Name: Ekstrakcja DNA okrzemek z próbek wody i tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: Poznaj protokół ekstrakcji DNA okrzemek z próbek wody i tkanek płucnych w celach kryminalistycznych. Ta metoda pozwala określić przyczynę i miejsce utonięcia w praktyce sądowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82060341,81560304) oraz przez Projekt Naukowo-Badawczy Platformy Innowacji Akademickich Prowincji Hainan (YSPTZX202134).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Medycznego w Hainan. Próbki tkanek użyte w tym badaniu nie są uważane za badania z udziałem ludzi. Próbki te uzyskano w celu sądowej diagnozy patologicznej, a reszta wykorzystano do ekstrakcji DNA okrzemek w tym eksperymencie. Badacze nie są w stanie łatwo zidentyfikować osób w celu uzyskania świadomej zgody od odpowiednich zainteresowanych stron.
UWAGA: Aby zapewnić ogólną stosowalność metody badawczej opisanej w tym eksperymencie, eksperyment ten zasadniczo przebiegał zgodnie z instrukcją obsługi używanego zestawu i tylko niektóre kroki zostały zmodyfikowane. Próbki wody użyte w tym eksperymencie zostały losowo pobrane ze stawów w pobliżu laboratorium (rysunek uzupełniający 1A). W tym eksperymencie potwierdzono, że tkanka płucna topielca jest tkanką badawczą w celu zademonstrowania protokołu ekstrakcji (rysunek uzupełniający 1B). W praktyce sądowej czasami konieczne jest również użycie innych narządów i tkanek ciał topielców (takich jak wątroba, śledziona, nerki, szpik kostny itp.) do ekstrakcji DNA okrzemek, co wymaga niewielkich odpowiednich ulepszeń tej metody eksperymentalnej, które zostaną wyjaśnione w odpowiedniej sekcji eksperymentu. Próbki tkanki płucnej użyte w tym eksperymencie pochodziły ze zwłok, które w oczywisty sposób zostały utopione w sprawach kryminalistycznych. Przeprowadzono badania morfologiczne w celu udowodnienia, że tkanka płucna zawiera okrzemki (rysunek uzupełniający 2).
1. Wstępna obróbka próbek
<ol>
	<li>Wstępne uzdatnianie próbek wody
	<ol>
		<li>Pobrać 10 ml próbki wody do probówki wirówkowej i wirować przy 13 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić 9,8 ml supernatantu za pomocą pistoletu do pipetowania i przenieść około 200 μl wzbogaconej próbki wody okrzemkowej pozostałej na dnie do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. 
		UWAGA: Najpierw można przeprowadzić eksperyment wstępny, a początkową ilość można zwiększyć, jeśli 10 ml próbki wody nie wystarcza do wzbogacenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka wstępna próbek tkanek
	<ol>
		<li>Pobrać 0,5 g tkanki brzegu płuc z utopionego ciała, całkowicie posiekać lub zmielić tkankę płucną, aż stanie się błotnista. Zapobieganie zanieczyszczeniu egzogennych okrzemek jest podstawą tego etapu. Kilkakrotnie pokrój tkankę na kawałki za pomocą nożyczek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
UWAGA: Wszystkie etapy wirowania są zakończone w temperaturze pokojowej. Za pomocą wirówki biurkowej o sile odśrodkowej 14 500 x g; przed rozpoczęciem doświadczenia należy przygotować łaźnię wodną (lub metalową) podgrzaną do temperatury 70 °C. Wszystkie kroki muszą być ściśle zgodne z zasadami aseptyki.
<ol>
	<li>Pobieranie próbek wody i tkanek 
	UWAGA: Próbka wody i metoda ekstrakcji DNA okrzemek tkankowych są takie same.
	<ol>
		<li>Dodać szklane kulki do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej wstępnie przetworzoną próbkę wody. Odwróć 10x-15x, aby dobrze wymieszać. Dodane kulki szklane składają się z dużych i małych kulek szklanych zmieszanych w stosunku masowym 1:1. Średnica dużych koralików szklanych wynosi 1,5-2,0 mm, a małych koralików szklanych 0,4-0,6 mm.</li>
		<li>Weź 0,5 g drobno posiekanej chusteczki, dodaj szklane kulki do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej tkankę, jak opisano powyżej. Odwróć 10x-15x, aby wymieszać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 40 μl proteinazy K (20 mg/ml) do probówek. Umieść w temperaturze pokojowej na 15 minut, w tym czasie odwróć i wymieszaj 10x co 3 min. 
	UWAGA: Jeśli tkanka nie jest w pełni strawiona, ilość proteinazy K można odpowiednio zwiększyć, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu wiążącego do probówek wirówkowych, natychmiast wirować i mieszać przez 4 minuty (częstotliwość mieszania oscylacyjnego: 3000 obr./min). 
	UWAGA: Na tym etapie intensywność i czas wytrząsania powinny być ściśle kontrolowane, aby zapewnić wystarczającą intensywność i czas mieszania.</li>
	<li>Umieścić probówki wirówkowe w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C na 10 minut, a roztwór stanie się klarowny.</li>
