Name: Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj różnicowanie osteoklastów z ludzkich komórek iPSC przy użyciu czynników biologicznych i technik charakteryzacji. Ta metoda wspiera badania chorób kości i inżynierię tkankową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Giachelli za ich pomoc techniczną i wsparcie. Dziękujemy Centrum Mikroskopii im. W. M. Kecka i kierownikowi Centrum Keck, dr Nathanialowi Petersowi, za pomoc w uzyskaniu obrazów mikroskopii konfokalnej i mikroskopii szerokokątnej. Dziękujemy również UW Flow Core Facility oraz kierownikowi Flow Core Facility, Aurelio Silvestronie, za wsparcie techniczne i pomoc. Na koniec dziękujemy Hannah Blümke za wsparcie w zakresie ilustracji i projektowania graficznego.
Finansowanie zapewniono dzięki grantowi National Institutes of Health R35 HL139602-01. Uznajemy również grant NIH S10 S10 OD016240 na finansowanie instrumentu w Centrum W. M. Keck, a także grant NIH 1S10OD024979-01A1 na finansowanie instrumentów w UW Flow Core Facility.

UWAGA: Wszystkie odczynniki używane w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów. O ile nie określono inaczej, wszystkie media zostały wstępnie wyważone do temperatury 37 °C przed użyciem. Wszystkie etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 37 °C i w trybie najwolniejszego przyspieszania/zwalniania. O ile nie określono inaczej, supernatant jest zawsze usuwany za pomocą jednorazowych szklanych pipet Pasteura.
1. Rozmrażanie i rozmnażanie ludzkich iPSC
<ol>
	<li>Na dzień przed rozmrożeniem iPSC pokryj studzienkę 6-dołkowej płytki 1 ml podstawowego ekstraktu błonowego o stężeniu 200-300 μg/ml. Umieścić na noc płytkę studzienkową w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia rozmrozić i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000. Kroplami dodaj 5-7 ml DMEM/F-12 z 15 mM HEPES.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie usunąć komórki z wirówki i uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wolnej od surowicy hiPSC (hiPSC-SFM zawierającej 10 μM inhibitora kinazy Rho (ROCK) Y-27632) przy użyciu P1000 z końcówkami o szerokim otworze.</li>
	<li>Odessać podstawowy ekstrakt błonowy z dołka pokrytego poprzedniego dnia (etap 1.1) i przenieść 1 ml hiPSC-SFM z 10 μM Y-27632 do studzienki. Dodaj zawieszone iPSC do studzienki, aby osiągnąć końcową objętość 2 ml na studzienkę.</li>
	<li>Zakręć płytką, aby równomiernie rozprowadzić agregaty iPSC przed umieszczeniem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Pełne zmiany pożywki należy wykonywać co drugi dzień za pomocą hiPSC-SFM (bez dodatku inhibitora ROCK Y-27632). iPSC zwykle osiągają 70-80% konfluencji po 3-4 dniach namnażania.</li>
</ol>
2. Przejazdy iPSC
<ol>
	<li>Na dzień przed pasażowaniem iPSC należy pokryć studzienki 6-dołkowej płytki podstawowym ekstraktem błonowym o stężeniu 200-300 μg/ml. Umieścić płytkę studzienkową w temperaturze 4 °C na noc. 
	UWAGA: Upewnij się, że komórki osiągnęły około 70-80% konfluencji. Upewnij się, że iPSC nie ulegają nadmiernemu zlewaniu (ponad 80% konfluencji), ponieważ będzie to sprzyjać spontanicznemu różnicowaniu.</li>
	<li>Pasażowanie iPSC należy rozpocząć od usunięcia zróżnicowanych regionów lub regionów z wieloma martwymi agregatami iPSC pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą końcówek do pipet o pojemności 10 μl lub 20 μl lub skrobaka do komórek. Zróżnicowane obszary będą miały gęstszy lub bielszy kolor. 
	UWAGA: Zeskrobane agregaty komórkowe mogą nadal częściowo przyczepiać się do dna studni.</li>
	<li>Umyj dno studzienki kilka razy pipetą P1000 o szerokim otworze, aby usunąć wszelkie kruszywa, które mogą być nadal częściowo przyczepione do dna studni.</li>
	<li>Wyrzucić zużyte podłoże, w którym hodowano iPSC, zawierające oderwane agregaty iPSC. Powtórz etap płukania jeszcze dwa razy roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Następnie dodaj 1 ml 5 U/ml Dispazy na dołek. Krawędzie kolonii iPSC oderwą się od płytki studzienki, co można zaobserwować pod mikroskopem stereoskopowym po 3-5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć Dispase, aby uniknąć przemieszczenia lekko oderwanych kruszyw i dodać 1 ml DMEM/F-12 z 15 mM HEPES. Użyj jednorazowego podnośnika do komórek, aby pokroić agregaty na małe rozmiary. Spójność rozmiarów agregatów iPSC można poprawić za pomocą narzędzia do pasażowania komórek macierzystych.</li>
	<li>Zmyć pokrojone agregaty iPSC z pożywką w studzience i przenieść pożywkę z kruszywem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub P1000 z końcówką o szerokim otworze.</li>
	<li>Przepłukać studzienkę preparatem DMEM/F-12 i przenieść pożywkę do probówki o pojemności 15 ml z agregatami iPSC.</li>
	<li>Odwirować pokrojone agregaty iPSC przy 200 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać 2 ml hiPSC-SFM w celu usunięcia i ponownego zawieszenia iPSC za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub P1000 z końcówkami o szerokim otworze.</li>
	<li>Odessać resztki ekstraktu z błony podstawowej z wstępnie pokrytej płytki (płytek) dołka i dodać 1 ml hiPSC-SFM do każdej studzienki płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Przenieś iPSC do nowych studzienek na płytce 6-dołkowej, tak aby końcowa objętość wynosiła 2 ml hiPSC-SFM na studzienkę za pomocą P1000 z końcówkami o szerokim otworze. W zależności od linii iPSC należy zoptymalizować współczynniki podziału. W tym przypadku zastosowano podział 1:6.</li>
	<li>Sprawdź studnię pod kątem pływających agregatów i wielkości agregatów pod mikroskopem stereoskopowym. Idealnie, wielkość kruszywa powinna wynosić od 50 do 200 μm.</li>
	<li>Zakręcić płytką studzienki, aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce po przeniesieniu agregatów i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 aż do zbiegu 70-80%.</li>
</ol>
3. Zamrażanie z powrotem iPSC
<ol>
	<li>Aby ponownie zamrozić komórki iPSC, należy przejść komórki zgodnie z powyższym opisem (patrz krok protokołu "2. Pasażowanie iPSC"). Po pokrojeniu komórek na kolonie i zmyciu z dna studzienki (krok 2.10), wirować pokrojone agregaty w ilości 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki do kriokonserwacji bez surowicy na dołek płytki 6-dołkowej do probówki o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić pokrojone kruszywa za pomocą P1000 z końcówką o szerokim otworze.</li>
	<li>Przenieś komórki do wstępnie oznakowanych krioprobówek. Zamknąć probówki i przenieść probówki do wstępnie schłodzonego pojemnika do kriokonserwacji w temperaturze 4 °C. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C przez 24-48 godzin.</li>
	<li>Przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Schematyczne podsumowanie procesu różnicowania OC jest zilustrowane na rysunku Rysunek 1.</li>
</ol>
4. Indukcja ciała embrionalnego
<ol>
	<li>Hoduj i rozwijaj wystarczającą ilość iPSC, jak opisano powyżej, do indukcji EB. 
