Name: Proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj metodę amplifikacji toczącego się koła do wykrywania aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych. Technika ta oferuje wysoką czułość i prostotę, umożliwiając badaczom skrining leków oraz pomiar odpowiedzi komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować technikowi laboratoryjnemu Noriko Y. Hansen, Wydziałowi Biologii Molekularnej i Genetyki, Uniwersytet w Aarhus, za pomoc techniczną w związku z oczyszczaniem enzymów Phi29 i TOP1.

UWAGA: Znajdź listę wymaganych kompozycji, sprzętu i innych materiałów w Tabeli materiałów.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hoduj preferowane komórki w odpowiednim podłożu i hoduj je zgodnie z instrukcjami. Na przykład hoduj Caco2, komórki pochodzące z gruczolakoraka jelita grubego, w pożywce Minimal Essential Medium (MEM) uzupełnionej 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 100 jednostek/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Hodowle komórkowe należy przechowywać w wilgotnym inkubatorze (5%CO2/95% atmosfera powietrza w temperaturze 37 °C). Umieść komórki w kolbach do hodowli tkankowych i dziel co 3 dni, aby utrzymać komórki na poziomie 70% zgrywania.</li>
	<li>Zebrać komórki z 70% zlewającej się kolby przez traktowanie trypsyną (0,25% trypsyna, 0,02% roztwór EDTA) i przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS, aby dostosować stężenie komórek do 0,5 × 106 komórek / probówkę. Wirować z prędkością 200 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant. 
	UWAGA: Ogniwa używane do REEAD muszą być świeże i przechowywane na lodzie. Wyniki uzyskane za pomocą komórek Caco2 zostały niedawno opublikowane17. Test został przetestowany na różnych liniach komórkowych, w tym na komórkach pochodzących z raka okrężnicy, piersi, płuc i szyjki macicy18,19,20,21,22,23, ale może być używany ze wszystkimi surowymi próbkami biologicznymi zawierającymi TOP1, takimi jak tkanki, krew i ślina.</li>
</ol>
2. Przygotowanie funkcjonalnych slajdów
<ol>
	<li>Przymocuj specjalnie zaprojektowaną silikonową siatkę izolacyjną do funkcjonalnej zjeżdżalni, tworząc w ten sposób studnię. Dociśnij silikon, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przygotować mieszaninę 5 μM 5'-aminowego primera w 1x buforze wydruku. Dodać 4 μl mieszaniny do każdej studzienki i umieścić studnię w komorze hybrydyzacyjnej z nasyconym NaCl w temperaturze od 15 °C do 25 °C, chroniąc przed światłem. 
	UWAGA: Komorę hybrydyzacyjną można łatwo wykonać za pomocą pudełka z końcówkami do pipet wypełnionego nasyconym NaCl. Hybrydyzacja trwa minimum 16 h i maksimum 72 h. Zobacz sekwencję startera 5'-aminowego w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. Szkiełka są funkcjonalizowane grupami NHS, aby umożliwić wiązanie oligonukleotydów modyfikowanych amino.</li>
</ol>
3. Generowanie zamkniętych podłoży cyrkularnych
<ol>
	<li>Przygotowanie zamkniętych okrągłych substratów z rekombinowanym TOP1 lub ekstraktem komórkowym.
	<ol>
		<li>Lizować osad komórkowy składający się z 0,5 × 106 komórek w 500 μl buforu do lizy, aby osiągnąć gęstość komórek 1,000 komórek/μl. Inkubować przez 10 minut na lodzie.</li>
		<li>Przygotować okrągłą mieszaninę składającą się z 2 μL 5 μM substratu specyficznego dla TOP1 (sekwencja substratu jest następująca: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') i 2 μL rekombinowanego enzymu TOP1 lub 2 μL komórki ekstrahować (patrz krok 3.1.1) w 16 μl 1x buforu reakcyjnego TOP1. 
		UWAGA: Stężenie użytego rekombinowanego TOP1 zależy od wybranej metody odczytu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2, <silna klasa="xfig">Rysunek 3, <silna klasa="xfig">Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5). Zobacz sekwencję substratu specyficznego dla TOP1 w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D).</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 2 μl 1% SDS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zamkniętych okrągłych substratów w obecności leków
	<ol>
		<li>Przygotuj okrągłą mieszaninę składającą się z 2 μL 5 μM substratu specyficznego dla TOP1 i 1 μL 100% DMSO lub 1 μL 1,6 mM kamptotecyny (CPT) w 14 μL 1x buforu reakcyjnego TOP1. Dodać 2 μl rekombinowanego enzymu TOP1 o stężeniu 5 ng/μl. 
		UWAGA: Można stosować inne związki małocząsteczkowe lub leki. W takim przypadku należy dokonać miareczkowania związku. Jeśli związek jest rozpuszczony w rozpuszczalniku innym niż DMSO, należy go użyć jako kontroli zamiast DMSO.</li>
		<li>Inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 2 μl 1% SDS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: Krok 3 można rozpocząć równolegle z krokiem 2, a okręgi mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc. Alternatywnie, kręgi DNA można przygotować w tym samym czasie, co krok 4 i natychmiast zużyć. Zobacz sekwencję substratu specyficznego dla TOP1 w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C. Podłoże składa się w kształt hantli z podwójnym obszarem łodygi zawierającym preferowane miejsce cięcia TOP1 i dwie jednożyłowe pętle. Otwarte podłoże hantli jest przekształcane w zamknięte okrągłe podłoże przez rozszczepienie i podwiązanie za pośrednictwem TOP1 i jest dalej określane jako koło. Ze względu na nadmiar primeru 5'-amino, nie będzie konkurencji między otwartymi i zamkniętymi podłożami specyficznymi dla TOP1.
4. Blokowanie twórcy studni
<ol>
	<li>Zanurzyć koperkę w tacce o wymiarach 5 cm x 5 cm wypełnionej buforem 1, który został wstępnie podgrzany do 50 °C. Za pomocą pipety wepchnij płyn do studzienek, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Usunąć bufor 1 i przemyć 2 x 1 min dH2O. Energicznie wstrząsnąć ręką.</li>
	<li>Dodać bufor 2, który został wstępnie podgrzany do temperatury 50 °C. Upewnij się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Umyć 2 x 1 min z dH2O. Energicznie wstrząsnąć ręką.</li>
	<li>Myć z 70% EtOH przez 1 min. Energicznie wstrząsnąć ręką.</li>
	<li>Pozwól wiertnikowi schnąć na powietrzu. 
	UWAGA: Do osuszenia studni użyj sprężonego powietrza. Alternatywnie możliwe jest przedmuchiwanie powietrzem za pomocą pipety Pasteura. Przed kontynuowaniem upewnij się, że studzienki są suche.</li>
</ol>
5. Hybrydyzacja kręgów do twórcy studni
<ol>
	<li>Dodaj 4 μl okręgów (wykonanych w kroku 3) do każdego odpowiedniego dołka.</li>
	<li>Umieścić komorze wilgotnościowej w komorze wilgotnościowej na 1 godzinę z dH2O w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Komorę wilgotnościową można wykonać, używając pudełka na końcówki do pipet wypełnionegodH2O. Alternatywnie hybrydyzację można przeprowadzić przez noc w temperaturze 25 °C w komorze wilgotnościowej.</li>