	<li>Dodać 100 μl izopropanolu do probówek wirówkowych, wirować i mieszać przez 15 s, w tym czasie mogą pojawić się kłaczkowate opady. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby dobrze wymieszać z odpowiednią mocą w powyższych krokach operacji, ale należy unikać energicznego potrząsania, aby zapobiec ścinaniu DNA.</li>
	<li>Roztwór otrzymany w poprzednim kroku umieścić wraz z osadem flokulentu do kolumny adsorpcyjnej (kolumnę adsorpcyjną umieszcza się w probówce zbiorczej). Długość kolumny adsorpcyjnej wynosi 3,0 cm, średnica 1,0 cm, a matryca adsorpcyjna to membrana matrycy krzemowej.</li>
	<li>Wirować przy 8 000 x g przez 30 s, wyrzucić odpady płynne do probówki zbiorczej i umieścić kolumnę adsorpcyjną z powrotem w probówce zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do usuwania inhibitora do kolumny adsorpcyjnej. Wirować przy 13 400 x g przez 30 s i wyrzucić odpady płynne do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu płuczącego do kolumny adsorpcyjnej. Wirować przy 13 400 x g przez 30 s i wyrzucić odpad cieczy do probówki zbiorczej. 
	UWAGA: Przed pierwszym użyciem dodaj określoną ilość bezwzględnego etanolu do butelki buforowej do mycia.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do przemywania do kolumny adsorpcyjnej. Wirować przy 13 400 x g przez 30 s i wyrzucić odpady płynne do probówki zbiorczej.</li>
	<li>Umieścić kolumnę adsorpcyjną z powrotem w pustej probówce zbiorczej. Wirować przy 14 500 x g przez 2 minuty i usunąć bufor płuczący tak bardzo, jak to możliwe, aby zapobiec zahamowaniu dalszych reakcji przez resztki etanolu w buforze myjącym.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę adsorpcyjną i umieść ją w czystej probówce wirówkowej. Dodać 100 μl buforu elucyjnego do środkowej części membrany adsorpcyjnej.</li>
	<li>Umieścić kolumnę adsorpcyjną w temperaturze pokojowej na 3-5 minut i odwirować przy 13 400 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Ponownie dodać roztwór otrzymany w poprzednim kroku do odśrodkowej kolumny adsorpcyjnej. Umieścić odśrodkową kolumnę adsorpcyjną w temperaturze pokojowej na 2 minuty i odwirować przy 13 400 x g przez 1 min. 
	UWAGA: Bufor elucyjny należy wstępnie podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez około 10 minut. Objętość elucji nie powinna być mniejsza niż 50 μl; w przeciwnym razie wydajność DNA zostanie zmniejszona.</li>
	<li>Wyekstrahowane DNA okrzemek należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C do wykorzystania w przyszłości. Jeżeli roztwór DNA ma być przechowywany przez długi czas, należy go przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Test PCR
UWAGA: Ponieważ zawartość okrzemek w próbkach kryminalistycznych jest często niska, ekstrakty z próbek tkanek ciał topielców mogą również zawierać różne stopnie tkanek i organów (takich jak płuca w tym eksperymencie) z ich własnym DNA. W związku z tym bezpośrednie wykrywanie całkowitego DNA w ekstraktach DNA nie odzwierciedla sytuacji ekstrakcji DNA okrzemek. W tym eksperymencie wybrano startery specyficzne dla okrzemek, a produkty PCR użyto do oceny ekstrakcji DNA okrzemek w ekstrakcie. Produkty można obserwować i analizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a także można je analizować za pomocą fluorescencyjnej ilościowej krzywej topnienia PCR w czasie rzeczywistym, która ma wyższą czułość.
<ol>
	<li>Dodać 2 μl wyekstrahowanego DNA z próbek wody i tkanek jako matrycę. Wybierz jedną z dwóch poniższych metod inspekcji.</li>
	<li>Konwencjonalny test PCR
	<ol>
		<li>Użyj primers22, który może specyficznie amplifikować fragmenty rDNA okrzemek 18S. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1.</li>
		<li>Ustal system reakcji PCR i warunki amplifikacji zgodnie z charakterystyką starterów. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 2.</li>
		<li>Uruchom produkty amplifikacji PCR na 2% żelu agarozowym. Obserwuj i analizuj obrazowanie za pomocą imagera żelowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fluorescencyjny ilościowy test PCR
	<ol>
		<li>Użyj powyższych starterów, które mogą specyficznie amplifikować fragmenty rDNA okrzemki 18S, aby przygotować fluorescencyjny ilościowy system reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 3.</li>
		<li>Wykonaj amplifikację PCR i przeanalizuj uzyskaną krzywą amplifikacji oraz wartości Ct. W tym samym czasie ustaw program, stopniowo stopij dwuniciowe amplifikowane produkty na jednoniciowe za pomocą technologii fluorescencyjnej ilościowej krzywej topnienia PCR, a następnie przeanalizuj uzyskane krzywe topnienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Economical Diatom DNA Extraction Using a Modified Kit