	UWAGA: Produkcję OC można zwiększyć poprzez zwiększenie liczby ciał zarodkowych, co z kolei daje ogólnie wyższą wydajność komórek krwiotwórczych. Jedna studzienka składająca się z 70-80% zlewających się iPSC daje około 8,4 x 105 komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki. Do utworzenia jednego ciała zarodkowego potrzeba 12 500 jednokomórkowych iPSC.</li>
	<li>Odessać zużytą pożywkę z kultur iPSC i przepłukać kolonie iPSC D-PBS.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml podgrzanego do temperatury pokojowej odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i zawiruj naczynie hodowlane, aby pokryć całą powierzchnię studzienki. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C przez 5-8 minut.</li>
	<li>Wyjąć naczynie z inkubatora, odessać odczynnik do dysocjacji pojedynczych komórek i dodać 1 ml pożywki różnicującej etapu 1 do studzienek, składającej się z pożywki wolnej od surowicy hiPSC z 50 ng/ml ludzkiego białka morfogenetycznego kości 4 (hBMP4), 50 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-165 (hVEGF), 20 ng/ml ludzkiego czynnika komórek macierzystych (hSCF), oraz 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Delikatnie odłącz komórki, spłukując studzienkę pożywką Stage 1. Zgrupuj zdysocjowane iPSC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki różnicującej etapu 1 do studzienek i zmyć pozostałe komórki lub użyć skrobaka do komórek w przypadku kolonii, które nie zmywają się łatwo.</li>
	<li>Po przeniesieniu wszystkich komórek do probówki, odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć osad komórkowy. Odessać i ponownie zawiesić komórki w sumie 2 ml wstępnie zbalansowanej pożywki różnicującej etapu 1 za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub P1000 z końcówką o szerokim otworze.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego urządzenia do liczenia komórek. Dodać pożywkę do 15 ml probówki zawierającej zawiesinę jednokomórkową na płytkę 12 500 komórek na basenie na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem o bardzo niskim nasadce w 100 μl pożywki różnicującej etapu 1. 
	UWAGA: Pod mikroskopem komórki pojawią się jako zawiesina jednokomórkowa z komórkami rozproszonymi w całej studzience.</li>
	<li>Odwirować 96-dołkowe płytki przez 3 minuty przy 100 x g. Po odwirowaniu komórki powinny zacząć przypominać sferoidy, gdy są oglądane pod mikroskopem. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.</li>
	<li>Zmień połowę pożywki w dniu 1 i dniu 2 za pomocą pożywki różnicującej etapu 1. Aby zwiększyć wydajność, za pomocą pipety wielokanałowej należy przelać 50 μl zużytego podłoża różnicującego etapu 1 na płytkę Petriego.</li>
	<li>Po wyrzuceniu pożywki z płytki 96-dołkowej sprawdź, czy pod mikroskopem stereoskopowym nie ma EB, które mogły zostać przypadkowo usunięte. Przenieś przypadkowo usunięte EB na płytkę 96-dołkową za pomocą pipety P1000 z końcówkami o szerokim otworze.</li>
	<li>Dodać 50 μl świeżej pożywki różnicującej etapu 1 do każdego dołka 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem o bardzo niskim nasadce za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
</ol>
5. Różnicowanie układu krwiotwórczego
<ol>
	<li>Na dzień przed rozpoczęciem różnicowania układu krwiotwórczego należy pokryć studzienkę 6-dołkowej płytki 1 ml ekstraktu z błony podstawowej o stężeniu 200-300 μg/ml. Umieścić płytkę studzienkową w temperaturze 4 °C na noc. 
	UWAGA: Każdy odwiert otrzyma 8 EB w późniejszym momencie tego protokołu. W zależności od liczby przygotowanych EB należy odpowiednio pokryć studzienki.</li>
	<li>Odessać nadmiar podstawowego ekstraktu błonowego i wstępnie napełnić studzienki 6-dołkowej płytką 3 ml pożywki różnicującej etapu 2, składającej się z hematopoetycznego podłoża podstawowego, do którego dodaje się 2 mM ultraglutaminy, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 25 ng/ml ludzkiej interleukiny 3 (hIL-3) i 100 ng/ml ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (hM-CSF).</li>
	<li>Używając P1000 z końcówkami o szerokim otworze, przenieś 8 EB do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Po przeniesieniu potwierdzić na oko lub pod mikroskopem stereoskopowym, że w każdym dołku znajduje się 8 EB. 
