Name: Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę kowalentnego wiązania BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującej się monowarstwy. Technika zachowuje bioaktywność białka i umożliwia badanie sygnalizacji komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Prof. J.P. Spatzowi (Wydział Chemii Biofizycznej, Uniwersytet w Heidelbergu oraz Wydział Nowych Materiałów i Biosystemów, Instytut Systemów Inteligentnych im. Maxa Plancka, Stuttgart) za jego życzliwe wsparcie. Z dużym uznaniem cieszy się również wsparcie finansowe ze strony Max-Planck-Gesellschaft i Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SFB/TR79 dla E.A.C.-A.).

1. Synteza estru 11-merkaptoundekanoilo-N-hydroksysukcynimidu (MU-NHS)
<ol>
	<li>Dodawać kroplami roztwór 500 mg N-hydroksysukcynimidu i 30 mg 4-(dimetyloamino)pirydyny w 10 ml acetonu (rocznie) do 1 g kwasu 11-merkaptoundekanowego w 40 ml dichlorometanu (raz na dobę) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Schłodzić reakcję do temperatury 0 °C i dodać kroplami 1,1 g N,N'-dicykloheksylokarbodiamidu w 10 ml dichlorometanu (w atmosferze azotu). Utrzymuj reakcję w niskiej temperaturze przez 1 godzinę, a następnie mieszaj w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Przefiltrować osad i wysuszyć go pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyścić produkt metodą chromatografii błyskawicznej z użyciem benzenu naftowego i octanu etylu (p.a.) w stosunku 1:1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie jednorodnych warstw złota
<ol>
	<li>Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe precyzyjnymi chusteczkami i poddaj je sonikacji przez 5 minut w roztworze zawierającym mieszaninę octanu etylu (p.a.) i metanolu (p.a.) w stosunku 1:1. Podłoża spłukać metanolem i wysuszyć pod strumieniem azotu.</li>
	<li>Umieść czyste podłoża w urządzeniu do powlekania napylającego. Ewakuuj komorę. Usuń najwyższą warstwę tlenku chromu z docelowego chromu, napylając przez 60 sekund. Umieść próbki pod metalową belką i pokryj je warstwą chromu o długości 10 nm, a następnie pokryj warstwą złota o długości 40 nm.</li>
</ol>
3. Unieruchomienie powierzchniowe BMP-2
<ol>
	<li>Rozpuścić MU-NHS w N,N-dimethlyformamide (DMF) do końcowego stężenia około 1 mM i inkubować złote substraty w roztworze MU-NHS w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w atmosferze azotu.</li>
	<li>Sonikować powierzchnie w DMF przez 2 minuty, spłukać DMF i MeOH i wysuszyć pod strumieniem azotu.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy rhBMP-2 w sterylnym 4 mM HCl o stężeniu 100 μg/ml (przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C). W przypadku rozcieńczeń roboczych (3,5 μg/ml) rozcieńczyć roztwór podstawowy w PBS/NaCl (PBS zawierający 1 M NaCl) i bezpośrednio przed użyciem dostosować do pH 8,5.</li>
	<li>Inkubować powierzchnie funkcjonalizowane MU-NHS w roztworze roboczym rhBMP-2 w temperaturze 4 °C przez noc. Usunąć supernatant z inkubacji. Sonikować powierzchnie w PBS/NaCl przez 2 minuty i myć 3x sterylnym PBS/NaCl.</li>
</ol>
4. Charakterystyka powierzchni
<ol>
	<li>Aby zablokować nieswoistą adsorpcję przeciwciała, inkubować powierzchnie z 5% BSA (w/v) w roztworze PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować z przeciwciałem anty-BMP-2 (1:100 w 1% (w/v) roztworze BSA/PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć powierzchnie dwukrotnie PBS i poddać sonikacji przez 30 sekund.</li>
	<li>Inkubować substraty z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP (1:1,000 w 1% (w/v) roztworze BSA/PBS) przez 30 minut w temperaturze RT, a następnie dwukrotnie przemyć PBS.</li>
	<li>Użyj testu Ampliflu Red do pomiaru aktywności enzymatycznej HRP przy 570 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
</ol>
5. Analiza aktywności biologicznej
<ol>
	<li>Wysiewaj 1 x 105 mysich mioblastów C2C12 na studzienkę na płytkach 6-dołkowych w pożywce wzrostowej, składającej się z DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej pirogronian uzupełniony 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i inkubuj je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>Zagłodź komórki w DMEM bez surowicy przez 3-5 godzin przed wysiewem na powierzchnie ozdobione unieruchomionym BMP-2.</li>
	<li>W celu zbadania krótkotrwałej indukcji sygnalizacji należy zastąpić pożywkę 200 μl świeżego DMEM bez surowicy i umieścić unieruchomione powierzchnie BMP-2 nad komórkami. Z powierzchnią należy obchodzić się pęsetą z cienką końcówką, aby uniknąć zarysowań.</li>
	<li>Delikatnie usunąć powierzchnie i odessać pożywkę pipetą, dwukrotnie umyć komórki PBS. Przejdź do analizy odpowiedzi komórek.</li>
	<li>W celu analizy długoterminowej aktywności biologicznej należy umieścić komórki na powierzchni i hodować je w temperaturze 37 °C/5% CO2 w warunkach niskiej surowicy (2% FBS) przez sześć dni.</li>
</ol>