<ol><li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li>
<li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5%3A+An+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458(2022).</li>
<li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inordinate+fondness%3F+The+number%2C+distributions%2C+and+origins+of+diatom+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Eukaryot+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li>
<li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Water%22%5BJournal%5D)">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241(2017).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059(2022).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li>
<li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model%3A+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983(2021).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li>
<li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+identification+of+algae+%28morphological+and+molecular%29%3A+species+concepts%2C+methodologies%2C+and+their+implications+for+ecological+bioassessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phycol%22%5BJournal%5D)">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li>
<li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death%3A+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li>
<li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims%3A+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li>
<li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li>
<li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008(2021).</li>
<li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+shell+incorporated+PHBV%2FPCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li>
<li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world%27s+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li>
<li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+studies+of+silica+biomineralization%3A+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li>
<li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681(2021).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning%3A+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li>
<li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+diatoms%3A+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene%2C+including+new+primers+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Divers+Evol%22%5BJournal%5D)">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li>
<li>Vinayak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+gene+markers+detect+diatom+DNA+in+a+drowned+mice+establishing+drowning+as+a+cause+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death.</a> Electrophoresis. , (2020).</li>
<li>Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Estuaries+and+Coasts%22%5BJournal%5D)">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Ben Amor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+TaqMan+qPCR+assay+for+rapid+detection+and+quantification+of+Gymnodinium+catenatum+for+application+to+harmful+algal+bloom+monitoring+in+coastal+areas+of+Tunisia%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).</li>
<li>Doddaraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+early+diagnosis+of+bacterial+blight+in+pomegranate+caused+by+Xanthomonas+axonopodis+pv.+punicae+using+sensitive+PCR+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques.</a> Sci Rep. 9 (1), 10097(2019).</li>
<li>Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False-positive+diatom+test%3A+a+real+challenge%3F+A+post-mortem+study+using+standardized+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leg+Med+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols.</a> Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).</li>
<li>Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+carbon+availability+in+benthic+diatom+communities%3A+photosynthesis+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398(2017).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzyme+digestion+time+on+the+detection+of+diatom+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pak+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species.</a> Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+DNA+barcodes+for+forensic+discrimination+of+drowning+incidents%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents.</a> FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145(2020).</li>
<li>Mizushima, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+heart-specific+RING+finger+protein+207+is+involved+in+energy+metabolism+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+reference+libraries+for+environmental+barcoding%3A+a+best+practice+example+from+diatom+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research.</a> PLoS One. 9 (9), 108793(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Komórki okrzemkowe są chronione przez twarde krzemionkowe ściany komórkowe17, a struktura ta musi zostać zniszczona, aby wyodrębnić DNA okrzemek. Zwykłe zestawy nie niszczą łatwo krzemionkowej skorupy okrzemek; w związku z tym trudno jest z powodzeniem wyodrębnić DNA okrzemek21. Nasze laboratorium udoskonaliło najczęściej stosowany zestaw do ekstrakcji DNA z krwi, dodając w procesie ekstrakcji okrzemek szklane kulki o różnych średnicach i różnym stosunku masy. W tym samym c...

