Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Protokół ten opisuje metody, które pozwalają badaczom na ekspresję CDNA lub SIRNA w natywnym nabłonku dróg moczowych. Głównymi zaletami tej techniki jest jej względna prostota, zdolność do ekspresji cDNA, siRNA w nabłonku dróg moczowych z wysoką wydajnością i w stosunkowo krótkim czasie. Najtrudniejszą częścią tej techniki jest cewnikowanie.

Jednak ogólna technika jest stosunkowo łatwa do opanowania, gdy się jej nauczysz. Procedurę zademonstruje Giovanni Ruiz, specjalista ds. badań IV w moim laboratorium. Na początek umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej obok stożków nosowych.

Utrzymuj zwierzę w znieczuleniu przez cały czas trwania protokołu. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc palec u nogi. Aby zapobiec wprowadzaniu powietrza do pęcherza, napełnij plastikową część cewnika dożylnego i związany z nim piast sterylnym PBS za pomocą sterylnej pipety lub strzykawki do przenoszenia.

Gdy zwierzę znajduje się w pozycji leżącej, przetrzyj zewnętrzny przewód moczowy 70% alkoholem. Następnie delikatnie chwyć tkankę tworzącą zewnętrzny ujście cewki moczowej i rozciągnij ją pionowo od zwierzęcia za pomocą cienkich kleszczy. Wprowadzić sterylny cewnik do przewodu zewnętrznego.

Drugą ręką ostrożnie włóż cewnik pionowo około trzech do czterech milimetrów do ujścia cewki moczowej. Następnie opuść cewnik wprowadzony do przewodu zewnętrznego w kierunku ogona zwierzęcia, co ułatwia jego wejście do części cewki moczowej, która przechodzi poniżej kości łonowej, a ostatecznie do pęcherza moczowego. Pozwól, aby mocz z pęcherza wyciekł.

Usuń resztki moczu, wykonując manewr Crede'a, masując i delikatnie uciskając guzek pęcherza w dolnej części brzucha. Aby nabłonek dróg moczowych był podatny na transdukcję, umyj pęcherz myszy lub szczura, podłączając sterylną strzykawkę o pojemności jednego mililitra wypełnioną PBS do piasty cewnika. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów sterylnego PBS do pęcherza myszy.

Po odłączeniu strzykawki od złączki cewnika, należy pozwolić PBS na opróżnienie. Wkroplić 100 mikrolitrów 0,1% N-dodecyl-beta-D-maltozydu rozpuszczonego w PBS i filtrze 0,2 mikrometra wysterylizowanego do pęcherza myszy za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Zatrzymać N-dodecylo-beta-D-maltozyd w pęcherzu moczowym przez 10 minut, pozostawiając strzykawkę na miejscu.

Usunąć N-dodecyl-beta-D-maltozyd z pęcherza moczowego, odłączając strzykawkę i pozwalając jej odpłynąć. Aby wprowadzić wirusa do pęcherza moczowego, przymocuj sterylną strzykawkę o pojemności jednego mililitra do piasty cewnika i wkraplaj do pęcherza od 5 000 000 do 100 000 000 IVP adenowirusa rozcieńczonego w 100 mikrolitrach sterylnego PBS dla myszy lub 450 mikrolitrów dla szczurów. Po 30 minutach odłączyć strzykawkę i pozwolić, aby roztwór wirusa opróżnił pęcherz moczowy na jednorazową wkładkę.

Wyrzuć pozostałości roztworu wirusa chusteczką chłonną, wyrzucając podkładkę i wytrzyj odpady niebezpieczne biologicznie. Aby zwierzę mogło dojść do siebie, należy przerwać przepływ izofluranu. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie i uzyskać pełną mobilność przed umieszczeniem go z powrotem w klatce, zwłaszcza jeśli zwierzęta są trzymane w grupie.

Przeanalizuj efekty ekspresji transgenu od 12 do 72 godzin po leczeniu przy użyciu metod takich jak hybrydyzacja mRNA in situ, Western blot lub immunofluorescencja. Analiza Western blot lizatów urotelialnych ujawniła znakowaną V5 ekspresję ludzkiego hormonu wzrostu w nabłonku dróg moczowych transdukowanych, ale nie w pęcherzach nietransdukowanych. Ekspresja została również potwierdzona przez immunofluorescencję przy użyciu przeciwciał, które rozpoznawały ludzki hormon wzrostu, czyli znacznik epitopu V5.

Analiza Western blot potwierdziła ekspresję Claudin-2 u szczurów transdukowanych adenowirusem, ale nie u tych, którym transdukowano kontrolowanym wirusem kodującym GFP. Analiza immunofluorescencyjna dodatkowo potwierdziła egzogenną ekspresję Claudin-2 w urotelialnych komórkach parasolowych transdukowanych kodującym wirusa cDNA Claudin-2. Wykrycie egzogennej kladyny-2 w białku złącza ścisłego 1 za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej całego zamontowanego lub przekrojowego nabłonka dróg moczowych ujawniło obecność połączenia ścisłego i wewnątrzkomórkowych nagromadzeń Claudin-2 w cytoplazmie komórki.

Pole obrazu pokazuje, że zliczenie liczby transdukowanych komórek parasolowych ujawnia wydajność zbliżającą się do 95%, a w całej ścianie pęcherza moczowego transdukowany jest tylko nabłonek dróg moczowych i żadna inna tkanka nie jest celem wszczepionego adenowirusa. Cewnikowanie ma kluczowe znaczenie, aby protokół działał zgodnie z przeznaczeniem. Technika ta pozwala badaczom badać normalną biologię urotelialną, a także zrozumieć warunki, w których nadekspresja lub niedostateczna ekspresja białka prowadzi do choroby.