</ol>
6. Mycie
<ol>
	<li>Umyj studnię za pomocą buforu 3.</li>
	<li>Usuń bufor 3 i zastąp go buforem 4.</li>
	<li>Usunąć bufor 4 i przemyć 70% EtOH.</li>
	<li>Usuń EtOH i pozwól wiertnikowi wyschnąć. 
	UWAGA: Wszystkie etapy mycia są wykonywane przez 1 minutę w tacy o wymiarach 5 cm x 5 cm poprzez całkowite zanurzenie szkiełka. Zawsze upewnij się, że w studzienkach nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
7. Wzmocnienie toczącego się koła
<ol>
	<li>Przygotuj mieszaninę RCA składającą się z 1x buforu reakcyjnego Phi29 uzupełnionego 0,2 μg / μL BSA, 1 jednostką polimerazy Phi29 i 0,25 mM dNTP i 0,0125 mM ATTO-488-dUTP do odczytu fluorescencji lub 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP i 0,01 mM Biotin-dCTP do odczytu kolorymetrycznego/chemiluminescencyjnego. Dodaj 4 μl do każdego dołka. Zobacz Rysunek 1E. 
	UWAGA: Przygotowanie mieszanki RCA musi odbywać się na lodzie. W przypadku włączania nukleotydów fluorescencyjnych do RCA, unikaj bezpośredniego światła z tego etapu, aby chronić fluorofory.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej. W przypadku stosowania nukleotydów fluorescencyjnych należy ustawić komorę wilgotnościową w ciemności. Zobacz Rysunek 1F,G.</li>
</ol>
8. Mycie
<ol>
	<li>W przypadku protokołów odczytu chemiluminescencji lub kolorymetrii umyj studzierkę jak w kroku 6, a następnie przejdź do kroku 11.</li>
	<li>W przypadku protokołu odczytu fluorescencji przed praniem usuń silikonową siatkę za pomocą pęsety, jak w poniższych krokach.
	<ol>
		<li>Myć szkiełko przez 10 minut w buforze 3.</li>
		<li>Usuń bufor 3 i zastąp go buforem 4. Prać przez 5 min.</li>
		<li>Usuń bufor 4 i myj przez 1 minutę w 70% EtOH.</li>
		<li>Usuń EtOH i pozwól studni wyschnąć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Wizualizacja fluorescencyjnych produktów z toczącego się koła za pomocą skanera fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Zeskanuj szkiełko w skanerze fluorescencyjnym za pomocą filtrów odpowiadających zastosowanemu fluoroforowi. Użyj maksymalnego możliwego fotopowielacza, który nie daje nasycenia. 
	UWAGA: Skaner fluorescencyjny używany do akwizycji obrazu w tym protokole wyposażony jest w laser o długości fali 473 nm oraz filtr-wzbudzenie FAM o długości fali 490 nm, emisja 520 nm.</li>
	<li>Zaimportuj obraz do ImageJ i zmień typ obrazu na 8-bitowy (Obraz | Rodzaj | 8-bitowy). Aby zmierzyć pasma osobno, ogranicz mierzony obszar za pomocą narzędzia do rysowania prostokątów z paska narzędzi. Narysuj żądany obszar i zmierz intensywność (Analizuj | Środek). Następnie przenieś pierwotnie narysowany obszar do następnego pasma i zmierz.</li>
	<li>Wykreśl dane w żądanym oprogramowaniu. Reprezentatywne obrazy, w tym kwantyfikacja wyodrębniona z ImageJ, są przedstawione na Rysunek 2.</li>
</ol>
10. Wizualizacja fluorescencyjnych produktów z toczącego się koła za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Za pomocą pisaka odpornego na EtOH narysuj położenie studzienek przed zdjęciem siatki silikonowej i umyj szkiełko jak w kroku 8.2. Po zakończeniu etapów mycia zamontuj szkiełko z 1 μl podłoża montażowego bez 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) i dodaj szklankę nakryciową. Aby umożliwić wizualizację w aparacie, przyklej szkiełko do szkiełka mikroskopowego o wymiarach 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Analizuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w 60-krotny obiektyw zanurzeniowy w oleju i kamerę. Zrób 12-15 zdjęć każdej próbki/studzienki.</li>
	<li>Zaimportuj obrazy do ImageJ i ułóż je w stos (punkt menu Obraz | Stosy | Obraz do stosu). Zmień typ obrazu na 8-bitowy (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy).</li>
	<li>Ustawianie progu (punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg).
	<ol>
		<li>Ustaw próg w następujący sposób: ustaw dolny pasek i dostosuj górny pasek tak, aby tylko prawe sygnały były czerwone, a tło czarne. Upewnij się, że próg jest tak niski, jak to możliwe, zanim rzeczywiste sygnały zaczną zanikać.</li>
		<li>Przejrzyj poszczególne obrazy i upewnij się, że odpowiadają obrazom przed ustawieniem progu. Pamiętaj, że próg może się zmieniać w zależności od eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zliczanie sygnałów (Analizuj | Analizuj cząstki). Upewnij się, że pole podsumowania w ustawieniach ImageJ jest zaznaczone.
	<ol>
		<li>Eksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego lub innego oprogramowania w celu dalszego przetwarzania danych. Reprezentatywne obrazy, w tym kwantyfikacja wyodrębniona z ImageJ, są przedstawione na Rysunek 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. Sprzężenie przeciwciała antybiotyny sprzężonego z HRP z produktami znakowanego biotyną toczącego się koła
<ol>
	<li>Do każdej studzienki dodać 4 μl przeciwciała antybiotyny sprzężonego z HRP, rozcieńczonego w stosunku 1:300 w buforze 5, uzupełnionego 5% odtłuszczonym mlekiem beztłuszczowym i 5% BSA.</li>
	<li>Inkubować przez 50 minut w temperaturze 15-25 °C w komorze wilgotnościowej (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1H).</li>
	<li>Mycie 3 x 3 min z buforem 5.</li>
	<li>Wysuszyć maszynę do odwiertu.</li>
</ol>
12. Wizualizacja produktów z toczącego się koła znakowanego biotyną
<ol>
	<li>Wizualizacja z ECL
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem zmieszać 40 μl ECL Luminolu i 40 μlH2O2Pierwsza. Dodaj 2 μl do każdego dołka.</li>
		<li>Wizualizacja slajdu za pomocą kamery CCD lub na kliszach rentgenowskich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja za pomocą TMB
	<ol>
		<li>Po kroku 11.4 usuń silikonową siatkę. Następnie dodaj 400 μl TMB na wierzch całego szkiełka i umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. Poczekaj ~5-10 min na rozwinięcie koloru. Po rozwinięciu koloru umyj szkiełko 70% EtOH.</li>
		<li>Wizualizuj rozwój kolorów gołym okiem. Zrób zdjęcie slajdu aparatem fotograficznym lub telefonem komórkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaimportuj obraz do ImageJ i zmień typ obrazu na 8-bitowy (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy). Aby zmierzyć pasma osobno, ogranicz mierzony obszar za pomocą narzędzia do rysowania prostokątów z paska narzędzi. Narysuj żądany obszar i zmierz intensywność (Analizuj | Środek). Następnie przenieś pierwotnie narysowany obszar do następnego pasma i zmierz.</li>
	<li>Wykreśl dane w żądanym oprogramowaniu. Reprezentatywne obrazy, w tym kwantyfikację wyodrębnione z ImageJ, są przedstawione w Rysunek 4, <silna klasa="xfig">Rysunek 5 i <silna klasa="xfig">Rysunek 6.</li>
</ol>

