obraz linijki mikrometrycznej w oprogramowaniu Image Pro.

Następnie kliknij na pomiar i wybierz kalibrację. Następnie wybierz Kreator kalibracji przestrzennej z wybraną kalibracją aktywnego obrazu. Kliknij Dalej.

Wprowadź nazwę kalibracji i upewnij się, że przestrzenne jednostki odniesienia są ustawione na mikrony. Następnie zaznacz przycisk Utwórz kalibrację referencyjną i kliknij przycisk Dalej. Kliknij narysuj linię odniesienia.

Pojawi się pasek skali odniesienia. Zmień położenie podziałki, aby dopasować ją do końców mikrometru. Następnie wskaż, że odniesienie wskazuje 1000 jednostek.

Kliknij w porządku. Następny i skończ. Po skalibrowaniu oprogramowania otwórz obraz robaka.

Następnie w menu miary wybierz kalibrację, a następnie kliknij wybierz przestrzenny. Z menu rozwijanego wybierz file nazwa utworzony dla kalibracji mikrometru. Następnie w menu miary wybierz pomiary w oknie, które zostanie otwarte.

Wybierz bezpłatne narzędzie do rysowania i za pomocą myszy komputerowej narysuj linię przez środek ciała zwierzęcia od głowy do ogona. Długość zostanie podana w oknie. Powtórz ten proces dla wszystkich zwierząt na polu.

Eksportuj pomiary długości do pliku Microsoft Excel lub innego odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Przeanalizuj dane, obliczając średnią i odchylenie standardowe dla każdej próbki. Następnie porównaj wyniki dla każdej grupy za pomocą testu T-test ucznia.

Transformujący czynnik wzrostu beta lub TGF beta SUPERFAMILY białko DBL one jest wymagane do aktywacji szlaku TGF beta. W odpowiedzi na aktywację sygnału, wewnątrzkomórkowe przetworniki sygnału smad przemieszczają się do jądra i inicjują transkrypcję genu. Zobacz elegancję, w której szlak TGF beta jest zakłócony, mają mniejszy rozmiar ciała, w tym krótszą długość ciała niż zwierzęta typu dzikiego.

W ten sposób ekrany dla morskiej elegancji. Mutanty wielkości ciała są zdolne do identyfikacji składników i modyfikatorów sygnalizacji beta TGF w celu przetestowania skuteczności RNAi poprzez karmienie w celu identyfikacji mutantów wielkości ciała. RNAi został użyty do powalenia DBL jeden szlak składników SMA trzy na SMA sześć w czterech różnych szczepach morskiej elegancji.

Testowane szczepy C elegance obejmowały dwa, które są nadwrażliwe na RN AI, A jeden, Lin 15 B i RF trzy, a także standardowy szczep typu dzikiego N dwa i szczep LIN 36, którego czułość RNAi jest podobna do N dwa, jak pokazano tutaj. Kiedy ekspresja SMA 3 lub SMA 6 została zakłócona, zwierzęta wykazywały znacznie krótszy rozmiar ciała niż zwierzęta kontrolne, z wyjątkiem SMA 6 RNAi w Lin 36. Tło w RF trzy.

Długość tła ciała młodych dorosłych po leczeniu RNAi wynosiła od 84 do 95% samego wektora. W tle A one Lin 15 B długość ciała młodych dorosłych po RNAi wynosiła od 68 do 86% zwierząt kontrolnych. Jednak szczep A one lin 15 B daje potomstwo widokowe.

To sprawia, że nie nadają się do badań przesiewowych na dużą skalę. Dlatego do tych technik sugeruje się użycie trzeciego szczepu RF. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować geny, które regulują wzrost i wielkość ciała za pomocą techniki interferencji RNI.