Name: Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj metodę transdukcji nabłonka dróg moczowych za pomocą adenowirusa, umożliwiającą ekspresję cDNA i siRNA z wydajnością bliską 95%. Technika ta pozwala badać biologię nabłonka moczowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta nagrodą za projekt pilotażowy przez P30DK079307 (dla M.G.D.), R01DK119183 grantu NIH (dla G.A. i M.D.C.), R01DK129473 grantu NIH (dla G.A.), nagrodę American Urology Association Career Development oraz grant Fundacji Winters (dla N.M.), przez Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores z Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), oraz przez S10OD028596 (do G.A.), który sfinansował zakup systemu konfokalnego używanego do uchwycenia niektórych obrazów przedstawionych w tym rękopisie.

<ol><li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Urothelium%3A+Life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Urothelium: Life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Truschel, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-regulated+exocytosis%2Fendocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+cytoplasmic+vesicles+into+apical+membrane+of+mammalian+urinary+bladder+epthelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium.</a> Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).</li>
<li>Eaton, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+contraction+of+the+umbrella+cell+apical+junctional+ring+in+response+to+bladder+filling+and+voiding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).</li>
<li>Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+apical+and+basolateral+membrane+requirements+for+stretch-induced+membrane+traffic+at+the+apical+surface+of+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).</li>
<li>Birder, L., Andersson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Urothelial signaling.</a> Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).</li>
<li>Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+bladder%2C+cystitis+and+nerve%2Furothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions.</a> Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).</li>
<li>Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uroepithelial-associated+sensory+web%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The uroepithelial-associated sensory web.</a> Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Montalbetti, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+urothelial+paracellular+transport+promotes+cystitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis.</a> American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).</li>
<li>Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+bladder+urothelial+pathophysiology+in+functional+bladder+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders.</a> BioMed Research International. 2014, 865463(2014).</li>
<li>Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating conditional knockout mice.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).</li>
<li>Kashyap, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+nerve+growth+factor+expression+in+the+bladder+by+antisense+oligonucleotides+as+new+treatment+for+overactive+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder.</a> Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).</li>
<li>Bolenz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+ex+vivo+urothelial+penetration+by+oligodeoxynucleotides+for+optimizing+treatment+of+transitional+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Quantitative+Cytology+and+Histology%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma.</a> Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).</li>
<li>Tyagi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+antisense+therapy+for+cystitis+using+TAT-peptide+nucleic+acid+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates.</a> Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).</li>
<li>Sadoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interim+results+of+a+phase+1-2a+trial+of+Ad26.COV2.S+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+delivery%3A+Potential+applications+for+gene+and+cell-Based+therapies+in+the+new+era+of+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine.</a> Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11a-dependent+exocytosis+of+discoidal%2Ffusiform+vesicles+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).</li>
<li>Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+endocytosis+in+bladder+umbrella+cells+occurs+through+an+integrin-regulated+and+RhoA-+and+dynamin-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Molecular+Biology+Organization+journal%22%5BJournal%5D)">Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway.</a> The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).</li>
<li>Khandelwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rab11a-Rab8a-Myo5B+network+promotes+stretch-regulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).</li>
<li>Prakasam, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A1+adenosine+receptor-stimulated+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells+requires+phosphorylation+of+ADAM17+Ser811+and+EGF+receptor+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).</li>
<li>Gallo, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB27B+requirement+for+stretch-induced+exocytosis+in+bladder+umbrella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).</li>
<li>Amasheh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-2+expression+induces+cation-selective+channels+in+tight+junctions+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).</li>
<li>Yu, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores%3A+identification+of+an+electrostatic+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site.</a> The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).</li>
<li>Kasahara, H., Aoki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+adenoviral+RNAi+vector+in+vascular+smooth+muscle+cells+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes.</a> Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).</li>
<li>Bolognesi, B., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaching+the+limit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reaching the limit.</a> eLife. 7, 39804(2018).</li>
<li>Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+responses+to+adenovirus+and+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors.</a> Viruses. 14 (5), 888(2022).</li>
<li>Sanchez Freire, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+may+mediate+the+down-regulation+of+neurokinin-1+receptor+in+chronic+bladder+pain+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome.</a> American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas gdy Ramesh i in. koncentrowali się na opracowywaniu strategii wykorzystania transdukcji adenowirusowej w leczeniu raka pęcherza moczowego18, nowsze doniesienia wykazały użyteczność tych technik w badaniu prawidłowej biologii/fizjologii i patofizjologii uroteliów 10,18,19,20,21. Do ważnych cech tego podejścia należą: (i) W całej ...