<ol><li>Baldwin, E. L., Osheroff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide%2C+topoisomerase+II+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry-Anti-Cancer+Agents%22%5BJournal%5D)">Etoposide, topoisomerase II and cancer.</a> Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).</li>
<li>Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibition+in+colorectal+cancer%3A+Biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets.</a> British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).</li>
<li>Ikeguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopoisomeraseI+expression+in+tumors+as+a+biological+marker+for+CPT-11+chemosensitivity+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer.</a> Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).</li>
<li>Meisenberg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+cellular+roles+for+TDP1+and+TOP1+in+modulating+colorectal+cancer+response+to+irinotecan%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).</li>
<li>Palshof, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+copy+number+alterations+as+biomarker+for+irinotecan+efficacy+in+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Proszek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+as+a+biomarker%3A+Detection+of+activity+at+the+single+molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level.</a> Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).</li>
<li>Leppard, J. B., Champoux, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+topoisomerase+I%3A+Relaxation%2C+roles%2C+and+damage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control.</a> Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).</li>
<li>Champoux, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerases%3A+structure%2C+function%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).</li>
<li>Redinbo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+human+topoisomerase+I+in+covalent+and+noncovalent+complexes+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA.</a> Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).</li>
<li>Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase assays.</a> Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3(2012).</li>
<li>Tesauro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erybraedin+C%2C+a+natural+compound+from+the+plant+Bituminaria+bituminosa%2C+inhibits+both+the+cleavage+and+religation+activities+of+human+topoisomerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I.</a> Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).</li>
<li>Keller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+1+inhibits+MYC+promoter+activity+by+inducing+G-quadruplex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation.</a> Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).</li>
<li>Christiansen, K., Westergaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intra-+and+intermolecular+DNA+ligation+mediated+by+eukaryotic+topoisomerase+I.+Role+of+bipartite+DNA+interaction+in+the+ligation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).</li>
<li>Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+DNA+duplex+requirements+for+topoisomerase+I-mediated+cleavage+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).</li>
<li>Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+topoisomerase+covalent+complexes+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).</li>
<li>Stougaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+detection+of+human+topoisomerase+I+cleavage-ligation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity.</a> ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).</li>
<li>Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+fast+DNA-based+tool+to+investigate+topoisomerase+1+activity%2C+a+biomarker+for+drug+susceptibility+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Underst.+Colorectal+Cancer+Treatment%22%5BJournal%5D)">Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer.</a> Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).</li>
<li>Jakobsen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+topoisomerase+I+and+tyrosyl-DNA+phosphodiesterase+1+activities+in+non-small+cell+lung+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue.</a> Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).</li>
<li>Jakobsen, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP1+and+TOP1+as+targets+in+anticancer+treatment+of+NSCLC%3A+Activity+and+protein+level+in+normal+and+tumor+tissue+from+150+NSCLC+patients+correlated+to+clinical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data.</a> Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).</li>
<li>Keller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-slide+detection+of+enzymatic+activities+in+selected+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells.</a> Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).</li>
<li>Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity in single cells.</a> Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).</li>
<li>Tesauro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+camptothecin+sensitivities+in+subpopulations+of+colon+cancer+cells+correlate+with+expression+of+different+phospho-isoforms+of+topoisomerase+i+with+different+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities.</a> Cancers. 12 (5), 1240(2020).</li>
<li>Tesauro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+i+activity+and+sensitivity+to+camptothecin+in+breast+cancer-derived+cells%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+I+Inhibitors%3A+Chemistry%2C+biology%2C+and+interfacial+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugging+topoisomerases%3A+lessons+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Drugging topoisomerases: lessons and challenges.</a> ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).</li>
<li>Bailly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irinotecan%3A+25+years+of+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Irinotecan: 25 years of cancer treatment.</a> Pharmacological Research. 148, 104398(2019).</li>
<li>Petersen, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+fast+dna+based+sensor+system+for+screening+of+small-molecule+compounds+targeting+eukaryotic+topoisomerase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1255(2021).</li>
<li>García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerases+in+apicomplexan+parasites%3A+promising+targets+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).</li>
<li>Hede, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+malaria+causing+Plasmodium+parasite+in+saliva+from+infected+patients+using+topoisomerase+I+activity+as+a+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).</li>
</ol>

Autorzy: C.T. i K.M. są pracownikami VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. i M.S. są akcjonariuszami i/lub posiadaczami opcji na akcje. C.T., B.R.K. i M.S. oświadczają, że są wymienieni jako wynalazcy patentu EP2022/057172 złożonego w imieniu VPCIR biosciences ApS. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów.

