Name: Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj protokół kriokonserwacji ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych. Metoda określa optymalne stadium eksponencjalne, poprawia przeżywalność i wspiera terapie zastępcze siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81970816) dla Mei Jiang; Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (82201223) dla Xinyue Zhu; oraz Plan Działań na rzecz Innowacji Naukowych i Technologicznych Szanghajskiej Komisji Nauki i Technologii (2014090067000) dla Haiyun Liu.

1. Dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki RPE zgodnie z wcześniejszym opisem17,22. 
	UWAGA: Wszystkie komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez cały czas trwania protokołów.</li>
	<li>Przygotować wymaganą ilość PBS i pożywki hodowlanej w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C i umieścić odczynnik do dysocjacji komórek w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyrzucić roztwór hodowlany i umyć płytki dwukrotnie 1 ml podgrzanego PBS na studzienkę.</li>
	<li>Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek do płytek 6-dołkowych i trawić komórki w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po inkubacji obserwuj pod mikroskopem komórki, które kurczą się i błyszczą na krawędziach, aby potwierdzić zakończenie trawienia. 
	UWAGA: Dysocjacja na bazie trypsyny nie jest zalecana, ponieważ daje niską żywotność komórek.</li>
	<li>Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy pipetą o pojemności 1 ml w celu dysocjacji komórek i rozcieńczyć zawiesinę komórek podgrzaną pożywką hodowlaną (bez Y-27632) w stosunku 1:10. Następnie odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w temperaturze 250 × g.</li>
	<li>Szybko wylej supernatant po odwirowaniu, delikatnie zawieś ponownie osad komórkowy w 2 ml pożywki hodowlanej i ponownie zawieś komórki 10-15x za pomocą pipety.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka do komórek 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i obliczyć liczbę komórek. 
	UWAGA: Zawiesina jednokomórkowa jest niezbędna do dokładnego zliczania komórek i jednolitej gęstości wysiewu komórek po rozmrożeniu.</li>
</ol>
2. Określenie optymalnego stadium komórki do kriokonserwacji
UWAGA: Ponieważ stan komórki różni się między metodami różnicowania a liniami komórkowymi, faza wykładnicza komórek RPE hodowanych w różnych laboratoriach powinna być określona przed zamrożeniem.
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną fiolkę roztworu matrycy błony podstawnej na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć matrycę w 12 ml zimnego DMEM/F-12 i dobrze wymieszać. Dodać jedno szkiełko nakrywkowe do dołka i pokryć każde zagłębienie 24-dołkowej płytki 0,25 ml rozcieńczonego roztworu. Przed użyciem inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C i zasysać roztwór powlekający tuż przed posiewem komórek. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące podwielokrotnej objętości są specyficzne dla partii w oparciu o stężenie białka i znajdują się w karcie specyfikacji produktu.</li>