<ol><li>Helm, G., Andersson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summary+statement%3A+Bone+morphogenetic+proteins%3A+Basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science.</a> Spine. 27 (16S), S9(2002).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+multifunctional+regulators+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development.</a> Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).</li>
<li>Reddi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs%3A+from+bone+morphogenetic+proteins+to+body+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).</li>
<li>Rengachary, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+basic+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurg+Focus%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: basic concepts.</a> Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).</li>
<li>Schlunegger, M., Grütter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+feature+revealed+by+the+crystal+structure+at+2.2+%C3%85%3B+resolution+of+human+transforming+growth+factor-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2.</a> Nature. 358, 430-434 (1992).</li>
<li>Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+bone+morphogenetic+protein-2+at+2.7+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution.</a> J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).</li>
<li>Nimni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypeptide+growth+factors%3A+targeted+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Polypeptide growth factors: targeted delivery systems.</a> Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).</li>
<li>Wozney, J., Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+and+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+bone+formation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Related+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair.</a> Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).</li>
<li>Rosen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+BMP+inhibitors+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">BMP and BMP inhibitors in bone.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+BMP-2-BRIA+ectodomain+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).</li>
<li>Keller, S., Nickel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recognition+of+BMP-2+and+BMP+receptor+IA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor+signaling%3A+transcriptional+targets%2C+regulation+of+signals%2C+and+signaling+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).</li>
<li>Nohe, A., Hassel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+bone+morphogenetic+protein+%28BMP%29+receptor+oligomerization+determines+different+BMP-2+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways.</a> J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+immobilization+of+epidermal+growth+factor+onto+culture+substrates+for+the+selective+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells.</a> Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).</li>
<li>Gonçalves, R., Martins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+immobilized+EGF+on+self-assembled+monolayers%3A+Optimization+of+the+immobilization+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+Part+A.+94A%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).</li>
<li>Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+converts+the+differentiation+pathway+of+C2C12+myoblasts+into+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage.</a> J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).</li>
<li>Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+release+from+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Growth factor release from tissue engineering scaffolds.</a> J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).</li>
<li>Uludag, H., D'Augusta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+a+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+BMP-2+for+functionalization+of+titanium+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces.</a> Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).</li>
<li>Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-2+decorated+silk+fibroin+films+induce+osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).</li>
<li>Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+systems+for+bone+growth+factors+-+the+new+players+in+skeletal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration.</a> J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).</li>
<li>Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+growth+factor+immobilization+strategies+for+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration.</a> Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).</li>
<li>Crouzier, T., Fourel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+BMP-2+from+a+soft+biopolymeric+film+unveils+its+activity+on+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration.</a> Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).</li>
<li>Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+morphogenetic+protein+2+contains+a+heparin-binding+site+which+modifies+its+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity.</a> European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).</li>
<li>Love, J., Estroff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+thiolates+on+metals+as+a+form+of+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).</li>
<li>Kato, K., Sato, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+histidine-tagged+recombinant+proteins+onto+micropatterned+surfaces+for+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays.</a> Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).</li>
<li>Martins, M., Curtin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+designed+surfaces+for+blood+deheparinization+using+an+immobilized+heparin-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide.</a> J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).</li>
<li>Limbut, W., Kanatharana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+capacitive+immunosensors+based+on+self-assembled+monolayers+formed+from+thiourea%2C+thioctic+acid%2C+and+3-+mercaptopropionic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid.</a> Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).</li>
<li>Patel, N., Davies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+protein+molecules+onto+homogeneous+and+mixed+carboxylate-terminated+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).</li>
<li>Hu, J., Duppatla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+PEGylation+of+bone+morphogenetic+protein-2+cysteine+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues.</a> Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).</li>
<li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGD+modified+polymers%3A+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li>
<li>Cao, T., Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+spacer+length+effect+on+immobilized+Escherichia+coli+pili-antibody+molecular+recognition+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM.</a> Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).</li>
<li>Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+immobilize+bioactive+proteins%2C+including+bone+morphogenetic+protein-4+%28BMP-4%29%2C+on+titanium+alloy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy.</a> Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym protokole opisujemy przygotowanie powierzchni funkcjonalizowanych bioaktywnym rhBMP-2. Podejście to składa się z dwóch etapów: 1) wstępnego uformowania samoorganizującej się monowarstwy (SAM) dwufunkcyjnego łącznika na powierzchni złota; 2) kowalencyjna immobilizacja białka rhBMP-2. W poprzednich pracach zwalidowaliśmy skuteczne wiązanie dwufunkcyjnego łącznika i czynnika wzrostu oraz wykazaliśmy, że unieruchomiony powierzchniowo rhBMP-2 utrzymuje swoją aktywność biologiczną19. Bioaktywność czynni...