Topoizomerazy reprezentują klasę enzymów modyfikujących DNA, które cieszą się dużym zainteresowaniem badawczym i klinicznym, będąc celem związków małocząsteczkowych o potencjalnym działaniu w leczeniu przeciwnowotworowym lub w walce z chorobami zakaźnymi. Co więcej, aktywność ludzkiego TOP1 okazała się skutecznym biomarkerem rokowania i leczenia nowotworów 18,19,23. Chociaż to aktywność TOP1 wpływa na skuteczność inhibitora chemioterapeutyku26, często w warunkach klinicznych ocenia się ilość DNA-RNA lub ilość TOP1. Wynika to z braku szybkich, łatwych i bezpłatnych narzędzi na bazie żelu, które mogą zapewnić dokładne i precyzyjne określenie ilościowe aktywności topoizomerazy w każdym środowisku laboratoryjnym.
W tym miejscu opisano protokół testu REEAD pozwalający na pomiar aktywności TOP1 w sposób bezżelowy. W tym protokole oczyszczony TOP1 lub surowy ekstrakt z komórek jest inkubowany ze specjalnie zaprojektowanym substratem DNA w kształcie hantli, który po rozszczepieniu/podwiązaniu za pośrednictwem TOP1 jest przekształcany w zamkniętą, okrągłą cząsteczkę. Okręgi są następnie hybrydyzowane na szklanej powierzchni i wzmacniane przez RCA. Aby umożliwić łatwość użycia w przeprowadzaniu reakcji zachodzących na szkiełku, do szkła przymocowana jest silikonowa siatka, która tworzy indywidualne dołki, w których zachodzą reakcje. W ten sposób protokół wykorzystuje system wielodołkowy - silikonową siatkę - zwaną wellmaker.
Protokół został wykorzystany do wykrycia aktywności rekombinowanych TOP1 i TOP1 wyekstrahowanych z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2, podanych jako przykład. Ponadto, jako przykład wykorzystania REEAD jako narzędzia do badań przesiewowych leków, protokół został wykorzystany do wykrycia hamowania aktywności TOP1 przez dobrze znany inhibitor TOP1 CPT24,25. Test został połączony z różnymi metodami odczytu - mikroskopią fluorescencyjną, która daje wysoką czułość, oraz skanerem fluorescencyjnym, chemiluminescencyjnym lub kolorymetrycznym, które wymagają mniej specjalistycznego sprzętu i szkolenia. Bardzo czuły odczyt mikroskopu fluorescencyjnego ma ograniczenia związane z koniecznością dobrej jakości ustawienia mikroskopu fluorescencyjnego, wykwalifikowanego personelu oraz czasochłonnego pozyskiwania i analizy obrazu.
Z tych powodów prezentowany jest odczyt skanera fluorescencyjnego, który pozwala na szybszą akwizycję i analizę, nawet jeśli kosztem czułości. W przypadku braku skanera fluorescencyjnego można rozważyć dwie doskonałe alternatywy, metody odczytu chemiluminescencji i kolorymetryczne. Obie metody są szybkie i proste, nie wymagają drogiego sprzętu ani specjalistycznego szkolenia. We wszystkich formatach odczytu REEAD ma wiele zalet w porównaniu z najnowocześniejszymi testami, które są bardziej czasochłonne, oparte na żelu (z wymaganiami dotyczącymi środków interkalacyjnych) i mniej bezpośrednio ilościowe. W przedstawionym protokole jest jednak kilka krytycznych kroków. Podczas przeprowadzania badań przesiewowych leków należy zoptymalizować punkty czasowe, stężenie leku i stosunek ilości TOP1 do substratu DNA w porównaniu z opisanymi ustawieniami zoptymalizowanymi dla CPT. Lek można badać, wykonując preinkubację z substratem DNA lub preinkubację z enzymem TOP1. Może to dostarczyć cennych informacji na temat zdolności cząsteczki do hamowania TOP1 i zapewnić wgląd w mechanizm działania leku.
Co więcej, jeśli występują niskie sygnały lub ich brak, najprawdopodobniej jest to spowodowane nieefektywną lizą surowej próbki lub degradacją TOP1 w ekstrakcie z powodu niewłaściwego stosowania inhibitorów proteazy. Ponadto może to być również spowodowane nieodpowiednim przechowywaniem ważnych składników testu, takich jak rekombinowany TOP1, polimeraza phi29, nukleotydy, substrat i starter. Wreszcie, należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania oligonukleotydów, ponieważ ma to ogromny wpływ na wydajność testu. W przypadku stosowania ekstraktu surowego należy zoptymalizować wydajność ekstrakcji określonej próbki biologicznej, a ilość i aktywność TOP1 może różnić się od podanego tutaj przykładu. Z tego powodu każdy surowy ekstrakt, który ma być poddany badaniu, będzie wymagał miareczkowania w celu określenia granicy wykrywalności testu i zakresu czułości przy użyciu tej konkretnej próbki. Protokół został zoptymalizowany pod kątem wykrywania ludzkiego TOP1. Aktywność innych eukariotycznych TOP1 można zmierzyć, ale stężenie NaCl i czas inkubacji mogą wymagać optymalizacji zgodnie z metodą oczyszczania enzymu i optymalną aktywnością enzymu. Więcej okrągłych substratów będzie wynikać z długotrwałej inkubacji, podczas gdy mniej okrągłych substratów będzie wynikać ze skróconej inkubacji.
Oprócz przedstawionych zastosowań, REEAD pozwala na pomiar aktywności TOP1 w surowych ekstraktach z małych biopsji od pacjentów z rakiem18, przewidywanie cytotoksycznego działania przeciwnowotworowego CPT w liniach komórek nowotworowych 20,21,22, a nawet wykrywanie aktywności enzymu w pojedynczych komórkach20,21. Co więcej, prezentowane ustawienie REEAD z wykorzystaniem odwiertu umożliwia wielodołkowe badania przesiewowe leków w bibliotekach związków syntetycznych lub naturalnych. Oprócz tego opracowano zmodyfikowaną wersję testu REEAD, zwaną REEAD C/L. Taka konfiguracja umożliwia oddzielne badania etapów rozszczepienia i podwiązania reakcji TOP127. Dzięki REEAD C/L możliwe jest określenie mechanizmu działania inhibitorów małocząsteczkowych i scharakteryzowanie ich jako inhibitorów katalitycznych TOP1 o potencjalnym działaniu przeciwpasożytniczym28 lub jako trucizny TOP1 do stosowania w leczeniu przeciwnowotworowym 24,25. Wreszcie, dzięki specyficznemu przeprojektowaniu substratów DNA w celu dopasowania do różnych wymagań (dotyczących wiązania DNA lub ligacji rozszczepienia) innych enzymów TOP1, REEAD był również stosowany do wykrywania chorób zakaźnych (takich jak w przypadku Plasmodium falciparum, powodującego malarię29) lub Leishmania donovani i wirusa małpiej ospy (dane nie pokazane). Lub może być używany do identyfikacji związków małocząsteczkowych o działaniu przeciwpatogennym. Przedstawiony protokół zapewnia naukowcom z dziedziny TOP1 łatwą metodę wykrywania aktywności enzymów przy niewielkiej lub żadnej optymalizacji i z możliwością dostosowania do jeszcze szerszych zastosowań w przyszłości.