	UWAGA: Po 1 dniu pływające EB przylgną do dna studni. W ciągu kolejnych 5-7 dni powinna stać się widoczna pływająca populacja komórek składająca się z komórek krwiotwórczych. Okres różnicowania układu krwiotwórczego może być zróżnicowany, począwszy od 7 dni. Różnicowanie przez 10 dni wykazało populację krwiotwórczą składającą się z dużych subpopulacji CD45+, CD14+ i CD11b+.</li>
	<li>Po 5 dniach leczenia pożywką różnicującą etapu 2 należy przeprowadzić zmianę pożywki, usuwając zużyte podłoże i dozując je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pipetować powoli, starając się usunąć jak najmniej pływających komórek i utrzymać naprężenia ścinające na jak najniższym poziomie. Pipetowanie pod mikroskopem stereoskopowym może pomóc uniknąć przypadkowego usunięcia komórek.</li>
	<li>Natychmiast dodać 1 ml świeżej pożywki różnicującej etapu 2 do studzienek. W celu odzyskania pływających komórek krwiotwórczych, które mogą być już obecne na tym etapie procesu różnicowania, nie należy wyrzucać dozowanej pożywki. Zamiast tego należy wirować probówkę ze zużytym podłożem o stężeniu 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać świeżą pożywkę różnicującą etapu 2 do probówki i zawiesić ponownie w celu odłączenia komórek, które mogły zostać przeniesione ze zużytą pożywką.</li>
	<li>Dodaj 2 ml świeżej pożywki różnicującej etapu 2 z odzyskanymi komórkami do każdej studzienki, która została wcześniej wypełniona 1 ml pożywki różnicującej etapu 2.</li>
	<li>W 10 dniu różnicowania układu krwiotwórczego sprawdź, czy nie ma dużej liczby pływających komórek krwiotwórczych. Zbierz je, zbierając je do probówki o pojemności 50 ml. Można je zamrozić z powrotem w 10% DMSO, 50% FBS i 40% pożywce lub natychmiast użyć do różnicowania komórek w OC.</li>
</ol>
6. Dojrzewanie M-CSF i różnicowanie OC
<ol>
	<li>Komórki nasienne w stężeniu 200 000 komórek/cm2 na kulturze tkankowej dobrze potraktowane płytki i potraktowane alfa-MEM, uzupełnione 10% FBS i 50 ng / ml hM-CSF.</li>
	<li>Aby przeprowadzić testy funkcjonalne lub obrazowanie, należy odłączyć dojrzałe komórki M-CSF 3 dni po wysiewie, przemłukując wstępnie podgrzanym PBS do temperatury 37 °C za pomocą P1000 z końcówką o szerokim otworze. Do całkowitego odłączenia komórek może być konieczne powtarzanie etapów mycia.</li>
	<li>Przenieść oderwane komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą P1000 z końcówką o szerokim otworze i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić i rozpuścić osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej OC, składającej się z alfa-MEM uzupełnionego 10% FBS, 50 ng / ml hM-CSF i 80 ng / ml hRANKL. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego urządzenia do liczenia komórek i ponownie zasiaj dojrzałe komórki M-CSF o gęstości 200,00-250,000 komórek/cm2 w odpowiednim roztworze hodowlanym do testów funkcjonalnych lub obrazowania (tj. Testy resorpcji kości, szkiełka nakrywkowe do obrazowania itp.).</li>
	<li>Różnicuj za pomocą pożywki różnicującej OC przez 7-9 dni. Co 2-3 dni należy wykonywać pełną wymianę pożywki studzienkowej ze świeżą pożywką różnicującą OC. 
	UWAGA: Wielojądrowe OC pojawiają się zwykle po 5-7 dniach.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Protokół ten oferuje niezawodną i solidną metodę różnicowania iPSC na OC. Niemniej jednak istnieje kilka pułapek, które można napotkać w całym procesie różnicowania. Ludzkie linie iPSC wygenerowane z komórek o różnym pochodzeniu tkankowym zostały z powodzeniem zróżnicowane przy użyciu tego protokołu33. W przypadku ponownego zamrażania iPSC (patrz krok protokołu "3. Zamrażanie z powrotem iPSC"), jedna studzienka w punkcie pasażowania została zamrożona z powrotem w jednym kriowiale. Podczas rozmrażania (patrz krok protokołu "1. Rozmrażanie i rozmnażanie ludzkich iPSC"), jeden kriowial rozmrażono w pojedynczym dołku na 6-dołkowej płytce. Różne linie iPSC będą zachowywać się nieco inaczej, a tempo proliferacji będzie się różnić. Współczynnik podziału będzie musiał zostać odpowiednio dostosowany.
Podczas pasażowania iPSC lub dysocjacji iPSC do zawiesiny pojedynczej komórki w celu indukcji EB ważne jest, aby usunąć wszelkie spontanicznie zróżnicowane kolonie lub agregaty martwych komórek, aby poprawić skuteczność i wydajność różnicowania mezodermalnego i krwiotwórczego. Można to zrobić pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą skrobaka do komórek, końcówek do pipet z pipety P10 lub P20 lub narzędzia do skrobania zbudowanego z pipety Pasteura35.
Jak wspomniano powyżej, protokół ten obejmuje dysocjację kolonii iPSC w zawiesinę jednokomórkową w celu indukcji EB, podczas gdy w przypadku innych protokołów iPSC pozostawia się jako agregaty do odwirowania w celu indukcji EB36. Doniesiono, że rozmiar, liczba komórek, kształt i morfologia EB wpływają na różnicowanie 37,38,39. W związku z tym stawiamy hipotezę, że dysocjacja do zawiesiny jednokomórkowej pozwala na lepszą jednorodność EB do EB pod względem wielkości i kształtu po odwirowaniu, a tym samym bardziej spójne wyniki produkcji komórek krwiotwórczych31.
Opisano inne metody indukcji EB. Doniesiono, że takie metody, które wykorzystują zawiesinę pojedynczej komórki w połączeniu z inhibitorem ROCK w celu poprawy przeżycia komórek, są korzystne w kontrolowaniu wielkości EB i wyniku różnicowania31.
Opisana w niniejszym protokole metoda indukcji EB na 96-dołkowej płytce okrągło-dołkowej jest odpowiednia do produkcji EB na dużą skalę i pozwala na zwiększenie skali produkcji OC. Niedawno opisano bardziej nowatorskie metody różnicowania układu krwiotwórczego bez etapu indukcji ciała zarodkowego, które mogą ułatwić proces różnicowania32. Niemniej jednak protokoły te nie zostały jeszcze ustalone dla różnicowania OC33.
W wyżej wymienionym protokole opisujemy zmianę pożywki w 5. dniu różnicowania układu krwiotwórczego. Niewielka liczba pływających komórek może pojawić się już około 4-5 dnia różnicowania. Aby uniknąć wyrzucenia jakichkolwiek pływających komórek, pożywkę należy zebrać do probówki i odwirować przed wyrzuceniem. Osad komórkowy na dnie probówki musi następnie zostać usunięty ze świeżą pożywką i powinien zostać przeniesiony z powrotem do studzienek na płytce 6-dołkowej. Znaczenie wczesnej populacji komórek pływających w różnicowaniu OC nadal wymaga jednak ustalenia.
Produkcję komórek krwiotwórczych można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Wysoka wydajność komórek CD45 +, CD14 + i CD11b + jest pożądana dla różnicowania osteoklastów33. Doniesiono, że kriokonserwacja pobranych pływających komórek krwiotwórczych jest trudna ze względu na ogólnie ograniczone wskaźniki odzysku i niską żywotność komórek40,41. Poprzez krioprezerwację komórek krwiotwórczych w pożywce do kriokonserwacji składającej się w 50% z pożywki do eksplandowania komórek krwiotwórczych bez surowicy (patrz tabela materiałów), 40% FBS i 10% DMSO, byliśmy w stanie odzyskać komórki o żywotności komórek około 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) po rozmrożeniu.