Białko morfogenetyczne kości 2 (BMP-2) należy do rodziny transformujących czynników wzrostu (TGF-β) i działa jako induktor tworzenia kości de novo, jak również regulator kilku tkanek podczas rozwoju embrionalnego i homeostazy dorosłych1-3. Każdy monomer biologicznie aktywnego homodimerycznego białka BMP-2 zawiera motyw "węzła cysteinowego", który jest wysoce konserwatywny we wszystkichBMPs 4. Sześć z siedmiu reszt cysteiny tworzy wewnątrzcząsteczkowe wiązania dwusiarczkowe, które stabilizują każdy monomer, podczas gdy siódma cysteina bierze udział w dimeryzacji, tworząc wiązanie międzycząsteczkowe między dwoma monomerami5,6. Ten wysoce konserwatywny węzeł cysteinowy określa trójwymiarową strukturę białka BMP-2 i decyduje o jego unikalnych właściwościach, takich jak odporność na ciepło, denaturanty i kwaśne pH7-9. BMP-2 wiąże się z receptorami transbłonowymi kinazy serynowo-treoninowej , indukując w ten sposób transdukcję sygnału10-12. W zależności od trybu oligomeryzacji receptora aktywowane są różne szlaki sygnałowe: kaskada sygnałowa niezależna od Smad prowadzi do indukcji fosfatazy alkalicznej poprzez sygnalizację p38, podczas gdy szlak zależny od Smad aktywowany przez fosforylację receptora powoduje translokację jądrową kompleksu Smad i aktywację transkrypcji określonych genów docelowych, takich jak inhibitor różnicowania (Id)12-14.
W kości, BMP-2 indukuje różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych w osteoblasty, stymulując w ten sposób gojenie i tworzenie się de novo kości. Obecnie BMP-2 o ekspresji rekombinowanej jest stosowany klinicznie w celu przyspieszenia gojenia się złamanych miejsc. Powszechną strategią w inżynierii tkanki kostnej jest stosowanie iniekcyjnych czynników wzrostu, które są mniej inwazyjne w porównaniu z miejscowymi systemami dostarczania. Jednak badania in vivo i zastosowania kliniczne wykazały, że krótki biologiczny okres półtrwania, niespecyficzna lokalizacja i szybki miejscowy klirens BMP-2 mogą prowadzić do kilku problemów miejscowych, ektopowych i ogólnoustrojowych15. W związku z tym, aby uzyskać skuteczną prezentację, konieczne jest uwięzienie lub unieruchomienie BMP-2 w materiałach lub na materiałach w celu jego lokalnego i trwałego dostarczenia do miejsca docelowego. Trwałe dostarczanie można osiągnąć za pomocą podejść do retencji niekowalencyjnej, takich jak uwięzienie fizyczne, adsorpcja lub kompleksowanie jonów16. Wiadomo jednak, że niespecyficzna adsorpcja białek do powierzchni może prowadzić do denaturacji cząsteczek17. W ciągu ostatniej dekady opracowano różne rodzaje podpór do kowalencyjnego wiązania czynników wzrostu. Zastosowanie dwufunkcyjnych cząsteczek łączących, które są ukierunkowane na przykład na grupy aminowe lub karboksylowe białka, jest jednym z rodzajów podejścia, które niekoniecznie wymaga modyfikacji białka w celu osiągnięcia jego unieruchomienia. W rzeczywistości, podczas gdy modyfikacja białek ma tę zaletę, że kontroluje orientację białka, wprowadzenie sztucznych domen, znaczników peptydowych i łańcuchów specyficznych dla miejsca może zmienić aktywność biologiczną czynników wzrostu17. Tak więc, aby obejść denaturację spowodowaną interakcją z materiałem nośnym, powierzchnie można wcześniej funkcjonalizować, na przykład za pomocą samoorganizującej się monowarstwy (SAM) cząsteczki łączącej, a następnie sprzężenia pożądanego czynnika18. Zastosowaliśmy podejście oparte na SAM do kowalencyjnego unieruchomienia BMP-2 na powierzchni poprzez celowanie w jego wolne reszty aminowe i wykazaliśmy, że unieruchomione białko zachowuje zarówno krótko-, jak i długoterminową aktywność biologiczną19. Protokół ten zapewnia prosty i skuteczny sposób dostarczania BMP-2 do komórek w celu przeprowadzenia badań in vitro nad mechanizmami zachodzącymi na błonie komórkowej i regulującymi sygnalizację wewnątrzkomórkową odpowiedzialną za sygnalizację osteogenną.