	<li>Wysiewać pojedyncze komórki RPE z kroku 1.7 na szkiełkach nakrywkowych pokrytych matrycą błony podstawnej o gęstości 105/cm2 w 1 ml pożywki hodowlanej. Odświeżaj pożywkę co 2-3 dni.</li>
	<li>We wskazanych punktach czasowych (1, 3, 5, 7 i 11 dni po pasażu) inkubować komórki RPE z 10 μM EdU w pożywce przez 24 godziny. Utrwalić, przeniknąć i wybarwić komórki koktajlem reakcyjnym zgodnie z opisem w instrukcji, aby wykryć włączony EdU.</li>
	<li>Uchwyć obrazy z pięciu losowych pól pod mikroskopem fluorescencyjnym i oblicz procent komórek EdU-dodatnich. Wykreślić odpowiednie krzywe proporcji w czasie dodatnim EdU, aby wygenerować krzywą wzrostu. Następnie określ okno zamrażania lub fazę wykładniczą dla każdej linii komórkowej zgodnie z krzywą wzrostu. 
	UWAGA: Przywrócona sześciokątna morfologia komórek wskazuje, że komórki wychodzą z fazy wykładniczej.</li>
</ol>
3. Kriokonserwacja
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z krokami 1.1-1.7, z wyjątkiem tego, że czas trawienia skraca się do 5 minut, odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy masie 250 × g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez szybkie zalanie po odwirowaniu i delikatnie zawiesić osad komórkowy w pożywce do kriokonserwacji do gęstości 2 × 106 komórek/ml i przenieść 1 ml zawiesiny komórek do fiolek kriogenicznych o pojemności 1,2 ml.</li>
	<li>Natychmiast umieścić fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania, zamrozić w temperaturze -80 °C przez noc, aby osiągnąć szybkość chłodzenia -1 °C/min, a następnie przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
4. Rozmrażanie
<ol>
	<li>Ogrzać pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i napełnić 10 ml podgrzanej pożywki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Szybko rozmrozić fiolki kriogeniczne pobrane bezpośrednio z magazynu ciekłego azotu za pomocą automatycznego systemu rozmrażania.</li>
	<li>Wlej 0,5-1 ml podgrzanej pożywki hodowlanej do fiolki kriogenicznej, aby upewnić się, że zamrożone komórki stopniowo przystosowują się do nowego środowiska. Następnie przenieść 1,5-2 ml zawiesiny komórek do 10 ml pożywki hodowlanej w probówce o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 250 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez szybkie zalanie po odwirowaniu, ponownie zawiesić osad w 2 ml podgrzanej pożywki hodowlanej i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru w celu określenia wskaźników odzysku i przeżycia przy użyciu standardowego wykluczenia błękitu trypanowego (0,4% barwienie błękitem trypanowym).</li>
	<li>Hodować komórki na powierzchniach pokrytych matrycą błony podstawnej w gęstości10-5 żywotnych komórek/cm2 w pożywce hodowlanej uzupełnionej Y-27632 (końcowe stężenie: 10 μM). Usuń Y-27632 po 24 godzinach.</li>
	<li>Aby określić szybkość przyczepiania, ponownie oddysocjuj komórki i policz liczbę komórek 24 godziny po rozmrożeniu.</li>
</ol>
5. Walidacja optymalnej fazy zamrażania
<ol>
	<li>Aby zweryfikować optymalną fazę zamrażania określoną w kroku 2.4, należy rozmrozić komórki RPE zamrożone w różnych punktach czasowych i hodować je przez 28 dni. Zbierz komórki do analizy qPCR i immunostainingu, aby ocenić ekspresję markerów RPE, jak opisano wcześniej17.</li>
</ol>