W praktyce kryminalistycznej ustalenie, czy zwłoki znalezione w wodzie tonące, czy też zostały wrzucone do wody po śmierci, jest niezbędne do prawidłowego rozstrzygnięcia sprawy1. Jest to również jeden z trudnych problemów, które należy pilnie rozwiązać w praktyce kryminalistycznej2. Okrzemki występują obficie w środowisku naturalnym (zwłaszcza w wodzie)3,4. W procesie tonięcia, z powodu niedotlenienia i reakcji na stres, ludzie będą mieli intensywne ruchy oddechowe i będą wdychać dużą ilość tonącego płynu. W związku z tym okrzemki w wodzie dostają się do płuc wraz z tonącą cieczą, a niektóre okrzemki mogą dostać się do krążenia krwi przez barierę pęcherzykowo-kapilarną i rozprzestrzenić się na narządy wewnętrzne wraz z przepływem krwi5,6. Wykrycie okrzemek w tkankach i narządach wewnętrznych, takich jak płuca, wątroba i szpik kostny, jest mocnym dowodem na utonięcie przed śmiercią7,8. Obecnie badania sądowe okrzemek opierają się głównie na metodach badań morfologicznych. Po serii wstępnego trawienia tkanki, pod mikroskopem przeprowadza się morfologiczne, jakościowe i ilościowe oceny niestrawionych okrzemek. W tym okresie należy stosować niebezpieczne i nieprzyjazne dla środowiska odczynniki, takie jak kwas azotowy. Proces ten jest czasochłonny i wymaga od badaczy solidnej wiedzy taksonomicznej i dużego doświadczenia. To wszystko stawia przed personelem kryminalistycznym pewne wyzwania9. Technologia testowania DNA okrzemek to nowa technologia testowania okrzemek opracowana w ostatnich latach10,11,12. Technologia ta umożliwia identyfikację gatunkową okrzemek poprzez analizę specyficznego składu sekwencji DNA okrzemek13,14. Technologia PCR i technologia sekwencjonowania są powszechnie stosowanymi metodami technicznymi, ale ich podstawą jest udana ekstrakcja DNA z okrzemek. Jednak okrzemki mają specjalną budowę, odmienną od innych organizmów, co sprawia, że ich techniki ekstrakcji DNA również się różnią.
Ściana komórkowa okrzemki ma wysoki stopień krzemienia, a jej głównym składnikiem jest dwutlenek krzemu15,16,17. Krzemionkowa ściana komórkowa jest bardzo twarda i musi zostać zniszczona przed ekstrakcją DNA. Zwykłe zestawy do ekstrakcji DNA są często trudne do użycia bezpośrednio do ekstrakcji DNA okrzemek, ponieważ nie mogą zniszczyć krzemionkowej powłoki okrzemek18. Dlatego zniszczenie krzemionkowej otoczki okrzemek jest jednym z kluczowych problemów technicznych, które należy rozwiązać przy ekstrakcji DNA okrzemek.
Jednocześnie, ponieważ liczba okrzemek zawartych w próbkach z badań kryminalistycznych, czy to w próbkach wody, czy w organach i tkankach ciał topielców, jest często ograniczona, konieczne jest wzbogacanie okrzemek. Istotą wzbogacenia jest oddzielenie substancji. Próbując zebrać okrzemki razem, zminimalizuj zawartość innych składników materialnych (składników zakłócających). W pracach kryminalistycznych laboratoria często stosują metody wirowania lub wzbogacania filtracji membranowej w celu oddzielenia komórek okrzemkowych19. Ponieważ jednak urządzenia do pompowania próżniowego nie są powszechnie stosowane, metoda wzbogacania membrany nie jest często stosowana w zwykłych pierwotnych laboratoriach kryminalistycznych. Tak więc metodą wirowania jest nadal powszechnie wzbogacanie okrzemek w laboratoriach kryminalistycznych20.
Ekstrakcja DNA z okrzemek jest obecnie stosowana głównie w praktyce kryminalnej, a jej zastosowanie ma istotne ograniczenia. Obecnie na rynku dostępnych jest niewiele zestawów do ekstrakcji DNA okrzemek stosowanych w kryminalistyce i są one na ogół drogie21. W tym artykule przedstawiono ulepszoną metodę ekstrakcji DNA okrzemek, dzięki której ekstrakcja DNA okrzemek jest prosta, wygodna i opłacalna. Zwiększa to zastosowanie późniejszych badań biologii molekularnej okrzemek i może lepiej rozwiązywać problemy związane z utonięciem w medycynie sądowej poprzez badania okrzemek. Ta metoda rozbija krzemionkowe ściany komórkowe okrzemek poprzez dodanie szklanych kulek i ustawienie odpowiedniego czasu na wirowanie. W ten sposób proteinaza K i roztwór wiążący szybko elizują komórki i dezaktywują różne enzymy w komórkach. Genomowe DNA jest absorbowane przez błonę matrycy w kolumnie adsorpcyjnej i ostatecznie eluowane przez bufor elucyjny. Taki ulepszony zestaw do ekstrakcji genów krwi pełnej poprawia efekt ekstrakcji DNA okrzemek z zestawu krwi w materiałach do badań kryminalistycznych, zmniejsza koszty ekstrakcji DNA okrzemek w praktyce sądowej i może być lepiej stosowany w oddolnych badaniach kryminalistycznych.

