Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa
6 października 2022
Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.
Protokół ten opisuje metody, które pozwalają badaczom na ekspresję CDNA lub SIRNA w natywnym nabłonku dróg moczowych. Głównymi zaletami tej techniki jest jej względna prostota, zdolność do ekspresji cDNA, siRNA w nabłonku dróg moczowych z wysoką wydajnością i w stosunkowo krótkim czasie. Najtrudniejszą częścią tej techniki jest cewnikowanie.
Jednak ogólna technika jest stosunkowo łatwa do opanowania, gdy się jej nauczysz. Procedurę zademonstruje Giovanni Ruiz, specjalista ds. badań IV w moim laboratorium. Na początek umieść znieczuloną mysz na poduszce grzewczej obok stożków nosowych.
Utrzymuj zwierzę w znieczuleniu przez cały czas trwania protokołu. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, szczypiąc palec u nogi. Aby zapobiec wprowadzaniu powietrza do pęcherza, napełnij plastikową część cewnika dożylnego i związany z nim piast sterylnym PBS za pomocą sterylnej pipety lub strzykawki do przenoszenia.
Gdy zwierzę znajduje się w pozycji leżącej, przetrzyj zewnętrzny przewód moczowy 70% alkoholem. Następnie delikatnie chwyć tkankę tworzącą zewnętrzny ujście cewki moczowej i rozciągnij ją pionowo od zwierzęcia za pomocą cienkich kleszczy. Wprowadzić sterylny cewnik do przewodu zewnętrznego.
Drugą ręką ostrożnie włóż cewnik pionowo około trzech do czterech milimetrów do ujścia cewki moczowej. Następnie opuść cewnik wprowadzony do przewodu zewnętrznego w kierunku ogona zwierzęcia, co ułatwia jego wejście do części cewki moczowej, która przechodzi poniżej kości łonowej, a ostatecznie do pęcherza moczowego. Pozwól, aby mocz z pęcherza wyciekł.
Usuń resztki moczu, wykonując manewr Crede'a, masując i delikatnie uciskając guzek pęcherza w dolnej części brzucha. Aby nabłonek dróg moczowych był podatny na transdukcję, umyj pęcherz myszy lub szczura, podłączając sterylną strzykawkę o pojemności jednego mililitra wypełnioną PBS do piasty cewnika. Wstrzyknąć 100 mikrolitrów sterylnego PBS do pęcherza myszy.
Po odłączeniu strzykawki od złączki cewnika, należy pozwolić PBS na opróżnienie. Wkroplić 100 mikrolitrów 0,1% N-dodecyl-beta-D-maltozydu rozpuszczonego w PBS i filtrze 0,2 mikrometra wysterylizowanego do pęcherza myszy za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra. Zatrzymać N-dodecylo-beta-D-maltozyd w pęcherzu moczowym przez 10 minut, pozostawiając strzykawkę na miejscu.
Usunąć N-dodecyl-beta-D-maltozyd z pęcherza moczowego, odłączając strzykawkę i pozwalając jej odpłynąć. Aby wprowadzić wirusa do pęcherza moczowego, przymocuj sterylną strzykawkę o pojemności jednego mililitra do piasty cewnika i wkraplaj do pęcherza od 5 000 000 do 100 000 000 IVP adenowirusa rozcieńczonego w 100 mikrolitrach sterylnego PBS dla myszy lub 450 mikrolitrów dla szczurów. Po 30 minutach odłączyć strzykawkę i pozwolić, aby roztwór wirusa opróżnił pęcherz moczowy na jednorazową wkładkę.
Wyrzuć pozostałości roztworu wirusa chusteczką chłonną, wyrzucając podkładkę i wytrzyj odpady niebezpieczne biologicznie. Aby zwierzę mogło dojść do siebie, należy przerwać przepływ izofluranu. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie i uzyskać pełną mobilność przed umieszczeniem go z powrotem w klatce, zwłaszcza jeśli zwierzęta są trzymane w grupie.
Przeanalizuj efekty ekspresji transgenu od 12 do 72 godzin po leczeniu przy użyciu metod takich jak hybrydyzacja mRNA in situ, Western blot lub immunofluorescencja. Analiza Western blot lizatów urotelialnych ujawniła znakowaną V5 ekspresję ludzkiego hormonu wzrostu w nabłonku dróg moczowych transdukowanych, ale nie w pęcherzach nietransdukowanych. Ekspresja została również potwierdzona przez immunofluorescencję przy użyciu przeciwciał, które rozpoznawały ludzki hormon wzrostu, czyli znacznik epitopu V5.
Analiza Western blot potwierdziła ekspresję Claudin-2 u szczurów transdukowanych adenowirusem, ale nie u tych, którym transdukowano kontrolowanym wirusem kodującym GFP. Analiza immunofluorescencyjna dodatkowo potwierdziła egzogenną ekspresję Claudin-2 w urotelialnych komórkach parasolowych transdukowanych kodującym wirusa cDNA Claudin-2. Wykrycie egzogennej kladyny-2 w białku złącza ścisłego 1 za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej całego zamontowanego lub przekrojowego nabłonka dróg moczowych ujawniło obecność połączenia ścisłego i wewnątrzkomórkowych nagromadzeń Claudin-2 w cytoplazmie komórki.
Pole obrazu pokazuje, że zliczenie liczby transdukowanych komórek parasolowych ujawnia wydajność zbliżającą się do 95%, a w całej ścianie pęcherza moczowego transdukowany jest tylko nabłonek dróg moczowych i żadna inna tkanka nie jest celem wszczepionego adenowirusa. Cewnikowanie ma kluczowe znaczenie, aby protokół działał zgodnie z przeznaczeniem. Technika ta pozwala badaczom badać normalną biologię urotelialną, a także zrozumieć warunki, w których nadekspresja lub niedostateczna ekspresja białka prowadzi do choroby.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia protokół dotyczący efektywnego przeprowadzania transdukcji natywnego urotelium gryzoni za pomocą rekombinantnych adenowirusów, umożliwiającego ekspresję cDNA i siRNA. Kluczowe wyniki obejmują osiągnięcie prawie 95% efektywności transdukcji w komórkach urotelialnych, ułatwiając badania nad biologią urotelium i powiązanymi chorobami.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia urotelium
- Regulacja ekspresji genów
- Techniki transdukcji
Tło
- Znaczenie urotelium w funkcji pęcherza
- Wyzwania w badaniu ekspresji genów in vivo
- Potrzeba skutecznych metod transdukcji
Stosowane metody
- Zastosowanie rekombinantnego adenowirusa do dostarczania genów
- Modele myszy i szczurów
- Testy Western blot i immunofluorescencji do analizy
Główne wyniki
- Wykazano wysoką efektywność ekspresji transgenów w komórkach urotelialnych
- Potwierdzono ekspresję określonych białek, takich jak Klaudin-2 i ludzki hormon wzrostu
- Ustalono, że adenowirus specyficznie transdukuje urotelium bez wpływu na sąsiednie tkanki
Wnioski
- Protokół ten umożliwia dogłębne badania funkcji genów w urotelium
- Oferuje wgląd w warunki wpływające na biologię pęcherza, przyczyniając się do szerszych badań biologicznych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Adenovirus-mediated transgene delivery in native bladder urothelium enables rapid, high-efficiency modulation of gene expression in vivo, addressing a critical bottleneck in functional target validation for lower urinary tract research. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence at the discovery and preclinical interface, facilitating portfolio decisions for programs targeting urothelial biology. The method's specificity and scalability position it as a reusable platform for interrogating gene function and disease mechanisms in rodent models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in native urothelial tissue for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of candidate targets through controlled overexpression or knockdown.
- Facilitates rapid hypothesis testing in disease-relevant rodent models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo systems for downstream phenotypic or biomarker assays.
- Delivers reproducible, high-efficiency transduction for quantitative protein expression analysis.
- Enables robust comparison of transgene effects using standardized readouts such as Western blot and immunofluorescence.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker exploration in bladder research.
- Provides continuity from discovery-stage gene modulation to preclinical functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement of urothelial targets based on in vivo functional data.
Pipeline & Workflow Integration
This adenoviral transduction protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical validation, enabling rapid target interrogation and functional assessment in rodent models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function and pathway involvement in urothelial tissue.
- Screening: Provides a reproducible platform for quantitative assessment of transgene expression and downstream effects.
- Analytics: Enables robust measurement of protein expression via Western blot and immunofluorescence for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by enabling disease-relevant gene modulation in vivo.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol for repeated use across multiple gene targets and rodent models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in urothelial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, high-efficiency gene delivery with reproducible outcomes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital allocation by providing rapid in vivo functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of urothelial targets for advancement or deprioritization.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in rodent catheterization and in vivo gene delivery.
- Needs access to high-titer adenoviral vectors and analytical tools for protein detection.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other tissues or species may require protocol optimization.
- Catheterization is a critical step and may present a learning curve for new operators.