Advancing Cryostorage of Human Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells

<ol><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).</li>
<li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthamology%22%5BJournal%5D)">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li>
<li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium%3A+Development%2C+injury+responses%2C+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).</li>
<li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cell+transplantation%2C+biomaterials%2C+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li>
<li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li>
<li>Da Cruz,, L,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Li, Q. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305(2021).</li>
<li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li>
<li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems%3A+an+opinion+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731(2022).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+%28Neuro-2a%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431(2019).</li>
<li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).</li>
<li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off+the+shelf+cellular+therapeutics%3A+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454(2022).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium%3A+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li>
<li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291(2017).</li>
<li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274(2017).</li>
<li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation%3A+a+focus+on+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym badaniu opisano skuteczny protokół zamrażania i rozmrażania komórek RPE pochodzących z hESC do celów badawczych i klinicznych. W przeciwieństwie do unieśmiertelnionej linii komórkowej RPE, ARPE-19, komórki RPE o prawidłowym charakterystycznym fenotypie i funkcji nabłonka, takie jak komórki RPE pochodzące z komórek macierzystych, są bardziej wrażliwe na krioprezerwację. Mniej niż 32% komórek pozostało po 24 godzinach od rozmrożenia, jeśli nie zostało odpowiednio zachowane17. Czas kriok...

