Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Ogólnym celem tej procedury jest kowalencyjne związanie dwóch cząsteczek BMP z powierzchniami bez utraty ich bioaktywności. Osiąga się to poprzez uprzednie uformowanie warstwy złota na podłożu przez fizyczne osadzanie z fazy gazowej. Drugim krokiem jest stworzenie samoorganizującej się monowarstwy dwufunkcyjnego łącznika NHS Thiol mu NHSA.

Następnie RH BMP dwa jest kowalencyjnie związany z łącznikiem. Ostatnim krokiem jest usunięcie niezwiązanego BMP Two za pomocą sonikacji. Ostatecznie stosuje się test wiązania przeciwciał, aby wykazać pomyślne wiązanie BMP dwa z powierzchniami, a aktywność biologiczną BMP związanego z powierzchnią określa się w komórkach poprzez analizę fosforylacji SMA 1 5 8.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii czynników wzrostu, takie jak to, czy początkowe wiązanie czynników wzrostu z ich receptorami na powierzchni komórki jest wystarczające do wywołania odpowiedzi sygnałowych. Procedurę zademonstrują dwie członkinie mojego laboratorium, Teresa Paul i Elizabeth Schwab. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść szkiełka nakrywkowe precyzyjnymi chusteczkami i poddaj je sonikacji przez pięć minut w mieszaninie octanu etylu i metanolu jeden do jednego.

Po sonikacji spłucz podłoża metanolem i wysusz je pod strumieniem azotu. Umieść czyste podłoża w urządzeniu do napylania i opróżnij komorę. Usuń najwyższą warstwę tlenku chromu z celu chromu, napylając przez 60 sekund.

Następnie pokryj podłoże 10-nanometrową warstwą chromu, a następnie pokryj 40-nanometrową warstwą złota. Po zakończeniu wyjmij złote podłoża z komory i odłóż je na bok. Przenieść złote substraty do kolby okrągłodennej z dwiema szyjkami i inkubować je w jednym milimolowym M-U-N-H-S w DMF w temperaturze pokojowej przez cztery godziny w atmosferze azotu.

Po inkubacji sonikować substraty w DMF przez dwie minuty. Opłucz je DMF i metanolem i wysusz pod strumieniem azotu. Rozcieńczyć dwa roztwory podstawowe RHB MP jednym molowym chlorkiem sodu w PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 3,5 mikrograma na mililitr.

Bezpośrednio przed użyciem dostosuj ten roztwór roboczy do pH 8,5 za pomocą sterylnego 10-milimolowego wodorotlenku potasu. Umieść pierścień A-P-D-M-S na wierzchu próbki. Przenieść substrat na płytkę sześciodołkową, aby upewnić się, że tylko powierzchnie podłoża są wystawione na działanie roztworu inkubacyjnego.

Następnie inkubować funkcjonalizowane substraty M-U-N-H-S z dwoma roztworami roboczymi RHB MP w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po usunięciu supernatantu inkubacyjnego dodać jeden molowy chlorek sodu do PBS i sonikować substraty przez dwie minuty. Po zakończeniu przemyć podłoża trzykrotnie sterylnym jednomolowym chlorkiem sodu w PBS, aby zablokować niespecyficzne wchłanianie przeciwciała.

Inkubować substraty w 5% BSA w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować substraty z roztworem przeciwciał anty BMP przez godzinę w temperaturze pokojowej po zakończeniu, przemyć substraty dwukrotnie PBS i poddać je sonikacji przez 30 sekund. Następnie inkubuj substraty w sprzężonym z HRP roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj je dwukrotnie PBS.