<table><tbody><tr><td>Bufor wiążący</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>szybko lizujących komórek</td></tr><tr><td>ChemoHS qPCR Mix</td><td>Monad</td><td>00007547-120506</td><td>qPCR Mix</td></tr><tr><td>D2000 drabinka DNA</td><td>Czas rzeczywisty (Pekin) Biotechnologia</td><td>RTM415</td><td>Zmierz położenie pasm elektroforetycznych</td></tr><tr><td>D512</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109196</td><td>podkład do przedmowy</td></tr><tr><td>D978</td><td>Taihe Biotechnologia</td><td>TW21109197</td><td>odwrócony starter</td></tr><tr><td>Bufor elucyjny</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Bufor elucyjny o niskiej zawartości soli zmywa szklany</td></tr><tr><td>koralik</td> DNA <td>Yingxu Chemical Machinery (Szanghaj)&nbsp;</td><td>70181000</td><td>Specjalne kulki szklane do dyspergowania i mielenia</td></tr><tr><td>Importuj kolumnę adsorpcyjną</td><td>BioTeke</td><td>B2008006022</td><td>Kolumna adsorpcyjna z membraną o matrycy krzemionkowej</td></tr><tr><td>Bufor do usuwania</td><td>inhibitorów BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Usuwanie inhibitorów w ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Wytrącić lub wyizolować DNA</td></tr><tr><td>MIX-30S Mini mikser</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>działanie oscylacyjne</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Inaktywacja nukleaz wewnątrzkomórkowych i innych białek</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td><td>Qiagen</td><td>R1116175</td><td>kwantyfikacja fluorescencji w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td> PCR Speed Wirówka <td>9013001121</td><td></td><td>Scilogex</td></tr><tr><td>Tanon 3500R Gel Imager</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>obrazowanie żelem</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Mix</td></tr><tr><td>Thermo Cycler</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td><td>zwykły bufor do mycia PCR</td></tr><tr><td></td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Usuń zanieczyszczenia, takie jak metabolity komórkowe</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja dna okrzemek z próbek wody i tkanek

