Proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła

Protokół ten przedstawia metodę amplifikacji toczącego się koła w celu wykrycia aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach w szybki i prosty sposób. Główną zaletą tej metody jest to, że jest łatwa do naśladowania również przez niedoświadczonych badaczy i jest bardziej czuła w porównaniu z innymi testami na bazie żelu, gdy stosuje się surowe ekstrakty. Zastosowanie tego protokołu rozciąga się od pomiaru odpowiedzi na leczenie farmakologiczne po badania przesiewowe związków małocząsteczkowych o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym lub przeciwzakaźnym.

Procedurę zademonstruje Karol Mizieliński, specjalista ds. rozwoju z naszego laboratorium. Na początek przymocuj specjalnie zaprojektowaną silikonową siatkę izolacyjną do funkcjonalnego szkiełka, tworząc w ten sposób studnię. Dociśnij silikonową siatkę, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza między powierzchnią szkła a silikonem.

Następnie przygotuj mieszankę starterów, dodając pięć mikromolowych, pięć pierwszych aminokwasów w jednym buforze wydruku. Następnie dodaj cztery mikrolitry tej mieszaniny do każdej studzienki i inkubuj wytwornicę studni w komorze hybrydyzacyjnej z nasyconym chlorkiem sodu. Aby wytworzyć zamknięte okrągłe substraty, dodaj dwa mikrolitry pięciu mikromolowych substratów specyficznych dla topoizomerazy 1 i dwa mikrolitry rekombinowanego enzymu topoizomerazy 1 lub przygotowanego ekstraktu komórkowego do 16 mikrolitrów jednorazowego buforu reakcyjnego topoizomerazy.

Inkubuj tę okrągłą mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut i zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając dwa mikrolitry 1% sds. Zanurz studzienkę w tacce wypełnionej buforem 1, podgrzanym do 50 stopni Celsjusza. Odpipetować bufor do studzienek, aby upewnić się, że wewnątrz studzienki nie pozostały pęcherzyki powietrza, a następnie inkubować tacę przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza.

Po inkubacji usunąć bufor 1 i przemyć dwukrotnie wodą destylowaną, energicznie wstrząsając, przez jedną minutę między przemyciami. Usuń wodę, następnie dodaj bufor 2, podgrzany do 50 stopni Celsjusza do tacy, a następnie inkubuj i umyj maszynkę do studzienek, jak pokazano wcześniej dla buforu 1. Następnie umyj maszynę do studzienek 70% etanolem, energicznie potrząsając przez minutę i użyj sprężonego powietrza, aby zestaw wyschł.

Aby przeprowadzić hybrydyzację, dodaj cztery mikrolitry przygotowanej mieszaniny kołowej do każdej odpowiedniej studzienki i umieść maszynkę do studzienki w komorze wilgotnościowej z wodą destylowaną o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji myć studzienkę przez jedną minutę i buforować 3, bufor 4 i 70% etanolu, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Przygotuj i dodaj cztery mikrolitry mieszaniny RCA do każdej studzienki studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w komorze wilgotnościowej.

Aby mikroskopowo uwidocznić wzmocnione fluorescencyjne produkty z toczącego się koła, najpierw umyj szkiełko buforem 3, buforem 4 i 70% etanolem. Osusz szkiełko sprężonym powietrzem i przyklej je do szkiełka mikroskopowego. Zaznacz położenie studzienek markerem, a następnie usuń silikonową siatkę za pomocą pęsety.

Aby umożliwić wizualizację w kamerze, zamontuj szkiełko z dwoma mikrolitrami medium montażowego bez dapi i dodaj szkło nakrywkowe. Przeanalizuj szkiełko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, z 60-krotnym obiektywem zanurzonym w oleju i kamerą. Po obrazowaniu zaimportuj zdjęcia do obrazu J i ułóż obrazy w stos, klikając Obraz, następnie Stosy i obrazy do stosu, a następnie zmień typ obrazu na 8 bitów.