<table><tbody><tr><td>N-hydroksysukcynimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>4-(dimetyloamino)pirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>522805</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>AppliChem</td><td>A2282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas 11-merkaptoundekanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>674427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dichlormetan</td><td>Merck</td><td>106050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D80002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ropa naftowa benzen</td><td>Merck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Carl Roth</td><td>M 875</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zastosowanie</td> <td>octanu etylu</td><td>A3550</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth</td><td>4627</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Carl Roth</td><td>T921</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D Systems</td><td>355-BM</td><td>Bez nośnika; wyrażony w E.coli</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli(dimetylosiloksan) (PDMS)Dow</td> <td>Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-rhBMP-2</td><td>Sigma</td><td>B9553</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Test Ampliflu Red</td><td>Sigma</td><td>90101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), płyn</td><td>Gibco</td><td>41966</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca o wysokim poziomie glukozy (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>Sterylnie filtrowana, testowana na hodowlach komórkowych</td></tr><tr><td>Długopis/Paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05% (1x) z EDTA 4Na</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicyna (0,1 M)</td><td>Riedel-de Ha&euml; nr</td><td>33226</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (1%)</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td>Bufor do lizy (test ALP)19</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)(1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>HNO3.2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek (ZnCl2) (1 mM)</td><td>Carl Roth</td><td>3533.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p-nitrofenylofosforan (pNPP)</td><td>Sigma</td><td>S0942</td><td>Substrat fosfatazy</td></tr><tr><td>Łańcuch ciężki anty-myzyny (MHC)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>MF20</td><td>Przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza anty-mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Kąpiel Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Częstotliwość 35 kHz</td><td>BANDELIN electronic GmbH Co. KG</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MED 020 System napylania</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td>Warunki powlekania Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sek Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sek</td></tr><tr><td>Tecan Infinite M200 Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kowalencyjne wiązanie bmp-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Covalent Binding of BMP-2 on Surfaces Using a Self-assembled Monolayer Approach

Białko morfogenetyczne kości 2 (BMP-2) jest czynnikiem wzrostu osadzonym w macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki kostnej. BMP-2 działa jako wyzwalacz różnicowania komórek mezenchymalnych w osteoblasty, stymulując w ten sposób gojenie i tworzenie kości de novo. Kliniczne zastosowanie rekombinowanego ludzkiego BMP-2 (rhBMP-2) w połączeniu z rusztowaniami wzbudziło ostatnio kontrowersje, związane ze sposobem prezentacji i ilością podawaną. Przedstawiony tutaj protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób dostarczania BMP-2 do badań in vitro na komórkach. Opisujemy, jak utworzyć samoorganizującą się monowarstwę składającą się z heterobifunkcyjnego łącznika i pokazujemy kolejny etap wiązania w celu uzyskania kowalencyjnego unieruchomienia rhBMP-2. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest osiągnięcie trwałej prezentacji BMP-2 przy jednoczesnym zachowaniu aktywności biologicznej białka. W rzeczywistości powierzchniowe unieruchomienie BMP-2 pozwala na ukierunkowane badania, zapobiegając niespecyficznej adsorpcji, jednocześnie zmniejszając ilość czynnika wzrostu, a przede wszystkim utrudniając niekontrolowane uwalnianie z powierzchni. Zarówno krótko-, jak i długoterminowe zdarzenia sygnalizacyjne wyzwalane przez BMP-2 mają miejsce, gdy komórki są wystawione na działanie powierzchni prezentujących kowalencyjnie unieruchomiony rhBMP-2, co czyni to podejście odpowiednim do badań in vitro nad odpowiedziami komórek na stymulację BMP-2.

