Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Wprowadzenie.Osteoklasty to wielojądrowy typ komórek powszechnie używany przez naukowców w takich dziedzinach, jak badania nad chorobami kości, badania nad rakiem, inżynieria tkankowa i badania nad endoprotezami. Niemniej jednak różnicowanie osteoklastów może być trudne, ponieważ konieczna jest fuzja prekursorów. Ponadto różnicowanie ludzkich osteoklastów od IPSC wymaga zastosowania różnych czynników biologicznych w odpowiednim czasie.

Jeśli chodzi o ludzkie komórki pierwotne. CD34 + komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są obecnie najczęściej stosowanym typem komórek do różnicowania w osteoklasty. Podejście to jest jednak ograniczone przez niejednorodność w populacji CD34+ i ich ograniczoną zdolność do rozbudowy.

Ludzkie IPSC stanowią alternatywne źródło osteoklastów. Ponieważ można je rozmnażać w nieskończoność, pozwalają na rozbudowę i zwiększenie produkcji osteoklastów. Pozwala to na różnicowanie dużej liczby osteoklastów, co ułatwia badania osteoklastów.

Tutaj nasz postdoc Alexander Blumke i doktorantka Jessica Simon demonstrują różnicowanie osteoklastów od ludzkich IPSC Passaging IPSC. Rozpocznij pasowanie IPSC, usuwając zróżnicowane regiony lub regiony z wieloma martwymi agregatami IPSC pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą końcówki pipety P-10 lub P-20 lub skrobaka do komórek. Zróżnicowane regiony będą wydawać się gęstsze i bielsze.

Umyj odłączone komórki starym podłożem, a następnie dwukrotnie zmyj wszelkie pozostałe oderwane komórki za pomocą PBS. Następnie dodaj do studzienki jeden mililitr pięciu jednostek na mililitr dypazy na studzienkę. Krawędzie kolonii odrywające się od naczynia można zaobserwować pod mikroskopem stereoskopowym po trzech do pięciu minutach.

Ostrożnie usunąć dypazę i dodać jeden mililitr DMEM/F-12 z 15-milimolowym HEPES. Użyj narzędzia do pasażowania komórek macierzystych lub jednorazowego podnośnika komórkowego, aby pociąć agregaty na małe rozmiary. Przenieś pożywkę z kruszywami do 15-mililitrowej stożkowej rurki za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej lub P-1000 z końcówką o szerokim otworze.

Przepłucz studzienkę DMEM/F-12 i przenieś pożywkę do 15-mililitrowej probówki. Odwirować pokrojone agregaty IPSC w temperaturze 200 G przez trzy minuty. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać dwa mililitry pożywki bez surowicy ludzkiej IPSC w celu usunięcia i ponownego zawieszenia IPSC za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej lub P-1000 z końcówkami o szerokim otworze.

Odessać resztki ekstraktu z błony podstawnej z wstępnie pokrytych płytek dołkowych i dodać jeden mililitr pożywki bez ludzkiej surowicy IPSC do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Przenieś IPSC do nowych studzienek na płytce sześciodołkowej, tak aby końcowa objętość wynosiła dwa mililitry ludzkiego podłoża bez surowicy IPSC na studzienkę za pomocą P-1000 z końcówkami o szerokim otworze. W zależności od linii IPSC, współczynniki podziału muszą być zoptymalizowane.

W tym przypadku zastosowano podział 1:6. Zakręć płytką dołka, aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce po przeniesieniu agregatów. Indukcja ciała zarodka.

Odessać starą pożywkę z kultur IPSC i przepłukać studzienki DPBS. Dodaj pół mililitra podgrzanego do temperatury pokojowej do każdego dołka sześciodołkowej płytki i zakręć naczyniem hodowlanym, aby pokryć całą powierzchnię studzienki. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37 stopni C przez pięć do ośmiu minut.

Wyjąć naczynie z inkubatora, odessać roztwór i dodać pożywkę pierwszego stopnia do studzienek składających się z 50 nanogramów na mililitr ludzkiego białka morfogennego kości 4, 50 nanogramów na mililitr ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 165, 20 nanogramów na mililitr ludzkiego czynnika komórek macierzystych i 10 mikromolowego inhibitora ROCK Y-27632. Delikatnie odłącz komórki, spłukując studzienkę pożywką pierwszego stopnia. Przeciągnij komórki do stożkowej rurki.

Dodaj nową pożywkę pierwszego stopnia do studzienek i odłącz pozostałe komórki za pomocą skrobaka do komórek. Po przeniesieniu wszystkich komórek do probówki, odwirować przy 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Odessać i ponownie zawiesić komórki w sumie dwóch mililitrach wstępnie zbalansowanego podłoża pierwszego stopnia.

Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego urządzenia do liczenia komórek Wysiewaj 12 500 komórek na dołek na okrągłodennej 96-dołkowej płytce o ultraniskim mocowaniu w 100 mikrolitrach pożywki pierwszego stopnia. Pod mikroskopem komórki pojawią się dyfuzyjnie w całym roztworze. Odwirować 96-dołkowe płytki przez trzy minuty przy stężeniu 100 G Po odwirowaniu komórki powinny zacząć przypominać sferoidy, gdy są oglądane pod mikroskopem.

Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni C. Zmień połowę pożywki pierwszego dnia i drugiego dnia na pożywkę pierwszego etapu. Użyj pipety wielokanałowej, aby wylać starą pożywkę na szalkę Petriego.