Topoizomerazy należą do klasy enzymów modyfikujących DNA, a wiele z nich okazało się użytecznych jako biomarkery chorób ludzkich1,2,3,4,5,6. TOP1 bierze udział w rozwiązywaniu stresu topologicznego związanego z procesami komórkowymi, takimi jak replikacja DNA, transkrypcja genów, rekombinacja i segregacja chromosomów7. TOP1 może rozwiązywać zarówno ujemne, jak i dodatnie supercewki za pomocą mechanizmu, który polega na tworzeniu przejściowego jednoniciowego pęknięcia w DNA8,9. Po związaniu się z DNA, TOP1 pozycjonuje miejsce aktywne tyrozynę (Tyr723) do przeprowadzenia ataku nukleofilowego na szkielet fosfodiestru. Następnie generowany jest kompleks rozszczepienia TOP1-DNA z enzymem kowalencyjnie przyłączonym do końca 3' uszkodzonej nici DNA. Powoduje to uwolnienie naprężeń skrętnych, umożliwiając 5'-punktowemu zakończeniu rozszczepionego pasma obracanie się wokół nienaruszonego pasma. Wreszcie grupa hydroksylowa końca 5' wykonuje atak nukleofilowy na wiązanie 3'-fosfotyrozylowe. W rezultacie, TOP1 zostaje uwolniony, a szkielet DNA zostaje przywrócony8.
Opracowano kilka testów do badania etapów cyklu katalitycznego TOP1, w tym test relaksacyjny10, test przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA)11,12, testy rozszczepienia i ligacji DNA samobójstwa13,14, oraz test enzymów in vivo (ICE)15. Testy te mają jednak kilka ograniczeń, ponieważ są zależne od elektroforezy żelowej, która wymaga środków interkalujących DNA lub wymagają wysoce specjalistycznego szkolenia i sprzętu. Ponadto testy wymagają dużych ilości oczyszczonego enzymu TOP1 (od 1 do 5 ng w przypadku testu relaksacyjnego i od 50 do 200 ng w przypadku testu EMSA i testu rozszczepienia-ligacji) lub ekstraktów z co najmniej 106 komórek, aby działały optymalnie. W związku z tym opracowano wysoce czułą metodę, która umożliwia specyficzne wykrywanie aktywności TOP1 w surowych próbkach biologicznych i na poziomie pojedynczego zdarzenia katalitycznego, zwaną testem REEAD16.
Tutaj prezentowany jest protokół do wykrywania aktywności TOP1 za pomocą testu REEAD16. Schematyczne przedstawienie testu jest przedstawione w <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Specjalnie zaprojektowana siatka silikonowa jest przymocowana do funkcjonalnego szkiełka w celu stworzenia zestawu wielofunkcyjnego szkła z szkiełkiem, zwanego wellmaker w poniższym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Następnie następuje sprzężenie zmodyfikowanego 5'-aminowym startera z funkcjonalnymi grupami NHS w dołkach szkiełka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Reakcja rozszczepienia i ligacji, w której pośredniczy TOP1, przekształca określony substrat DNA w zamknięty okrąg. Substrat specyficzny dla TOP1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) spontanicznie składa się w kształt hantli zawierający dwuniciową łodygę i dwie jednoniciowe pętle. Jedna z pętli jest uzupełnieniem gruntu zakotwiczonego w powierzchni. Obszar łodygi zawiera preferowane miejsce rozszczepienia TOP1 trzy podstawy przed końcem 3' i zwis 5'-hydroksylowy. Cyrkularyzację substratu można osiągnąć za pomocą ekstraktu komórkowego/tkankowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C) lub rekombinowanego, oczyszczonego TOP1 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).
Gdy substrat jest rozszczepiany przez TOP1, enzym staje się przejściowo związany z końcem 3', a fragment trójzasadowy dyfunduje, pozwalając zwisowi 5' na wyżarzanie się do podłoża i ułatwiając ligację za pośrednictwem TOP1. Podwiązanie powoduje cyrkularyzację substratu, a następnie dysocjację TOP1. Zamknięty okrąg jest hybrydyzowany z zakotwiczonym powierzchniowo starterem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E) i jest używany jako matryca do izotermicznego wzmacniania tocznego koła tocznego (RCA) za pośrednictwem polimerazy phi29, która może wykonywać RCA z przemieszczeniem nici, dając 103 powtarzające się produkty tandemowe. Podczas kroku RCA można włączyć nukleotydy znakowane fluorescencyjnie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F) lub sprzężone z biotyną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G)17. Włączenie znakowanych fluorescencyjnie nukleotydów pozwala na wykrycie RCP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera fluorescencyjnego. Alternatywnie, przeciwciało antybiotynowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1H) może wiązać biotynylowane nukleotydy, umożliwiając w ten sposób wykrywanie produktów zwijanego koła (RCP) przy użyciu wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) lub poprzez konwersję 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) do wykrywalnego koloru. RCA podąża za liniową kinetyką reakcji, dzięki czemu test REEAD jest bezpośrednio ilościowy, ponieważ jeden RCP reprezentuje pojedynczą reakcję rozszczepienia-podwiązania, w której pośredniczy TOP1. Tutaj pokazano, że test ten może być stosowany do wykrywania aktywności TOP1 jako oczyszczonego rekombinowanego enzymu lub ekstrahowanego z surowych próbek oraz jako narzędzie do badań przesiewowych leków anty-TOP1.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera do analizy</td><td></td><td></td><td></td>obrazu fluorescencyjnego</tr><tr><td>Kamera</td><td></td><td></td> CCD <td>Do analizy obrazu chemiluninowego</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td></td><td>Wyposażony w 60-krotny obiektyw immersyjny z olejkiem i filtr GFP ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/)</td></tr><tr><td>Skaner fluorescencyjny</td><td>Typhoon</td><td>FLA 9500</td><td>Wyposażony w laser 473 i filtr FAM</td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa z dH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora hybrydyzacyjna z nasyconym oprogramowaniem NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fidżi</td><td></td><td>Pobierz pod adresem:</td></tr> <tr><td>https://imagej.net/software/fiji/downloadsMaterials </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek odpowiednia dla wybranej linii</td><td></td><td></td><td></td>komórkowej</tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>#T4174</td> Paciorkowiec Sigma#P4300 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych</td><td>ThermoFisher</td><td>#178983</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>#10270106</td><td></td></tr><tr><td>NEEA</td><td>Sigma</td><td>#M7145</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>#10010023</td><td></td></tr><tr><td>Funkcjonalizowane szkiełka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'-aminowy anty-TOP1 primer</td><td>Sigma</td><td></td><td>5'-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3'</td></tr><tr><td>Aktywowane slajdy Codelink HD</td><td>SurModics</td><td>#DHD1-0023</td><td></td></tr><tr><td>Siatka krzemowa</td><td>Grace-biolabs</td><td></td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>klej Pertex</td><td>Histolabs</td><td>#00801</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe 76 x 26 mm</td><td>Hounisen</td><td>#2510 1201BL</td><td>Można użyć innego szkiełka mikroskopowego o tym samym wymiarze</td></tr><tr><td>Koła DNA i amplifikacja toczącego się koła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOP1 specyficzny substrat</td>: <td>Sigma</td><td></td><td>5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT AAG TTT TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3'</td></tr><tr><td>ATTO-488-dUTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>#95387</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-dCTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>#NU-809-BIO16L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher</td><td>#R0181</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza Phi29</td><td>VPCIR Biosciences</td><td>#10010041</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany TOP1</td><td>VPCIR Biosciences</td><td>#10010001</td><td></td></tr><tr><td>Wykrywanie toczącego się koła produkty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioFX TMB</td><td>SurModics</td><td>#ESPM-0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Szklana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mieszanina ECL</td><td>Cytiva</td><td>#RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>Sprzężone przeciwciało antybiotynowe HRP</td><td>Merck</td><td>#A4541</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka montażowa (vectachield)</td><td>Laboratoria wektorowe</td><td>#H-1000</td><td></td></tr><tr><td><silny>Lista</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor</td><td></td><td></td> PE <td>1 mM EDTA, 8,12 mM Na2HPO4&middot; 2H2O, 1.88 mM NaH2PO4&middot; Bufor wydruku H2O</td></tr><tr><td>6x</td><td>300 mM Na3PO4, pH 8,5</td>Roztwór blokujący Bufor 5 uzupełniony 5% mlekiem beztłuszczowym i 5% BSA pH 9 Bufor do lizy 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM inhibitory EDTA + proteazy 10x bufor reakcyjny TOP1 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7,5</td></tr><tr><td>10x Phi29 Bufor</td><td></td><td></td> reakcyjny <td>330 mM octan trisu pH 7,5, 100 mM octan Mg, 660 mM octan K, 1% Tween20, 200 mM</td></tr><tr><td>Bufor</td> DTT 1 <td></td><td></td><td>50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM etanoloamina. Uwaga: przechowywany w temperaturze 50 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Bufor 2</td><td></td><td></td><td>4x SSC, 0,1% SDS. Uwaga: przechowywany w temperaturze 50 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Bufor 3</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,3% SDS</td></tr><tr><td>Bufor 4</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20</td></tr><tr><td>Bufor 5</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20</td></tr><tr><td>Chemikalia do</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>#T1506</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>#1.00317.2011</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>#1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>#05056489001</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>#436143</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>#1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>#1.06346.1000</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma</td><td>#411000</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Invitrogen</td><td>#15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Tris-octan</td><td>Sigma</td><td>#T1258</td><td></td></tr><tr><td>Mg-octan</td><td>Sigma</td><td>#M0631</td><td></td></tr><tr><td>K-octan</td><td>Sigma</td><td>#1.04820.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>#8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>#D0632</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>#1.02382.1000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>#M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#1.06404.5000</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Sigma</td><td>#70166</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A4503</td><td></td></tr></tbody></table>

proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Techniki oparte na amplifikacji izotermicznej, takie jak amplifikacja toczącego się koła, zostały z powodzeniem wykorzystane do wykrywania kwasów nukleinowych, ilości białek lub innych istotnych cząsteczek. Metody te okazały się istotną alternatywą dla PCR lub ELISA do zastosowań klinicznych i badawczych. Co więcej, wykrycie ilości białka (za pomocą Western blot lub immunohistochemii) jest często niewystarczające, aby dostarczyć informacji do diagnozy raka, podczas gdy pomiar aktywności enzymu stanowi cenny biomarker. Pomiar aktywności enzymów pozwala również na diagnozę i potencjalne leczenie chorób przenoszonych przez patogeny. U wszystkich eukariontów topoizomerazy są kluczowymi enzymami wiążącymi DNA, biorącymi udział w kontroli stanu topologicznego DNA podczas ważnych procesów komórkowych i należą do ważnych biomarkerów rokowania i leczenia raka.
Przez lata, topoizomerazy były intensywnie badane jako potencjalny cel leków przeciwpasożytniczych i przeciwnowotworowych z bibliotekami naturalnych i syntetycznych związków małocząsteczkowych, które są badane co roku. W tym miejscu przedstawiono metodę amplifikacji tocznego koła, zwaną testem wykrywania aktywności enzymatycznej wzmocnionej okręgiem toczącym się (REEAD), która pozwala na ilościowy pomiar aktywności topoizomerazy 1 (TOP1) w prosty, szybki i bezżelowy sposób. Poprzez rozszczepienie i ligacjację specjalnie zaprojektowanego substratu DNA, TOP1 przekształca oligonukleotyd DNA w zamknięty okrąg, który staje się matrycą do amplifikacji koła tocznego, dając ~103 produkty powtarzalnego koła toczenia w tandemie. W zależności od włączenia nukleotydu podczas amplifikacji, istnieje możliwość różnych metod odczytu, od fluorescencji, przez chemiluminescencję, po kolorymetrię. Ponieważ każda ligacja rozszczepienia za pośrednictwem TOP1 generuje jeden zamknięty krąg DNA, test jest bardzo czuły i bezpośrednio ilościowy.