W naszej konfiguracji jako substancja pomocnicza wybrano złoto, ponieważ zapewnia ono biologicznie nieswoisty, lecz chemicznie regulowalny układ. Co więcej, zastosowanie samoorganizujących się monowarstw niesie ze sobą wiele korzyści: SAM spontanicznie adsorbują się za pomocą swoich „grup głowowych” na metalach i tworzą monowarstwy z niewielką liczbą defektów, podczas gdy ich funkcjonalne grupy końcowe mogą być dalej modyfikowane. Stanowią one zatem platformę do dostosowania właściwości interfejsu w sposób kontrolowany, ...

Opisujemy metodę skutecznego unieruchamiania BMP-2 na powierzchniach. Nasze podejście opiera się na tworzeniu samoorganizującej się monowarstwy w celu uzyskania kowalencyjnego wiązania BMP-2 poprzez jego wolne reszty aminowe. Ta metoda jest użytecznym narzędziem do badania sygnalizacji na błonie komórkowej.

Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) is a growth factor embedded in the extracellular matrix of bone tissue. BMP-2 acts as trigger of mesenchymal cell ...

Ogólnym celem tej procedury jest kowalencyjne związanie dwóch cząsteczek BMP z powierzchniami bez utraty ich bioaktywności. Osiąga się to poprzez uprzednie uformowanie warstwy złota na podłożu przez fizyczne osadzanie z fazy gazowej. Drugim krokiem jest stworzenie samoorganizującej się monowarstwy dwufunkcyjnego łącznika NHS Thiol mu NHSA.Następnie RH BMP dwa jest kowalencyjnie związany z łącznikiem. Ostatnim krokiem jest usunięcie niezwiązanego BMP Two za pomocą sonikacji. Ostatecznie stosuje się test wiązania przeciwciał, aby wykazać pomyślne wiązanie BMP dwa z powierzchniami, a aktywność biologiczną BMP związanego z powierzchnią określa się w komórkach poprzez analizę fosforylacji SMA 1 5 8.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii czynników wzrostu, takie jak to, czy początkowe wiązanie czynników wzrostu z ich receptorami na powierzchni komórki jest wystarczające do wywołania odpowiedzi sygnałowych. Procedurę zademonstrują dwie członkinie mojego laboratorium, Teresa Paul i Elizabeth Schwab. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść szkiełka nakrywkowe precyzyjnymi chusteczkami i poddaj je sonikacji przez pięć minut w mieszaninie octanu etylu i metano

covalent-binding-bmp-2-on-surfaces-using-self-assembled-monolayer

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszej pracy pokazujemy, jak wykorzystać test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay, PLA) wraz z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (Bone Morphogenetic Protein, BMP) w utrwalonych komórkach. Technika ta pozwoliła nam śledzić nuklearną akumulację endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych przez BMP oraz ilościowo określić ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.

Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Biomateriały domieszkowane białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP2) zostały użyte jako nowa strategia terapeutyczna do leczenia złamań kostnych bez zrostu. Aby przezwyciężyć skutki uboczne wynikające z niekontrolowanego uwalniania czynnika, proponujemy nową strategię bezpośredniego unieruchomienia czynnika, tworząc w ten sposób materiały o ulepszonych zdolnościach osteogennych.

Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Sonda siły biomembranowej (BFP) to technika dynamicznej spektroskopii sił in situ (DFS). BFP można wykorzystać do pomiaru stałej sprężystości oddziaływań molekularnych na żywe komórki. Protokół ten przedstawia analizę stałej sprężystości dla wiązań molekularnych wykrytych przez BFP.

Analiza molekularnej stałej sprężystości za pomocą spektroskopii sondy siły biomembranowej

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Protokół syntezy i charakterystyki samoorganizujących się monowarstw szkieletu metaloorganicznego jest dostarczany przy użyciu szczepionych polimerami, kryształów metaloorganicznych (MOF). Procedura pokazuje, że cząstki MOF szczepione polimerem mogą być samoorganizujące się na granicy faz powietrze-woda, co skutkuje dobrze uformowanymi, wolnostojącymi, jednowarstwowymi strukturami, czego dowodem jest obrazowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się monowarstw metaloorganicznych z wykorzystaniem cząstek pokrytych polimerem

Poznaj metodę kowalentnego wiązania BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującej się monowarstwy. Technika zachowuje bioaktywność białka i umożliwia badanie sygnalizacji komórkowej.

Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Przeglądaj więcej filmów