Osteoklastogeneza wymaga fuzji wielu monojądrowych prekursorów OC w celu wytworzenia wielojądrowych osteoklastów, które są zdolne do resorpcji minerałów i kości. Podczas gdy mysie linie komórkowe prekursorowe OC po prostu potrzebują dodania RANKL do indukowania tworzenia OC42, ludzkie prekursory wymagają dodatkowego M-CSF do przeżycia i proliferacji komórek43. OSCAR został niedawno odkryty jako dodatkowy receptor zaangażowany w różnicowanie OC, mimo że do tej pory tylko kolagen typu I został zidentyfikowany jako ligand. Podczas gdy badania OSCAR z OC pochodzącymi z iPSC są nadal ograniczone, suprafizjologiczne stężenia RANKL i M-CSF in vitro w mysiej linii komórkowej wydają się omijać konieczność aktywacji OSCAR44, aktywacja OSCAR in vivo wydaje się być niezbędnym sygnałem kostymulującym dla osteoklastogenezy45. Dodatkowym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest powierzchnia płytki studziennej. Wiadomo, że chemiczne właściwości powierzchni46 i fizyczne47 wpływają na różnicowanie osteoklastów i mogą sprzyjać lub utrudniać pomyślne różnicowanie. Pewna heterogeniczność w populacji prekursorów wydaje się również kluczowa dla udanej fuzji OC, ponieważ różne czynniki związane z fuzją, takie jak CD47 i DC-STAMP, działają na różnych etapach fuzji osteoklastów48.
Podsumowując, protokół ten umożliwia odróżnienie OC u ludzi od iPSC w celu ułatwienia i przyspieszenia badań nad OC.

Osteoklasty (OC) są pochodzenia hematopoetycznego1,2, wszechstronne typy komórek, które są powszechnie używane przez badaczy w takich dziedzinach jak badania nad chorobami kości3,4, badania nad rakiem5,6, inżynieria tkankowa7,8 i endoproteza research9,10. Niemniej jednak różnicowanie OC może być trudne, ponieważ fuzja prekursorów jednojądrzastych w wielojądrowe OC jest niezbędna do stworzenia funkcjonalnych OCs11. Do różnicowania OC niezbędnych jest kilka czynników biologicznych, takich jak aktywator receptora ligandu NF-κB (RANKL) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Doniesiono, że M-CSF ma pozytywny wpływ na proliferację komórek, przeżywalność komórek i wyrażenie RANK12,13,14. Z drugiej strony, RANKL wiąże się z RANK, który aktywuje kaskady sygnalizacyjne w dół, które indukują osteoklastogenezę. Aktywacja odbywa się za pośrednictwem czynnika 6 związanego z receptorem TNF (TRAF6), co prowadzi do degradacji czynnika jądrowego wzmacniacza genu polipeptydu światła kappa w inhibitorze limfocytów B, alfa (IκB-α), białku wiążącym, które wiąże dimery NF-kB16,17. W związku z tym degradacja IκB-α uwalnia dimery NF-kB, które następnie przemieszczają się do jądra i indukują ekspresję czynników transkrypcyjnych c-Fos i czynnika jądrowego aktywowanych komórek T 1 (NFATc1). To z kolei wyzwala transkrypcję wielu białek związanych z różnicowaniem OC 15,18. Białka o podwyższonej regulacji, takie jak DC-Stamp i Atp6v0d2, pośredniczą w fuzji prekursorów OC między komórkami, prowadząc do powstania syncytium19,20,21.
W odniesieniu do ludzkich komórek pierwotnych, PBMC CD34+ i CD14+ są obecnie najczęściej używanymi typami komórek do różnicowania na OCs22. Jednak podejście to jest ograniczone przez heterogeniczność w populacji CD34+ komórek pobranych od dawców23 i ich ograniczoną zdolność do rozbudowy. Ludzkie komórki iPS stanowią alternatywne źródło OC. Ponieważ mogą być one propagowane w nieskończoność24, pozwalają na rozbudowę i skalowanie produkcji OC. Pozwala to na różnicowanie dużej liczby OC, co ułatwia badania OC.
Opublikowano kilka protokołów do różnicowania iPSC na OCs25,26,27. Cały proces różnicowania można podzielić na część propagacyjną iPSC, część różnicowania mezodermalnego i krwiotwórczego oraz różnicowanie OC. Propagacja iPSC przed procesem różnicowania pozwala na zwiększenie skali produkcji OC przed różnicowaniem. Istnieje kilka podejść dotyczących różnicowania mezodermalnego i krwiotwórczego. Tradycyjnie tworzenie ciał zarodkowych (EB) było wykorzystywane do różnicowania komórek krwiotwórczych, ale podejścia oparte na monowarstwach stanowią kolejną strategię różnicowania układu krwiotwórczego, która nie wymaga indukcji EB. Niemniej jednak systemy oparte na monowarstwach wydają się wymagać dalszej optymalizacji, ponieważ my i inni stwierdziliśmy, że podejścia oparte na EB są bardziej odporne na różnicowanie OC.
Tutaj opisujemy różnicę między OC a ludzkimi iPSC za pomocą protokołu opartego na EB. Protokół ten został zaadaptowany z Rössler et al.26 i zmodyfikowany w celu zwiększenia wytrzymałości i umożliwienia kriokonserwacji podczas procesu różnicowania. Po pierwsze, komórki krwiotwórcze pobraliśmy tylko raz po 10 dniach różnicowania. Komórki krwiotwórcze zostały następnie poddane krioprezerwacji, aby umożliwić większą elastyczność podczas procesu różnicowania. Dodatkowo zwiększyliśmy gęstość wysiewu komórek krwiotwórczych z 1 x 105 do 2 x 105 komórek/cm2 w celu różnicowania OC. Zastosowano nowszą pożywkę bez ludzkiej surowicy iPSC (hiPSC-SFM, patrz Tabela materiałów), a powlekanie studzienek wykonano 200-300 μg/ml ekstraktu z błony podstawowej (patrz Tabela materiałów) zamiast 0,1% żelatyny. Penicylina/streptomycyna nie była dodawana do pożywki.