Użyj testu czerwieni grypowej, aby zmierzyć aktywność enzymatyczną HRP na głębokości 570 nanometrów za pomocą ziarna czytnika płytek jeden razy 10 do piątych ust C dwóch C 12 mioblastów na studzienkę w sześciu dołkach w pożywce wzrostowej i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po wyjęciu płytek z inkubatora, odessać pożywkę z dołków i zagłodzić komórki w DMEM wolnym od surowicy przez trzy do pięciu godzin przed wysiewem na funkcjonalizowane BMP dwie powierzchnie substratu w celu zbadania krótkotrwałej indukcji sygnalizacji. Zastąp pożywkę 200 mikrolitrami świeżego DMEM wolnego od surowicy i umieść unieruchomiony BMP dwa podłoża nad komórkami za pomocą pęsety z cienką końcówką po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Delikatnie usunąć podłoża i odessać pożywkę za pomocą pipety. Następnie dwukrotnie przemyj komórki PBS i przystąp do analizy odpowiedzi komórek za pomocą elektroforezy żelowej i western blotting w celu analizy długoterminowej aktywności biologicznej. Umieść komórki na powierzchniach zgodnie z wcześniejszym opisem i hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 w 2% FBS przez sześć dni.

Po inkubacji. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu sprawdzenia RH BMP, dwie powierzchnie wiążące prezentujące unieruchomioną RH BMP dwie inkubowano z przeciwciałem specyficznym dla BMP, dwoma i przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP. Powierzchniowo unieruchomiony RH BMP dwa lub I BMP dwa wykryto przed i po stymulacji komórek.

Pokazane tutaj jest udane wiązanie RH BMP dwa z powierzchnią w potwierdzeniu rozpoznanym przez anty BMP dwie IgG. Unieruchomioną powierzchnię RH BMP 2 określono ilościowo za pomocą testu metrycznego amli flu flu red chole, a dane pokazują, że po stymulacji komórki białko było nadal wykrywane na powierzchni, odpowiedzi komórek na powierzchnie prezentujące unieruchomione RHB MP dwa zostały ocenione i porównane z efektem nietraktowanych substratów złota. W tym przypadku komórki C i C 12 były stymulowane przez 30 minut przez RHB MP dwie funkcjonalizowane powierzchnie zbliżające się od góry.

W tym modelu BMP dwa hamuje różnicowanie komórek w wielojądrowe rurki mięśniowe i indukuje fenotypy osteoblastów. Aktywacja SMAD 1 5 8, które są dalszymi reporterami dwutorowego szlaku sygnałowego BMP, jest analizowana przez western blotting, jak pokazano tutaj. Fosforylację SM obserwuje się po 30-minutowej stymulacji przez I BMP dwa, podczas gdy fosforylacja SMAD 1 58 nie występuje w komórkach wystawionych na działanie niepoddanych działaniu nietraktowanych próbek złota.

Wynik ten wskazuje, że proces unieruchomienia nie zmienia krótkoterminowej aktywności BMP 2 i wyzwala wczesne kroki w sygnalizacji SMAD w celu ustalenia, czy I BM P 2 wpływa na długoterminowe różnicowanie osteogenne. Poziom ekspresji fosfatazy alkalicznej badano za pomocą testu metrycznego chole. Aktywność fosfatazy alkalicznej komórek C dwóch C 12 mierzono po inkubacji komórek przez sześć dni na zwykłym złocie i na dwóch powierzchniach IBP.

Aktywność fosfatazy alkalicznej w lizatach komórek hodowanych na dwóch powierzchniach I BM P wykazała istotnie wyższą absorpcję w porównaniu z kontrolą. Wynik ten ujawnia, że IBMP dwa indukuje ekspresję fosfatazy alkalicznej w C dwóch C 12 komórkach w celu zbadania wpływu IBP dwa. W przypadku miogenezy C dwie komórki C 12 zostały posiane bezpośrednio na złocie lub na funkcjonalizowanych powierzchniach i hodowane w warunkach niskiej surowicy.

Po sześciu dniach wykonano barwienie łańcucha ciężkiego miozyny, jak pokazano tutaj. C, dwie komórki C 12 nie były w stanie utworzyć miozynowych miozynowych mio-komórek o ciężkim łańcuchu dodatnim w obecności I BM P dwa, w przeciwieństwie do komórek na złotych substratach. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak unieruchomienie BMP 2 na nanocząstkach złota, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.

Na przykład, ile unieruchomionego BMP 2 jest lokalnie potrzebne, aby skutecznie wyzwolić odpowiedzi sygnalizacyjne.