W niniejszej pracy przedstawiono protokół wykrywania aktywności TOP1 z wykorzystaniem testu REEAD16. Protokół ten został zastosowany do wykrywania aktywności rekombinowanej TOP1 przy użyciu czterech różnych metod odczytu: skanera fluorescencyjnego, mikroskopu fluorescencyjnego, chemiluminescencji oraz metody kolorymetrycznej. Protokół posłużył również do wykrycia aktywności TOP1 wyekstrahowanej z komórek Caco2, jako przykładu ekstraktu surowego, z wykorzystaniem odczytu chemiluminescencyjnego lub TMB. Ponadto protokół został wykorzystany jako narzędzie do przesiewania leków w celu wykrycia inhibicji aktywności rekombinowanej TOP1 przez CPT, jako przykład inhibitora specyficznego dla TOP1, przy zastosowaniu metody odczytu chemiluminescencyjnego.
Wyniki uzyskane podczas analizy aktywności TOP1 przy użyciu odczytu fluorescencyjnego przedstawiono na Rysunku 2 oraz Rysunku 3. Reprezentatywny skan preparatu fluorescencyjnego oraz wynikowa kwantyfikacja przedstawione są na Rysunku 2. Jak wynika z kwantyfikacji, metoda ta posiada granicę detekcji wynoszącą 12,5 ng TOP1. Reprezentatywne obrazy i wynikowa kwantyfikacja uzyskane przy użyciu odczytu z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawione są na Rysunku 3. Przy zastosowaniu tej metody odczytu granica detekcji wynosi zaledwie 0,1 ng TOP1. Wyniki uzyskane podczas analizy aktywności TOP1 przy użyciu odczytu chemiluminescencyjnego przedstawiono na Rysunku 4, a wyniki z odczytu kolorymetrycznego na Rysunku 5. Granica detekcji dla tych metod odczytu wynosi 6 ng TOP1 lub odpowiada TOP1 wyekstrahowanej z 312 komórek Caco2. Rysunek 6 przedstawia pomiary aktywności TOP1 w obecności 80 µM CPT lub DMSO jako przykład zastosowania w przesiewaniu leków. Reprezentatywny obraz i wynikowa kwantyfikacja z trzech niezależnych eksperymentów wykazują, że CPT hamuje zależną od TOP1 cyrkularyzację substratu, zgodnie z oczekiwaniami24,25.
<img alt="Schemat procesu edycji genów z RCA, polimerazą Phi29 i biotinylacją do detekcji DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny opis protokołu REEAD. (A,B) Przygotowanie funkcjonalizowanych szkiełek. Siatkowa podkładka silikonowa jest mocowana do funkcjonalizowanego szkiełka. Następnie do szkiełka przyłącza się starter 5'-aminowy, co umożliwia amplifikację substratu specyficznego dla TOP1. (C,D) Generowanie zamkniętych kolistych substratów. Substrat specyficzny dla TOP1 zwija się w kształt hantle z preferowanym miejscem cięcia TOP1 w dwuniciowej łodydze oraz sekwencją wiązania startera w jednej z dwóch jednoniciowych pętli. (C) TOP1 jest uwalniany podczas lizy komórek. Po cięciu i ligacji zapśredniczonej przez TOP1 substrat zostaje przekształcony w zamknięty krąg; (D) zastosowano oczyszczoną, rekombinowaną TOP1. (E) Amplifikacja metodą kroczącego kręgu. Zamknięte koliste substraty są hybrydyzowane z zakotwiczonym na powierzchni starterem i amplifikowane metodą RCA przy użyciu polimerazy Phi29. RCA może być przeprowadzona albo poprzez wbudowanie nukleotydów fluorescencyjnych, jak w F, albo nukleotydów biotinylowanych, jak w G. Fluorescencyjne produkty kroczącego kręgu są wizualizowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego lub skanera fluorescencyjnego. (H) Przyłączanie przeciwciała antybiotynowego sprzężonego z HRP. Biotynilowane produkty kroczącego kręgu są inkubowane z przeciwciałem antybiotynowym sprzężonym z HRP. Rozwój sygnału jest zapśredniczony przez enzym HRP, a sygnały są wizualizowane za pomocą ECL i wykrywane kamerą CCD lub za pomocą TMB, co pozwala na wizualizację kolorymetryczną. Skróty: REEAD = rolling circle enhanced enzyme activity detection; RCA = rolling circle amplification; TOP1 = topoizomeraza 1; HRP = peroksydaza chrzanowa; ECL = enhanced chemiluminescence; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Intensywność fluorescencji w funkcji stężenia TOP1; obraz żelu i wykres analizy ilościowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Pomiary aktywności TOP1 przy użyciu skanera fluorescencyjnego. Lewy panel przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności 3-50 ng TOP1 z zastosowaniem protokołu odczytu skanerem fluorescencyjnym. Prawy panel przedstawia wynikową analizę ilościową. Test t z korektą Welcha, p = 0,0064, n = 4. Skrót: TOP1 = topoizomeraza 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, efekt stężenia TOP1, analiza obrazu, wykres, wyniki ilościowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Pomiary aktywności TOP1 przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Panel lewy przedstawia reprezentatywne obrazy preparatu podczas analizy aktywności 0,1–12,5 ng TOP1 z wykorzystaniem protokołu odczytu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Należy zwrócić uwagę, że obrazy zostały przycięte w celu właściwego zaprezentowania kropek. Z tego powodu nie odpowiadają one liczbie sygnałów w analizie ilościowej przedstawionej w panelu prawym. t-test z poprawką Welcha, p = 0,0136, n = 3. Skrót: TOP1 = topoizomeraza 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Chemiluminescencja ECL, intensywność TOP1, oczyszczone białko vs komórki Caco2, wykres, analiza blotu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pomiary aktywności TOP1 z wykorzystaniem odczytu chemiluminescencyjnego. (A) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności 3-50 ng TOP1 przy użyciu protokołu odczytu chemiluminescencyjnego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p &lt; 0,0001, n = 4. (B) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności TOP1 wyekstrahowanego z 156-40 000 komórek Caco2 przy użyciu protokołu odczytu chemiluminescencyjnego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0224, n = 3. Skróty: TOP1 = topoizomeraza 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Kolorymetryczny test TMB pokazujący oczyszczanie TOP1, intensywność w stosunku do ng białka oraz wyniki liczby komórek Caco2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Pomiary aktywności TOP1 z wykorzystaniem odczytu kolorymetrycznego. (A) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy 3-50 ng TOP1 z zastosowaniem protokołu odczytu kolorymetrycznego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0012, n = 4. (B) Panel lewy przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy aktywności TOP1 wyekstrahowanego z 156-40 000 komórek Caco2 z zastosowaniem protokołu odczytu kolorymetrycznego. Panel prawy przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0117, n = 3. Skróty: TOP1 = topoizomeraza 1; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki przesiewania leków; wykres intensywności i blot dla DMSO, CPT, Neg; porównanie eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Pomiary aktywności TOP1 po zastosowaniu leków z wykorzystaniem protokołów odczytu chemiluminescencyjnego. Lewy panel przedstawia reprezentatywny obraz preparatu podczas analizy 10 ng TOP1 w obecności 5% DMSO lub 80 µM CPT przez 1 min. Prawy panel przedstawia wynikową kwantyfikację. Test t z poprawką Welcha, p = 0,0017, n = 3. Skróty: TOP1 = topoizomeraza 1; CPT = kamptotecyna; DMSO = dimetylosulfoksyd; Neg = kontrola negatywna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opisano protokół czułego i ilościowego wykrywania aktywności topoizomerazy 1 za pomocą testu zwiększonej aktywności enzymatycznej w toczeniu koła. Metoda pozwala na wykrycie aktywności topoizomerazy 1 z oczyszczonych składników lub ekstraktów komórkowych/tkankowych. Protokół ten ma szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach związanych z wykrywaniem aktywności enzymatycznej.

Proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...