Nabłonek dróg moczowych to wyspecjalizowany nabłonek, który wyściela miedniczkę nerkową, moczowody, pęcherz moczowy i bliższą cewkę moczową1. Składa się z trzech warstw: warstwy wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych, często dwujądrowych komórek parasolowych, których wierzchołkowe powierzchnie są skąpane w moczu; pośrednia warstwa komórkowa z populacją dwujądrowych komórek wzmacniających tranzyt, które mogą dać początek powierzchownym komórkom parasolowym w odpowiedzi na ich ostrą utratę; oraz pojedyncza warstwa komórek podstawnych, których podzbiór funkcjonuje jako komórki macierzyste, które mogą regenerować cały nabłonek dróg moczowych w odpowiedzi na przewlekłe uszkodzenie. Komórki parasolowe są głównie odpowiedzialne za tworzenie bariery urotelialnej o wysokiej odporności, której składniki obejmują błonę wierzchołkową (bogatą w cholesterol i cerebrozydy) o niskiej przepuszczalności dla wody i substancji rozpuszczonych oraz kompleks połączeń wierzchołkowych o wysokiej odporności (składający się z połączeń ścisłych, połączeń adherens, desmosomów i związanego z nimi pierścienia aktomiozyny)<klasa sup = "xref">1. Zarówno wierzchołkowa powierzchnia komórki parasolowej, jak i jej pierścień łączący rozszerzają się podczas napełniania pęcherza i szybko wracają do stanu wstępnie napełnionego po mikcji1,2,3,4,5. Oprócz roli w funkcji bariery, przypuszcza się również, że nabłonek dróg moczowych pełni funkcje sensoryczne i przetwornikowe, które pozwalają mu wyczuwać zmiany w środowisku zewnątrzkomórkowym (np. rozciąganie) i przekazywać te informacje poprzez uwalnianie mediatorów (w tym ATP, adenozyny i acetylocholiny) do leżących poniżej tkanek, w tym suburotelialnych procesów nerwowych aferentnych6,7,8. Niedawne dowody na tę rolę znaleziono u myszy pozbawionych urotelialnej ekspresji zarówno Piezo1, jak i Piezo2, co powoduje zmienioną funkcję mikcji9. Dodatkowo, u szczurów występuje nadekspresja białka CLDN2 tworzącego pory o ścisłym połączeniu w warstwie komórek parasolowych, u których występuje stan zapalny i ból analogiczny do obserwowanego u pacjentów ze śródmiąższowym zapaleniem pęcherza moczowego10. Przypuszcza się, że zaburzenie funkcji czuciowo-czuciowej/przetwornika urotelialnego lub bariery może przyczyniać się do kilku zaburzeń pęcherza moczowego6,11.
Lepsze zrozumienie biologii nabłonka dróg moczowych w stanach normalnych i chorobowych zależy od dostępności narzędzi, które pozwolą badaczom łatwo obniżyć ekspresję genów endogennych lub umożliwić ekspresję transgenów w tkance natywnej. Podczas gdy jednym z podejść do obniżenia ekspresji genów jest wygenerowanie myszy z warunkowym nokautem urotelialnym, podejście to zależy od dostępności myszy z floksowanymi allelami, jest pracochłonne i może zająć miesiące lub lata, aby je ukończyć12. Nic więc dziwnego, że badacze opracowali techniki transfekcji lub transdukcji nabłonka dróg moczowych, co może prowadzić do wyników w krótszej skali czasowej. Opublikowane metody transfekcji obejmują użycie lipidów kationowych13, antysensownych fosforydowanych oligodeoksynukleotydów14, lub antysensownych kwasów nukleinowych związanych z 11-merowym peptydem penetrującym białko HIV TAT15. Jednak w tym protokole skupiono się na wykorzystaniu transdukcji za pośrednictwem adenowirusa, dobrze zbadanej metodologii, która jest skuteczna w dostarczaniu genów do szerokiego zakresu komórek, została przetestowana w licznych badaniach klinicznych, a ostatnio została wykorzystana do dostarczenia cDNA kodującego białko kapsydu COVID-19 do biorców jednego wariantu szczepionki COVID-1916, 17. W celu uzyskania bardziej szczegółowego opisu cyklu życiowego adenowirusa, wektorów adenowirusowych i klinicznych zastosowań adenowirusów, czytelnik jest kierowany do reference17.
Ważnym kamieniem milowym w użyciu adenowirusów do transdukcji nabłonka dróg moczowych, był raport Ramesha i wsp., który wykazał, że krótkie wstępne leczenie detergentami, w tym N-dodecyl-β-D-maltozydem (DDM), znacznie zwiększyło transdukcję nabłonka dróg moczowych przez adenowirusa kodującego β-galaktozydazę18. Korzystając z tego badania potwierdzającego zasadność jako przewodnika, transdukcja nabłonka dróg moczowych za pośrednictwem adenowirusa została teraz wykorzystana do ekspresji różnych białek, w tym GTPaz rodziny Rab, czynników wymiany guaniny-nukleotydów, fragmentów motorycznych miozyny, tworzących pory klaudyny związanych ze ścisłymi połączeniami i ADAM1710,19,20,21,22. To samo podejście zaadaptowano do ekspresji małych interferujących RNA (siRNA), których efekty zostały uratowane przez koekspresję opornych na siRNA wariantów transgene22. Opisany tutaj protokół obejmuje ogólne metody generowania dużych ilości wysoce skoncentrowanego adenowirusa, co jest wymogiem dla tych technik, a także adaptacje metod Ramesh et al.18 do ekspresji transgenów w nabłonku dróg moczowych z wysoką wydajnością.