Po wyrzuceniu pożywki z płytki 96-dołkowej sprawdź, czy nie ma EB, które mogły zostać przypadkowo usunięte. Przenieść przypadkowo usunięte EB na szalce Petriego z powrotem za pomocą pipety P-1000 Różnicowanie krwiotwórcze. Wstępnie napełnij studzienki sześciodołkowej płytką trzema mililitrami pożywki drugiego stopnia, do której dodaje się dwumilimolową ultraglutaminę, 55-mikromolowy beta-merkaptoetanol, 25 nanogramów na mililitr, ludzką interleukinę-3 i 100 nanogramów na mililitr ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów.

Używając P-1000 i końcówki o szerokim otworze, przenieś osiem EB do każdego dołka sześciodołkowej płytki. Po przeniesieniu sprawdź wzrokowo pod mikroskopem stereoskopowym, czy w każdym dołku znajduje się osiem EB. Po pięciu do siedmiu dniach powinna stać się widoczna pływająca populacja komórek składająca się z komórek krwiotwórczych.

Okres różnicowania układu krwiotwórczego może być zróżnicowany, począwszy od siedmiu dni. Różnicowanie przez 10 dni wykazało populację krwiotwórczą składającą się z dużych subpopulacji CD45+CD14+i CD11b+. Po pięciu dniach leczenia pożywką drugiego etapu należy przeprowadzić zmianę pożywki, ostrożnie usuwając starą pożywkę i dozując ją do 50-mililitrowej stożkowej tuby.

Natychmiast dodaj jeden mililitr nowego podłoża drugiego stopnia do studzienek. Aby uratować pływające komórki krwiotwórcze, które mogą być już obecne, wirować probówkę ze starą pożywką o stężeniu 300 G przez pięć minut. Dodać nową pożywkę drugiego stopnia do probówki i ponownie zawiesić w celu odłączenia komórek, które mogły zostać przeniesione za pomocą starej pożywki.

Dodaj dwa mililitry nowej pożywki drugiego stopnia z zapisanymi komórkami do każdej studzienki, która wcześniej była wypełniona jednym mililitrem pożywki drugiego etapu. W 10 dniu różnicowania układu krwiotwórczego pływające komórki krwiotwórcze są zbierane poprzez zebranie ich do 50-mililitrowej stożkowej probówki i mogą być albo zamrożone z powrotem za pomocą 10% DMSO, 50% FBS i 40% pożywki, albo natychmiast wykorzystane do dalszego różnicowania komórek w osteoklasty. Dojrzewanie M-płynu mózgowo-rdzeniowego i różnicowanie osteoklastów.

Komórki nasienne o powierzchni 200 000 komórek na centymetr kwadratowy i traktowane przez trzy dni alfa MEM uzupełnionym 10% FBS i 50 nanogramami na mililitr M-CSF. W celu przeprowadzenia testów funkcjonalnych lub obrazowania, należy odłączyć dojrzałe komórki MCSF, przemłukując je P-1000 z końcówką o szerokim otworze. Przenieść oderwane komórki ze starą pożywką do probówki i wirować z prędkością 300 G przez pięć minut.

Ponownie zawiesić i rozpuść osad komórkowy świeżym alfa MEM uzupełnionym 10% FBS, 50 nanogramów na mililitr M-CSF i 80 nanogramów na mililitr liganda RANK. Zasiej ponownie komórki w odległości 200 000 komórek na centymetr kwadratowy i różnicują się przez siedem do dziewięciu dni. Wielojądrowe osteoklasty zwykle pojawiają się około piątego do siódmego dnia.

Reprezentatywne wyniki. Skład wygenerowanej populacji komórek krwiotwórczych można analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Tutaj komórki krwiotwórcze wykazują dużą populację komórek prekursorowych CD45 +.

Populacje komórek wykazujące ekspresję markerów monocytów CD14 i CD11b zwykle stanowią jedną trzecią całej populacji w porównaniu z kontrolnymi izotypami. Terminalnie zróżnicowany osteoklast pochodzący z IPSC można oglądać pod mikroskopem jako komórki wielojądrowe TRAP-dodatnie. Mikroskopia konfokalna pokazuje barwienie komórek pod kątem katepsyny K. Testy funkcjonalne, takie jak testy wchłaniania kości lub minerałów, pozwalają na dalsze ilościowe określenie aktywności osteoklastów.

W tym przypadku wgłębienia resorpcyjne są widoczne po usunięciu dojrzałego osteoklastu za pomocą 10% wybielacza przed obrazowaniem, podczas gdy prekursory osteoklastów dojrzałe w M-CSF traktowane bez dodatku liganda RANK nie wykazują wgłębień resorpcyjnych. Konkluzja. Protokół ten umożliwia solidne i niezawodne różnicowanie ludzkich osteoklastów i może stanowić gotowe rozwiązanie w przypadku chorób kości lub chorób związanych z nadmiernym zwapnieniem. Używamy osteoklastów do dalszej inżynierii ich w naszych komórkach RANK, które wykorzystują wewnątrzkomórkową domenę sygnalizacyjną, która może być aktywowana w połączeniu z chemicznym induktorem dimeryzacji w celu kontrolowanej i niezależnej od osteoprotegeryny aktywacji osteoklastów.