Protokół Rössler et al.26 został pierwotnie zaadaptowany z iPSC do protokołu różnicowania makrofagów28, który wykorzystuje tworzenie EB do różnicowania układu krwiotwórczego. Podczas gdy tworzenie EB było używane przez badaczy przez dłuższy czas do różnicowania układu krwiotwórczego29,30, w literaturze opisano kilka metod indukcji EB, takich jak spontaniczna agregacja, wirowanie na okrągłej płytce studziennej, hodowla kropli wiszących, hodowla bioreaktorów, stożkowa hodowla probówkowa, wolno obracające się naczynie boczne i kultura żelu mikromold31. Protokół ten wykorzystuje wirowanie zdysocjowanych iPSC w płytce dołka z okrągłym dnem w celu zbliżenia pojedynczych komórek iPSC do siebie i umożliwienia tworzenia kuli (EB), jak opisano poniżej.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało 2-merkaptoetanolowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>- Anty-Katepsyna K&nbsp;</td><td>Przeciwciało Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td></td><td>- Przeciwciało anty-ludzkie CD45</td> BD <td>555485</td><td></td>sprzężone z</tr><tr><td>APC - IgG1 myszy sprzężone z APC, &kappa; Przeciwciało 555751 kontrolne</td><td>izotypu</td><td></td> - Przeciwciało anty-ludzkie CD14 BD 563372 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>sprzężone z BV711</td></tr><tr><td>- koniugaty BV711 Mysie IgG2b, &kappa; Isotype Control</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało - Kozia Anty-Królicza IgG H& L Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Przeciwciało Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>- anty-ludzkie CD14 sprzężone z PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało - Anty-ludzka integryna alfa M/CD11b sprzężona z PE</td><td>R& Przeciwciało D Systems</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>- Przeciwciało anty-ludzkie CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td>sprzężone z</tr><tr><td>PE-Cy7 - IgG1 i kappa myszy sprzężone z PE-Cy7; Przeciwciało kontrolne</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>- PE / cyjanina sprzężona z anty-ludzkim CD11b</td><td>301308</td><td></td> Przeciwciało - <td></td></tr><tr><td>PE / cyjanina 5 sprzężona z mysią IgG1 i kappa; Isotype Ctrl</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało - PerCP-Cy5.5-sprzężone z Myszą IgG1 &kappa; Przeciwciało Isotype Control</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td></tr> - Zestaw do oznaczania resorpcji kości <tr>CD43 <td>BD</td><td>563521</td><td></td><td>sprzężony z PerCpCy5.5</td></tr><tr><td></td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek Countess 3</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Stem Cell Qualified Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu</td><td>R& D Sytems</td><td>3434-010-02</td><td>Podstawowy ekstrakt membranowy</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R& D Systems</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispaza (5 U/ml)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 z komórką macierzystą 15 mM HEPES</td><td></td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Białko morfogenetyczne ludzkiej kości 4 (hBMP4)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka IL-3</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (hM-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rozpuszczalny receptor aktywujący czynnik jądrowy-&kappa; B Ligand (hsRANKL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik ludzkich komórek macierzystych (hSCF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki TruStain FcX (roztwór blokujący receptor Fc)</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego-165 (hVEGF165)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Rodamina falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alpha;, nukleozydy, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05855</td><td>Pożywka do kriokonserwacji bez surowicy</td></tr><tr><td>mTeSR Plus STEMCELL</td><td>Technologies</td><td>100-0276</td><td>Pożywka wolna od ludzkiej iPSC (hiPSC-SFM)</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96-Well, poddana działaniu nunclon Sphera, dno w kształcie litery U Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>Okrągłodenna, ultra-niska płytka 96-dołkowa</td></tr><tr><td>P1000 Końcówki o szerokim otworze</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>StemCell</td><td>09650</td><td>Pożywka do hodowli komórek krwiotwórczych</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher</td><td>12563011</td><td>Odczynnik do dysocjacji pojedynczych komórek</td></tr><tr><td>Ultraglutamine</td><td>Bioscience Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Podłoże z komórek krwiotwórczych bez surowicy</td><td>Bioscience Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Hematopoietic bazal medium</td></tr> <tr><td>i mikro;-Slide 8 Well High</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Ten protokół szczegółowo opisuje propagację i pasaż ludzkich iPSC oraz ich różnicowanie w osteoklasty. Po pierwsze, iPSC są dysocjowane do zawiesiny jednokomórkowej w celu dalszego wykorzystania w indukcji ciała zarodka. Po indukcji mezodermalnej ciała embrionoidalne ulegają różnicowaniu hematopoetycznemu, wytwarzając pływającą populację komórek krwiotwórczych. Następnie pobrane komórki krwiotwórcze przechodzą etap dojrzewania czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów, a na końcu różnicowanie osteoklastów. Po różnicowaniu osteoklastów, osteoklasty charakteryzują się barwieniem dla TRAP w połączeniu z barwieniem jądrowym zielenią metylową. Osteoklasty obserwuje się jako wielojądrowe polikariony TRAP+. Ich identyfikacja może być dodatkowo wsparta barwieniem katepsyną K. Testy resorpcji kości i minerałów pozwalają na charakterystykę funkcjonalną, potwierdzając tożsamość osteoklastów w dobrej wierze. Protokół ten demonstruje solidną i wszechstronną metodę odróżniania ludzkich osteoklastów od iPSC i pozwala na łatwe zastosowanie w zastosowaniach wymagających dużych ilości funkcjonalnych ludzkich osteoklastów. Można przewidzieć zastosowania w dziedzinie badań nad kośćmi, nowotworami, inżynierią tkankową i badaniami nad endoprotezami.

Monitorowanie morfologii komórek w przebiegu procesu różnicowania 
Wszystkie opisane poniżej wyniki uzyskano przy użyciu linii iPSC MCND-TENS2 do różnicowania w komórki OC. Ta linia iPSC była wcześniej wykorzystywana w kilku badaniach32,33. Niemniej jednak, inne linie iPSC zostały również z powodzeniem zastosowane w tym protokole różnicowania.
Regularna ocena wizualna ujawnia odmienne i wyraźne cechy morfologiczne iPSC w całym procesie różnicowania do OCs (Rysunek 2). Kolonie iPSC (Rysunek 2A) zostały rozdzielone do zawiesiny pojedynczych komórek, która przed wirowaniem przejawia się jako poszczególne komórki w płytce z dołkami o okrągłym dnie (Rysunek 2B). Po wirowaniu (krok 4.9 w protokole) komórki zbiorą się w centrum płytki o okrągłym dnie o ultra-niskiej adhezji i następnie utworzą sfery (ciała embrionalne, EBs, Rysunek 2C). EBs zwiększą swoją wielkość dwu- lub trzykrotnie w procesie różnicowania mezodermalnego (Rysunek 2D) i staną się łatwo widoczne gołym okiem pod koniec 4-dniowego okresu różnicowania (Rysunek 2E). Po przeniesieniu do dołków płytki 6-dołkowej w celu różnicowania hematopoetycznego można zaobserwować przyleganie i zlewanie się EBs z dnem płytki (Rysunek 2F, krok 5.3 w protokole). Po 7-8 dniach w pożywce hodowlanej stają się widoczne duże ilości pływających komórek hematopoetycznych (Rysunek 2G). Po zbiorze i ponownym wysianiu komórek hematopoetycznych następuje faza dojrzewania z zastosowaniem M-CSF i rozpoczyna się różnicowanie do OC (krok 6.4 w protokole). W ciągu 5-6 dni po raz pierwszy pojawiają się komórki wielojądrowe z dużym, przezroczystym ciałem komórkowym (Rysunek 2H). Na tym etapie wciąż widoczna jest duża liczba komórek jednojądrowych. Po kolejnych 2-3 dniach różnicowania do OC, komórki OC będą dalej zlewać się z sąsiednimi komórkami, tworząc duże polikariony z jeszcze większą liczbą jąder (Rysunek 2I).