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to pigmentowana monowarstwa komórek niezbędna do utrzymania prawidłowej funkcji siatkówki1. Dysfunkcja i śmierć RPE są ściśle związane z wieloma chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki, w tym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem, barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki i chorobą Stargardta2,3. Terapia zastępcza RPE jest jednym z najbardziej obiecujących schematów leczenia tych chorób4,5,6,7. Stabilne zaopatrzenie w komórki RPE dawcy ma zasadnicze znaczenie dla terapii komórkowej. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) pochodzące z komórek macierzystych są idealnym źródłem komórek do terapii komórkowej, ponieważ naśladują funkcję pierwotnych komórek RPE i mogą wytwarzać teoretycznie nieograniczoną podaż8. Proces różnicowania jest jednak pracochłonny, a okres trwałości uzyskanych komórek RPE jest stosunkowo krótki ze względu na późniejsze przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Dlatego kriokonserwacja komórek RPE pochodzących z hESC jest niezbędnym krokiem wymaganym do długoterminowego przechowywania i dystrybucji na żądanie9.
Uszkodzenia komórkowe wywołane krioprezerwacją mogą nieumyślnie zagrozić skuteczności terapeutycznej10,11. Dlatego ostatnie badania nad krioprezerwacją sugerują, że optymalne warunki przechowywania kriogenicznego powinny być określone podczas projektowania terapii komórkowych12. Skuteczna kriokonserwacja gwarantuje wydajną regenerację komórek, wysoką żywotność i przywrócenie funkcji komórek po cyklu zamrażania i rozmrażania. Jednak wcześniejsze badania nad krioprezerwacją przylegających monowarstw komórek ssaków wykazały bardzo zmienne (35%-95%) wskaźniki przeżywalności po rozmrożeniu13,14,15. Wiele czynników znacząco wpływa na wyniki kriokonserwacji, szczególnie w fazie zamrażania16,17. Ostatnie badania wykazały, że komórki RPE zamrożone w różnych punktach czasowych wykazywały różną regenerację po rozmrożeniu17. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą brakuje badań dotyczących określenia optymalnego okna czasowego zamrażania dla komórek macierzystych RPE. W różnych badaniach komórki zostały zamrożone na różnych etapach: niektóre komórki zostały zamrożone wkrótce po pasażowaniu lub przed konfluencją lub pigmentacją8,15,18, podczas gdy inne zostały zamrożone w innych punktach czasowych9,19,20,21. Ponadto nie ma jednoznacznych dowodów na to, czy faza lub etap komórek RPE używanych do kriokonserwacji wpływa na funkcję RPE po rozmrożeniu. W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy po raz pierwszy, że wykładnicza faza wzrostu komórek (P2D5) jest najlepszym etapem kriokonserwacji komórek RPE pochodzących z hESC pod względem żywotności komórek oraz odzyskiwania właściwości i funkcji komórkowych17.
Metoda tutaj ustanowiona ma na celu kriokonserwację RPE pochodzącego z hESC na optymalnym etapie, aby osiągnąć najlepszą konserwację pod względem żywotności i funkcji komórki po rozmrożeniu. Korzystając z testu znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) w celu wykrycia wykładniczej fazy syntezy DNA przed krioprezerwacją, rozmrożone komórki RPE wykazywały >80% żywotność i szybkość przyłączania, ekspresję genu specyficzną dla RPE, spolaryzowaną morfologię komórek, wydzielanie czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego, odpowiednią odporność przeznabłonkową i zdolność fagocytarną8,17,22. Chociaż protokół ten koncentruje się na komórkach RPE pochodzących z hESC i nie wszystkie komórki terapeutyczne są jednakowo krioprezerwowane, strategia zamrażania w fazie wykładniczej może być stosowana do wielu innych komórek terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, Alexa Fluor 488 Barwnik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Biolife Solutions</td><td>07930</td><td>pożywka do krioprezerwacji #1</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>Genxin</td><td>Selcell</td><td>YB050050</td><td>pożywka do krioprezerwacji #2</td></tr><tr><td>Ludzkie embrionalne komórki macierzyste</td><td>dostarczone przez Wicell, USA</td><td>Linia</td><td></td>komórkowa H9</tr><tr><td>Matrigel, Matrix z kwalifikacją hESC Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>matryca błony podstawnej</td></tr><tr><td>ThawSTAR CFT2 Zautomatyzowany system rozmrażania komórek</td><td>BioLife Solutions</td><td>AST-601</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Niebieski roztwór 0,4%</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TryPLE Select</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td></td><td>odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>12563029 XVIVO-10 podłoże</td><td>Lonza</td><td>BEBP04-743Q</td><td>Pożywka hodowlana RPE</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) są doskonałym źródłem komórek do terapii zastępczej u osób z chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki; jednak badania nad stabilnym i bezpiecznym bankowaniem tych komórek terapeutycznych są rzadkie. Bardzo zmienna żywotność komórek i funkcjonalna regeneracja komórek RPE po kriokonserwacji to najczęściej spotykane problemy. W niniejszym protokole naszym celem było osiągnięcie najlepszego wskaźnika regeneracji komórek po rozmrożeniu poprzez wybór optymalnej fazy komórkowej do zamrożenia w oparciu o pierwotne warunki eksperymentalne. Komórki zamrożono w fazie wykładniczej określonej za pomocą testu znakowania 5-etynylo-2′-deoksyurydyny, co poprawiło żywotność komórek i szybkość regeneracji po rozmrożeniu. Stabilne i funkcjonalne komórki uzyskano wkrótce po rozmrożeniu, niezależnie od długiego procesu różnicowania. Opisane tutaj metody pozwalają na proste, wydajne i niedrogie przechowywanie i rozmrażanie komórek RPE pochodzących z hESC. Chociaż protokół ten koncentruje się na komórkach RPE, ta strategia zamrażania może być stosowana do wielu innych typów zróżnicowanych komórek.