Protokół ten przedstawia metodę amplifikacji toczącego się koła w celu wykrycia aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach w szybki i prosty sposób. Główną zaletą tej metody jest to, że jest łatwa do naśladowania również przez niedoświadczonych badaczy i jest bardziej czuła w porównaniu z innymi testami na bazie żelu, gdy stosuje się surowe ekstrakty. Zastosowanie tego protokołu rozciąga się od pomiaru odpowiedzi na leczenie farmakologiczne po badania przesiewowe związków małocząsteczkowych o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym lub przeciwzakaźnym.Procedurę zademonstruje Karol Mizieliński, specjalista ds. rozwoju z naszego laboratorium. Na początek przymocuj specjalnie zaprojektowaną silikonową siatkę izolacyjną do funkcjonalnego szkiełka, tworząc w ten sposób studnię. Dociśnij silikonową siatkę, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza między powierzchnią szkła a silikonem.Następnie przygotuj mieszankę starterów, dodając pięć mikromolowych, pięć pierwszych aminokwasów w jednym buforze wydruku. Następnie dodaj cztery mikrolitry tej mieszaniny do każdej studzienki i inkubuj wytwornicę studni w komorze hybrydyzacyjnej z nasyconym chlorkiem sodu. Aby wytworzyć zamknięte okrągłe substraty, dodaj dwa mikrolitry pięciu mikromolowych substratów specyficznych dla topoizomerazy 1 i dwa mikrolitry rekombinowanego enzymu topoizomerazy 1 lub przygotowanego ekstraktu komórkowego do 16 mikrolitrów jednorazowego buforu reakcyjnego topoizomerazy.Inkubuj tę okrągłą mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut i zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając dwa mikrolitry 1% sds. Zanurz studzienkę w tacce wypełnionej buforem 1, podgrzanym do 50 stopni Celsjusza. Odpipetować bufor do studzienek, aby upewnić się, że wewnątrz studzienki nie pozostały pęcherzyki powietrza, a następnie inkubować tacę przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza.Po inkubacji usunąć bufor 1 i przemyć dwukrotnie wodą destylowaną, energicznie wstrząsając, przez jedną minutę między przemyciami. Usuń wodę, następnie dodaj bufor 2, podgrzany do 50 stopni Celsjusza do tacy, a następnie inkubuj i umyj maszynkę do studzienek, jak pokazano wcześniej dla buforu 1. Następnie umyj maszynę do studzienek 70% etanolem, energicznie potrząsając przez minutę i użyj sprężonego powietrza, aby zestaw wyschł.Aby przeprowadzić hybrydyzację, dodaj cztery mikrolitry przygotowanej mieszaniny kołowej do każdej odpowiedniej studzienki i umieść maszynkę do studzienki w komorze wilgotnościowej z wodą destylowaną o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji myć studzienkę przez jedną minutę i buforować 3, bufor 4 i 70% etanolu, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Przygotuj i dodaj cztery mikrolitry mieszaniny RCA do każdej studzienki studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w komorze wilgotnościowej.Aby mikroskopowo uwidocznić wzmocnione fluorescencyjne produkty z toczącego się koła, najpierw umyj szkiełko buforem 3, buforem 4 i 70% etanolem. Osusz szkiełko sprężonym powietrzem i przyklej je do szkiełka mikroskopowego. Zaznacz położenie studzienek markerem, a następnie usuń silikonową siatkę za pomocą pęsety.Aby umożliwić wizualizację w kamerze, zamontuj szkiełko z dwoma mikrolitrami medium montażowego bez dapi i dodaj szkło nakrywkowe. Przeanalizuj szkiełko za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, z 60-krotnym obiektywem zanurzonym w oleju i kamerą. Po obrazowaniu zaimportuj zdjęcia do obrazu J i ułóż obrazy w stos, klikając Obraz, następnie Stosy i obrazy do stosu, a następnie zmień typ obrazu na 8 bitów.Aby ustawić próg, kliknij Obraz, Dostosuj, a następnie Próg. Ustaw dolny pasek na 255 i dostosuj górny pasek tak, aby tylko prawe sygnały były czerwone, a tło było czarne. Przejrzyj poszczególne obrazy i upewnij się, że odpowiadają obrazom przed dostosowaniem progu.Upewnij się, że próg jest ustawiony tak nisko, jak to możliwe, zanim rzeczywiste sygnały zaczną zanikać. Aby policzyć sygnały, kliknij Analizuj, a następnie Analizuj cząstki i upewnij się, że pole podsumowania w ustawieniach obrazu J jest zaznaczone. Dodać cztery mikrolitry rozcieńczonego przeciwciała antybiotyny sprzężonego z peroksydazą chrzanowa do każdej studzienki i inkubować w temperaturze od 15 do 25 stopni Celsjusza przez 50 minut w komorze wilgotnościowej.Pod koniec inkubacji umyć studzienkę trzykrotnie buforem 5 przez trzy minuty każdy i pozostawić do wyschnięcia. Aby zobrazować chemiluminescencję, dodaj dwa mikrolitry świeżo przygotowanej mieszanki luminolu ECL i nadtlenku wodoru do studzienek i zwizualizuj szkiełko za pomocą kamery CCD lub na kliszach rentgenowskich. Alternatywnie, aby wykonać wizualizację za pomocą TMB, usuń silikonową siatkę po umyciu buforem 5 i dodaj 400 mikrolitrów TMB na wierzch całego szkiełka.Trzymaj szkiełko w komorze wilgotnościowej i poczekaj od pięciu do 10 minut na uzyskanie koloru. Po wywołaniu koloru umyj szkiełko 70% tethanem i sfotografuj szkiełko aparatem lub telefonem komórkowym w celu analizy za pomocą oprogramowania do obrazu J. Zaimportuj obraz do obrazu J i zmień typ obrazu na 8-bitowy, klikając Typ obrazu, a następnie 8-bitowy.Ogranicz mierzony obszar za pomocą narzędzia do rysowania prostokątów z paska narzędzi, aby osobno zmierzyć pasma i narysować żądany obszar. Zmierz intensywność, klikając, analizuj, a następnie zmierz. Następnie przesuń pierwotnie narysowany obszar do następnego pasma i zmierz.Po zmierzeniu intensywności dla wszystkich pasm, narysuj dane w żądanym oprogramowaniu. Aktywność topoizomerazy 1 określona za pomocą odczytu skanera fluorescencyjnego jest przedstawiona tutaj, jak wynika z oceny ilościowej. Odczyt ten ma granicę wykrywalności wynoszącą 12,5 nanograma, reprezentatywne obrazy i wynikowe określenie ilościowe uzyskane za pomocą odczytu z mikroskopu fluorescencyjnego są pokazane tutaj.Ta metoda odczytu ma granicę wykrywalności wynoszącą 0,1 nanograma, próg wykrywania wzmocnionej chemiluminescencji i metod odczytu kolorowego wynosił 6 nanogramów. Przy tych samych odczytach granica wykrywalności wynosiła 1 250 komórek dla ECL i 312 komórek dla TMB. Gdy aktywność topoizomerazy 1 mierzono z ekstraktów pochodzących z komórek gruczolakoraka jelita grubego.Jako przykład zastosowania badań przesiewowych leków, aktywność topoizomerazy 1 mierzono w obecności kamptotecyny lub dimetylosulfotlenku. Wyniki kwantyfikacji wykazały, że kamptotekyna hamuje krążenie substratu za pośrednictwem topoizomerazy 1 zgodnie z oczekiwaniami. Jest to prosty protokół, który wymaga jedynie zwrócenia szczególnej uwagi na etapy mycia i czas inkubacji reakcji.Możliwe jest również zbadanie, w jaki sposób leki hamują aktywność topoizomerazy 1, przy użyciu Reida jest bardzo czuły i łatwy do wykonania, umożliwia szybkie badanie przesiewowe potencjalnych inhibitorów topoizomerazy 1 oraz wykorzystanie aktywności topoizomerazy 1 jako biomarkera odpowiedzi na lek w nowotworach.

simple-fast-rolling-circle-amplification-based-detection

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

W tym filmie demonstrujemy procedurę określania aktywności helikazy docelowego białka w celu rozwinięcia znakowanego biotyną substratu dsRNA. Aktywność enzymu zidentyfikowano poprzez analizę przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, a następnie test chemiluminescencyjny przy użyciu chemiluminescencyjnej streptawidyny sprzężonej z enzymem.

Pomiar aktywności helikazy białka docelowego za pomocą dupleksów RNA znakowanych biotyną

Ten protokół demonstruje prosty, solidny i wysokoprzepustowy test rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania jednowymiarowej (1D) dyfuzji cząsteczek wzdłuż DNA.

Prosta, solidna i wysokowydajna implementacja testu rozciągania przepływu pojedynczej cząsteczki do badania transportu cząsteczek wzdłuż DNA

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Poznaj metodę amplifikacji toczącego się koła do wykrywania aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych. Technika ta oferuje wysoką czułość i prostotę, umożliwiając badaczom skrining leków oraz pomiar odpowiedzi komórkowych.

Proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła (Wideo) | JoVE Journal

Proste i szybkie wykrywanie aktywności topoizomerazy 1 w surowych próbkach biologicznych w oparciu o amplifikację toczącego się koła

Przeglądaj więcej filmów