Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium
November 3rd, 2023
To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.
Nasze laboratorium ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmu molekularnego chorób siatkówki z naciskiem na niezaspokojone potrzeby medyczne pacjentów. Naszym celem jest opracowanie dla nich skutecznych metod leczenia, takich jak terapie oparte na komórkach macierzystych. Kriokonserwacja komórek RP pochodzących z komórek macierzystych jest ważnym krokiem w terapii zastępczej RP.
Obecnie komórki są zamrażane na różnych etapach, co skutkuje bardzo zmiennymi wskaźnikami przeżywalności podczas siewu. Jest to potrzebne do określenia optymalnego stopnia zaawansowania komórek do zamrażania tych komórek. Nasz protokół zapewnia proste, wydajne i niedrogie sposoby zamrażania komórek RP poprzez określenie fazy wykładniczej komórek RP do zamrożenia.
Jest mniej zależny od metod różnicowania lub linii komórkowych. Na początek rozcieńczyć fiolkę z rozmrożoną zimną matrycą membrany podstawnej z 12 mililitrami DMEM/F12. Dobrze wymieszaj zawiesinę.
Dodaj jedno szkiełko nakrywkowe do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Następnie odpipetować 250 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu matrycowego do każdej studzienki. Odrzucić pożywkę hodowlaną z hodowanych płytek komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z hESC.
Umyj płytki dwa razy jednym mililitrem podgrzanego PBS na studzienkę. Następnie dodaj 0,5 mililitra odczynnika do dysocjacji komórek do dołków płytek hodowlanych i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby rozpocząć trawienie. Po inkubacji obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić koniec trawienia.
Teraz za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie odpipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół 10 razy. Dodać podgrzaną pożywkę hodowlaną, aby rozcieńczyć zawiesinę. Następnie odwiruj go w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Wylać supernatant z probówki odwirowej. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Użyj pipety, aby wymieszać komórki od 10 do 15 razy.
Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Następnie policz komórki nabłonka barwnikowego siatkówki. Zassać roztwór powlekający przed posiewem.
Następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do każdej studzienki i zasiej komórki na szkiełkach nakrywkowych. Po włączeniu i zabarwieniu EdU uchwyć obrazy pięciu losowych pól za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Oblicz procent komórek EdU-dodatnich.
Następnie wykreśl odpowiednie krzywe proporcji w czasie, aby wygenerować krzywą wzrostu. Na koniec określ okno zamrażania od fazy wykładniczej dla każdej linii komórkowej. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki początkowo utraciły swoją charakterystyczną sześciokątną morfologię, ale później odzyskały ją w wykładniczej fazie wzrostu.
Kiedy komórki były hodowane przez dodatkowy tydzień, proliferacja komórek zmniejszyła się. Test proliferacji EdU potwierdził, że komórki P2 dnia piątego wykazywały wyższy wskaźnik proliferacji, podczas gdy komórki P2 dnia 11 weszły w fazę spowolnienia. Na początek należy zdysocjować komórki nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzące z hESC.
Przygotować zawiesinę komórek, a następnie policzyć komórki. Teraz odwiruj komórki w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wylać supernatant.
Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w podłożu kriokonserwującym. Następnie przenieś jeden mililitr zawiesiny komórek do 1,2-mililitrowej fiolki kriogenicznej. Umieść fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania i zamrażaj przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Aby rozmrozić zamrożone fiolki, najpierw podgrzej pożywkę w metalowych kulkach podgrzanych do 37 stopni Celsjusza. Napełnij 10 mililitrów podgrzanej pożywki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki.
Teraz wyjmij fiolki kriogeniczne z ciekłego azotu i umieść je w automatycznym systemie rozmrażania w celu szybkiego rozmrożenia. Wrzuć od 0,5 do jednego mililitra podgrzanej pożywki hodowlanej do fiolki kriogenicznej, aby zapewnić stopniową adaptację komórek. Następnie odpipetować od 1,5 do dwóch mililitrów zawiesiny ogniw do 15-mililitrowej probówki z medium.
Odwirować komórki w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odrzucić supernatant. Zawiesić osad w dwóch mililitrach ciepłego podłoża.
Załaduj komórki do hemocytometru i policz je, aby określić wskaźniki powrotu do zdrowia i przeżycia. Hoduj rozmrożone komórki na płytkach pokrytych błoną podstawną w pożywce z Y27632. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki, które zostały zamrożone w piątym dniu w fazie wykładniczej, wykazywały wyższy wskaźnik przyczepiania się po rozmrożeniu.