<table><tbody><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4488</td><td>sterylna, serologiczna pipeta, indywidualnie pakowana</td></tr><tr><td>12 ml probówka do ultrawirówek</td><td>ThermoFisher</td><td>06-752</td><td>Cienkościenna ultrawirówka PET</td></tr><tr><td>stożkowa probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352097</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>igła 18 G</td><td>BD&nbsp;</td><td>305196</td><td>Igła 18 G x 1,5 cala</td></tr><tr><td>Pipeta 20 ml</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4489</td><td>sterylna, serologiczna pipeta, pakowana pojedynczo</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352098</td><td>sterylna</td></tr><tr><td>pipeta 5 ml</td><td>Corning Costar (Millipore Sigma)</td><td>CLS4487</td><td>sterylna, serologiczna pipeta, pakowana pojedynczo</td></tr><tr><td>Cavicide</td><td>Henry Schein</td><td>6400012</td><td>Roztwór przeciwwirusowy</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych - 15 cm</td><td>Falcon (Corning)</td><td>353025</td><td>sterylne, poddane działaniu hodowli tkankowej&nbsp; (czasza 150 mm x 25 mm)</td></tr><tr><td>Skrobak</td><td>do komórek Sarstedt</td><td>893.1832</td><td>długość rączki 24 cm, długość ostrza 1,7 cm</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>C-4306</td><td>Biologia molekularna klasa &ge; 98%</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana DMEM (wysoka glukoza)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td>z 4,5 g/L glukozy + L-glutamina + czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>EDS</td><td>Bioiultra klasa &ge; 99%</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Hyclon (Cytiva)</td><td>SH30070.03</td><td>zdefiniowana surowica</td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>5,75 cala szklana pipeta, autoklawizowana</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G-5516</td><td>Biologia molekularna klasy &ge; 99%</td></tr> <tr><td>komórek HEK293</td> Komórki <td>HEK293T ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>są wariantem komórek HEK293, które wyrażają duży antygen T SV40</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Cewnik dożylny Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>- mysz</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3063</td><td>24 G x 3/4 cala Bezpieczny cewnik dożylny&nbsp; Nieprzepuszczalny dla promieni rentgenowskich</td></tr><tr><td>cewnik dożylny - szczur</td><td>Smith Medical Jelco</td><td>3060</td><td>22 G x 1 cal Bezpieczny cewnik dożylny nieprzepuszczający promieni rentgenowskich</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P-9541</td><td>Biologia molekularna klasa &ge; 99%</td></tr> <tr><td>KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5655</td><td>Klasa hodowli komórkowej&nbsp; &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&bull; 7 H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>431478</td><td>&nbsp; &ge; 99,99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>Biologia molekularna klasa &ge; 99%</td></tr><tr><td>N-dodecyl-&beta;-D-maltozyd&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4641</td><td>&nbsp; &ge; 98%</td></tr><tr><td>Stożek nosowy dla wielu zwierząt</td>, <td>specjalnie zaprojektowane</td><td></td><td>opcje komercyjne, w tym jeden z kolumny Parkland Scientific (RES3200)</td></tr><tr><td>PD-10&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-085-01</td><td>Fabrycznie zapakowane kolumny wypełnione antybiotykiem Sephadex G-25M</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15070063</td><td>100x stężony roztwór</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioPhotometer</td><td></td></tr><tr><td>Statyw i zacisk</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q i 05-769-8FQ</td><td>dostępne u wielu dostawców</td></tr><tr><td>Sterylna jednostka filtrująca</td><td>Fisher Scientific (Nalgene)</td><td>09-740-65B</td><td>0,2 i mikro; m Filtr o szybkim przepływie (150 ml)</td></tr><tr><td>Sterylny filtr 0,2 i mikro; m (strzykawka)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SLGV004SL</td><td>Millipore Sigma Milex 0,22 & mikro; m jednostka filtrująca, którą podłącza się do strzykawki</td></tr><tr><td>Wirówka superszybka</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810R</td><td>z wirnikiem o stałym kącie nachylenia Eppendorf F34-6-38 (12 000 obr./min)</td></tr><tr><td>Strzykawka (1 mL)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309628</td><td>Strzykawka 1 ml końcówka Luer-lok - sterylna</td></tr><tr><td>strzykawka (3 ml)</td><td>BD&nbsp;</td><td>309656</td><td>3-mL końcówka strzykawki - sterylna</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa (niska prędkość)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5702</td><td>z wahliwym wirnikiem kubełkowym</td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>polietylenowa pipeta transferowa 3,4 ml</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Millipore Sigma</td><td>648310-M</td><td>Biologia molekularna klasa&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE select roztwór proteazy</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>12604013</td><td>Enzym ekspresyjny TrypLE (1x), bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td>z wirnikiem Beckman SW41 (41 000 obr./min)</td></tr><tr><td>Waporyzator&nbsp;</td><td>Usługi w zakresie znieczulenia ogólnego, Inc.</td><td>Waporyzator Tec 3</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>analogowy mikser wirowy</td></tr></tbody></table>

ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

Oprócz tworzenia bariery o wysokim oporze, przypuszcza się, że naczyn dróg moczowych wyściełający miedniczkę nerkową, moczowody, pęcherz moczowy i bliższą cewkę moczową wyczuwa i przekazuje informacje o swoim otoczeniu do tkanek leżących poniżej, promując funkcję i zachowanie mikcji. Przerwanie bariery urotelialnej lub jej funkcji czuciowej/przetwornikowej może prowadzić do choroby. Badanie tych złożonych zdarzeń jest utrudnione przez brak prostych strategii zmiany ekspresji genów i białek w nabłonku dróg moczowych. Opisano tutaj metody, które pozwalają badaczom generować duże ilości adenowirusa o wysokim mianie, który można następnie wykorzystać do transdukcji nabłonka dróg ciężkich gryzoni z wysoką wydajnością i w stosunkowo prosty sposób. Zarówno cDNA, jak i małe interferujące RNA mogą być wyrażane za pomocą transdukcji adenowirusowej, a wpływ ekspresji transgenu na funkcję urotelialną można ocenić od 12 godzin do kilku dni później. Metody te mają szerokie zastosowanie w badaniach prawidłowej i nieprawidłowej biologii urotelialnej z wykorzystaniem mysich lub szczurzych modeli zwierzęcych.

Przygotowanie wirusa 
Przykład oczyszczania wirusa za pomocą wirowania w gradiencie gęstości przedstawiono na Ryc. 1A. Jasnoróżowy prążek, znajdujący się na granicy nałożonego materiału komórkowego i warstwy CsCl o gęstości 1,25 g/mL, składa się głównie z rozbitych komórek i ich szczątków (patrz. magenta strzałka na Ryc. 1A). Różowy kolor wynika z niewielkiej ilości pożywki przeniesionej z kroku 1.5 protokołu. Cząstki wirusa będące przedmiote...