W tym przypadku komórki RPE pochodzące z hESC w dniu P1D35 zostały spasażowane i wysiane z gęstością 105/cm2. W ciągu tygodnia od wysiania, podczas fazy adaptacyjnej (około 2 dni), utracono charakterystyczną heksagonalną morfologię oraz pigmentację. Komórki RPE stopniowo odzyskały morfologię heksagonalną w fazie wykładniczej (około 5 dni, Rysunek 1A) i weszły w fazę spowolnienia (około 6 dni), wykazując bardziej poligonalną morfologię. Jeśli hodowla komórek była kontynu...

To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Nasze laboratorium ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmu molekularnego chorób siatkówki z naciskiem na niezaspokojone potrzeby medyczne pacjentów. Naszym celem jest opracowanie dla nich skutecznych metod leczenia, takich jak terapie oparte na komórkach macierzystych. Kriokonserwacja komórek RP pochodzących z komórek macierzystych jest ważnym krokiem w terapii zastępczej RP.Obecnie komórki są zamrażane na różnych etapach, co skutkuje bardzo zmiennymi wskaźnikami przeżywalności podczas siewu. Jest to potrzebne do określenia optymalnego stopnia zaawansowania komórek do zamrażania tych komórek. Nasz protokół zapewnia proste, wydajne i niedrogie sposoby zamrażania komórek RP poprzez określenie fazy wykładniczej komórek RP do zamrożenia.Jest mniej zależny od metod różnicowania lub linii komórkowych. Na początek rozcieńczyć fiolkę z rozmrożoną zimną matrycą membrany podstawnej z 12 mililitrami DMEM/F12. Dobrze wymieszaj zawiesinę.Dodaj jedno szkiełko nakrywkowe do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Następnie odpipetować 250 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu matrycowego do każdej studzienki. Odrzucić pożywkę hodowlaną z hodowanych płytek komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z hESC.Umyj płytki dwa razy jednym mililitrem podgrzanego PBS na studzienkę. Następnie dodaj 0,5 mililitra odczynnika do dysocjacji komórek do dołków płytek hodowlanych i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby rozpocząć trawienie. Po inkubacji obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić koniec trawienia.Teraz za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie odpipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół 10 razy. Dodać podgrzaną pożywkę hodowlaną, aby rozcieńczyć zawiesinę. Następnie odwiruj go w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Wylać supernatant z probówki odwirowej. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Użyj pipety, aby wymieszać komórki od 10 do 15 razy.Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Następnie policz komórki nabłonka barwnikowego siatkówki. Zassać roztwór powlekający przed posiewem.Następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do każdej studzienki i zasiej komórki na szkiełkach nakrywkowych. Po włączeniu i zabarwieniu EdU uchwyć obrazy pięciu losowych pól za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Oblicz procent komórek EdU-dodatnich.Następnie wykreśl odpowiednie krzywe proporcji w czasie, aby wygenerować krzywą wzrostu. Na koniec określ okno zamrażania od fazy wykładniczej dla każdej linii komórkowej. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki początkowo utraciły swoją charakterystyczną sześciokątną morfologię, ale później odzyskały ją w wykładniczej fazie wzrostu.Kiedy komórki były hodowane przez dodatkowy tydzień, proliferacja komórek zmniejszyła się. Test proliferacji EdU potwierdził, że komórki P2 dnia piątego wykazywały wyższy wskaźnik proliferacji, podczas gdy komórki P2 dnia 11 weszły w fazę spowolnienia. Na początek należy zdysocjować komórki nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzące z hESC.Przygotować zawiesinę komórek, a następnie policzyć komórki. Teraz odwiruj komórki w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wylać supernatant.Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w podłożu kriokonserwującym. Następnie przenieś jeden mililitr zawiesiny komórek do 1,2-mililitrowej fiolki kriogenicznej. Umieść fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania i zamrażaj przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Aby rozmrozić zamrożone fiolki, najpierw podgrzej pożywkę w metalowych kulkach podgrzanych do 37 stopni Celsjusza. Napełnij 10 mililitrów podgrzanej pożywki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki.Teraz wyjmij fiolki kriogeniczne z ciekłego azotu i umieść je w automatycznym systemie rozmrażania w celu szybkiego rozmrożenia. Wrzuć od 0,5 do jednego mililitra podgrzanej pożywki hodowlanej do fiolki kriogenicznej, aby zapewnić stopniową adaptację komórek. Następnie odpipetować od 1,5 do dwóch mililitrów zawiesiny ogniw do 15-mililitrowej probówki z medium.Odwirować komórki w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odrzucić supernatant. Zawiesić osad w dwóch mililitrach ciepłego podłoża.Załaduj komórki do hemocytometru i policz je, aby określić wskaźniki powrotu do zdrowia i przeżycia. Hoduj rozmrożone komórki na płytkach pokrytych błoną podstawną w pożywce z Y27632. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki, które zostały zamrożone w piątym dniu w fazie wykładniczej, wykazywały wyższy wskaźnik przyczepiania się po rozmrożeniu.W stosunku do ich charakterystycznej sześciokątnej morfologii, komórki zamrożone w innych punktach czasowych miały fenotyp fibroblastyczny. Komórki P2 w piątym dniu wykazywały wyższą ekspresję i bardziej prawidłowo zlokalizowane markery komórkowe 28 dni po rozmrożeniu. Zauważono, że różne podłoża do krioprezerwacji działały równie dobrze w osiąganiu wysokiej żywotności komórek i przyczepiania po rozmrożeniu.

cryopreservation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Poznaj protokół kriokonserwacji ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych. Metoda określa optymalne stadium eksponencjalne, poprawia przeżywalność i wspiera terapie zastępcze siatkówki.

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium (Wideo) | JoVE Journal

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

Przeglądaj więcej filmów