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Badanie okrzemek jest niezbędnym środkiem pomocniczym w praktyce kryminalistycznej, aby ustalić, czy zwłoki utonęły w wodzie i wywnioskować miejsce utonięcia. Badania okrzemek są również ważną treścią badawczą w dziedzinie środowiska i planktonu. Technologia testowania biologii molekularnej okrzemek, która koncentruje się na DNA okrzemek jako głównym obiekcie badań, jest nową metodą badania okrzemek. Ekstrakcja DNA okrzemek jest podstawą badań molekularnych okrzemek. Obecnie zestawy powszechnie stosowane do ekstrakcji DNA okrzemek są drogie, co zwiększa koszty prowadzenia powiązanych badań. Nasze laboratorium udoskonaliło ogólny zestaw do szybkiej ekstrakcji genomowego DNA z krwi pełnej i uzyskało zadowalający efekt ekstrakcji DNA okrzemek, zapewniając w ten sposób alternatywne, ekonomiczne i niedrogie rozwiązanie do ekstrakcji DNA oparte na szklanych kulkach do powiązanych badań. DNA okrzemek wyekstrahowane przy użyciu tego protokołu może zaspokoić wiele dalszych zastosowań, takich jak PCR i sekwencjonowanie.

Ponieważ roztwór DNA wyizolowany za pomocą obecnie stosowanej metody ekstrakcji zawiera wszystkie komponenty DNA z różnych źródeł obecnych w próbce, DNA otrzymane zgodnie z tym protokołem nie stanowiło wyjątku. Zatem roztwór DNA nie był jedynie roztworem genomowego DNA okrzemków. Startery umożliwiające specyficzną amplifikację fragmentów 18S rDNA okrzemków zostały wybrane na podstawie analizy literatury22,23,24. Startery zostały...

Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji DNA okrzemek przy użyciu zmodyfikowanego zestawu do ekstrakcji DNA powszechnie używanego.