Ocena populacji krwiotwórczej pochodzącej z ciał embroidalnych (EB) 
Różnicowanie krwiotwórcze może być prowadzone przez zmienny okres czasu. W literaturze opisano okresy trwające od 7 dni do 9 tygodni. W niniejszym protokole różnicowanie krwiotwórcze przeprowadza się przez okres 10 dni. Stwierdzono, że 10 dni różnicowania krwiotwórczego pozwoliło uzyskać niską liczbę wczesnych progenitorów CD34+ (0,53%, Ryc. 3A) oraz większą liczbę progenitorów krwiotwórczych CD43+ (48,5%, Ryc. 3B) na etapie pośrednim. Co ważniejsze, po 10-dniowym okresie inkubacji wygenerowano wystarczające ilości HPC CD45+ (96,2%, Ryc. 3C), CD14+ (33%, Ryc. 3D) i CD11b+ (35,9%, Ryc. 3E), aby móc je dalej różnicować w osteoklasty (OC). Niemniej jednak okres traktowania cytokinami w celu różnicowania krwiotwórczego (krok 5.4 protokołu) może wymagać korekty i optymalizacji w zależności od linii iPSC, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek CD45+, CD14+ i CD11b+.
Średnio, po 10 dniach różnicowania, z każdej studzienki zawierającej 8 EB zebrano 6 milionów komórek krwiotwórczych.
Ocena morfologii i aktywności OC 
Po różnicowaniu OC można ocenić morfologicznie i funkcjonalnie. Prekursory OC są ponownie wysiewane na szkiełka z komorami lub szkiełka podstawowe po etapie dojrzewania z użyciem M-CSF, aby poprawić jakość obrazu podczas barwienia na TRAP lub katepsynę K. Enzymatyczne barwienie na TRAP po różnicowaniu OC wykazuje duże, wielojądrowe, TRAP-dodatnie OC (Rysunek 4A). Dodatkowo, pomiędzy wielojądrowymi OC można zaobserwować słabo TRAP-dodatnie komórki jednojądrowe. Kontrole negatywne bez dodatku RANKL nie wykazują stopionych, wielojądrowych OC. Niemniej jednak, można dostrzec niewielką liczbę słabo TRAP-dodatnich komórek jednojądrowych (Rysunek 4B).
Obrazy z konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLSM) przedstawiają osteoklasty (OCs) barwione na katepsynę K (turkusowy) i F-aktynę (czerwony) wraz z barwieniem jądrowym DAPI (niebieski) (Rysunek 4C, 4D). Po zastosowaniu RANKL zgodnie z protokołem widoczne są duże wielojądrowe osteoklasty, charakteryzujące się rozbudowaną strukturą cytoszkieletu F-aktynowego oraz dodatnim barwieniem na katepsynę K (Rysunek 4C). W kontrolach negatywnych, bez dodatku RANKL, nie obserwuje się zfuzowanych komórek wielojądrowych.
Aktywność funkcjonalną osteoklastów (OC) można dodatkowo ocenić poprzez pomiar aktywności resorpcyjnej. Do określenia aktywności resorpcyjnej można zastosować testy resorpcji kości lub minerałów. W tym przypadku prekursory OC wysiano do studzienek pokrytych fosforanem wapnia i poddano terminalnemu różnicowaniu. Obszary, w których nastąpiła resorpcja powłoki mineralnej, są widoczne w kolorze niebiesko-szarym (Rycina 4E). Można zidentyfikować dołki resorpcyjne o różnych rozmiarach. Pozostała, nieresorbowana powłoka fosforanu wapnia jest widoczna w kolorze brązowym. Obecność dołków resorpcyjnych potwierdza tożsamość zróżnicowanych komórek wielojądrowych jako OC. Ponadto dołki resorpcyjne można poddać ilościowej ocenie w celu analizy i porównania aktywności resorpcyjnej. Całkowity obszar zresorbowanego minerału w stosunku do całkowitej powierzchni studzienki można określić jako wartość procentową. Dodatkowo można zmierzyć rozmiar i liczbę dołków resorpcyjnych. Nieleczone kontrole negatywne nie wykazały obecności dołków resorpcyjnych (Rycina 4F).
<img alt="Schemat różnicowania iPSC; przebieg procesu rozwoju komórek hematopoetycznych i osteoklastów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja procesu różnicowania osteoklastów z ludzkich iPSC. Ilustracja wykonana przez Hannah Blümke przy użyciu Affinity Designer 2.1.1. Ilustracja wykorzystuje rysunki użyte wcześniej33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Sekwencja wzrostu hodowli komórkowej; obrazy mikroskopowe przedstawiające etapy agregacji komórek i zmiany morfologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazy mikroskopowe z całego procesu różnicowania ludzkich iPSC w osteoklasty. (A) Niezróżnicowane kolonie iPSC podczas propagacji. (B) iPSC w dołkach o okrągłym dnie po dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek przed wirowaniem. (C) Pojedyncze komórki iPSC zebrane w centrum po wirowaniu. (D) Ciałka zarodkowe (EBs) zwiększają swoją wielkość podczas 4-dniowego okresu różnicowania mezodermalnego. (E) Widoczne ciałka zarodkowe po różnicowaniu mezodermalnym. (F) Po przeniesieniu ciałek zarodkowych na płytki 6-dołkowe pokryte ekstraktem z błony podstawnej, widoczne jest ich przyleganie i fuzja z dnem dołka. (G) Po 5–7 dniach różnicowania hematopoetycznego w medium można zaobserwować dużą liczbę pływających komórek hematopoetycznych. (H) Po dojrzewaniu w obecności M-CSF, pierwsze osteoklasty z 3–4 jądrami pojawiają się po 5–7 dniach różnicowania z RANKL. (I) Pod koniec różnicowania osteoklastów można zaobserwować duże komórki wielojądrowe. Paski skali: A, D, F, G = 200 µm, B, C, H, I = 50 µm, E = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej wykazujące ekspresję markerów CD (CD34, CD43, CD45, CD14, CD11b)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza markerów powierzchniowych komórek krwi pochodzących z ciał embrionalnych za pomocą cytometrii przepływowej. Ekspresja markerów umożliwia analizę komórek krwi i identyfikację subpopulacji po bramkowaniu singletów i żywych komórek. (A) Populacja wczesnych ontogenetycznie progenitorów krwi CD34+ jest bardzo mała lub nieobecna przy zastosowaniu tego protokołu. (B) Komórki CD43+ stanowią około 50% całej populacji. (C) Progenitory krwi CD45+ na późniejszym etapie stanowią największą część populacji krwiotwórczej, wynosząc 96,2%. (D, E) Bezpośrednie prekursory OC CD14+ i CD11b+ stanowią odpowiednio 33% i 36%. Na czerwono: niebarwiona kontrola negatywna, na niebiesko: kontrole izotypowe, na żółto: komórki zabarwione przeciwciałem do odpowiedniego markera. Wykresy wykorzystują wcześniej opublikowane dane33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia leczenia RANKL M-CSF; powstawanie osteoklastów, analiza fluorescencyjna, morfologia komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ocena