Ekstrakcja DNA okrzemek z próbek wody i tkanek

Nasze badania koncentrują się głównie na temacie utonięć. Chcieliśmy odpowiedzieć na pytanie, czy ciało znalezione w wodzie zmarło w wyniku utonięcia, a także odpowiedzieć na inne pytanie, gdzie osoba wpadła do wody. Oznacza to, że należy znać miejsce utonięcia.

W porównaniu z innymi technologiami zapewniamy prosty, wygodny i ekonomiczny protokół ekstrakcji DNA okrzemek, który możemy lepiej wykorzystać w badaniach kryminalistycznych, zwłaszcza w podstawowej praktyce kryminalistycznej. Nasze laboratorium będzie dalej koncentrować się na problemach związanych z utonięciem w oparciu o wzór w wodzie, taki jak przyczyna śmierci, interwał pośmiertny i tak dalej. Co więcej, prowadzimy również badania z zakresu entomologii sądowej i niektórych szczególnych zjawisk w tropikalnej medycynie sądowej.

Na początek weź 10 mililitrów próbki wody okrzemkowej do probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o masie 13,400 g przez pięć minut. Za pomocą pistoletu do pipet ostrożnie wyrzuć 9,8 mililitra supernatantu.

Następnie przenieś 200 mikrolitrów wzbogaconej próbki wody okrzemkowej do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Następnie należy pobrać 0,5 grama tkanki brzegu płuc z utopionego ciała ludzkiego. Nożyczkami przetnij tkankę płucną, aż stanie się błotnista.

W przypadku ekstrakcji DNA zarówno z próbek okrzemek, jak i płuc, najpierw dodaj szklane kulki do obu próbek. Po dokładnym wymieszaniu próbek dodaj 40 mikrolitrów proteinazy K do probówek. Po 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodać 200 mikrolitrów buforu wiążącego do obu probówek.

Natychmiast wymieszać próbki za pomocą mieszalnika wirowego przez cztery minuty. Następnie umieść probówki w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie przenieś klarowny roztwór z kłaczkowym osadem do trzycentymetrowej kolumny absorpcyjnej wypełnionej matrycą krzemową.

Odwirować kolumnę przy 8 000 g przez 30 sekund. Następnie wylej odpady z probówki zbiorczej i włóż kolumnę z powrotem do probówki zbiorczej. Teraz dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania inhibitora do kolumny i odwiruj przy 13, 400 g przez 30 sekund.

Po wyrzuceniu cieczy odpadowej dodać 700 mikrolitrów buforu myjącego do kolumny i ponownie odwirować. Po wyrzuceniu cieczy odpadowej umieścić kolumnę absorpcyjną z powrotem w pustej probówce zbiorczej. Odwirować kolumnę przy 14 500 g przez dwie minuty, aby usunąć jak najwięcej buforu do płukania.

Teraz wyjmij kolumnę i umieść ją w czystej probówce wirówkowej. Dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do środkowej części membrany absorpcyjnej. Odwirować kolumnę przy 13,400 g przez jedną minutę po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej.

Przenieść roztwór otrzymany w probówce zbiorczej z powrotem do kolumny absorpcyjnej przed ponownym odwirowaniem. Przechowuj wymyte DNA okrzemek w temperaturze od 2 do 8 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Elektroforeza w żelu agarozowym wykazała prążki DNA okrzemek od 250 do 500 pz zarówno w próbkach wody, jak i tkankach po amplifikacji PCR.