Summary
建立一个持久的慢性细菌感染的小鼠模型
Abstract
细菌感染的小鼠模型是一个强大的模型系统研究，如感染，炎症，免疫学，信号转导和肿瘤等领域。许多研究人员都采取诱导的结肠炎的优势
Protocol
该协议包括三部分：细菌培养，小鼠灌胃，检测和沙门氏菌 。
1。 沙门氏菌的生长条件。
- 准备沙门氏菌卢里亚Bertani肉汤（LB）板，37℃过夜孵育。
- 从LB平板克隆选择和投入7毫升LB培养基，在12毫升管，并在37 ° C为5小时左右摇晃。
- 固定相的文化和孵化用0.05毫升50毫升LB培养基，接种于37 ° C，不摇晃时间约18小时。
- 自旋在室温下过夜的细菌培养，10分钟6000转，暂停使用比率100:3（LB：HBSS）的HBSS的细菌。例如：
每50毫升LB培养将暂停在1.5毫升的HBSS。 - 对于动物灌胃，进一步在1:10的比例稀释的细菌培养。例如：
每1.5毫升LB培养将暂停在15毫升的HBSS。
2。 沙门氏菌感染模型*.
- 准备链霉素溶液。每个鼠标将在100μL的HBSS 7.5毫克链霉素。例如，准备10只小鼠在1.2毫升的HBSS总链霉素90毫克。准备链霉素溶液时，总是有一些额外的体积。
- 水和食物4小时之前撤回灌胃治疗。
- 链霉素（100μL对照组小鼠的HBSS）7.5毫克链霉素灌胃的小鼠。牢牢抓住用大拇指和中指在鼠标肩的皮肤，舒展的头部和颈部，用食指伸直，使食道。直接喂养针沿口的屋顶，向咽后部的右侧球头，然后轻轻地向下传递到食道，并注入100μL解决方案。应该感到无电阻。
- 链霉素治疗后，被撤回的水和食物与细菌感染小鼠前再次的20小时。
- 灌胃100μL悬浮在HBSS中每个鼠标或用无菌的HBSS（对照组）灌胃治疗。灌胃过程是相同的2.3）灌胃小鼠，用链霉素。
*动物实验，通过使用无特定病原体的雌性C57BL / 6小鼠（泰康利，哈德森，NY）6-7周龄，正如先前所描述的1。该协议被批准，由美国罗切斯特大学委员会的动物资源（UCAR）大学。
3。肠道沙门氏菌检测。
- 收集小鼠粪便（约100毫克）。
- 粪便样品转移到1.5微离心管中，用1ml PBS和涡大力。
- 离心10分钟800转。上清液转移到一个干净的离心管。
- 离心5分钟转速6000。丢弃上清液200μL的PBS添加到颗粒和振荡。
- 数的200μLPBS与一次性细胞吊具上BBL CHROMagar板检测沙门氏菌沙门氏菌出现紫红色（上升到紫色，参见图1）。如果200μL产量上盘太多的殖民地，使用100μL或50μL的连胜纪录。
4。代表性的成果。
鼠伤寒沙门氏菌的定植是正确的协议时，可以在小鼠小肠中检测到6个月以上的沙门氏菌可通过粪便文化检测6个月以上（图1 ）。作为一个典型的出这种模式，车身重量损失和死亡，感染后4个星期内发生。依赖感染沙门氏菌株，有些老鼠可能无法存活超过6个月。
图1。肠道沙门氏菌沙门氏菌出现紫红色上升到紫色的颜色，由于代谢差异的存在，在选定chromogens的。是抑制其他细菌或产生蓝绿色或无色菌落。
图2。感染沙门氏菌突变株PhoP C，PhoP彗星的小鼠的存活比例阿夫拉， 和 PhoP彗星AvrA-/AvrA + PhoP彗星阿夫拉4周（28天）。
表1。 沙门氏菌感染4周的小鼠的体重。
| 0 | 1个星期 | 2个星期 | 3个星期 | 4周 | |
| 控制 | 16.78 ± 1.05 | 16.91 ± 1.28 | 18.26 ± 1.23 | 19.31 ± 1.26 | 20.26 ± 1.15 |
| PhoP 彗星 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17.43 ± 1.63 * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| PhoP 彗星阿夫拉， | 16.91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17.06 ± 2.14 ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| PhoP 彗星 AvrA-/AvrA + | 16.94 ± 0.96 | 17.17 ± 1.02 | 17.63 ± 1.42 * | 18.44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
*与对照组比较P <0.05
**相比，对照组P <0.01
表2。 沙门菌在这项研究中使用。
| 名称 | 说明 | 参考或来源 |
| 沙门氏菌 14028s | 野生型S.鼠伤寒沙门氏菌 | ATCC |
| PhoP 彗星 | 非致病性的复杂的调节突变 | 米勒等人，1990年 |
| PhoP 彗星阿夫拉， | 阿夫拉的突变 | 科利尔- Hyams等，2002年 |