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Protokół ten opisuje metody, które pozwalają badaczom na ekspresję CDNA lub SIRNA w natywnym nabłonku dróg moczowych. Głównymi zaletami tej techniki jest jej względna prostota, zdolność do ekspresji cDNA, siRNA w nabłonku dróg moczowych z wysoką wydajnością i w stosunkowo krótkim czasie. Najtrudniejszą częścią tej techniki jest cewnikowanie.Jednak ogólna technika jest stosunkowo łatwa do opanowania, gdy się jej nauczysz. Procedurę zademonstruje Giovanni Ruiz, specjalista ds. badań IV w moim laboratorium. Na początek umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej obok stożków nosowych.Utrzymuj zwierzę w znieczuleniu przez cały czas trwania protokołu. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc palec u nogi. Aby zapobiec wprowadzaniu powietrza do pęcherza, napełnij plastikową część cewnika dożylnego i związany z nim piast sterylnym PBS za pomocą sterylnej pipety lub strzykawki do przenoszenia.Gdy zwierzę znajduje się w pozycji leżącej, przetrzyj zewnętrzny przewód moczowy 70% alkoholem. Następnie delikatnie chwyć tkankę tworzącą zewnętrzny ujście cewki moczowej i rozciągnij ją pionowo od zwierzęcia za pomocą cienkich kleszczy. Wprowadzić sterylny cewnik do przewodu zew

expression-transgenes-native-bladder-urothelium-using-adenovirus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wstrzykiwanie do ściany pęcherza moczowego myszy jest przydatnym podejściem do ortotopowych badań nad biologią komórek macierzystych pęcherza oraz biologią nowotworów. Tę precyzyjną metodę mikrochirurgiczną można opanować dzięki starannej technice i praktyce.

Iniekcja w ścianę pęcherza myszy

Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidu DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy za pomocą kombinacji cewnikowania cewki moczowej i technik elektroporacji. Opisana procedura pozwala na wygenerowanie modeli raka pęcherza moczowego u myszy.

Dostarczanie plazmidów DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy: procedura oparta na elektroporacji mająca na celu skuteczne dostarczanie plazmidów DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy w celu wygenerowania modeli modyfikowanych genetycznie

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Model raka pęcherza moczowego wywołanego N-butylo-N-(4-hydroksybutylo)nitrozoaminą został opracowany u transgenicznych myszy ludzkich mucyny 1 (MUC1) w celu przetestowania immunoterapii ukierunkowanej na MUC1.  Po podaniu szczepionki peptydowej ukierunkowanej na MUC1 potwierdzono odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T na MUC1 poprzez pomiar poziomu cytokin w surowicy i aktywności specyficznej dla limfocytów T.

Indukcja inwazyjnego raka przejściowokomórkowego pęcherza moczowego u nienaruszonych immunologicznie ludzkich myszy transgenicznych MUC1: model rozwoju immunoterapii

Ten protokół opisuje nowo ustaloną metodę dostarczania wirusa do mysiej prostaty. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, nadekspresję genów lub dostarczanie rekombinazy Cre, technika ta umożliwia ortotopową zmianę ekspresji genów i wdraża nowy mysi model raka prostaty.

Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Ten protokół dostarcza szczegółowych kroków eksperymentalnych w celu ustanowienia trójwymiarowej hodowli in vitro organoidów guza pęcherza moczowego pochodzących z wywołanego przez czynnik rakotwórczy mysiego raka pęcherza moczowego. Opisano metody hodowli, w tym pasażowanie, inżynierię genetyczną i ortotopowe przeszczepianie organoidów nowotworowych.

Hodowla, manipulacja i ortotopowe przeszczepienie organoidów guza pęcherza moczowego myszy

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Ten protokół opisuje metodologię oceny funkcji mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych w natywnych komórkach urotelialnych za pomocą fluorescencyjnego czujnika Ca2+ GCaMP5G.

Ex vivo Analiza mechanicznie aktywowanych stanów nieustalonychCa2+ w komórkach urotelialnych

Poznaj metodę transdukcji nabłonka dróg moczowych za pomocą adenowirusa, umożliwiającą ekspresję cDNA i siRNA z wydajnością bliską 95%. Technika ta pozwala badać biologię nabłonka moczowego.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Przeglądaj więcej filmów