Aby ustawić próg, kliknij Obraz, Dostosuj, a następnie Próg. Ustaw dolny pasek na 255 i dostosuj górny pasek tak, aby tylko prawe sygnały były czerwone, a tło było czarne. Przejrzyj poszczególne obrazy i upewnij się, że odpowiadają obrazom przed dostosowaniem progu.

Upewnij się, że próg jest ustawiony tak nisko, jak to możliwe, zanim rzeczywiste sygnały zaczną zanikać. Aby policzyć sygnały, kliknij Analizuj, a następnie Analizuj cząstki i upewnij się, że pole podsumowania w ustawieniach obrazu J jest zaznaczone. Dodać cztery mikrolitry rozcieńczonego przeciwciała antybiotyny sprzężonego z peroksydazą chrzanowa do każdej studzienki i inkubować w temperaturze od 15 do 25 stopni Celsjusza przez 50 minut w komorze wilgotnościowej.

Pod koniec inkubacji umyć studzienkę trzykrotnie buforem 5 przez trzy minuty każdy i pozostawić do wyschnięcia. Aby zobrazować chemiluminescencję, dodaj dwa mikrolitry świeżo przygotowanej mieszanki luminolu ECL i nadtlenku wodoru do studzienek i zwizualizuj szkiełko za pomocą kamery CCD lub na kliszach rentgenowskich. Alternatywnie, aby wykonać wizualizację za pomocą TMB, usuń silikonową siatkę po umyciu buforem 5 i dodaj 400 mikrolitrów TMB na wierzch całego szkiełka.

Trzymaj szkiełko w komorze wilgotnościowej i poczekaj od pięciu do 10 minut na uzyskanie koloru. Po wywołaniu koloru umyj szkiełko 70% tethanem i sfotografuj szkiełko aparatem lub telefonem komórkowym w celu analizy za pomocą oprogramowania do obrazu J. Zaimportuj obraz do obrazu J i zmień typ obrazu na 8-bitowy, klikając Typ obrazu, a następnie 8-bitowy.

Ogranicz mierzony obszar za pomocą narzędzia do rysowania prostokątów z paska narzędzi, aby osobno zmierzyć pasma i narysować żądany obszar. Zmierz intensywność, klikając, analizuj, a następnie zmierz. Następnie przesuń pierwotnie narysowany obszar do następnego pasma i zmierz.

Po zmierzeniu intensywności dla wszystkich pasm, narysuj dane w żądanym oprogramowaniu. Aktywność topoizomerazy 1 określona za pomocą odczytu skanera fluorescencyjnego jest przedstawiona tutaj, jak wynika z oceny ilościowej. Odczyt ten ma granicę wykrywalności wynoszącą 12,5 nanograma, reprezentatywne obrazy i wynikowe określenie ilościowe uzyskane za pomocą odczytu z mikroskopu fluorescencyjnego są pokazane tutaj.

Ta metoda odczytu ma granicę wykrywalności wynoszącą 0,1 nanograma, próg wykrywania wzmocnionej chemiluminescencji i metod odczytu kolorowego wynosił 6 nanogramów. Przy tych samych odczytach granica wykrywalności wynosiła 1 250 komórek dla ECL i 312 komórek dla TMB. Gdy aktywność topoizomerazy 1 mierzono z ekstraktów pochodzących z komórek gruczolakoraka jelita grubego.

Jako przykład zastosowania badań przesiewowych leków, aktywność topoizomerazy 1 mierzono w obecności kamptotecyny lub dimetylosulfotlenku. Wyniki kwantyfikacji wykazały, że kamptotekyna hamuje krążenie substratu za pośrednictwem topoizomerazy 1 zgodnie z oczekiwaniami. Jest to prosty protokół, który wymaga jedynie zwrócenia szczególnej uwagi na etapy mycia i czas inkubacji reakcji.

Możliwe jest również zbadanie, w jaki sposób leki hamują aktywność topoizomerazy 1, przy użyciu Reida jest bardzo czuły i łatwy do wykonania, umożliwia szybkie badanie przesiewowe potencjalnych inhibitorów topoizomerazy 1 oraz wykorzystanie aktywności topoizomerazy 1 jako biomarkera odpowiedzi na lek w nowotworach.