Ekstrakcja DNA okrzemek z próbek wody i tkanek

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Nasze badania koncentrują się głównie na temacie utonięć. Chcieliśmy odpowiedzieć na pytanie, czy ciało znalezione w wodzie zmarło w wyniku utonięcia, a także odpowiedzieć na inne pytanie, gdzie osoba wpadła do wody. Oznacza to, że należy znać miejsce utonięcia.W porównaniu z innymi technologiami zapewniamy prosty, wygodny i ekonomiczny protokół ekstrakcji DNA okrzemek, który możemy lepiej wykorzystać w badaniach kryminalistycznych, zwłaszcza w podstawowej praktyce kryminalistycznej. Nasze laboratorium będzie dalej koncentrować się na problemach związanych z utonięciem w oparciu o wzór w wodzie, taki jak przyczyna śmierci, interwał pośmiertny i tak dalej. Co więcej, prowadzimy również badania z zakresu entomologii sądowej i niektórych szczególnych zjawisk w tropikalnej medycynie sądowej.Na początek weź 10 mililitrów próbki wody okrzemkowej do probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o masie 13,400 g przez pięć minut. Za pomocą pistoletu do pipet ostrożnie wyrzuć 9,8 mililitra supernatantu.Następnie przenieś 200 mikrolitrów wzbogaconej próbki wody okrzemkowej do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Następnie należy pobrać 0,5 grama tkanki brzegu płuc z utopionego ciała ludzkiego. Nożyczkami przetnij tkankę płucną, aż stanie się błotnista.W przypadku ekstrakcji DNA zarówno z próbek okrzemek, jak i płuc, najpierw dodaj szklane kulki do obu próbek. Po dokładnym wymieszaniu próbek dodaj 40 mikrolitrów proteinazy K do probówek. Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 200 mikrolitrów buforu wiążącego do obu probówek.Natychmiast wymieszać próbki za pomocą mieszalnika wirowego przez cztery minuty. Następnie umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie przenieś klarowny roztwór z kłaczkowym osadem do trzycentymetrowej kolumny absorpcyjnej wypełnionej matrycą krzemową.Odwirować kolumnę przy 8 000 g przez 30 sekund. Następnie wylej odpady z probówki zbiorczej i włóż kolumnę z powrotem do probówki zbiorczej. Teraz dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania inhibitora do kolumny i odwiruj przy 13, 400 g przez 30 sekund.Po wyrzuceniu cieczy odpadowej dodać 700 mikrolitrów buforu myjącego do kolumny i ponownie odwirować. Po wyrzuceniu cieczy odpadowej umieścić kolumnę absorpcyjną z powrotem w pustej probówce zbiorczej. Odwirować kolumnę przy 14 500 g przez dwie minuty, aby usunąć jak najwięcej buforu do płukania.Teraz wyjmij kolumnę i umieść ją w czystej probówce wirówkowej. Dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do środkowej części membrany absorpcyjnej. Odwirować kolumnę przy 13,400 g przez jedną minutę po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej.Przenieść roztwór otrzymany w probówce zbiorczej z powrotem do kolumny absorpcyjnej przed ponownym odwirowaniem. Przechowuj wymyte DNA okrzemek w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Elektroforeza w żelu agarozowym wykazała prążki DNA okrzemek od 250 do 500 pz zarówno w próbkach wody, jak i tkankach po amplifikacji PCR.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Przedstawiamy ulepszony protokół izolacji wysokocząsteczkowego DNA z hipersalinitycznych mat mikrobjalnych. Przed ekstrakcją i puryfikacją DNA komórki mikrobjalne są oddzielane od macierzy maty. Pozwala to na zwiększenie stężenia, poprawę jakości oraz zwiększenie rozmiaru DNA. Protokół ten może być stosowany również w przypadku innych próbek trudnych do obróbki.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Przedstawiono protokół zbierania i odkażania rdzeni wiecznej zmarzliny gleb i lodu. Brak egzogennych kolonii i DNA sugeruje, że wykryte mikroorganizmy reprezentują materiał, a nie zanieczyszczenie pochodzące z wiercenia lub przetwarzania.

Usuwanie materiałów egzogenicznych z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni w celu zbadania starożytnych zbiorowisk biologicznych znajdujących się w środku

Opisujemy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA

Najczęstsze analizy zawartości jelit makrobezkręgowców są wizualne. Wymagając intensywnej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej organizmów drapieżnych, pomijają zdobycz o miękkim ciele, a ze względu na silne rozdrobnienie zdobyczy są prawie niemożliwe dla niektórych organizmów, w tym obunogów. Zapewniamy szczegółowe, nowatorskie podejścia genetyczne do identyfikacji zdobyczy makrobezkręgowców w diecie obunogów.

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

Protokół wykrywa kluczowe geny obiegu metanu na mokradłach przybrzeżnych południowego Teksasu i wizualizuje ich rozmieszczenie przestrzenne, aby lepiej zrozumieć regulację metanu i jego wpływ na środowisko w tych dynamicznych ekosystemach.

Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Poznaj protokół ekstrakcji DNA okrzemek z próbek wody i tkanek płucnych w celach kryminalistycznych. Ta metoda pozwala określić przyczynę i miejsce utonięcia w praktyce sądowej.

Ekstrakcja DNA okrzemek z próbek wody i tkanek

Przeglądaj więcej filmów