W stosunku do ich charakterystycznej sześciokątnej morfologii, komórki zamrożone w innych punktach czasowych miały fenotyp fibroblastyczny. Komórki P2 w piątym dniu wykazywały wyższą ekspresję i bardziej prawidłowo zlokalizowane markery komórkowe 28 dni po rozmrożeniu. Zauważono, że różne podłoża do krioprezerwacji działały równie dobrze w osiąganiu wysokiej żywotności komórek i przyczepiania po rozmrożeniu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie dostarcza szczegółowego protokołu dotyczącego efektywnego krioprezerwacji ludzkich komórek nabłonkowych pigmentowych siatkówki pochodzących od komórek macierzystych. Protokół ma na celu zwiększenie wskaźników przeżywalności tych komórek podczas zamrażania, co jest kluczowe dla terapii zastępczych siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad siatkówką
Tło
- Choroby siatkówki stanowią znaczne wyzwania medyczne.
- Terapie oparte na komórkach macierzystych są rozwijane w celu leczenia.
- Krioprezerwacja jest niezbędna dla żywotności komórek nabłonkowych pigmentowych siatkówki pochodzących od komórek macierzystych.
- Obecne metody zamrażania dają różne wskaźniki przeżywalności.
Cel badania
- Określenie optymalnego etapu komórek do zamrażania komórek nabłonkowych pigmentowych siatkówki.
- Dostarczenie prostego i efektywnego protokołu krioprezerwacji.
- Poprawa spójności wskaźników przeżywalności komórek po rozmrożeniu.
Zastosowane metody
- Ocena fazy eksponencjalnej komórek RP na potrzeby zamrażania.
- Opracowanie opłacalnego protokołu krioprezerwacji.
- Ocena wskaźników przeżywalności komórek po różnych etapach zamrażania.
- Porównanie wyników z istniejącymi metodami krioprezerwacji.
Główne wyniki
- Nowy protokół znacząco poprawia wskaźniki przeżywalności komórek RP.
- Zidentyfikowano optymalny etap komórek do efektywnego zamrażania.
- Zostały zweryfikowane opłacalne metody w porównaniu z tradycyjnymi podejściami.
- Wyniki potwierdzają wykonalność terapii opartych na komórkach macierzystych dla chorób siatkówki.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę krioprezerwacji komórek RP.
- Poprawa wskaźników przeżywalności może zwiększyć skuteczność terapii siatkówki.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w zastosowaniach klinicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Consistent cryopreservation of hESC-derived retinal pigment epithelial (RPE) cells addresses a critical bottleneck in cell therapy manufacturing for retinal degenerative diseases. Optimizing the freezing stage using quantitative proliferation assays enhances post-thaw viability, supporting scalable cell banking and reliable downstream applications. This protocol enables standardized, reproducible preservation of functional RPE cells, facilitating translational continuity and risk-adjusted advancement in regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Quantitative EdU labeling enables precise identification of the exponential growth phase for optimal cryopreservation.
- Improved post-thaw viability supports functional validation of RPE cell identity and phenotype.
- Standardized cell banking reduces biological variability, enhancing predictive confidence in downstream assays.
Screening & Assay Development
- Consistent recovery of viable RPE cells enables reliable preparation of disease-relevant cell systems for screening.
- Protocol supports reproducibility and scalability for high-throughput compound evaluation.
- Validated freezing window ensures assay standardization across batches and cell lines.
Translational & Preclinical Research
- Stable, functional RPE cells post-thaw facilitate continuity from discovery to preclinical validation.
- Protocol adaptability across differentiation methods and cell lines supports broader translational applications.
- Enables risk-adjusted decision-making for advancing cell therapy candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This cryopreservation protocol integrates into the cell therapy workflow from early discovery through preclinical development, supporting robust cell banking and functional recovery for downstream applications.
- Discovery Biology: EdU-based growth phase determination de-risks cell banking by ensuring optimal viability and phenotype retention.
- Screening: Standardized post-thaw recovery enables reproducible assay setup and compound testing.
- Analytics: Quantitative cell counting and viability assessment provide actionable metrics for process optimization.
- Translational Research: Functional RPE recovery post-thaw supports preclinical model development and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Protocol flexibility allows adaptation to other differentiated cell types, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhanced predictive confidence and target validation through standardized cell preservation.
- Operational Value: Improved reproducibility, scalability, and cost-efficiency in cell banking workflows.
- Strategic Value: Supports robust go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in cell therapy programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, EdU proliferation assays, and cryopreservation techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy, automated thawing systems, and standard cell banking infrastructure.
- Cross-team standardization of freezing window determination is essential for reproducibility.
- Protocol is adaptable across hESC-derived RPE lines and differentiation methods.
- Viability and phenotype recovery may vary with cell type and cryopreservation medium.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:07
Human Embryonic Stem Cell‐Derived Retinal Pigment Epithelial Cell Dissociation and Optimal Cryopreservation Stage Determination
4:11
Preservation of Human Embryonic Stem Cell‐Derived Retinal Pigment Epithelial Cells with Optimized Cryopreservation