| PhoP 彗星 AvrA-/AvrA + | PhoP 彗星阿夫拉补充质粒编码阿夫拉 | 科利尔- Hyams等，2002年 |
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Discussion
使用这个系统，它的研究人员，以了解如何灌胃动物是必要的。我们详细准备细菌培养和灌胃的小鼠的一种方法。我们还展示了如何监测在胃肠道（GI） 的沙门氏菌持久。在这个协议中的关键步骤包括：
- 链霉素预处理：链霉素预处理可以摆脱一些共生的肠道菌群，使小鼠受到沙门氏菌 感染 2 。
- 沙门氏菌灌胃：对于初学者来说，灌胃可以是具有挑战性的的。有时，灌胃失败，因为该解决方案是不小心注入呼吸道，导致小鼠死亡。
- 持久性细菌定植：需要密切监测细菌在胃肠道。除了 鼠粪文化，盲肠的内容也可以被用于在沙门氏菌检测BBL CHROMagar板。 沙门氏菌感染后处死小鼠时收集盲肠内容。
我们已经测试了不同浓度的沙门氏菌定植鼠标：1 × 10 3 1 × 10 8集落形成单位（100μL/鼠标）的菌落形成单位。在1 × 10 6至10 × 10 8菌落形成单位， 沙门氏菌是能够拓殖小鼠。因此，根据我们以前的出版物1，5和未发表的数据，在此解决方案中的沙门氏菌终浓度不会被测量前灌胃。
在这个实验过程中，我们使用无特定病原体的雌性C57BL / 6小鼠（泰康利，哈德逊，纽约州）6-7周龄。使用的菌株包括野生型鼠伤寒沙门氏菌株ATCC14028s（WT - SL），非致病性沙门氏菌突变株PhoP C3，PhoP彗星阿夫拉，和PhoP彗星AvrA-/AvrA + PhoP彗星阿夫拉（见表2） 。使用此协议， 鼠伤寒沙门氏菌的定植，可在小鼠小肠中检测到6个月以上（图1）通过观察排泄物和男孩体重测量。沙门氏菌感染和炎症。当收集组织样本和血液，小肠长度测量肠道炎症的一个特点。脾脏和肝脏的重量还审议。 ELISA5小鼠血清细胞因子进行了测试。此外，生物化学和分子生物学方法进一步用于测试5 沙门氏菌引起的炎性细胞因子的变化和病理变化。
通常情况下，身体消瘦和死亡发生在感染后4个星期内（见表1）。邮政沙门氏菌感染，细菌感染组有显着的体重损失相比，无细菌治疗的对照组（P <0.05或P <0.001见表1）。每周测量体重。如图所示的生存比例4周后感染。 2。总体而言，92％（N = 50）感染沙门氏菌株PhoP 彗星的小鼠，78％PhoP彗星阿夫拉，或70％PhoP彗星AvrA-/AvrA +可以在肠道中生存与持久性沙门氏菌。急性感染后，所有的幸存者仍然进行沙门氏菌 ，它可以检测到感染后6个月使用这项建议中所述的方法。一旦小鼠生存感染3周后，小鼠获得了体重，少死亡发生（图2）。此外，immunofluroscence染色数据还显示，在肠道黏膜27周后感染（图3） 沙门氏菌的入侵。这些数据表明，C，PhoP PhoP 彗星阿夫拉，或PhoP 彗星 AvrA-/AvrA +可用于慢性感染模型。
与寄主抗性因子NRAMP1的小鼠+ / + 抗沙门氏菌 感染 3-6 。 C57/BL6小鼠与Nramp缺陷，在目前的研究中使用。我们发现，90％的小鼠感染致病的沙门氏菌菌株14028s无法生存超过4周（数据未显示）。为了解野生型鼠伤寒沙门氏菌感染的长期影响，小鼠与Nampr1 + / +可以使用。
这种模式是建立在BSL - 2实验室。我们的协议是，由美国罗切斯特大学委员会的动物资源（UCAR）大学批准。 沙门氏菌感染小鼠有可能遭受的不适和痛苦，变得不活跃，走动缓慢。有可能成为它们的皮毛竖起，他们可能无法正常饲料或饮。动物将密切观察，如果无法走动不够好，保持水化和热量的摄入量，如果鼠标迹象表明，它已吸气液体或显着的体重损失（10％或以上）7，并没有任何不适，如签署没有立即死亡，鼠标是人道的安乐死。所有实验室人员进行培训观察小鼠适当8，9。
许多研究使用链霉素预处理已在感染1,2,10的早期阶段的研究由鼠伤寒沙门氏菌引起的结肠炎的优势。然而，只有少数报告在慢性感染小鼠体内11模型。小鼠消化道沙门氏菌持久存在，使我们能够探索长期的宿主细菌的相互作用，信号转导和肿瘤。我们建立了鼠伤寒沙门氏菌在小鼠小肠6个月以上的殖民化是一种慢性细菌感染小鼠模型。这种模式也可以用于大肠杆菌的发病机制及益生菌的研究。总体而言，这一协议将有助于研究人员利用小鼠模型，从根本上解决重要的生物学和微生物学的问题。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的NIDDK KO1 DK075386授予和美国癌症协会RSG - 09 - 075 - 01 - MBC孙军。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
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