morfologiczna i funkcjonalna ludzkich osteoklastów zróżnicowanych z iPSC. (A) Barwienie TRAP po zróżnicowaniu osteoklastów wykazuje duże, wielojądrowe, TRAP-dodatnie osteoklasty. Między wielojądrowe osteoklasty wplecione są słabo TRAP-dodatnie komórki jednojądrowe. (B) Kontrole negatywne bez dodatku RANKL, barwione na TRAP, nie wykazują zfuzowanych wielojądrowych osteoklastów. Niemniej jednak można zaobserwować niewielką liczbę słabo TRAP-dodatnich komórek jednojądrowych. (C) Obrazy z konfokalnej mikroskopii laserowej skaningowej komórek hematopoetycznych zróżnicowanych w osteoklasty na szkiełku przedmiotowym, barwione na F-aktynę (czerwony) i katepsynę K (turkusowy) w połączeniu z barwieniem jąder DAPI (niebieski), wykazują duże wielojądrowe osteoklasty dodatnie pod kątem katepsyny K. (D) Kontrole negatywne bez dodatku RANKL wykazują komórki jednojądrowe podobne do tych w (B) przy niższej gęstości komórek. (E) Ocenę funkcjonalną można przeprowadzić poprzez analizę aktywności resorpcyjnej osteoklastów. W tym celu zróżnicowanie osteoklastów przeprowadza się w teście resorpcji kości lub minerałów. Obrazy z mozaiki studzienek uzyskane za pomocą odwróconego mikroskopu szerokopolowego w trybie kontrastu fazowego przedstawiają duże obszary resorpcji warstwy mineralnej fosforanu wapnia. Aktywność resorpcyjna może być dodatkowo ilościowo określona poprzez pomiar powierzchni resorpcji w stosunku do powierzchni całkowitej. (F) Kontrole negatywne bez dodatku RANKL nie wykazują obszarów resorpcyjnych. Paski skali: A, B = 100 µm, C, D = 50 µm, E, F = 1 mm. Obrazy zostały opracowane na podstawie wcześniej opublikowanych danych33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Wprowadzenie.Osteoklasty to wielojądrowy typ komórek powszechnie używany przez naukowców w takich dziedzinach, jak badania nad chorobami kości, badania nad rakiem, inżynieria tkankowa i badania nad endoprotezami. Niemniej jednak różnicowanie osteoklastów może być trudne, ponieważ konieczna jest fuzja prekursorów. Ponadto różnicowanie ludzkich osteoklastów od IPSC wymaga zastosowania różnych czynników biologicznych w odpowiednim czasie.Jeśli chodzi o ludzkie komórki pierwotne. CD34 + komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są obecnie najczęściej stosowanym typem komórek do różnicowania w osteoklasty. Podejście to jest jednak ograniczone przez niejednorodność w populacji CD34+ i ich ograniczoną zdolność do rozbudowy.Ludzkie IPSC stanowią alternatywne źródło osteoklastów. Ponieważ można je rozmnażać w nieskończoność, pozwalają na rozbudowę i zwiększenie produkcji osteoklastów. Pozwala to na różnicowanie dużej liczby osteoklastów, co ułatwia badania osteoklastów.Tutaj nasz postdoc Alexander Blumke i doktorantka Jessica Simon demonstrują różnicowanie osteoklastów od ludzkich IPSC Passaging IPSC. Rozpocznij pasowanie IPSC, usuwając zróżnicowane regiony lub regiony z wieloma martwymi agregatami IPSC pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą końcówki pipety P-10 lub P-20 lub skrobaka do komórek. Zróżnicowane regiony będą wydawać się gęstsze i bielsze.Umyj odłączone komórki starym podłożem, a następnie dwukrotnie zmyj wszelkie pozostałe oderwane komórki za pomocą PBS. Następnie dodaj do studzienki jeden mililitr pięciu jednostek na mililitr dypazy na studzienkę. Krawędzie kolonii odrywające się od naczynia można zaobserwować pod mikroskopem stereoskopowym po trzech do pięciu minutach.Ostrożnie usunąć dypazę i dodać jeden mililitr DMEM/F-12 z 15-milimolowym HEPES. Użyj narzędzia do pasażowania komórek macierzystych lub jednorazowego podnośnika komórkowego, aby pociąć agregaty na małe rozmiary. Przenieś pożywkę z kruszywami do 15-mililitrowej stożkowej rurki za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej lub P-1000 z końcówką o szerokim otworze.Przepłucz studzienkę DMEM/F-12 i przenieś pożywkę do 15-mililitrowej probówki. Odwirować pokrojone agregaty IPSC w temperaturze 200 G przez trzy minuty. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać dwa mililitry pożywki bez surowicy ludzkiej IPSC w celu usunięcia i ponownego zawieszenia IPSC za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej lub P-1000 z końcówkami o szerokim otworze.Odessać resztki ekstraktu z błony podstawnej z wstępnie pokrytych płytek dołkowych i dodać jeden mililitr pożywki bez ludzkiej surowicy IPSC do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Przenieś IPSC do nowych studzienek na płytce sześciodołkowej, tak aby końcowa objętość wynosiła dwa mililitry ludzkiego podłoża bez surowicy IPSC na studzienkę za pomocą P-1000 z końcówkami o szerokim otworze. W zależności od linii IPSC, współczynniki podziału muszą być zoptymalizowane.W tym przypadku zastosowano podział 1:6. Zakręć płytką dołka, aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce po przeniesieniu agregatów. Indukcja ciała zarodka.Odessać starą pożywkę z kultur IPSC i przepłukać studzienki DPBS. Dodaj pół mililitra podgrzanego do temperatury pokojowej do każdego dołka sześciodołkowej płytki i zakręć naczyniem hodowlanym, aby pokryć całą powierzchnię studzienki. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37 stopni C przez pięć do ośmiu minut.Wyjąć naczynie z inkubatora, odessać roztwór i dodać pożywkę pierwszego stopnia do studzienek składających się z 50 nanogramów na mililitr ludzkiego białka morfogennego kości 4, 50 nanogramów na mililitr ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego 165, 20 nanogramów na mililitr ludzkiego czynnika komórek macierzystych i 10 mikromolowego inhibitora ROCK Y-27632. Delikatnie odłącz komórki, spłukując studzienkę pożywką pierwszego stopnia. Przeciągnij komórki do stożkowej rurki.Dodaj nową pożywkę pierwszego stopnia do studzienek i odłącz pozostałe komórki za pomocą skrobaka do komórek. Po przeniesieniu wszystkich komórek do probówki, odwirować przy 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Odessać i ponownie zawiesić komórki w sumie dwóch mililitrach wstępnie zbalansowanego podłoża pierwszego stopnia.Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego urządzenia do liczenia komórek Wysiewaj 12 500 komórek na dołek na okrągłodennej 96-dołkowej płytce o ultraniskim mocowaniu w 100 mikrolitrach pożywki pierwszego stopnia. Pod mikroskopem komórki pojawią się dyfuzyjnie w całym roztworze. Odwirować 96-dołkowe płytki przez trzy minuty przy stężeniu 100 G Po odwirowaniu komórki powinny zacząć przypominać sferoidy, gdy są oglądane pod mikroskopem.Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni C. Zmień połowę pożywki pierwszego dnia i drugiego dnia na pożywkę pierwszego etapu. Użyj pipety wielokanałowej, aby wylać starą pożywkę na szalkę Petriego.Po wyrzuceniu pożywki z płytki 96-dołkowej sprawdź, czy nie ma EB, które mogły zostać przypadkowo usunięte. Przenieść przypadkowo usunięte EB na szalce Petriego z powrotem za pomocą pipety P-1000 Różnicowanie krwiotwórcze. Wstępnie napełnij studzienki sześciodołkowej płytką trzema mililitrami pożywki drugiego stopnia, do której dodaje się dwumilimolową ultraglutaminę, 55-mikromolowy beta-merkaptoetanol, 25 nanogramów na mililitr, ludzką interleukinę-3 i 100 nanogramów na mililitr ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów.Używając P-1000 i końcówki o szerokim otworze, przenieś osiem EB do każdego dołka sześciodołkowej płytki. Po przeniesieniu sprawdź wzrokowo pod mikroskopem stereoskopowym, czy w każdym dołku znajduje się osiem EB. Po pięciu do siedmiu dniach powinna stać się widoczna pływająca populacja komórek składająca się z komórek krwiotwórczych.Okres różnicowania układu krwiotwórczego może być zróżnicowany, począwszy od siedmiu dni. Różnicowanie przez 10 dni wykazało populację krwiotwórczą składającą się z dużych subpopulacji CD45+CD14+i CD11b+. Po pięciu dniach leczenia pożywką drugiego etapu należy przeprowadzić zmianę pożywki, ostrożnie usuwając starą pożywkę i dozując ją do 50-mililitrowej stożkowej tuby.Natychmiast dodaj jeden mililitr nowego podłoża drugiego stopnia do studzienek. Aby uratować pływające komórki krwiotwórcze, które mogą być już obecne, wirować probówkę ze starą pożywką o stężeniu 300 G przez pięć minut. Dodać nową pożywkę drugiego stopnia do probówki i ponownie zawiesić w celu odłączenia komórek, które mogły zostać przeniesione za pomocą starej pożywki.Dodaj dwa mililitry nowej pożywki drugiego stopnia z zapisanymi komórkami do każdej studzienki, która wcześniej była wypełniona jednym mililitrem pożywki drugiego etapu. W 10 dniu różnicowania układu krwiotwórczego pływające komórki krwiotwórcze są zbierane poprzez zebranie ich do 50-mililitrowej stożkowej probówki i mogą być albo zamrożone z powrotem za pomocą 10% DMSO, 50% FBS i 40% pożywki, albo natychmiast wykorzystane do dalszego różnicowania komórek w osteoklasty. Dojrzewanie M-płynu mózgowo-rdzeniowego i różnicowanie osteoklastów.Komórki nasienne o powierzchni 200 000 komórek na centymetr kwadratowy i traktowane przez trzy dni alfa MEM uzupełnionym 10% FBS i 50 nanogramami na mililitr M-CSF. W celu przeprowadzenia testów funkcjonalnych lub obrazowania, należy odłączyć dojrzałe komórki MCSF, przemłukując je P-1000 z końcówką o szerokim otworze. Przenieść oderwane komórki ze starą pożywką do probówki i wirować z prędkością 300 G przez pięć minut.Ponownie zawiesić i rozpuść osad komórkowy świeżym alfa MEM uzupełnionym 10% FBS, 50 nanogramów na mililitr M-CSF i 80 nanogramów na mililitr liganda RANK. Zasiej ponownie komórki w odległości 200 000 komórek na centymetr kwadratowy i różnicują się przez siedem do dziewięciu dni. Wielojądrowe osteoklasty zwykle pojawiają się około piątego do siódmego dnia.Reprezentatywne wyniki. Skład wygenerowanej populacji komórek krwiotwórczych można analizować za pomocą cytometrii przepływowej. Tutaj komórki krwiotwórcze wykazują dużą populację komórek prekursorowych CD45 +.Populacje komórek wykazujące ekspresję markerów monocytów CD14 i CD11b zwykle stanowią jedną trzecią całej populacji w porównaniu z kontrolnymi izotypami. Terminalnie zróżnicowany osteoklast pochodzący z IPSC można oglądać pod mikroskopem jako komórki wielojądrowe TRAP-dodatnie. Mikroskopia konfokalna pokazuje barwienie komórek pod kątem katepsyny K. Testy funkcjonalne, takie jak testy wchłaniania kości lub minerałów, pozwalają na dalsze ilościowe określenie aktywności osteoklastów.W tym przypadku wgłębienia resorpcyjne są widoczne po usunięciu dojrzałego osteoklastu za pomocą 10% wybielacza przed obrazowaniem, podczas gdy prekursory osteoklastów dojrzałe w M-CSF traktowane bez dodatku liganda RANK nie wykazują wgłębień resorpcyjnych. Konkluzja. Protokół ten umożliwia solidne i niezawodne różnicowanie ludzkich osteoklastów i może stanowić gotowe rozwiązanie w przypadku chorób kości lub chorób związanych z nadmiernym zwapnieniem. Używamy osteoklastów do dalszej inżynierii ich w naszych komórkach RANK, które wykorzystują wewnątrzkomórkową domenę sygnalizacyjną, która może być aktywowana w połączeniu z chemicznym induktorem dimeryzacji w celu kontrolowanej i niezależnej od osteoprotegeryny aktywacji osteoklastów.

differentiation-characterization-osteoclasts-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z fibroblastów pochodzących od pacjentów z zespołem Li-Fraumeni (LFS), różnicowania iPSC poprzez mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) do osteoblastów oraz modelowania nowotworzenia in vivo przy użyciu osteoblastów pochodzących od pacjentów z LFS.

Modelowanie kostniakomięsaka za pomocą zespołu Li-Fraumeni Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Osteoklasty są kluczowymi komórkami resorpcyjnymi kości w organizmie. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę różnicowania in vitro osteoklastów z ludzkich monocytów krwi obwodowej. Metoda ta może być wykorzystana jako ważne narzędzie do lepszego zrozumienia biologii osteoklastów w homeostazie i chorobach.

Różnicowanie funkcjonalnych osteoklastów z monocytów CD14+ ludzkiej krwi obwodowej

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj różnicowanie osteoklastów z ludzkich komórek iPSC przy użyciu czynników biologicznych i technik charakteryzacji. Ta metoda wspiera badania chorób kości i inżynierię tkankową.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów