Ekstrakcja DNA okrzemek z próbek wody i tkanek
10 listopada 2023
Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA okrzemek przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do ekstrakcji DNA powszechnie używanego.
Nasze badania koncentrują się głównie na temacie utonięć. Chcieliśmy odpowiedzieć na pytanie, czy ciało znalezione w wodzie zmarło w wyniku utonięcia, a także odpowiedzieć na inne pytanie, gdzie osoba wpadła do wody. Oznacza to, że należy znać miejsce utonięcia.
W porównaniu z innymi technologiami zapewniamy prosty, wygodny i ekonomiczny protokół ekstrakcji DNA okrzemek, który możemy lepiej wykorzystać w badaniach kryminalistycznych, zwłaszcza w podstawowej praktyce kryminalistycznej. Nasze laboratorium będzie dalej koncentrować się na problemach związanych z utonięciem w oparciu o wzór w wodzie, taki jak przyczyna śmierci, interwał pośmiertny i tak dalej. Co więcej, prowadzimy również badania z zakresu entomologii sądowej i niektórych szczególnych zjawisk w tropikalnej medycynie sądowej.
Na początek weź 10 mililitrów próbki wody okrzemkowej do probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o masie 13,400 g przez pięć minut. Za pomocą pistoletu do pipet ostrożnie wyrzuć 9,8 mililitra supernatantu.
Następnie przenieś 200 mikrolitrów wzbogaconej próbki wody okrzemkowej do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Następnie należy pobrać 0,5 grama tkanki brzegu płuc z utopionego ciała ludzkiego. Nożyczkami przetnij tkankę płucną, aż stanie się błotnista.
W przypadku ekstrakcji DNA zarówno z próbek okrzemek, jak i płuc, najpierw dodaj szklane kulki do obu próbek. Po dokładnym wymieszaniu próbek dodaj 40 mikrolitrów proteinazy K do probówek. Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 200 mikrolitrów buforu wiążącego do obu probówek.
Natychmiast wymieszać próbki za pomocą mieszalnika wirowego przez cztery minuty. Następnie umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie przenieś klarowny roztwór z kłaczkowym osadem do trzycentymetrowej kolumny absorpcyjnej wypełnionej matrycą krzemową.
Odwirować kolumnę przy 8 000 g przez 30 sekund. Następnie wylej odpady z probówki zbiorczej i włóż kolumnę z powrotem do probówki zbiorczej. Teraz dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania inhibitora do kolumny i odwiruj przy 13, 400 g przez 30 sekund.
Po wyrzuceniu cieczy odpadowej dodać 700 mikrolitrów buforu myjącego do kolumny i ponownie odwirować. Po wyrzuceniu cieczy odpadowej umieścić kolumnę absorpcyjną z powrotem w pustej probówce zbiorczej. Odwirować kolumnę przy 14 500 g przez dwie minuty, aby usunąć jak najwięcej buforu do płukania.
Teraz wyjmij kolumnę i umieść ją w czystej probówce wirówkowej. Dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do środkowej części membrany absorpcyjnej. Odwirować kolumnę przy 13,400 g przez jedną minutę po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej.
Przenieść roztwór otrzymany w probówce zbiorczej z powrotem do kolumny absorpcyjnej przed ponownym odwirowaniem. Przechowuj wymyte DNA okrzemek w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Elektroforeza w żelu agarozowym wykazała prążki DNA okrzemek od 250 do 500 pz zarówno w próbkach wody, jak i tkankach po amplifikacji PCR.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA okrzemków z wykorzystaniem zmodyfikowanego, powszechnie stosowanego zestawu do izolacji DNA. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniach kryminalistycznych związanych ze sprawami utonięć.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kryminalistyka
- Badania nad utonięciami
- Techniki ekstrakcji DNA
Wstęp
- Analiza okrzemków może pomóc w ustaleniu przyczyny śmierci w przypadkach utonięcia.
- Zrozumienie miejsca utonięcia jest kluczowe dla dochodzeń kryminalistycznych.
- Protokół ma na celu uproszczenie i usprawnienie kosztowe procesu ekstrakcji DNA.
- Badania obejmują również entomologię sądową oraz tropikalną medycynę sądową.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu ekstrakcji DNA okrzemek.
- Udoskonalenie praktyk kryminalistycznych w badaniach nad przypadkami utonięć.
- Zbadanie zależności między wzorcami występowania okrzemek a okolicznościami utonięcia.
Zastosowane metody
- Zmodyfikowany powszechny zestaw do ekstrakcji DNA dla próbek okrzemek.
- Zastosowanie protokołu w kryminalistyce.
- Analiza obecności okrzemek w próbkach wody.
- Integracja z innymi metodologiami kryminalistycznymi.
Główne wyniki
- Skuteczna ekstrakcja DNA okrzemek z wykorzystaniem zmodyfikowanego protokołu.
- Wykazana efektywność w zastosowaniach kryminalistycznych.
- Potencjał do zwiększenia dokładności w ustalaniu przypadków utonięć.
- Podstawa do dalszych badań w powiązanych dziedzinach kryminalistyki.
Wnioski
- Zmodyfikowany protokół ekstrakcji DNA stanowi wartościowe narzędzie w kryminalistyce.
- Zapewnia on kosztowo efektywną i wydajną metodę analizy okrzemków.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jego zastosowań w dochodzeniach kryminalistycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Niezawodna ekstrakcja DNA okrzemków z próbek wody i tkanek pozwala badaczom z zakresu kryminalistyki i ochrony środowiska na z większą pewnością weryfikować hipotezy dotyczące utonięć. Niniejszy protokół stanowi kostu-efektywną, skalowalną alternatywę dla zestawów komercyjnych, wspierając szersze zastosowanie metody w warunkach ograniczonych zasobów. Wysoka wydajność uzyskiwanego DNA stanowi podstawę dla dalszych analiz molekularnych, które są kluczowe dla walidacji celów i minimalizacji ryzyka mechanistycznego w procesach kryminalistycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia molekularną weryfikację hipotez środowiskowych i kryminalistycznych poprzez analizę DNA okrzemków.
- Wspiera minimalizację ryzyka biologicznego poprzez dostarczanie wiarygodnego DNA do późniejszych etapów PCR i sekwencjonowania.
- Zwiększa pewność prognostyczną w kryminalistycznym ustalaniu zdarzeń związanych z utonięciem.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki DNA odpowiednie do standaryzowanych analiz molekularnych.
- Poprawia powtarzalność i wynik ilościowy w detekcji DNA okrzemek metodą PCR.
- Umożliwia skalowalne i efektywne kosztowo przetwarzanie próbek podczas wysokoprzepustowych badań kryminalistycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zestawia wyniki molekularne z odkrywaniem biomarkerów kryminalistycznych i środowiskowych.
- Zapewnia ciągłość od momentu pobrania próbki po walidację molekularną w procesach analitycznych kryminalistyki.
- Zmniejsza ryzyko związane z wdrażaniem nowych narzędzi molekularnych w zastosowaniach kryminalistycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etap pozyskiwania próbek z analizą molekularną, wspierając procesy badawcze od wstępnych odkryć kryminalistycznych po późniejsze etapy PCR i sekwencjonowania.
- Biologia odkrywcza: Stanowi podstawę do testowania hipotez dotyczących miejsca i przyczyny utonięcia.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, wysokiej jakości DNA do opracowania i walidacji analiz.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary prążków DNA okrzemków do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy pobieranie próbek środowiskowych z identyfikacją molekularnych biomarkerów w kontekście kryminalistycznym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, adaptowalny protokół dla zróżnicowanych potrzeb ekstrakcji DNA środowiskowego i kryminalistycznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w molekularnych analizach kryminalistycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ekstrakcję DNA za pomocą skalowalnych i kosztowo efektywnych procedur.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji w dochodzeniach kryminalistycznych i alokację zasobów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację narzędzi i protokołów molekularnej kryminalistyki z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biologii molekularnej i postępowania z materiałem dowodowym.
- Wymaga dostępu do wirówek, inkubatorów oraz aparatury do PCR.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności ekstrakcji i analizy DNA.
- Możliwość adaptacji do różnych typów próbek, w tym wody i tkanek, poprzez wprowadzanie niezbędnych modyfikacji protokołu.
- Ograniczeniem jest konieczność rygorystycznej kontroli zanieczyszczeń oraz stosowania walidowanych analiz w kolejnych etapach.
